השפעות של חומצה פרפלואורואוקטנואית על מיקרוביוטה במעיים ומטבוליטים מיקרוביאליים בעכברים C57BL/6JⅡ

2. חומרים ושיטות

2.1. בעלי חיים

עכברים זכרים בני ארבעה שבועות נטולי פתוגנים ספציפיים נרכשו ממעבדת ג'קסון (Bar Harbor, ME, ארה"ב). עכברים צרכו מי שתייה באופן חופשי. מתקן החיות באוניברסיטת ג'ורג'יה נשמר ב-22 ◦C ו-40-70% לחות, תחת מחזור אור: חושך של 12:12 שעות. לפני ניסוי החשיפה ל-PFOA, חמישה עכברים שוכנו בכלוב אחד, והעכברים החליפו כלובים באופן אקראי פעם בשבוע במשך ארבעה שבועות. החשיפה ל-PFOA החלה כאשר העכברים היו בני שמונה שבועות ותקופת החשיפה נמשכה ארבעה שבועות. בתחילת הניסוי, עכברים הוקצו לקבוצת החשיפה ל-PFOA או לקבוצת הביקורת באופן אקראי (n=10 עכברים בכל קבוצה), עם עכבר אחד בכלוב אחד. PFOA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב) ניתנה לעכברים דרך מי שתייה. הריכוז הסופי של PFOA במי השתייה היה 1 חלק למיליון (ppm). המינון נבחר על סמך המחקר הקודם שלנו [24]. עכברי שליטה צרכו מי שתייה ללא תוספת של PFOA. פרוטוקול בעלי החיים אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים, אוניברסיטת ג'ורג'יה (קוד פרוטוקול: A2014 10-014-Y2-A1).

לחץ לתרופות ביתיות לעצירות

2.2. מיצוי מטבוליטים

המיצוי של מטבוליטים בוצע כפי שתואר קודם [25]. בקצרה, 20 μL מכל דגימת סרום חולצו עם 225 μL מתנול. הדגימות עברו מערבולת למשך 10 שניות. לאחר מכן, 750 μL מתיל tert-butyl ether (MTBE) ו- 188 μL מים נוספו לדגימות לעיל כדי לגרום להפרדת פאזות. הדגימות נוערו ב-4 ◦C למשך 6 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-14,000×g למשך 2 דקות. ממס המיצוי פוטר בגז וקירר מראש ב-20 ◦C. הפאזה הלא קוטבית העליונה (350 μL) נאספה ואודה ליובש מוחלט באמצעות רכז מלכודות קור של Labconco Centrivap (Labconco, קנזס, MO, ארה"ב). עבור דגימות כבד וצואה, נוספו 225 μL מתנול ו- 750 μLMTBE ל-10 מ"ג מכל דגימה. הדגימות הומוגגו באמצעות aGenoGrinder 2010 (SPEX SamplePrep, Metuchen, ניו ג'רזי, ארה"ב) במהירות של 1500 סל"ד עבור 30 חול ולאחר מכן מערבלים ומנערים ב-4 ◦C למשך 6 דקות. לאחר מכן, נוספו 188 µL מים לדגימות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-14,000×g למשך 2 דקות. הפאזה העליונה הלא קוטבית (350 μL) נאסף והתאדה עד ליובש מוחלט. דגימות מיובשות הושעו מחדש ב-60 μL אצטוטריל 4:1 ומים (v/v) עם תקנים פנימיים. הדגימות נערכו במערבולת, ואחריה ביצוע קולי למשך 5 דקות וצנטריפוגה ב-14,000×g למשך 2 דקות. הסופרנטנט נאסף לניתוח LC-MS.

2.3. פרופיל מטבולומי לא ממוקד

פרופיל מטבולומי לא ממוקד בוצע כפי שתואר קודם [25]. מערכת Vanquish UHPLC (Thermo Scientific, Waltham, MA, ארה"ב) שימשה להפרדת מטבוליטים עם עמודת Acquity UPLC BEH Amide (150 מ"מ × 2.1 מ"מ × 1.7 מיקרומטר), שהייתה מחוברת ל-Acquity VanGuard BEH Amide מראש. עמודה (5 מ"מ × 2.1 מ"מ × 1.7 מיקרומטר, Waters, Milford, MA, ארה"ב). מים בדרגת LC-MS (100%) עם 10 mM אמוניום פורמט ו-0.125% חומצה פורמית (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO , ארה"ב) שימש כשלב נייד A. בינתיים, אצטוניטריל 95:5: מים (v/v) המכילים 10 מ"מ אמוניום פורמט ו-0.125% חומצה פורמית שימשו כשלב נייד ב'. הגרדיאנט התחיל עם 100% B ב-0- 2 דקות, 70% בת 7.7 דקות, 40% B ב-9.5 דקות, ו-30% B ב-10.25 דקות, ואחריו 100% B ב-12.75-16.75 דקות. קצב הזרימה נשמר על 0.4 מ"ל לדקה. ספקטרות נאספו במצב חיובי של יינון אלקטרוספריי (ESI) באמצעות Q-Exactive HF (Thermo Scientific, Waltham, MA, ארה"ב). טווח ה-themass נקבע מ-m/z 60 ל-900 עם מצב תלוי-נתונים ל-MS/MS spectraacquisition. נתונים גולמיים לא ממוקדים של מטבולומיקה הומרו לראשונה לקובצי ABF באמצעות ממיר ABF (https://www.reifycs.com/AbfConverter/ (נגישה ב-6 ביולי 2022)). MSDIAL גרסה 5.1.0.1 שימשה לזיהוי וכימות של מטבוליטים [26]. ה-Mass Spectral Feature Optimizer (MS-FLO) שימש לשיפור רשימות התכונות האיכותיות על ידי סימון תכונות לאיסוף נתונים נוסף [27]. זמן שמירה m/z ספריותו-Fiehn HILIC MS/MS מסדי נתונים של ספקטרה ב-MassBank של צפון אמריקה שימשו לזיהוי מטבוליטים.

2.4. 16S rRNA רצף גנים

ה-DNA הכולל הופק מדגימות צואה באמצעות ערכת הבידוד של PowerSoil® DNA (MO BIO Laboratories, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב), בהתאם להוראות היצרן. הפריימרים 515F ו-806R שימשו להגברה של אזור V4 של 16S rRNAgene, לאחר מכן על ידי נורמליזציה וברקוד. רצף ה-DNA על ערכת IlluminaMiSeq v2 עם 500 מחזורים. נתוני רצף הגנים rRNA של 16S נותחו באמצעות תובנות כמותיות של אקולוגיה מיקרוביאלית (QIIME) II [28]. בקצרה, נתוני רצף גולמיים נדונו באמצעות DADA2, ואחריו בחירת יחידה טקסונומית (OTU). SILVA (גרסה 138), שהוכשרה על ידי המסווג מבוסס sikit-learn Naive-Bayes, שימשה כמסד נתונים.

2.5. ניתוח סטטיסטי

גודל אפקט אנליזה מבחין ליניארי (LEfSe) שימש כדי לקבוע את החיידקים שהסבירו ביותר להסביר את ההבדלים בין PFOA לקבוצות הביקורת [29]. לצורך השוואה של מטבוליטים, נעשה שימוש במבחן Mann-Whitney U כדי לחשב את ערכי ה-p בין PFOA וקבוצות הביקורת. שיעור הגילוי הכוזב שימש לתיקון ההשוואות המרובות. מטבוליטים עם ערך p < 0.05 נחשבו משמעותיים. ניתוח מבחין בריבועים קטנים חלקיים (PLS-DA) וניתוח העשרת מסלולים בוצעו באמצעות MetaboAnalyst 5.0 [30]. MixOmics שימש לניתוח אינטגרטיבי של מיקרוביוטה במעיים ומטבוליטים צואה - זוהי מסגרת אינטגרטיבית לניתוח רב משתנים של נתוני אומיקס [31].

צמחי מרפא טבעיים להקלה על עצירות-Cistanche

Cistanche הוא סוג של צמחים טפילים השייך למשפחת ה- Orobanchaceae. צמחים אלו ידועים בסגולותיהם הרפואיות ושימשו ברפואה סינית מסורתית (TCM) במשך מאות שנים. מיני Cistanche נמצאים בעיקר באזורים צחיחים ומדבריים של סין, מונגוליה וחלקים אחרים של מרכז אסיה. צמחי Cistanche מאופיינים בגבעולים הבשרניים והצהבהבים שלהם ומוערכים מאוד בשל היתרונות הבריאותיים הפוטנציאליים שלהם. ב-TCM, מאמינים כי ל-Cistanche יש תכונות טוניקות והוא משמש בדרך כלל להזנת הכליה, לשיפור החיוניות ולתמיכה בתפקוד המיני. הוא משמש גם לטיפול בבעיות הקשורות להזדקנות, עייפות ורווחה כללית. בעוד ל-Cistanche יש היסטוריה ארוכה של שימוש ברפואה מסורתית, המחקר המדעי על יעילותו ובטיחותו מתמשך ומוגבל. עם זאת, ידוע שהוא מכיל תרכובות ביו-אקטיביות שונות כגון פנילתנואידים גליקוזידים, אירידואידים, ליגנאנים ופוליסכרידים, אשר עשויים לתרום להשפעותיו הרפואיות.

של Wecistancheאבקת cistanche, טבליות cistanche, כמוסות cistanche, ומוצרים אחרים מפותחים באמצעותמִדבָּרcistancheכחומרי גלם, שלכולם השפעה טובה על הקלה על עצירות. המנגנון הספציפי הוא כדלקמן: ל- Cistanche מאמינים שיש יתרונות פוטנציאליים להקלה על עצירות בהתבסס על השימוש המסורתי שלו ותרכובות מסוימות שהוא מכיל. בעוד שמחקרים מדעיים ספציפיים על ההשפעה של Cistanche על עצירות מוגבלים, מניחים שיש לו מספר מנגנונים שעשויים לתרום לפוטנציאל שלו להקל על עצירות. אפקט משלשל:Cistancheזה זמן רב בשימוש ברפואה הסינית המסורתית כתרופה לעצירות. מאמינים שיש לו השפעה משלשלת קלה, שיכולה לעזור לקדם תנועות מעיים ולגרום לעצירות. ניתן לייחס השפעה זו לתרכובות שונות ב- Cistanche, כגון פנילתנואידים גליקוזידים ופוליסכרידים. לחות המעיים: בהתבסס על השימוש המסורתי, Cistanche נחשבת לבעלת תכונות לחות, המתמקדות במיוחד במעיים. קידום הידרציה ושימון המעיים עשוי לעזור לרכך כלים ולהקל על מעבר קל יותר, ובכך להקל על עצירות. השפעה אנטי דלקתית: עצירות יכולה לפעמים להיות קשורה לדלקת במערכת העיכול. Cistanche מכיל תרכובות מסוימות, כולל phenylethanoid גליקוזידים וליגננים, אשר מאמינים כי יש תכונות אנטי דלקתיות. על ידי הפחתת דלקת במעיים, זה עשוי לעזור לשפר את סדירות תנועת המעיים ולהקל על עצירות.