השפעות מודולטוריות כפולות של דיוסמין על תהליכי היווצרות אבן כליה של סידן אוקסלט: התגבשות, צמיחה, אגרגציה, הידבקות תאי גביש, הפנמה לתאי צינורית כליה ופלישה דרך מטריצה ​​חוץ-תאית

למידע נוסף:ali.ma@wecistanche.com

Supaporn Khamchun^a,b,c,1, סוניסה יודי^a,1, Visith Thongboonkerd^a,*

^aיחידת פרוטאומיקה רפואית, משרד למחקר ופיתוח, הפקולטה לרפואה בית החולים Siriraj, אוניברסיטת Mahidol, בנגקוק 10700, תאילנד

^bהמחלקה לטכנולוגיה רפואית, בית הספר למדעי הבריאות בעלות הברית, אוניברסיטת פאיאו, פאיאו 56000, תאילנד

^cיחידת מצוינות בביורפואה מולקולרית אינטגרטיבית, בית הספר למדעי הבריאות בעלות הברית, אוניברסיטת פאיאו, פאיאו 56000, תאילנד

מילות מפתח: תרכובת ביו-אקטיבית, פלבונואיד, מעכב, מודולטור, נפרוליתיאסיס, פרומטור, אורוליתיאזיס

תַקצִיר

דיוסמיןהוא פלבון גליקוזיד טבעי (ביופלבנואיד) המצוי בפירות ובצמחים עם מספר פעילויות תרופתיות. נעשה בו שימוש נרחב כתוסף תזונה או כסוכן טיפולי במחלות/הפרעות שונות. למרות שמומלץ, עדות למנגנוני ההגנה שלה מפניכִּליָהמחלת אבנים (נפרוליתיאזיס/אורוליתיאזיס), במיוחד סידן אוקסלט (CaOx) מונוהידראט (COM) שהוא הסוג הנפוץ ביותר, נותרה לא ברורה. במחקר זה הערכנו באופן שיטתי את ההשפעות שלדיוסמין(ב-2.5-160 ננומטר) בשלבים שונים שלכִּליָהתהליכי היווצרות אבנים, כולל התגבשות COM, צמיחת גבישים, אגרגציה, הידבקות של תאי גביש, הפנמה לתאי צינורי כליה ופלישה דרך מטריצה ​​חוץ-תאית (ECM). התוצאות הראו זאתדיוסמיןהיו לו השפעות מודולטוריות תלויות מינון על כל תהליכי אבן הכליה COM שהוזכרו.דיוסמיןהגדילו באופן משמעותי את מספר הגבישים והמסה של COM במהלך התגבשות, אך הפחיתו את גודל הגביש והגדילה. בזמןדיוסמיןמקדם צבירה של גבישים, הוא עיכב הידבקות של תאי גביש והפנמה לתאי צינורי כליה. לבסוף, דיוסמין קידם פלישת גבישים דרך ה-ECM. הנתונים שלנו מספקים ראיות המדגימות הן את ההשפעות המעכבות והן המקדמות של דיוסמין על COMכִּליָהתהליכי יצירת אבנים. בהתבסס על פעילויות מודולטוריות כפולות אלו של דיוסמין, תפקידו האנטי-אורוליתיאזיס מוטל בספק ויש לנקוט זהירות לגבי השימוש בוכִּליָהמחלת אבנים.

1. הקדמה

דיוסמין(3′,5,7-trihydroxy-4′-methoxyflavone-7-rhamnoglucoside) הוא ביופלבנואיד טבעי שנמצא בדרך כלל בצמחים ופירות שונים, בעיקר Citrus spp. [1,2]. זה יכול להיות מסונתז או נגזר מהפלבנואיד האחר, הספרידין [1,2]. דיוסמין לבד או בשילוב עם הספרידין נמצא בשימוש נרחב כתרופה פלבוטרופית לטיפול בהפרעות ורידיות ולימפתיות כגון אי ספיקת ורידים כרונית וטחורים [3,4]. בנוסף, דיוסמין מציג מספר פעילויות ביולוגיות ותרופתיות אחרות, כולל פעילויות נוגדות חמצון ואנטי דלקתיות [5,6], תכונות אנטי-מוטגניות ואנטי-ניאופליסטיות [7,8], השפעות אנטיביוטיות [9], תכונות אנטי-היפרגליקמיות [ 10], והשפעות הגנה מפני נזקים מרובי איברים, כלומר,

קרדיווסקולרי [11], רשתית [12],כִּליָה, פגיעה בכבד ובמוח [13].

כִּליָהמחלת אבנים (או נפרוליתיאזיס/אורוליתיאזיס) נגרמת על ידי האבנית המוצקה שפותחה ומושקעת בתוך הכליה ופוגעת בבני אדם בכל אזורי הגלובוס עם שיעור הישנות גבוה [14-17]. בין כל הגבישים הסיבתיים השונים, סידן אוקסלט (CaOx), במיוחד צורת מונוהידראט (COM), הוא המרכיב הגבישי הפתוגני והנפוץ ביותר שנמצא ביוצרי האבנים (חולים עם אבנים בכליות) [18]. מבחינה מכאנית, לגבישי COM יש את יכולת ההדבקה החזקה ביותר ואת ההשפעות הציטוטוקסיות ביותר על תאי אפיתל צינורי כליה [19,20]. במהלך פתוגנזה של האבנים, הן למודל הפלאק של רנדל והן להשערה התוך-צינורית יש מאפיינים משותפים של תהליכי יצירת אבני COM, כולל התגבשות COM, צמיחה, צבירה, שמירה על ידי הידבקות פני השטח על תאי צינורית הכליה או אגן הכליה, הפנמה לתאים ופלישה לתאים. interstitium כלייתי דרך מטריקס חוץ-תאי (ECM) [21,22].

לאחרונה, מחקרים רבים התמקדו בגילוי התרופה תוך שימוש בצמחי מרפא/פירות ובתרכובות הביו-אקטיביות שלהם במטרה למנוע היווצרות אבנים חדשות ו/או חוזרות. מספר דיווחים קודמים הראו כי לחלק מהתרכובות הביו-אקטיביות, במיוחד לתרכובות פנוליות (פוליפנול, פלבנואיד, פלבון גליקוזיד וכו') המופקים ממספר צמחי/פירות מרפא, יש השפעות מניעה כנגד המנגנונים הפתוגניים שלכִּליָהמחלת אבנים גם במבחנה וגם in vivo [23-25]. בין החומרים המועילים הללו, מספר דיווחים העלו שדיוסמין עשוי למנוע שקיעה של גבישי CaOx בתוך רקמת הכליה במודלים של בעלי חיים [26,27]. עם זאת, תפקידו המווסת המדויק (עיכוב או קידום) והמנגנונים (שלבים או תהליכי יצירת אבנים) בהיווצרות אבני כליות COM לא נחקרו. המחקר הנוכחי העריך באופן שיטתי את ההשפעות שלדיוסמין(ב-2.5-160 ננומטר) בשלבים שונים שלכִּליָהתהליכי היווצרות אבנים, כולל התגבשות, צמיחת גבישים, אגרגציה, הידבקות של תאי גביש, הפנמה לתאי צינורי כליה ופלישה דרך ECM.

לחץ כדימינון Cistanche tubulosa לתפקוד הכליות

2. חומרים ושיטות

2.1. הכנת דיוסמין

דיוסמין(Tokyo Chemical Industry; טוקיו, יפן) הומס עם 100 אחוז דימתיל sulfoxide (DMSO) (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO) ומנות עבודה נעשו בריכוזים סופיים של 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 ו-160 ננומטר לחקירת השפעותיו על גבישי COM. בנוסף, 100 אחוז DMSO שימש כביקורת שלילית בכל הניסויים.

2.2. תרבית תאים

קו תאי אפיתל צינורי כליות MDCK שמקורו במקטע צינורי דיסטלי של הנפרון (ATCC; Manassas, VA) הופץ במדיום המינימלי החיוני של Eagle (MEM) (Gibco; Grand Island, NY) בתוספת של 10% סרום בקר עוברי (FBS), 60 U/ml פניצילין G (Sigma-Aldrich) ו-60 ug/ml Streptomycin (Sigma-Aldrich). התאים נשמרו באינקובטור לח עם 5 אחוז CO2 ב-37 מעלות צלזיוס.

2.3. בדיקת התגבשות COM

התגבשות COM בוצעה כמתואר קודם [28,29]. בקצרה, 500 ul של 10 mM CaCl2⋅2H2O במאגר התגבשות (המכיל 10 mM Tris-HCl ו-90 mM NaCl) (pH 7.4) נוספו לכל באר של 24-צלחת הבאר (Corning Inc.; Corning, ניו יורק). נפח שווה (4 ul) של חיץ התגבשות (בקרה ריקה), DMSO (שליטה שלילית) אודיוסמין(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 או 160 ננומטר) עורבבו עם CaCl2. לבסוף, נוספו 500 ul של 1.0 mM Na2C2O4 במאגר ההתגבשות כדי להפוך את הריכוזים הסופיים של CaCl2 ו- Na2C2O4 ל-5 mM ו-0.5 mM, בהתאמה. התערובת הודגרה ב-25 מעלות צלזיוס למשך שעה ולאחר מכן נבדקה. תמונות קריסטל נלכדו באופן אקראי מלפחות 15 שדות בעלי הספק גבוה (HPFs) תחת מיקרוסקופ אור מנוגד פאזה הפוך של Nikon Eclipse Ti-S (Nikon; טוקיו, יפן). גודל ומספר הגבישים נמדדו מ-15 HPFs לפחות עבור כל דגימה באמצעות תוכנת NIS Element D גרסה 4.11 (Nikon). מסת הגביש חושבה מ-100 גבישים לפחות ב-15 HPF באמצעות הנוסחה הבאה: מסת קריסטל (µm2/HPF)=גודל גביש ממוצע בכל שדה (µm2) × מספר הגבישים בכל שדה (/HPF) ( 1)

2.4. בדיקת צמיחת גבישים COM

בדיקת צמיחת קריסטל בוצעה כמתואר קודם [30,31].

בקצרה, נפח שווה (500 ul) של 10 mM CaCl2⋅2H2O ו-1.0 mM Na2C2O4 במאגר התגבשות מעורבב (1:1) (v/v) בכל באר של { {12}}צלחת באר. התערובת הודגרה ב-25 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לאפשר התגבשות מלאה. בשלב זה (T0), נפח שווה (4 ul) של חיץ התגבשות (בקרה ריקה), DMSO (שליטה שלילית) אודיוסמין(2.5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 או 160 ננומטר) נוספו לכל באר והתערובת הודגרה עוד 60 דקות (T60). ב-T0 ו-T60, תמונות גבישים נלכדו באופן אקראי מ-15 HPFs לפחות תחת מיקרוסקופ אור ניגודיות פאזה הפוכה של Nikon Eclipse Ti-S. גדלי גבישים ב-T0 ו-T60 נמדדו באמצעות תוכנת NIS Element D גרסה 4.11 (Nikon), בעוד שגידול הגביש (מיוצג על ידי Δ גודל גביש) חושב מ-100 גבישים לפחות ב-15 HPFs באמצעות הנוסחה הבאה: Δ גודל גביש (µm2)=גודל גביש ב-T60 − גודל גביש ב-T0 (2)

2.5. בדיקת צבירה גבישי COM

בדיקת צבירה קריסטלית בוצעה כמתואר קודם [32,33]. גבישי COM נוצרו כפי שהוזכר לעיל במבחן צמיחת הגבישים אך עם נפח גדול יותר בצינור חרוטי של 50- מ"ל (Corning Inc.) ולאחר מכן נקצרו על ידי צנטריפוגה ב-2000 גרם למשך 5 דקות. הסופרנטנט הושלך, ואילו גבישי COM נשטפו שלוש פעמים עם מתנול. לאחר צנטריפוגה נוספת ב-2000 גרם למשך 5 דקות, מתנול הושלך והגבישים יובשו באוויר למשך הלילה ב-25 מעלות צלזיוס. גבישי COM (1000 מיקרוגרם משקל יבש) הושעו מחדש ב-1 מ"ל של חיץ התגבשות בכל באר של 6-צלחת הבאר (Corning Inc.). נפח שווה (4 ul) של חיץ התגבשות (בקרה ריקה), DMSO (שליטה שלילית) אודיוסמין(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 או 160 ננומטר) נוספו לתרחיף הגבישים COM בכל באר. הצלחת נוערה ברציפות באינקובטור מטלטל (Zhicheng; שנחאי, סין) ב-150 סל"ד ו-25 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לאחר מכן, נבחנה היווצרות צבר גבישי COM (מוגדר כ"מכלול של שלושה או יותר גבישי COM בודדים שחברו יחדיו בחוזקה" [32]) והצטלמו תחת מיקרוסקופ אור מנוגד פאזה הפוך של Nikon Eclipse Ti-S. מספר אגרגטים של גבישי COM נספר מתוך לפחות 15 HPFs אקראיים לבאר.

2.6. בדיקת הידבקות תאי גביש COM

בדיקת הידבקות תאי גביש בוצעה כמתואר קודם [34,35]. בקצרה, גבישי COM נוצרו כפי שהוזכר לעיל בצינור חרוטי של 50- מ"ל ולאחר מכן נקצרו על ידי צנטריפוגה ב-2000 גרם למשך 5 דקות. הסופרנטנט הושלך, ואילו גבישי COM נשטפו שלוש פעמים עם מתנול. לאחר צנטריפוגה נוספת ב-2000 גרם למשך 5 דקות, מתנול הושלך והגבישים יובשו באוויר למשך הלילה ב-25 מעלות צלזיוס. הגבישים חולקו על ידי קרינת אור UV למשך 30 דקות לפני התערבות בתאים.

תאי MDCK (בצפיפות של 2 × 105 תאים/באר) נזרעו וגודלו בכל באר של 6-צלחת הבאר (Corning Inc.) למשך 48 שעות כדי להשיג חד-שכבה מתכנסת. לאחר מכן מצע התרבות רענן לפני הוספת גבישי COM (100 מיקרוגרם גבישים במשקל יבש לכל מ"ל מצע תרבות). נפח שווה (4 ul) של חיץ התגבשות (בקרה ריקה), DMSO (שליטה שלילית) אודיוסמין(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 או 160 ננומטר) נוספו לכל באר. התאים הודגרו עוד באינקובטור לח עם 5 אחוז CO2 ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן, התאים נשטפו במרץ עם PBS חמש פעמים והצטלמו תחת מיקרוסקופ אור ניגודיות פאזה הפוכה של Nikon Eclipse Ti-S. מספר גבישי ה-COM הנותרים שנדבקו על פני תא צינורי הכליה נספר לפחות מ-15 שדות אקראיים לבאר.

Cistanche לתפקוד הכליות

2.7. בדיקת הפנמת גבישי COM

גבישי COM המסומנים עם הקרינה נוצרו כמתואר קודם [36,37]. הרכבים/ריכוזים של כימיקלים ששימשו להתגבשות היו זהים לאמור לעיל לגבי הגבישים הפשוטים (שלא מסומנים), אבל 0.1 מיקרוגרם/מ"ל פלואורססין איזותיוציאנט (FITC) (Thermo Scientific Pierce; Rockford, IL) היה הוסף לתמיסת CaCl2⋅2H2O לפני ערבוב עם Na2C2O4. השלבים הבאים (התגבשות וקציר) בוצעו כאמור לעיל, אך בחושך.

כדי להעריך הפנמת גבישים לתאי אפיתל צינורי כליה, תאי MDCK (בצפיפות של 2 × 105 תאים/באר) נזרעו וגודלו בכל באר של 6-צלחת הבאר (Corning Inc.) למשך 48 שעות כדי להשיג חד-שכבתי מתמזגת. מונו-שכבת התא הודגרה עם גבישי COM המסומנים ב-FITC (1000 מיקרוגרם גביש/מ"ל מדיום) באינקובטור לח עם 5 אחוז CO2 ב-37 ◦C למשך שעה אחת. לאחר מכן, התאים נשטפו עם PBS והודגרו בתמיסת טריפסין-EDTA כדי לחסל גבישים לא מופנמים (הן נצמדים והן שאינם נדבקים). אחוז התאים עם גבישים מופנמים נכמת מתוך סך של 10,000 אירועים נרכשים באמצעות ציטומטר זרימה (BD Accuri C6) (BD Biosciences; סן חוזה, קליפורניה). התאים שהודגרו עם גבישי COM רגילים (לא מסומנים) שימשו לקביעה מראש של הרעש והסף לאות הקרינה החיובי. לאחר מכן נספרו התאים עם אותות הקרינה החיוביים והשתמשו בהם לחישוב אחוז כזה.

2.8. פלישת גבישי COM באמצעות בדיקת ECM

גבישי COM הוכנו כמתואר לעיל עבור מבחני צבירה של גבישים ומבחני הידבקות של תאי גביש. בדיקת פלישת קריסטל בוצעה על פי פרוטוקול שנקבע בעבר [38,39]. בקצרה, סך של 20 מיקרוגרם גבישי COM מצופים במאגר התגבשות (בקרה ריקה), DMSO (שליטה שלילית), אלבומין (Sigma-Aldrich) (שליטה חיובית) אודיוסמין(2.5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 או 160 ננומטר) נוספו ל-200 ul MEM. לאחר מכן, 200 ul של 0.3 pM Lys-plasminogen (Fitzgerald Industries international; Acton, MA) ב-PBS עורבבו והודגרו עם קומפלקס הקריסטל-חלבון ב-37 ◦C למשך שעה. הפלסמינוגן הלא קשור הושלך על ידי צנטריפוגה ב-2000 גרם למשך 5 דקות והגלולה נשטפה עם PBS פעם אחת. לאחר מכן, ערבבו 100 ul של 0.15 pM urokinase plasminogen activator (uPA) (Fitzgerald Industries International) ב-PBS עם קומפלקס קריסטל-חלבון-פלסמינוגן/פלסמין. התערובת נוספה לאחר מכן על גבי הג'ל המטריצה ​​בתוך תא ההגירה של ECM והודגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה של 24-שעות, התמיסה שנותרה בחלק העליון של תא הנדידה הוצאה באמצעות גזה או נייר טישו. גבישי ה-COM שנפלשו בתוך הג'ל המטריצה ​​צולמו לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופ אור עם מצב ניגודיות הפרעות דיפרנציאלית (DIC) (Nikon H600L). מרחק פלישת הגבישים נמדד ונמדד בממוצע לפחות מ-15 שדות בעלי הספק נמוך (LPF) בתוך אותו תא באמצעות תוכנת NIS Element D גרסה 4.11 (Nikon).

2.9. ניתוח סטטיסטי

כל הניסויים לעיל נעשו בשלושה עותקים (שלושה ניסויים עצמאיים) והנתונים הכמותיים מדווחים כממוצע ± SEM. השוואות מרובות בוצעו באמצעות אנליזה חד כיוונית של שונות (ANOVA) עם מבחן הפוסט-הוק של Tukey. מבחן מתאם פירסון בוצע כדי לקבוע את הקשר בין משתנים. כל הניתוחים הסטטיסטיים נעשו באמצעות תוכנת SPSS (גרסה 18) (IBM SPSS; Armonk, NY). ערך P נמוך מ-0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

3. תוצאות

3.1. השפעת דיוסמין על התגבשות COM

התגבשות היא אחד השלבים המוקדמים החיוניים שלכִּליָהתהליכי יצירת אבנים מכל הסוגים. לאחר 1-h התגבשות עם או בלידיוסמיןבריכוזים שונים (2.5, 5, 10, 20, 40, 80 או 160 ננומטר), נמדדו גודל ומספר גבישי COM וחושבה מסת גביש. חיץ התגבשות והמדלל DMSO שימשו כבקרות ריק ושליליות, בהתאמה. הנתונים הראו שכל המינונים (2.5-160 ננומטר) של disomin הפחיתו באופן משמעותי את גודל הגביש אך הגדילו את מספר הגבישים באופן תלוי מינון בהשוואה לביקורות ריקות ושליליות (איור 1A-1C). בהתאם למספר הגביש, מסת הגביש גדל בהתאם למינון (איור 1D). בסך הכל, נתונים אלה מצביעים על כך שדיוסמין מקדם התגבשות COM (ניאוקריסטלים).

3.2. השפעת דיוסמין על צמיחת גבישי COM

ההשפעה המודולטורית שלדיוסמיןעל צמיחת גבישי COM הוערכה על ידי מדידת שינוי בגודל הגביש (Δ גודל גביש) לאחר 60-דקות דגירה נוספת לאחר השלמת שלב ההתגבשות הראשוני, כאשר ניאו-גבישים נעדרו. התוצאות הראו שכל המינונים (2.5-160nM) של disomin הפחיתו באופן משמעותי את גודל הגביש Δ באופן תלוי מינון בהשוואה לביקורת הריקה והשלילית (איור 2). ממצאים אלו מצביעים על כך שדיוסמין מעכב את צמיחת גבישי COM.

3.3. השפעת דיוסמין על צבירת גבישי COM

בנוסף לצמיחת גבישים, צבירה של גבישים בודדים הנצמדים זה לזה בחוזקה היא שלב חשוב נוסף במהלךכִּליָהפתוגנזה של אבנים. הדרגה הגבוהה של צבירה גבישים עלולה להוביל בסופו של דבר להגדלת האבנים ולחסימה של לומן צינורי כליה קטן. השוואה עם פקדים ריקים ושליליים,דיוסמיןב-10-160nM מספר גדל בהתאם למינון של אגרגטים של גבישי COM (איור 3). תוצאות אלו מצביעות על כך שדיוסמין מקדם צבירה של גבישי COM.

Cistanche לתפקוד הכליות

3.4. השפעת דיוסמין על הידבקות תאי גבישי COM

שימור הגבישים הסיבתיים הוא אחד השלבים המכריעים עבורכִּליָההיווצרות אבנים וניתן לגרום להדבקה של תאי גביש המונעת את הוצאת הגבישים יחד עם יציאת השתן. לכן הערכנו את הפעילות המודולטורית שלדיוסמיןעל הידבקות תאי גביש COM. הנתונים חשפו שדיוסמין ב-5-160nM הפחית באופן משמעותי את יכולת ההדבקה של גבישי COM על תאי צינורי כליה באופן תלוי מינון בהשוואה לבקרות ריקות ושליליות (איור 4). נתונים אלה מצביעים על כך שדיוסמין מעכב את הידבקות תאי גביש COM.

3.5. השפעת דיוסמין על הפנמת גבישי COM לתאי צינורי כליה

לאחר הידבקות, כמה גבישי COM יכולים להיות מופנמים לתוך תאי הצינור הכליה ולגרום למספר תגובות תאיות עוקבות [37,40]. הפנמת קריסטל הוערכה על ידי שימוש בגבישי COM המסומנים ב-FITC וכומתה על ידי ציטומטריית זרימה. גבישי COM רגילים (ללא תיוג) שימשו להפחתת רעש טכני וכדי להבטיח שעוצמת הקרינה הייתה מאות FITC. בהשוואה לבקרות ריקות ושליליות, אחוז התאים עם גבישים מופנמים ירד באופן משמעותי על ידידיוסמיןב-10-160nM באופן תלוי מינון (איור 5). הממצאים מצביעים על כך שדיסומין מעכב הפנמת גבישי COM לתוך תאי צינורי כליה.

3.6. השפעת דיוסמין על פלישת גבישי COM דרך ECM

פלישת קריסטל דרך ECM היא תהליך פתוגני/הרסני במהלךכִּליָהפתוגנזה של אבנים שיכולה לעורר תגובות דלקתיות שונות ומפלים, ובכך להחמיר את מנגנוני המחלה. בחנו תופעה זו באמצעות פרוטוקול מבוסס המבוסס על פעילות פלסמינוגן-פלסמין של קומפלקס קריסטל-חלבון [38,39]. התוצאות הראו שכל המינונים של disomin (2.5-160nM) הגבירו באופן משמעותי את פלישת גבישי COM דרך ה-ECM באופן תלוי מינון (איור 6). מעניין,דיוסמיןב-160nM יכול לקדם את פלישת גבישי COM בהשוואה לאלבומין, שהוא המקדם החזק הידוע לחלישת גבישי COM [41] (איור 6). תוצאות אלו מצביעות על כך שדיוסמין מקדם מאוד פלישת גבישי COM דרך ה-ECM.

איור 1. אפקט שלדיוסמיןעל התגבשות COM. בדיקת התגבשות בוצעה עם נפח שווה (4 ul) של חיץ התגבשות (בקרה ריקה), DMSO (בקרה שלילית) או דיוסמין (2.5-160nM). (א): מורפולוגיה של קריסטל בכל מצב לאחר התגבשות 1- שעות. ההגדלה המקורית הייתה 400× עבור כל הלוחות. (ב): גודל קריסטל. (ג): מספר קריסטל. (ד): מסת קריסטל (ראה נוסחה 1 ב"חומרים ושיטות") נותחה מ-100 גבישים לפחות ב-15 HPFs. כל פס מייצג ממוצע ±SEM של הנתונים שנגזרו מ-3 ניסויים עצמאיים. *=עמ'< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" dmso.="">

איור 2. אפקט שלדיוסמיןעל צמיחת גבישי COM. בדיקת צמיחת גבישים בוצעה לאחר השלמת ההתגבשות (כדי למנוע התגבשות ניאו) עם נפח שווה (4 ul) של חיץ התגבשות (בקרת ריק), DMSO (בקרה שלילית) או דיוסמין (2.5-16 0nM). (א): מורפולוגיה של קריסטל בכל מצב ב-T0 ו-T60. ההגדלה המקורית הייתה 400 × עבור כל הלוחות. (B)-(J): היסטוגרמות של גדלי גבישים שנמדדו מגבישים בודדים ב-T0 ו-T60 בכל קבוצה. (K): Δ גודל גביש (ראה נוסחה 2 ב"חומרים ושיטות") נותח מ-100 גבישים לפחות ב-15 HPFs. כל פס מייצג ממוצע ± SEM של הנתונים שנגזרו מ-3 ניסויים עצמאיים. *= p < 0.05="" לעומת="" שליטה="" ריקה;="" #="p">< 0.05="" לעומת="">

איור 3. אפקט שלדיוסמיןעל צבירה גבישי COM. בדיקת צבירה קריסטלית בוצעה עם נפח שווה (4 ul) של חיץ התגבשות (בקרה ריקה), DMSO (בקרה שלילית) או דיוסמין (2.5-160nM). (א): מיקרוגרפים של גבישי ה-COM המצטברים (מסומנים עם עיגולים מנוקדים). ההגדלה המקורית הייתה 400 × לכל הלוחות. (ב): מספר אגרגטים של הגבישים נספר מ-15 HPFs אקראיים לפחות בכל באר. כל פס מייצג ממוצע ± SEM של הנתונים שנגזרו מ-3 ניסויים עצמאיים. *=עמ'< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="" dmso.="">

איור 4. השפעתדיוסמיןעל הידבקות תאי גביש COM. בדיקת הידבקות תאי גביש בוצעה עם נפח שווה (4 ul) של חיץ התגבשות (בקרה ריקה), DMSO (בקרה שלילית) או דיוסמין (2.5-160nM). (א): מיקרוגרפים של הגבישים הנותרים שנדבקו בחוזקה על שכבת התאים לאחר הסרת הגבישים הלא קשורים על ידי שטיפות נמרצות עם PBS. ההגדלה המקורית הייתה 200 × עבור כל הלוחות. (ב): מספר הגבישים המודבקים נספר מ-15 שדות אקראיים לפחות בכל באר. כל פס מייצג ממוצע ±SEM של הנתונים שנגזרו מ-3 ניסויים עצמאיים. *= עמ'<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p"><0.05 vs.="">

איור 5. אפקט שלדיוסמיןעל הפנמת גבישי COM לתאי צינורי כליה. בדיקת הפנמת גבישים בוצעה באמצעות גבישי COM המסומנים ב-FITC (FITC-COM), בעוד שגבישי COM הפשוטים (שלא מסומנים) שימשו להפחתת רקע/רעש. הבדיקה בוצעה עם נפח שווה (4 ul) של חיץ התגבשות (בקרה ריקה), DMSO (בקרה שלילית) או דיוסמין (2.5-160nM). (א): ניתוח זרימה ציטומטרית נקודה-מגרש של גודל (ציר y) ועוצמת הקרינה FITC (ציר x) של התאים לאחר הסרת גבישים לא מופנמים עם 0.1 אחוז טריפסין/2.5mM EDTA. (ב): אחוז התאים עם גבישי COM מופנמים עם תווית FITC. כל פס מייצג ממוצע ± SEM של הנתונים שנגזרו מ-3 ניסויים עצמאיים. *= עמ'<0.05 vs.="" fitc-com="" +="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" fitc-com="" +="" dmso.="">

איור 6. השפעתדיוסמיןעל פלישת גבישי COM דרך ה-ECM. פלישת קריסטל באמצעות בדיקת ECM בוצעה באמצעות גבישי COM מצופים במאגר התגבשות (בקרה ריקה), DMSO (שליטה שלילית), אלבומין (בקרה חיובית) או דיוסמין (2.5-160nM). (א): מיקרוגרפים של גבישי ה-COM פלשו או נדדו דרך תא ההגירה של ECM. ההגדלה המקורית הייתה 100 × עבור כל הלוחות. (ב): מרחק פלישת קריסטל נמדד מלפחות 15 LPFs אקראיים בכל חדר. כל פס מייצג ממוצע ±SEM של הנתונים שנגזרו מ-3 ניסויים עצמאיים. *= עמ'<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="">

4. דיון

מחלת אבנים בכליות נגרמת על ידי היווצרות של אבנית בתוךכִּליָהומערכת האגן. תהליכי היווצרות אבנים בכליות נפוצים כוללים התגבשות COM, צמיחה, אגרגציה, שמירה על ידי הידבקות של תאי גביש ופלישה דרך האינטרסטיטיום הכלייתי העשיר ב-ECM [21,22]. ישנם מספר ניסיונות למנוע מחלה זו באמצעות מגוון תרופות ו/או תוספי תזונה. שורות רבות של עדויות עדכניות דיווחו שלפלבנואידים, גליקוזידים של פלבון ותרכובות אחרות המופקות מפירות הדר עשויות להיות השפעות מניעה על מחלות אבנים בכליות והפרעות אחרות [23-25]. בין אלו,דיוסמין, נגזרת טבעית של פלבון גליקוזיד והספרידין המצוי בעיקר בפירות הדר [1,2], הוצע למלא תפקיד מונע מפני פציעות ונזקים שלכִּליָהרקמה [13,42]. יתרה מזאת, תפקידו האנטי-אורוליתיאזיס דווח בכמה מחקרים קודמים באמצעות מודלים של בעלי חיים [26,27]. עם זאת, ההשפעות המועילות והמנגנונים הבסיסיים של דיוסמין במניעת אבנים בכליות נותרו מעורפלים. לפיכך בחנו את הפעילות המודולטורית של דיוסמין על גבישי COM. הניתוחים השיטתיים נעשו בשלבים שונים של COMכִּליָההיווצרות אבנים, כולל התגבשות, צמיחת גבישים, אגרגציה, הידבקות של תאי גביש, הפנמה לתאי צינורי כליה ופלישה דרך ECM.

לאחר צריכת פומי שלדיוסמין, רמת הפלזמה שלו בבני אדם נעה בין {{0}}.5 ל-200ng/ml (או 0.8-300nM) [43,44]. ריכוז הפלזמה המקסימלי (Cmax) הוא בערך 50ng/ml (או 85nM) [43,44]. לכן, המינונים של דיוסמין בשימוש במחקר הנוכחי שלנו (2.5-160nM) היו בטווח הרלוונטי פרמקולוגית לפרמקוקינטיקה שלו. מכיוון ש-DMSO שימש כמדלל להמסה מלאה של דיוסמין לפי המלצה, DMSO שימש כביקורת שלילית במחקר זה בנוסף לבקרה הריקה כדי להבטיח שלא היו השפעות מהמדלל עצמו שעלולות להפריע לפירוש הנתונים. בכל המבחנים, הנתונים הראו שלא נצפו השפעות משמעותיות מ-DMSO וכל הנתונים הכמותיים שנגזרו מהביקורת השלילית היו דומים לאלו של הביקורת הריקה.

בדיקת התגבשות COM גילתה כי כל הריכוזים שלדיוסמין(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 ו-160nM) יכולים להפחית את גודל גבישי ה-COM, אך מצד שני, להגדיל את מספר הגבישים. מכיוון שמסת הגביש היא התוצר הסופי של גודל הגביש וגם של מספר והוא רלוונטי יותר לשקף את מידת התגבשות ה-COM, אז הערכנו אם דיוסמין השפיע על אינדקס הגביש הזה. הנתונים הראו שלכל הריכוזים של דיוסמין הייתה השפעה מקדמת על מסת הגביש COM, בהתאם לנתונים על מספר הגבישים. לאחר התגבשות, גבישי COM יכולים לצמוח עוד יותר לגודל הגדול יותר עבור השלב הבא שלכִּליָההיווצרות אבנים.

בניגוד להתגבשות, דיוסמין בכל הריכוזים הפגין את ההשפעה המעכבת על צמיחת גבישי COM באופן תלוי מינון. כמה מחקרים קודמים דיווחו שניתן להגביר את המסיסות של גבישי CaOx על ידי נגזרות של הידרוקסיאנטרקינונים עם גליקוזילציה [45]. בנוסף, הנוכחות של סוכרים בתרכובות ביו-אקטיביות כאלה יכולה להיקשר ליון סידן חופשי, אולי בגלל קבוצות ההידרוקסיל במבנה המולקולרי, ובכך לעכב את היווצרות גבישי CaOx [45,46]. דיוסמין עשוי גם להשפיע על המעבר של יוני הסידן והאוקסלט הממוססים לחלקיקים הגבישים COM בנוזל הצינורי הכלייתי בתהליך התגבשות COM המבוסס על מנגנון זה.

עם זאת, צבירת גבישי COM קודמה ב-10-160nMדיוסמין, מה שמרמז על יכולתו של דיוסמין לפעול כמקשר או מולקולה דביקה לגיוס גבישים בודדים שייקשרו יחד ליצירת אגרגטים גבישים. כריכה זו גורמת גם להתקדמות של גשרים דביקים בין גבישים בודדים ויכולה לגרום להיווצרות מבנה גדול של גבישי COM, אשר תורמים בקלות להשקעת אבן נידוס בתוךכִּליָה[32].

שימור גבישי COM באמצעות הידבקות של גבישים על משטחי תאים צינוריים של הכליה הוגדר כשלב חשוב נוסף להיווצרות אבנים בכליות [47]. הנתונים שלנו גילו שדיוסמין יכול להפחית את יכולת ההדבקה של גבישי COM להיקשר עם משטחים אפיקיים של תאי צינורות כליה MDCK. כמה מחקרים קודמים הראו שגליקואמינוגליקנים (תרכובות פוליסכרידים) המצופים על גבישי CaOx או מתבטאים על תאי צינורי כליה יכולים להפריע ליכולת ההדבקה של גבישי CaOx על תאי צינורי כליה [48]. בנוסף, הביטוי של קולטני גביש על תאים צינוריים של הכליה הוא אחד המנגנונים המכריעים הקובעים הידבקות תאי גביש [21]. בעוד שגבישי CaOx גורמים לפציעה של ממברנות אפיקליות, במיוחד מיקרו-ווילי, חלק מהפוליפנולים כגון epigallocatechin gallate (EGCG) יכולים למנוע הידבקות תאי גביש ופגיעה תאית [49]. יתרה מכך, חומר פלבנואיד בתמציות צמחים שונות דווח בעבר כמגביר את רמת ה-pH בשתן, מה שמוביל לעיכוב של הידבקות תאי גביש [50,51]. אוּלַי,דיוסמיןעשוי גם להחליש פגיעה סלולרית כזו הנגרמת על ידי COM, ובכך להפחית את הידבקות תאי גביש.

הוכחה שהפנמת גבישי COM מופיעה בעיקר על ידי אנדוציטוזיס דרך מסלול מקרופינוציטוזיס בתיווך ציטושלד אקטין [40]. פלבנואידים כגון quercetin דווחו כמשפיעים על שלד ציטו של אקטין הנדרש למקרופינוציטוזיס [52,53]. הממצאים שלנו הראו שדיוסמין הפחית משמעותית את היכולת של תאי MDCK להפנים גבישי COM. השפעה מעכבת כזו של דיוסמין עשויה להיות קשורה להרכבה או ארגון של ציטושלד אקטין בתוך התאים שמשפיע ישירות על מסלול המקרופינוציטוזיס [54,55].

לאחר ההפנמה, גבישי ה-COM התפרקו על ידי אנדוליזוזומים וכתוצאה מכך עלייה של יוני סידן ואוקסלט חופשיים באינטרסטיטיום הכלייתי [37]. עלייה כזו ביוני סידן ואוקסלט יכולה להוביל לנאו-התגבשות COM באינטרסטיטיום הכלייתי [56,57]. בנוסף, הנוכחות של גבישי COM אינטרסטיציאליים עשויה לנבוע מפגמים של מחסומי חיבור הדוק ומחסומי הידבקות פר-תאיים, וכתוצאה מכך לחדירות פר-תאית מוגברת וטרנסלוקציה של גבישים [58-60]. לאחר מכן, גבישים אלה יכולים לפלוש לאינטרסטיטיום הכלייתי דרך ה-ECM ובהמשך לעורר מספר תגובה דלקתית ונזק לרקמות [58-60]. במחקר זה, ראינו שהפלישה של גבישי COM דרך תא ההגירה של ECM נגרמה על ידי כל הריכוזים של דיוסמין. דיוסמין עשוי להיקשר למשטחי הגביש COM ולקיים אינטראקציה עם מערכת פלסמינוגן-פלסמין שהניעה את נדידת הגבישים בתא ההגירה של ECM [38,39].

Cistanche עבור כליות

כידיוסמיןגרמו הן להשפעות מעכבות והן לקידום על תהליכים שונים של יצירת אבני COM, לכן קבענו את הקשר ביניהם באמצעות מבחן המתאם של פירסון. ניתוח המתאם גילה שמספר הגבישים נמצא בקורלציה הפוכה הן עם גודל הגביש והן עם צמיחת הגביש (גודל גביש Δ) (איור 7A ו-B). גודל הגביש נמצא בקורלציה רבה עם צמיחת הגביש (איור 7C) אך מתאם הפוך למסת הגביש (איור 7D). לבסוף, מסת הגביש נמצאה בקורלציה חזקה הן עם מספר הגביש והן לצבירה של גבישים (איור 7E ו-F). מניתוח המתאם, הנתונים מצביעים על כך שמספר הגביש ומסת הגביש רלוונטיים יותר לשקף התגבשות מאשר גודל הגביש (איור 7A, D ו-E). בנוסף, גודלם של ניאו-גבישים במהלך התגבשות קשורים לצמיחת הגבישים שנוצרו מראש (איור 7C), בעוד שמידת ההתגבשות (כפי שמשתקף במספר הגבישים ומסת הגבישים) קשורה קשר הדוק לדרגת צבירה של גבישים (איור 7E ו- ו). עם זאת, מתאמים אלה הם ככל הנראה ספציפיים להשפעות הדיוסמין, בעוד שלאפקטים ממאפננים אחרים עשויים להיות אותם מתאמים או לא. לדוגמה, פיברונקטין מקטין את מסת הגביש ומעכב את צמיחת הגבישים, אך מקדם צבירה של גבישים [31]. בנוסף, Escherichia coli בת קיימא שלמה מגדילה את גודל הגביש ומסתה אך אין לה השפעות על מספר הגבישים [33]. נתונים אלה מצביעים על כך שהמתאמים בין מבחני גבישי COM שונים אינם אוניברסליים עבור כל המאפננים.

לבסוף, סיכמנו את התוצאות שהתקבלו ממבחנים שונים ומשלבים אותן עם המנגנונים הפתוגניים שלכִּליָהמחלת אבנים (ראה שרטוטים באיור 8). מניתוח המתאם, דיוסמין מקדם התגבשות (איור 8A). בין התגבשות לצמיחת גבישים,דיוסמיןשומר על איזון טוב על ידי קידום התגבשות אך, מצד שני, עיכוב צמיחת גבישים (איור 8B). לגבי כל ההשפעות על גבישי COM בלבד (ללא התחשבות בתאים וב-ECM שמתערבים גם הם), הפעילות המעודדת של דיוסמין בולטת יותר מהפעילות המעכבת שלו על גבישי COM שכן היא מקדמת גם התגבשות וגם צבירה של גבישים, אך מעכבת רק את צמיחת הגבישים ( איור 8C). למרות שההתגבשות גדלה, גודל הגביש פוחת וקשור לעיכוב הצמיחה (איור 7C). נתונים אלה תואמים את התוצאות שדווחו על ידי Kavanagh et al. [61–63], המדגים כי הגברת ההתגבשות מובילה לירידה של רווית העל של יוני סידן ואוקסלט בתמיסה, ובכך מפחיתה את הצמיחה. עם זאת, צמיחת גבישים אינה הגורם היחיד הקובע אתכִּליָהפתוגנזה של אבנים [64], במיוחד כאשר מסת הגביש מציפה וקשורה לעלייה בצבירה של גבישים (איור 7F) שיכולה להגביר את הסיכוי של חומרי גביש להיתקע במקטעים צינוריים קטנים (בהשערה תוך-צינורית), ובכך להגדיל הסיכוי להיווצרות אבנים. יתרה מכך, מחקר קודם הראה את הנתונים בקנה אחד עם הממצאים שלנו, מה שמצביע על כך שהעלייה במספר הגבישים קשורה לעלייה בצבירה של גבישים ולהגדלת האבן [63].

איור 7. ניתוח מתאמים. (A)–(F): מתאמים בין מספר גבישי COM, גודל גביש, גודל גביש Δ, מסת גביש ומספר אגרגטים גבישים נותחו על ידי מבחן המתאם של פירסון.

איור 8. סכמטיקה המסכמת את ההשפעות המודולטוריות שלדיוסמיןב-COMכִּליָהתהליכי יצירת אבנים. (א): השפעות של דיוסמין על התגבשות COM. (ב): השפעות של דיוסמין על התגבשות COM וצמיחת גבישים. (C): השפעות של דיוסמין על התגבשות COM, צמיחה וצבירה. (ד): השפעות של דיוסמין על כל תהליכי היווצרות אבנים בכליות COM.

כאשר בוחנים אינטראקציות עם תאי צינורי כליה ו-ECM, התמונה הגלובלית של ההשפעות הכפולות שלדיוסמיןב-COM היווצרות אבן בכליות הופכת ברורה הרבה יותר (איור 8D). דיוסמין מעכב הידבקות גבישים-תא, ובכך מפחית את הפנמת הגבישים לתוך התאים. ניתן להסביר זאת שלגודל הקטן יותר של גבישי COM יש פחות יכולת הדבקה לקשור את התאים הצינוריים הכלייתיים בהשוואה לגדולים יותר כפי שדווח במחקר האחרון שלנו [34] ומחקר קודם של קבוצה אחרת [65]. יכולת ההדבקה הפחותה של גבישי COM הקטנים יותר נובעת מכוח ההדבקה המופחת שלהם למשטח התא ומספר קטן יותר של קולטני גבישי COM הקשורים אליהם כפי שנקבע על ידי מיקרוסקופיה של כוח אטומי וניתוח פרוטאומה, בהתאמה [34]. דיוסמין גם מעכב הפנמת גבישים. שימו לב שתהליך ההפנמה הוא חרב פיפיות הדורשת פרשנות מדוקדקת. הפנמה או אנדוציטוזיס באחד ממנגנוני ההגנה שהתאים השתמשו בהם לחיסול גבישים על ידי אנדוליזומים. עם זאת, השפלה של הגבישים השלמים מייצרת יוני סידן ואוקסלט חופשיים שיכולים לעבור מהתא התוך תאי לאינטרסטיטיום הכלייתי, שם הם יכולים ליצור ניאו-גבישים [56,57]. מצד שני, דיוסמין מעודד פלישת גבישים דרך ה-ECM, שהוא אחד המנגנונים החשובים לפתוגנזה של אבנים בכליות (במיוחד במודל הרובד של רנדל) [58-60]. בסך הכל, איור 8D מסכם את כל ההשפעות המודולטוריות הכפולות של דיוסמין על COMכִּליָהתהליכי יצירת אבנים. יש לציין שלא ניתן לחשב במדויק את האיזון בין ההשפעות המקדמות והמעכבות הללו (בניגוד למשוואה מתמטית). יתר על כן, ישנם מספר גורמים אנדוגניים ואקסוגניים אחרים שיכולים גם להתערב בתהליכי יצירת האבן. לבסוף, דיוסמין גם מציג מספר השפעות עקיפות על היווצרות אבנים בכליות, כולל תכונות נוגדות החמצון והאנטי דלקתיות שלו [5,6] שיש לקחת בחשבון. לכן, התוצאה הסופית של ההשפעות המודולטוריות הכפולות הללו שלדיוסמיןב-COMכִּליָההיווצרות אבנים זקוקה לחקירה נוספת in vivo ומחקר פרוספקטיבי בקבוצה גדולה.

5. מסקנות

לסיכום, אנו מדווחים כאן על ההשפעות הכפולות של דיוסמין על אפנון גבישי COM באופן תלוי מינון. בעוד שהוא מעכב צמיחת גבישי COM, הידבקות תאי גביש והפנמה לתאי צינורי כליה,דיוסמיןמקדם התגבשות COM, צבירה ופלישה דרך ה-ECM. לכן, תפקידו האנטי-אורוליתיאזיס מוטל בספק ויש לנקוט זהירות לגבי השימוש בו במחלת אבנים בכליות.

הצהרת תרומת הכותבים של CrediT

Supaporn Khamchun: מושג, מתודולוגיה, תוכנה, אימות, ניתוח פורמלי, חקירה, אצור נתונים, כתיבה - טיוטה מקורית, ויזואליזציה, Sunisa Yoodee: מושג, מתודולוגיה, תוכנה, אימות, ניתוח פורמלי, חקירה, אצור נתונים, כתיבה - טיוטה מקורית, ויזואליזציה, בקר ב-Thongboonkerd: מושג, מתודולוגיה, תוכנה, אימות, משאבים, כתיבה - סקירה ועריכה, פיקוח, ניהול פרויקטים, רכישת מימון.

הצהרת ניגוד אינטרסים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

אנו אסירי תודה על הסיוע הטכני של Kittiya Suwannakud. עבודה זו נתמכה על ידי המשרד הלאומי למחקר ומדיניות חדשנות במדע להשכלה גבוהה (NXPO) באמצעות PMU-B וקרן המחקר של תאילנד (IRN60W0004). VT נתמך גם על ידי מענק "Chalermhrakiat", הפקולטה לרפואה בית החולים Siriraj.

הפניות

[1] A. Bogucka-Kocka, M. Wozniak, M. Feldo, J. Kockic, K. Szewczyk,דיוסמין– טכניקות בידוד, קביעה בחומר צמחי ובתכשירים פרמצבטיים ושימוש קליני, נאט. לְדַרבֵּן. Commun. 8 (2013) 545–550.

[2] Y. Zheng, R. Zhang, W. Shi, L. Li, H. Liu, Z. Chen, L. Wu, מטבוליזם ופעילויות פרמקולוגיות של התרכובת המועילה לבריאות הטבעית diosmin, Food Funct. 11 (2020) 8472–8492.

[3] MR Cesarone, G. Belcaro, L. Pellegrini, A. Ledda, G. Vinciguerra, A. Ricci, A. Di Renzo, I. Ruffini, G. Gizzi, E. Ippolito, F. Fano, M. Dugall. , G. Acerbi, U. Cornelli, M. Hosoi, M. Cacchio, Venoruton vs Daflon: הערכה של השפעות על איכות החיים באי ספיקת ורידים כרונית, Angiology 57 (2006) 131-138.

[4] KA Lyseng-Williamson, CM Perry, Micronised Purified flavonoid fraction: סקירה של השימוש בו באי ספיקה ורידית כרונית, כיבים ורידים וטחורים, Drugs 63 (2003) 71-100.

[5] AS Shalkami, M. Hassan, AG Bakr, Anti-inflammatory, the antioxidant and anti-apoptotic activity of diosmin in colitis ulcerative colitis הנגרמת על ידי חומצה אצטית, Hum. Exp. טוקסיקול. 37 (2018) 78–86.

[6] M. Berkoz, Diosmin מדכא את המתווכים הפרה-דלקתיים במקרופאגים RAW264.7 המושרים על ידי ליפופוליסכריד באמצעות מסלולי אותות NF-kappaB ו-MAPKs, Gen. Physiol. ביופיס. 38 (2019) 315–324.

[7] M. Rajasekar, K. Suresh, K. Sivakumar, Diosmin גורמים לאפופטוזיס באמצעות אפנון של איתות STAT-3 ב-7,12 dimethylbenz(a)anthracene induced harmster buccal pouch carcinogenesis, Biomed. פארם. 83 (2016) 1064–1070.

[8] A. Lewinska, J. Adamczyk-Grochala, E. Kwasniewicz, A. Deregowska, M. Wnuk, Diosmin-induced senescence, apoptosis and autophagy בתאי סרטן השד בסטטוס p53 ופעילות ERK שונה, Toxicol. Lett. 265 (2017) 117–130.

[9] AC Pushkaran, V. Vinod, M. Vanuopadath, SS Nair, SV Nair, AK Vasudevan, R. Biswas, CG Mohan, Combination of repurposed drug diosmin with amoxicillin- clavulanic acid גורם לעיכוב סינרגטי של גדילת mycobacterial, Sci. נציג 9 (2019) 6800.

[10] CC Hsu, MH Lin, JT Cheng, MC Wu, פעולה אנטי-היפרגליקמית של דיוסמין, פלבנואיד הדרים, נגרמת באמצעות בטא אנדורפין אנדוגני בחולדות סוכרתיות דמויות I, Clin. Exp. פארם. פיזיול. 44 (2017) 549–555.

[11] O. Senthamizhselvan, J. Manivannan, T. Silambarasan, B. Raja,דיוסמיןטיפול מקדים משפר את תפקוד הלב ומדכא מתח חמצוני בלב חולדה לאחר איסכמיה/פרפוזיה חוזרת, Eur. ג'יי פארם. 736 (2014) 131–137.

[12] N. Tong, Z. Zhang, Y. Gong, L. Yin, X. Wu, Diosmin מגן על רשתית החולדות מפני פציעת איסכמיה/פרפוזיה חוזרת, J. Ocul. פארם. ת'ר. 28 (2012) 459–466.

[13] AE Elhelaly, G. AlBasher, S. Alfarraj, R. Almeer, EI Bahbah, MMA Fouda, SG Bungau, L. Aleya, MM Abdel-Daim, Protective effects of hesperidin and diosmin against aacrylamide-induced hever, kidney, ונזק חמצוני מוחי בחולדות, Environ. Sci. לזהם. מילון Int. 26 (2019) 35151–35162.

[14] C. Thongprayoon, AE Krambeck, AD Rule, Determining the true last ofכִּליָהמחלת האבנים, נאט. הכומר נפרול. 16 (2020) 736–746.

[15] K. Bishop, T. Momah, J. Ricks, Nephrolithiasis, Prim. Care 47 (2020) 661–671.

[16] A. Viljoen, R. Chaudhry, J. Bycroft, Renal stones, Ann. קלינ. Biochem 56 (2019) 15–27.

[17] PM Ferraro, R. Marano, A. Primiano, J. Gervasoni, M. Bargagli, G. Rovere, PF Bassi, G. Gambaro, הרכב אבן והסתיידויות כלי דם בחולים עם נפרוליתיאזיס, J. Nephrol. 32 (2019) 589–594.

[18] ג' שוברט, ניתוח אבן, Urol. מילון 34 (2006) 146–150.

[19] A. Vinaiphat, S. Aluksanasuwan, J. Manissorn, S. Suthimethakorn, V. Thongboonkerd, Response of renal tubular cells to differential and doses of calcium oxalate crystals: integrative proteome network analysis and functional researchers, Proteomics 17 (2017) ), 1700192.

[20] P. Peerapen, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, ניתוח רשת חלבון ומחקרים פונקציונליים של ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי סידן אוקסלט בתאי אפיתל צינוריים של הכליה, Proteomics 18 (2018), 1800008.

[21] KP Aggarwal, S. Narula, M. Kakkar, C. Tandon, Nephrolithiasis: מנגנון מולקולרי של היווצרות אבנים בכליות והתפקיד הקריטי שמילאו מאפננים, Biomed. מילון Int. 2013 (2013), 292953.

[22] VN Ratkalkar, JG Kleinman, Mechanisms of formation stone, Clin. כומר עצם כורה. Metab. 9 (2011) 187–197.

[23] X. Zeng, Y. Xi, W. Jiang, Protective roles of flavonoids and flavonoid plant extracts against urolithiasis: a review, Crit. Rev. Food Sci. נוטר. 59 (2019) 2125–2135.

[24] MC Nirumand, M. Hajialyani, R. Rahimi, MH Farzaei, S. Zingue, SM Nabavi, A. Bishyee, Dietary Plants for the prevention and management ofכִּליָהאבנים: עדויות פרה-קליניות וקליניות ומנגנונים מולקולריים, Int. י.מול. Sci. 19 (2018) 765.

[25] S. Ahmed, MM Hasan, H. Khan, ZA Mahmood, S. Patel, The mechanistic insight of polyphenols in calcium oxalate urolithiasis mitigation, Biomed. פארם. 106 (2018) 1292–1299.

[26] VV Prabhu, D. Sathyamurthy, A. Ramasamy, S. Das, M. Anuradha, S. Pachiappan. ביול. 54 (2016) 1513–1521.

[27] A. Noorafshan, S. Karbalay-Doust, F. Karimi,דיוסמיןמפחית את שקיעת סידן אוקסלט וניוון רקמות בנפרוליתיאזיס בחולדות: מחקר סטריאולוגי, קוריאני J. Urol. 54 (2013) 252–257.

[28] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Chutipongtanate, גורמים הקובעים סוגים ומורפולוגיות של גבישי סידן אוקסלט: ריכוזים מולרים, חציצה, pH, ערבוב וטמפרטורה, Clin. צ'ים. Acta 367 (2006) 120–131.

[29] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Sinchaikul, ST Chen, Proteomic analysis of calcium oxalate monohydrate crystal-induced cytotoxicity in distal renal tubular cells, J. Proteome Res. 7 (2008) 4689–4700.

[30] P. Amimanan, R. Tavichakorntrakool, K. Fong-ngern, P. Sribenjalux, A. Lulitanond, V. Prasongwatana, C. Wongkham, P. Boonsiri, WJ Umka, V. Thongboonkerd, Longation factor Tu on Escherichia coli מבודד משתן של חולי אבנים בכליות מקדם צמיחת גבישי סידן אוקסלט והצטברות, Sci. רפ' 7 (2017) 2953.

[31] S. Khamchun, K. Sueksakit, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Modulatory effects of fibronectin על התגבשות קלציום אוקסלט, צמיחה, צבירה, הידבקות על תאי צינורית כליה ופלישה דרך מטריצה ​​חוץ-תאית, J. Biol. אינורג. Chem. 24 (2019) 235–246.

[32] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, הגדרה וניתוחים שיטתיים של מדדי צבירה להערכת מידת צבירה גבישי סידן אוקסלט, חזית. Chem. 5 (2017) 113.

[33] R. Kanlaya, O. Naruepantawart, V. Thongboonkerd, Flagellum אחראים לקידום ההשפעות של Escherichia coli בר-קיימא על התגבשות סידן אוקסלט, צמיחת גבישים וצבירת גבישים, Front. Microbiol 10 (2019) 2507.

[34] P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Differential bound proteins and adhesive capabilities of calcium oxalate monohydrate crystals with each sizes, Int. ג'יי ביול. מקרומול. 163 (2020) 2210–2223.

[35] K. Fong-ngern, K. Sueksakit, V. Thongboonkerd, Surface heat shock protein 90 משמש כקולטן פוטנציאלי לקריסטל סידן אוקסלט על קרום אפיקלי של תאי אפיתל צינורי כליה, J. Biol. אינורג. Chem. 21 (2016) 463–474.

[36] S. Chaiyarit, S. Mungdee, V. Thongboonkerd, תיוג לא רדיואקטיבי של גבישי סידן אוקסלט לחקירות של אינטראקציה והפנמה של תאים גבישים, אנאל. שיטות 2 (2010) 1536–1541.

[37] S. Chaiyarit, N. Singhto, V. Thongboonkerd, Calcium oxalate monohydrate crystals המופנמים לתוך תאי צינורי כליה מתכלים ומומסים על ידי אנדוליזוזומים, Chem. ביול. אינטראקציה. 246 (2016) 30–35.

[38] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, מבחן חדשני להערכת השפעות קידום של חלבונים על פלישת גבישי סידן אוקסלט דרך מטריצה ​​חוץ-תאית המבוססת על פעילות פלסמינוגן/פלסמין, Talanta 101 (2012) 240-245.

[39] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, גבישי סידן אוקסלט הגבירו את הפרשת האנולאז-1 מתאי צינורי כליה אשר שיפרו לאחר מכן את פלישת הגבישים והמונוציטים דרך interstitium כלייתי, Sci. נציג 6 (2016) 24064.

[40] R. Kanlaya, K. Sintiprungrat, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Macropinocytosis הוא המנגנון העיקרי לאנדוציטוזיס של גבישי סידן אוקסלט לתוך תאי צינורית כליה, Cell Biochem. ביופיס. 67 (2013) 1171–1179.

[41] S. Sassanarakkit, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, StoneMod: מסד נתונים עבורכִּליָהחלבונים מווסתים אבן עם עדויות ניסיוניות, Sci. נציג 10 (2020) 15109.

[42] G. Eraslan, ZS Sarica, LC Bayram, MY Tekeli, M. Kanbur, M. Karabacak, The effects of diosmin on aflatoxin-induced כבד וכליות, Environ. Sci. לזהם. מילון Int. 24 (2017) 27931–27941.

[43] R. Russo, D. Chandradhara, N. De Tommasi, Comparative bioavailability of twoדיוסמיןניסוחים לאחר מתן פומי למתנדבים בריאים, מולקולות 23 (2018) 2174.

[44] JQ Silveira, TB Cesar, JA Manthey, EA Baldwin, J. Bai, S. Raithore, Pharmacokinetics of flavanone glycosides לאחר בליעה של מנות בודדות של מיץ תפוזים סחוט טרי לעומת מיץ תפוזים מעובד מסחרית בבני אדם בריאים, J. Agric . Food Chem. 62 (2014) 12576–12584.

[45] A. Frackowiak, P. Skibinski, W. Gawel, E. Zaczynska, A. Czarny, R. Gancarz, Synthesis of glycoside derivatives of hydroxyanthraquinone with יכולת להתמוסס ולעכב את היווצרותם של גבישים של סידן אוקסלט. תרכובות פוטנציאליות בטיפול באבנים בכליות, Eur. J. Med. Chem. 45 (2010) 1001–1007.

[46] F. Grases, J. Perello, B. Isern, RM Prieto, Study of myo-inositol hexaphosphate-based cream to prevent dystrophic calcinosis cutis, Br. ג'יי דרמטול. 152 (2005) 1022–1025.

[47] V. Thongboonkerd, Proteomics of crystal-cell interactions: מודל לחקר אבנים בכליות, Cells 8 (2019) 1076.

[48] ​​CF Verkoelen, שימור קריסטל במחלת אבנים בכליות: תפקיד מכריע עבור ה-glycosaminoglycan hyaluronan? ריבה. Soc. נפרול. 17 (2006) 1673–1687.

[49] K. Fong-ngern, A. Vinaiphat, V. Thongboonkerd, Microvillar injury in renal tubular epithelial cells הנגרמת על ידי גביש סידן אוקסלט והתפקיד המגן של epigallocatechin-3-gallate, FASEB J. 31 (2017) 120 –131.

[50] J. Zhou, J. Jin, X. Li, Z. Zhao, L. Zhang, Q. Wang, J. Li, Q. Zhang, S. Xiang, Total flavonoids of Desmodium styracifolium מחליש את היווצרות הידרוקסי- Urolithiasis של סידן אוקסלט המושרה על ידי L-proline בחולדות, Urolithiasis 46 (2018) 231-241.

[51] J. Manissorn, K. Fong-ngern, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Evaluation Systematic for the effects of urine pH on crystallization calcium oxalate, crystal-cell and internalization into cell tubular renal tubular, Sci. נציג 7 (2017) 1798.

[52] S. Cui, J. Qian, P. Bo, Effect Inhibitive on phagocytosis of Candida albicans המושרה על ידי טיפול מקדים עם quercetin באמצעות התערבות ציטושלד אקטין, J. Tradit. סַנְטֵר. Med. 33 (2013) 804–809.

[53] S. Cui, Q. Wu, J. Wang, M. Li, J. Qian, S. Li, Quercetin מעכב נדידת מקרופאגים הנגרמת על ידי LPS על ידי דיכוי מסלול iNOS/FAK/paxillin ומווסת שלד הציטו, הדבקות התא. . מיגר. 13 (2019) 1–12.

[54] Y. Li, WG Gonzalez, A. Andreev, W. Tang, S. Gandhi, A. Cunha, D. Prober, C. Lois, ME Bronner, מיחזור ממברנות בתיווך מקרופינוציטוזיס מניע את נדידת הציצה העצבית על ידי אספקת F- אקטין ללמליפודיום, פרוק. נאטל. אקד. Sci. ארה"ב 117 (2020) 27400–27411.

[55] H. Inaba, K. Yoda, H. Adachi, The F-actin-binding RapGEF GflB נדרש עבור מקרופינוציטוזיס יעיל ב-Dictyostelium, J. Cell Sci. 130 (2017) 3158–3172.

[56] א.חאן, שכיחות, מנגנונים פתופיזיולוגיים וגורמים המשפיעים על אורוליתיאזיס, Int. אורול. נפרול. 50 (2018) 799–806.

[57] AP Evan, EM Worcester, FL Coe, J. Williams Jr., JE Lingeman, Mechanisms of Human Kidney formation, Urolithiasis 43 (Suppl 1) (2015) 19–32.

[58] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, תפקוד לקוי של מיטוכונדריה וכִּליָהמחלת האבנים, חזית. פיזיול. 11 (2020), 566506.

[59] SR Khan, היבטים היסטולוגיים של מודל "החלקיקים הקבועים" של היווצרות אבנים: מחקרים בבעלי חיים, Urolithiasis 45 (2017) 75–87.

[60] VY Bird, SR Khan, איך נוצרות אבנים? האם איחוד תיאוריות על היווצרות אבנים אפשרי? קֶשֶׁת. Esp. אורול. 70 (2017) 12–27.

[61] JP Kavanagh, שיטות לחקר התגבשות סידן אוקסלט ויישומה במחקר אורוליתיאזיס, Scanning Microsc. 6 (1992) 685–704, דיון 704-5.

[62] JP Kavanagh, L. Jones, PN Rao, קינטיקה של התגבשות קלציום אוקסלט בריכוזים שונים של שתן אנושי ומלאכותי, עם יחס קבוע של סידן לאוקסלט, Urol. מילון 27 (1999) 231–237.

[63] NK Saw, PN Rao, JP Kavanagh, A. nidus, crystalluria and aggregation: מרכיבי מפתח להגדלת אבן, Urol. מילון 36 (2008) 11–15.

[64] A. Borissova, GE Goltz, JP Kavanagh, TA Wilkins, Reverse Engineering the kidney: modeling calcium oxalate monohydrate crystallization in the nephron, Med. ביול. Eng. מחשוב. 48 (2010) 649–659.

[65] LA Thurgood, ES Sorensen, RL Ryall, ההשפעה של אוסטאופונטין תוך גבישי וקשור פני השטח על ההתקשרות של גבישי סידן אוקסלט דיהידראט לתאי כליות Madin-Darby (MDCK) בשתן אנושי מסונן במיוחד, BJU Int. 109 (2012) 1100–1109.