Echinacoside מעכב את הזדקנות הסלולרית של תאים פיברובלסטיים אנושיים MRC-5

איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

החומר הפעיל של Cistanche: כיצד אכינאקוסיד אנטי אייג'ינג?

Hong Xie 1, Hui Zhu1,2, Cong Cheng1, Yu Liang1, Zhao Wang1

במחקר זה, נחקרו ההשפעות של אכינאקוסיד, אחד הפנילאתנואידים המבודדים מגבעולי סיסטנצ'ס סלסה, רפואת צמחים סינית מסורתית, על תאי MRC-5 פיברובלסטיים של עוברי ריאות אנושיים. פעילות התפשטות התאים הוערכה עם Alamar Blue, והראתה שטיפול באכינאקוסיד יכול לעכב את ההזדקנות. תוצאות ציטומטריית זרימה מראות כי אכינאקוסיד יכול לעורר תאים בשלב G1 להיכנס לשלב S ושלב G2, ויכול לשפר את הפירוק ROS. התוצאות מבדיקת השביט מצביעות על כך שאכינאקוסיד יכול להגן על תאים מפני נזק ל-DNA, ובחלקו מבהיר את מנגנון ההשפעות שלו. כל התוצאות לעיל מצביעות על כך שלאכינאקוסיד יש פעילות אנטי-זדקנות פוטנציאלית.

ל- Cistanche deserticola השפעות רבות, לחץ כאן כדי לדעת יותר

1. הקדמה

תאים נורמליים בתרבית במבחנה מתרבים למספר מצומצם של הכפלות אוכלוסיה ('הגבול של הייפליק') ונכנסים לשלב של הזדקנות רפליקטיבית. תאים מזדקנים עוברים עצירת צמיחת תאים בשלב G1 ושינוי במורפולוגיה ובמטבוליזם, כולל הגדלה תאית, ביוגנזה מוגברת של ליזוזום וביטוי של פעילות גבוהה יותר של -galactosidase ב-pH 6 (-galactosidase הקשורות להזדקנות, SA- - -Gal ) (הייפליק ומורהד 1961; דימרי 1995). הצטברות של תאים מזדקנים מנבאת את הירידה הקשורה לגיל ברִקמָה/אֵיבָרפונקציות. כדי לגשת לדרך של עיכוב או היפוך ההזדקנות, המאמצים לגלות חומרים אנטי-אייג'ינג פעילים מעולם לא פסקו.אכינאקוסיידהוא אחד הפנילאתנואידים המבודדים מגבעולים שלסלסת סיסטאנצ'ס, רפואת צמחים סינית מסורתית, בעלת פוטנציאל לפעילות ביולוגית, הן כאנטי-סרום והןנוגד עייפותagent (Deng et al. 2004; Xiong et al. 1996). דווח גם שהוא מתנהג במבחנה כבעל עוצמהחינםקיצוניזַבָּל(Facino et al. 1995) ומוצגיםנוירו-פרוטקטיביפעילויותin vitro ו-in vivo (Koo et al. 2005; Geng et al. 2007). Echinacoside עשוי להיות מועמד לחומר אנטי אייג'ינג, ופעילות אנטי אייג'ינג עשויה להיות אחת מהתכונות הביולוגיות שלו. לפיכך, טיפלנו בקו תאים פיברובלסטי של עובר אנושי ריאות, MRC-5 עם echinacoside, בציפייה שהוא יכול לעכב או להפוך את ההזדקנות.

2. חקירות ותוצאות

ראשית, הוספנו echinacoside למדיום התרבות כדי לבדוק את השפעתו על צמיחת תאים ומחזורי תאים. נצפה כי כדאיות התאים עם חשיפה של 48 שעות לאכינאקוסיד גדלה באופן ברור ביחס לבקרה, ככל שהריכוז עלה (איור 1A), מה שמעיד על כך שאכינאקוסיד עזר לתאי מזדקנים להתרבות. תוצאת צביעת SA- Gal הראתה שרמת SA- -Gal ירדה בבירור לאחר טיפול באכינאקוסיד (נתונים לא מוצגים), מה שמצביע על כך שחלק מתאי ההזדקנות הופכים מהזדקנות. כדי לאשר אם תאים מזדקנים אכן הונעו להתרבות על ידי אכינאקוסיד, הוכנסה ציטומטריה עמית כדי לבדוק את השינוי בשלב מחזור התא של תאי MRC-5 המזדקנים לאחר טיפול באכינאקוסיד. במחקר שלנו, ראינו שעם עליית הריכוז של Echinacoside, יחס התאים בתקופת G1 ירד בהדרגה. להיפך, תאים נוספים הונעו להיכנס לשלב S ושלב G2 (איור 1B). הצטברות של מוקדי הטרוכרומטין הקשורים להזדקנות (SAHF) היא סמן ביולוגי ספציפי נוסף של תאים מזדקנים (Shay and Wright 2001). תאים מזדקנים הציגו מוקדי DNA מנוקדים אשר הומחזו על ידי צביעה של Hoechst (איור 1C). לעומת זאת, נראה כי לתאי MRC-5 שטופלו באכינאקוסיד יש פחות SAHF.

רמת מיני החמצן התגובתי (ROS) עולה ככל שהתאים מתקרבים לגבול ה- Hayfllick (Hutter et al. 2002). טיפול מתמשך בתאים עם רמות תת-קטלניות של ROS לא רק מגביר את רמת מוצרי הנזק החמצוני כגון lipofuscin (Sitte et al. 2001) אלא גם גורם לעצירת גדילה קבועה המלווה בהפעלה של מעכב הגדילה p53- מסלול (Toussaint et al. 2000). לכן, ברמה התאית, ROS ממלא תפקיד מפתח בהשראת הזדקנות. צבע הפלורסנט FL DCFH-DA שימש למדידת תכולת ROS עם ציטומטריה עמיתים. הוכח כי בהשוואה לבקרה, תכולת ה-ROS ירדה באופן ברור בתאים שהודגרו עם echinacoside (איור 2A). תוצאות אלו מצביעות על כךechinacosideעשוי לפעול כנוגד חמצון, להפחית את ייצור ROS או להאיץ את הסרת ROS.

מיני חמצן תגובתיים מצטברים (ROS) גורמים לפגיעה יוצאת דופן של מקרומולקולות בתאים, כולל חלבונים, DNA וטלומרים (Kovtun et al. 2007). נזקי DNA חמצוני מעוררים עצירת צמיחה P53-תלויה ב-G1, בעקבות הביטוי של p21Waf-1/SDI-1/Cip1 (Chen et al. 1998) והזדקנות תאים בפיברובלסטים של בני אדם נורמליים. השתמשנו במבחן שביט כדי למדוד את נזקי ה-DNA ותיקונו. גודלם של שברי ה-DNA ומספר ההפסקות קובעים את הנדידה והתבנית של השביט הנראה. תכולת ה-DNA של הזנב (תוצר של אורך הזנב ותכולת ה-DNA של הזנב) עולה עם הנזק. התוצאות שלנו מראות שטיפול מקדים עם echinacoside יכול בחלקו לקדם את תיקון נזקי ה-DNA, לפחות להגן על התאים מפני נגעי DNA הנגרמים על ידי H2O2 (איור 2B). בהתבסס על עובדות אלו, אנו מסיקים כי לאכינאקוסיד יש פעילות אנטי-זדקנות לפחות בתאי MRC-5. תוצאות המחקר שלנו מראות שאכינאקוסיד יכול להפחית את הצטברות ROS, להגן על תאים מפני נזק ל-DNA, לקדם תאי MRC-5 משלב G1 לשלבי S ו-G2, ובכך לשפר את התפשטות התאים. באופן כללי, ניתן לחלק את ההשפעות של אכינאקוסיד על תאי MRC-5 לשני היבטים: לקדם שגשוג תאים ולהפחתת הצטברות ROS. למרות שהמנגנון המדויק של הזדקנות התא עדיין לא ידוע והרשת של ויסות מחזור התא נותרה שנויה במחלוקת, הוכחנו שאכינאקוסיד יכול להגן על תאים מפני נזק חמצוני. לכן אנחנו משערים את זהechinacosideעשוי להיות מועמד טוב לוויסות הזדקנות, למרות שהמנגנון המדויק הבסיסי נותר שאלה פתוחה ומחקרים נוספים נמצאים בעיצומם.

3. ניסיוני

3.1. תרבית תאים וטיפול

קו תאים פיברובלסטי עוברי ריאה של עוברי אנוש MRC{{0}} (Institute of Biochemistry and Cell Biology, SIBS, CAS) נשמר במדיום מינימום חיוני שונה (Gibco/BRL) ובתוספת של 10 אחוז סרום בקר עוברי. תאי MRC-5 עוברים הזדקנות רפליקטיבית לאחר מעברי תאים מרובים, המוערכת על ידי האטת חילוף החומרים והפסקת החלוקה תוך 7 ימים. כל התרבויות נזרעו בצפיפות תאים של 104/cm2 אלא אם צוין אחרת והותרו להתרבות, ללא הפרעה, במשך 7 ימים. ריכוזים שונים של echinacoside נוספו 48 שעות לפני הבדיקה עם ממס כביקורת אלא אם צוין אחרת. הריכוז של DMSO בתרביות היה פחות מ-0.3 אחוז (v/v). לטיפול ב-H2O2, תאים הושררו עם 250M H2O2 למשך 12 שעות.

3.2. בדיקת שיעור הישרדות

תאים תורבו וטופלו עם echinacoside על צלחות 96 באר. לפני הגילוי, 10 אחוז Alamar BlueTM נוספו למדיום והודגרו במשך 4 שעות. ספיגה נמדדה עם ספקטרופוטומטר.

3.3. ניתוח ציטומטריית זרימה

ציטומטריית זרימה הוכנסה למדידת תכולת ה-DNA ורמות ה-ROS התוך-תאי באמצעות propidium iodide ו- DCFH-DA בהתאמה. תאים צופו בצפיפות של 105 תאים/10 מ"ל תמיסת תאים בכלים בקוטר 100 מ"מ והוסיפו לאכינאקוסיד למשך 48 שעות לאחר זריעת התא. לאחר טיפול של 48 שעות, תאים נקצרו ונשטפו ב-PBS לאחר צנטריפוגה, ולאחר מכן הושעו מחדש בתמיסת PBS עם 0.1 אחוז RNase ו-50 גרם/מ"ל פרופידיום יודיד או מדיום תרבות המכיל 10 M DCFH-DA למשך 30 דקות. תכולת ה-DNA או ROS נקבעה לאחר מכן על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה על-ידי Beckman Coulter Flow Cytometry System. הנתונים נותחו על ידי תוכנת MultiCycle.

3.4. מכתים Hoechst

תאים תורבו וטופלו עם echinacoside במשך 48 שעות על צלחת 96 בארות. המדיום הוסר, התאים נשטפו עם PBS, ולאחר מכן קבועים עם 4 אחוז פורמלדהיד ב-PBS למשך 20 דקות, ולאחר מכן כביסה עם PBS פעם אחת, והוצבעו בצבע Hoechst למשך 10 דקות. תמונות נלכדו.

3.5. אלקטרופורזה של ג'ל חד-תא (בדיקת שביט)

בדיקת שביט בוצעה כפי שדווח (Olive and Banath 2006). תמונות שביט בודדות נותחו באמצעות תוכנת CometScore. הכרה: עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי התוכנית הלאומית למחקר בסיסי (פרויקט 973) של סין (מס' 2007CB507406), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 30572341), והקרן למדעי הרפואה Tsinghua-Yue-Yuen (THYY20070008 ).