Conjugate Dendrimer-tesaglitazar גורם לשינוי פנוטיפ של מיקרוגליה ומשפר את פגוציטוזיס עמילואיד† חלק 1

החלפת מיקרוגליה ממצב 'פרו-דלקתי' מחמיר מחלה לפנוטיפ נוירו-פרוקטטיבי, 'אנטי דלקתי', היא אסטרטגיה מבטיחה לטיפול במחלות ניווניות מרובות.

מיקרוגליה הם סוג של תא במערכת העצבים המרכזית שאחראי בעיקר על שמירה על בריאותם ותפקודם של נוירונים. הם יכולים להפריש מגוון של גורמי גדילה וגורמים נוירוטרופיים ויכולים לשמור על פעילות מטבולית תקינה של נוירונים על ידי פינוי חומרי פסולת סביב נוירונים. מחקרים בשנים האחרונות הראו שמיקרוגליה קשורה קשר הדוק לזיכרון. בואו נסתכל על זה ביחד.

ראשית, מיקרוגליה יכולה לעורר נוירונים ולקדם את ההפעלה של נוירונים, ובכך לשפר את הזיכרון. על ידי שחרור של סדרה של נוירוטרנסמיטורים, כגון גלוטמט ואלנין, מיקרוגליה יכולה לקדם את העברת האות בין נוירונים ויכולה לשפר את תהודה של אות גליה-נוירונים בין ממברנות פרה-סינפטיות, ולקדם עוד יותר את ההתרגשות העצבית ויצירת זיכרון.

שנית, מיקרוגליה יכולה גם לפנות פסולת סביב נוירונים, לשמור על פעילות מטבולית תקינה של נוירונים, ולהפחית את התמותה הנוירונית, ובכך לקדם שיפור בזיכרון. כאשר יותר מדי אשפה מצטברת סביב נוירונים, זה ישפיע על הפעילות המטבולית הרגילה של נוירונים, מה שיוביל למוות נוירוני ותפקוד מוחלש, ובכך יפחית את ביצועי הזיכרון. מיקרוגליה יכולה לשמור על הסביבה המטבולית התקינה של נוירונים ולהפחית את התמותה הנוירונית על ידי בליעה ופירוק הפסולת הסובבת, ובכך לשפר את הזיכרון.

לסיכום, מיקרוגליה קשורות קשר הדוק לזיכרון. על ידי קידום העירור של נוירונים ופינוי הפסולת הסובבת, מיקרוגליה יכולה לשפר עוד יותר את הזיכרון ולשמור על המוח שלנו בריא ופעיל. עלינו לשים לב להגנה על בריאות המיקרוגליה כדי להשיג זיכרון טוב יותר. ניתן לראות שעלינו לשפר את הזיכרון, ו-Cistanche יכולה לשפר משמעותית את הזיכרון מכיוון ש-Cistanche הוא חומר רפואי סיני מסורתי בעל השפעות ייחודיות רבות, אחת מהן היא שיפור הזיכרון. היעילות של Cistanche מגיעה מהמרכיבים הפעילים השונים שהוא מכיל, לרבות חומצה טאנית, פוליסכרידים, גליקוזידים פלבנואידים ועוד. מרכיבים אלו יכולים לקדם את בריאות המוח במגוון דרכים.

לחץ לדעת 10 דרכים לשיפור הזיכרון

מיקרוגליה פרו-דלקתית תורמת להתקדמות המחלה על ידי שחרור חומרים נוירוטוקסיים והאצת הצטברות חלבון פתוגנית. הוכח כי אגוניסטים של PPAR ו-PPAR מעבירים את המיקרוגליה מפנוטיפ פרו-דלקתי ('M1-כמו') לפנוטיפ מופעל לחלופין ('M2-דומה'). אסטרטגיות כאלה נחקרו בניסויים קליניים למחלות נוירולוגיות, כמו אלצהיימר ומחלת פרקינסון, אך ככל הנראה נכשלו עקב חדירת מחסום דם-מוח (BBB) ​​לקוי.

הוכח כי דנדרימרים מפוליאמידואמין עם סיומת הידרוקסיל (ללא התקשרות של ליגנדים כלשהם) חוצים את ה-BBB הפגוע באתר של דלקת עצבית ומצטברים במיקרוגליה מופעלת.

לכן, צימוד דנדרימר של PPAR / אגוניסט כפול עשוי לאפשר החלפת פנוטיפ ממוקדת של מיקרוגליה מופעלת. כאן אנו מציגים את הסינתזה והאפיון של צמוד דנדרימר-PPAR / אגוניסט כפול (D-tesaglitazar).

במבחנה, D-tesaglitazar משרה שינוי של פנוטיפ 'M1 ל-M2', מקטין הפרשת מיני חמצן תגובתיים, מגביר ביטוי של גנים לפגוציטוזיס ופירוק אנזימטי של חלבונים פתוגניים (למשל -עמילואיד, -סינוקלאין), ומגביר -עמילואיד פגוציטוזיס.

תוצאות אלו תומכות בפיתוח נוסף של D-tesaglitazar לקראת תרגום עבור מחלות ניווניות מרובות, במיוחד אלצהיימר ומחלת פרקינסון.

מָבוֹא

בארצות הברית לבדה, ישנם כיום יותר מ-5.3 מיליון אנשים עם מחלת אלצהיימר (AD) ומיליון אנשים עם מחלת פרקינסון (PD).1 מאחר שהגיל המוגבר הוא גורם הסיכון הגדול ביותר למחלות ניווניות רבות, השכיחות והעלות של הטיפול במחלות אלו ימשיך לגדול ככל שהאוכלוסייה תמשיך להתבגר.

יתרה מכך, היעדר ההצלחה לאחרונה בפיתוח תרופות חדשות לטיפול במחלות אלו הדגיש את הצורך בפיתוח של טיפולים חדשניים. 2,3 כשלים קליניים אלו מדגישים את הקשיים בפיתוח תרופה, לרבות מתן ריכוז גבוה מספיק של התרופה למוח ליעילות ללא יעילות. גורם לתופעות לוואי שליליות.

מחלות ניווניות של עצבים כגון AD ו-PD חולקות שלושה מרכיבים נוירופתולוגיים עיקריים: דלקת עצבית, הצטברות חלבון פתוגנית ומוות נוירוני.4-7 אנשים לא בריאים, התא החיסוני המולד של המוח (themicroglia) פגוציט ללא הרף את החלבונים המקופלים בצורה שגויה (כגון עמילואיד, סינקליין). ) הגורמים למוות נוירוני בעת ייצורם, מה שמונע מאגרגטים של סימן ההיכר להיווצר.

עם זאת, אצל אנשים שבסופו של דבר מפתחים מחלות ניווניות של עצבים, המיקרוגליה כבר לא מסירה חלבונים אלה ביעילות ועוברת לפנוטיפ מחמיר מחלה, פרו-דלקתי (המוגדר בדרך כלל כ-M1).

בעוד שהסיווג הפרו-דלקתי/אנטי-דלקתי (M1/M2) של הפעלת מיקרוגליה הוא פישוט יתר של הספקטרום של קיטוב מקרופאגים, הוא עדיין משמש כמינוח רחב לתיאור הפנוטיפ הדומיננטי של מיקרוגליה בדלקת עצבית ותגובה לטיפול.

M1-כמו מיקרוגליות משחררות מיני חמצן תגובתיים ומתווכים דלקתיים אחרים אשר גם מעוררים מוות עצבי וגם מחמירים את הפתולוגיה של המחלה על ידי הגברת הייצור של חלבונים פתוגניים (למשל -עמילואיד, -סינוקלאין).

יתרה מכך, גורמי הסיכון הגנטיים העיקריים לפיתוח AD(TREM2 ו-APOE) מתבטאים ברמות גבוהות במיקרוגליה, והוכח שמסלול TREM2/APOE גורם לשינוי פנוטיפ אמיקרוגליאלי ב-AD, טרשת צדדית אמיוטרופית (ALS) וטרשת נפוצה מודלים של בעלי חיים.8

ממצאים אלה מדגים עוד יותר את תפקידה של מיקרוגליה בפתולוגיה של מחלות ניווניות עצביות מרובות של בני אדם. גישה למניפולציה של הפנוטיפ של מיקרוגליה תאפשר לחוקרים להבין את תפקידם במחלות נוירודגנרטיביות, בנוסף להיותה פוטנציאלית טיפול יעיל.

החלפת מיקרוגליה מ-M1 לפנוטיפ אנטי דלקתי ונוירו-מגן (M2) הוצעה כאסטרטגיה טיפולית לטיפול במחלות ניווניות מרובות. שינוי פנוטיפ M1 ל-M2 במקרופאגים ובמיקרוגליות במבחנה ובאינבו.

9,10 אגוניסטים של PPAR הוכחו כמפחיתים את ההפרשה המושרה על ידי LPS של מיני חמצן תגובתיים על ידי הפחתת הפעילות של NF-κB על ידי גרימת פירוק NF-κB ויצוא מהגרעין, כמו גם דיכוי טרנספורמציה תלוי ליגנד.11

יתר על כן, מחקרים אפידמיולוגיים הראו כי חולי סוכרת הנוטלים רוזיגליטזון או פיוגליטזון נמצאים בסיכון מופחת לפתח AD ו-PD.12 לאחר מכן, רוזיגליטזון ופיוגליטזון נחקרו באמצעות ניסויים קליניים בשלב III עבור AD, אך נכשלו.13

אחד ההסברים הסבירים לכישלון הניסויים הקליניים שהוזכרו לעיל הוא הובלת תרופות אלו על פני מחסום הדם-מוח (BBB), ובכך מגביל את מספר התרופות שהגיעו למוחם של חולים שנרשמו לניסויים קליניים אלו.14

ואכן, ההערכה היא שה-BBB מונע מכ-98% מכל תרופות מולקולות קטנות להגיע למוח, ורק חלק מהסם שנכנס למוח מגיע למיקרוגליה.15

בנוסף, PPAR הוא קולטן גרעיני נוסף במשפחת ה-PPAR.16 הוא מפגין תפקיד בהומאוסטזיס של שומנים ובוויסות דלקת, וגם אגוניסטים של PPAR הראו השפעות אנטי דלקתיות במיקרוגליה.

מחקרים קליניים באמצעות הדמיה עצבית, ניתוח רקמות שלאחר המוות וסמנים ביולוגיים של CSF סיפקו עדויות לכך שה-BBB פגום ב-AD ו-PD, כמו גם במחלות ניווניות אחרות.

17 דור -4 פוליאמידואמין (G4-PAMAM-OH) דנדרימרים עם סיום הידרוקסיל הוכח ככאלה שעוקפים באופן מהותי את ה-BBB הפגוע ומצטברים במיקרוגליות פעילות ללא צורך בליגנדים, לאחר ניהול מערכתי במספר מודלים שונים של מחלות נוירו-דלקת , כולל במכרסמים, ארנבות, כלבים ופרימטים לא אנושיים.18–28 באופן מובהק, ניתן לתת G4-PAMAM-OH באופן מערכתי ולחצות את BBB במודלים של מחלות עם הפרעה קלה של BBB כמו תסמונת רט.29

בנוסף, מידת הספיגה של G4-PAMAM-OH למוח עומדת ביחס ישר לחומרת המחלה במודל ארנב של שיתוק מוחין.30 לדנדרימרים עם סיום הידרוקסיל יש את היתרון של מתן לא פולשני בהשוואה למסירה מקומית מאוד פולשנית דרך הגולגולת הנדרשת במחקרים קודמים עם ננו-חלקיקים אחרים כגון פולי-אקפרולקטון ו-PEG, דנדרימרים של PAMAM בעלי מטען שלילי, נקודות קוונטיות וננו-פורמולציות המורכבות מפוליאתילןאימין (PEI) ודקסטרן סולפט.31–35

בנוסף, דנדרימרים מסוג הידרוקסיל PAMAM ממוקמים באופן אידיאלי לתרגום בשל יכולת ההרחבה שלהם ופרופיל הבטיחות הנסבל היטב in vivo.36–38 עקב נתוני יעילות פרה-קליניים חיוביים, (G4-PAMAM-OH)-N- צמוד אצטיל-ציסטאין מוערך כעת בניסויים קליניים מוקדמים לאדרנולאוקודיסטרופיה מוחית בילדות (NCT03500627) ודלקת הקשורה למחלת וירוס קורונה חמורה 2019 (COVID-19) (NCT04458298).

בדקנו צימוד דנדרימר-תרופתי של tesaglitazar(Tesa) המחובר ליצירת PAMAMdendrimer עם סיומו של -4 הידרוקסיל. Tesaglitazar הוא PPAR/אגוניסט כפול חזק המשלב את ההשפעות המועילות של אגוניסטים PPAR ו-PPAR. הוא מכיל קבוצה פונקציונלית של חומצה קרבוקסילית לצימוד קוולנטי לדנדרימר ולשחרור לאחר מכן.

גיטרות נוספות פותחו ונבדקו קלינית, אך טסה נבחרה בשל יחס הפעילות הגדול יותר של PPAR ל-PPAR, המבנה הכימי הפשוט יחסית ופרופיל הבטיחות.39–43

Tesa הגיעה בעבר לניסויים קליניים שלב III לסוכרת מסוג 2 בארצות הברית של אמריקה, אך נכשלה עקב רעילות תלוית מינון, שאותה ניתן למנוע על ידי הפחתת המינון הדרוש של מתן על ידי מתן דנדרימר מבוקרת. PPAR / אגוניסט כפול, אספקה ​​ממוקדת שלו למיקרוגליה מופעלת באתר של דלקת עצבית עשויה להועיל ביותר.

כאן, אנו מדגימים את הסינתזה והאפיון של מצומד דנדרימר-טסגליטאזר (D-Tesa) ומדגים את יכולתה של תרכובת זו לגרום לשינוי פנוטיפ 'M1 toM2' במיקרוגליה ולשפר פגוציטוזיס של עמילואיד המסומן בצורה פלואורסצנטית.

חומרים ושיטות

חומרים

1-[3-(דימתילאמינו)פרופיל]-3-אתיל קרבודיאימיד מתיודיד (EDC), 4(דימתילאמינו) פירידין (DMAP), CuSO4·5H2O, נתרן אסקורבט, חומצה הקסינואית ואלבומין בסרום בקר (BSA) נרכשו מסיגמא אולדריץ' ארה"ב והשתמשו בהם כפי שהתקבלו (סנט לואיס, MO).

Tesaglitazar הושג מ-AstaTech Inc. (בריסטול, הרשות הפלסטינית). דנדרמר PAMAM בליבת אתילנדיאמין (דור 4 עם 64 קבוצות קצה של הידרוקסיל) התקבל מ-Dendritech Inc. (Midland, MI) כתמיסה במתנול.

הדנדרימר אוחסן במתנול ב-4 מעלות ומתנול התאדה לפני השימוש. קרום דיאליזה עם חתך משקל מולקולרי (MWCO) של 1 kDa נרכש מ-Spectrum Laboratories Inc. (New Brunswick, NJ).

כל הממיסים האחרים שימשו כפי שהתקבלו בצורותיהם הנידרות. כל התגובות, למעט נחושת(I), תגובות לחיצה מזורזות של אלקין-אזיד (CuAAC), נערכו בתנאים נטולי מים במדיום אורגני עם כלי זכוכית מיובשים בתנור תחת חנקן אינרטי אַטמוֹספֵרָה.

לתרבית תאים: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Bovineserum עוברי (FBS), פניצילין-סטרפטומיצין (P/S), 0.05% טריפסין-EDTA ומגיב MTT הושגו מ-Invitrogen (Carlsbad, CA) , ארה"ב).

ריאגנט Griess הושג מ-Promega (מדיסון, WI) ו-TNF-ELISA הושג מ-R&D Systems (Minneapolis, MN). מתנול בדרגה אנליטית נרכש מ-Sigma-Aldrich. כחול טריפן התקבל מקורנינג (מנאסס, וירג'יניה, ארה"ב).

נהלי סינתזה עבור מצומדי D-Tesa
טטראתילן גליקול מונו אזיד (2) סונתז באמצעות פרוטוקול שפורסם בעבר.45

סינתזה וטיהור של Tesa-TEG-azide (3).
Tesa (950 מ"ג, 2.32 מילימול) הומס ב-10 מ"ל דימתילפורמאמיד (DMF). לתמיסה המערבבת הזו, הוסף טיפה טטרמתילן גליקול מונו-אזיד (2, 662.1 מ"ג, 3.02 מ"ל) ב-DMF (1 מ"ל). לאחר מכן נוספו DMAP (255.4 מ"ג, 2.09 מ"ג) ו-EDC (577.5 מ"ג, 3.02 מ"ג) לתערובת התגובה, והתגובה הועברה תחת טיהור חנקן בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.

התגובה נוטרה באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה וכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC). תערובת התגובה דוללה ב-100 מ"ל דיכלורומתאן (DCM) ותערובת התגובה הגולמית הועברה למשפך הפרדה, והשכבה האורגנית נשטפה לאחר מכן שלוש פעמים בתמיסת נתרן ביקרבונט רוויה, ואחריה תמיסת אמוניום כלוריד רוויה ולבסוף עם מי מלח.

השכבה האורגנית יובשה לאחר מכן עם נטול סודיום גופרתי. לאחר מכן הוסר הממס בשכבה האורגנית באמצעות מאייד סיבובי, והתמיסה הומסה מחדש ב-3 מ"ל DCM ונספגה על גבי סיליקה ג'ל לטיהור עם מערכת כרומטוגרפיה CombiFlash® תוך שימוש בשיטת שיפוע עם אתיל אצטט/הקסאן כממסים לייצור 3as ברור -שמן צהוב.

המוצר הרצוי, הטהור, נפלט בכמות של כ-30-40% אתיל אצטט. (תשואה: 70%). 1H NMR (500 מגה-הרץ, CDCl3) δ 7.27 (ד, J=8.6 הרץ, 2 שעות), 7.15 (ד, J=1.9 הרץ, 2 שעות), 7.08 (d, J=8.6 Hz, 2H), 6.73 (d, J=8.6 Hz,2H), 4.25–4.14 (m, 2H), 4.07 (t, J {{ 33}}.8 הרץ, 2H), 3.94 (dd, J =7.8, 5.2 הרץ, 1H), 3.67–3.47 (מ', 14H), 3.30 (dd, J=8.7 , 3.8 הרץ, 2H), 3.06 (s, 3H), 3.02 (t, J=6.7 הרץ, 2H), 2.91–2.84 (מ', 2H), 1.08 (t, J=7 .0 הרץ, 3H).ESI-MS: C28H39N3O10S תיאורטי: 609.24, הושג (M + 1):610.13.

סינתזה וטיהור של D-YNE (5).

(480 מ"ג, 4.22 ממול) נוספה לתמיסה מעורבת של G4-PAMAM-OH (2.5 גרם, 0.176 ממול) ב-20 מ"ל DMF נטול מים. תערובת זו, DMAP (430 מ"ג, 3.52 ממול) ו-EDC (1 גרם, 5.28 ממול) נוספו.

תערובת התגובה הועברה תחת טיהור חנקן במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. עם השלמת התגובה, תערובת התגובה הועברה לצינור דיאליזה DMF של 1000 MWCO דיאליזה בוצעה במשך 24 שעות, וה-DMF הוחלף בערך כל שש שעות.

לאחר מכן בוצעה דיאליזה עם מים דה-יונים (DI) למשך 24 שעות, כשהמים הוחלפו בערך כל שש שעות. לבסוף, תכולת צינור הדיאליזה שהתקבלה עברה ליופילציה למשך 48 שעות, והניבה אבקה לבנה ורכותית. (תפוקה: 61%). 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.10-7.67 (מ', דנדרמרירית אמידה פנימית H), 4.72 (שניות, משטח דנדרימר OH), 4.01 (t, אסטר –CH2), 3.32 (מ, דנדרימר –CH2), 3.06 (מ, מקשר דנדרימראנד –CH2), 2.85-2.58 (מ, דנדרימר –CH2), 2.56-1.89 (מ, דנדרמר ומקשר -CH2), 1.78-1.61 (מ, מקשר -CH2). סינתזה וטיהור של D-Tesa (6).

Tesa-TEG-azide (3,177.8 מ"ג, 0.3{{10}}3 mmol) התווסף לתערובת מעורבת של D-YNE(5, 35{{2{{27} }}} מ"ג, 0.023 מ"ל) ב-5 מ"ל של תערובת של 1:1 של טטרה-הידרופורן (THF) ומים עם 0.5 מ"ל של DMF בבקבוקון של 20 מ"ל בטוח במיקרוגל. עבור תגובת ה-CuAAC קליק, נוספו פנטהידרט נחושת-סולפט (11.6 מ"ג, 0.0467 מ"ל) ו-(+)-נתרן-לסקורבט (9.3 מ"ג, 0.0467 מ"ג) לתערובת התגובה.

הבקבוקון נאטם, וכלי התגובה הונח בכור מיקרוגל Biotage® Initiator והגיב תחת קרינת מיקרוגל של 20 W תוך ערבוב במשך 8 שעות ב-50 מעלות. תערובת התגובה הועברה לצינור דיאליזה של 1000 MWCO, ודיאליזה DMF בוצעה במשך 24 שעות, כאשר DMF הוחלף בממס טרי בערך כל 4 שעות.

לאחר מכן, התוכן של צינור הדיאליזה הועבר לשפופרת אפלקון, ונוספה כמות שווה של מים DI. בנוסף, נוספו 200 μl של תמיסת מלח ethylenediaminetetraacetic disodium לתוכן צינור הבז.

לאחר מכן הוכנסה תערובת זו לתוך צינור דיאליזה חדש של 1000 MWCO, והדיאליזה בוצעה במשך 12 שעות ב-1000 מ"ל DIwater עם תמיסת EDTA הוספה ולאחר מכן דיאליזה במים למשך 12 שעות.

לאחר מכן התערובת עברה ליופיליזציה למשך 48 שעות והביאה לאבקה לבנה ורודה. (תפוקה: 64%). 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.2-7.6 (מ', דנדרימר אינטרנאמיד H), 7.36 (d, Tesa ArH), 7.21 (d, Tesa ArH), 7.03 (d, TesaArH), 6.76 (d, Tesa ArH), 4.37 (s, Tesa H), 4.18–4.04 (m, linkerH), 3.96 (dd, Tesa ומקשר H), 3.70 (m, Tesa ומקשר H) ,3.58–3.14 (מ', דנדרימר -CH2), 3.14-2.86 (מ', דנדרימר-CH2), 2.87-2.49 (מ', דנדרימר ומקשר -CH2), 2.25 (מ', דנדרימר -CH2) , 1.82-1.67 (מ', מקשר -CH2), 0.97 (t, Tesa -CH3).

טכניקות אפיון

תהודה מגנטית גרעינית (NMR). ספקטרום NMR תועדו בספקטרומטר Bruker 500 MHz בטמפרטורת החדר. שינויים כימיים של פרוטונים (δ) מדווחים ב-ppm.

1H NMR שימש לקביעת מספר מולקולות Tesa המחוברות לכל מולקולה של D-Tesa בשיטת אינטגרציה של פרוטונים, על ידי השוואת הפסגות של פרוטונים אמידים פנימיים של דנדרימר ב-δ 7.6-8.2 ppm עם פרוטונים ארומטיים של Tesa ב-δ 7.36-6.76 ppmand מתיל. טסה באזור האליפטי. כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC).

נעשה שימוש ב-HPLC (Waters Corporation, Milford, מסצ'וסטס) מצויד במשאבה בינארית 1525, מסיר גז In-Line AF, דגימה אוטומטית 717 פלוס, גלאי מערך פוטודיודות 2998 וגלאי פלואורסצנטי רב λ2475 עם ממשק לתוכנת Waters Empower.

נעשה שימוש בעמודת סימטריה C18 הפוכה (Tosoh, יפן) בעלת גודל חלקיקים של 5 מיקרומטר, אורך 25 ס"מ וקוטר פנימי של 4.6 מ"מ. תרכובות נוטרו ב-210 ננומטר ו-254 ננומטר באמצעות גלאי PDA.

ממס A wasHPLC מים בדרגה עם 0.1% trifluoroacetic acid (TFA), והממס B היה acetonitrile (ACN) עם 5% מים ו-0.1% TFA. השיטה שבה נעשה שימוש התחילה ב-1{ {7}}0 : 0 (ACN: מים), ירד ל-10: 90 (מים: ACN) תוך 5 דקות, נשאר בקוטביות זו במשך 15 דקות, וחזר ל-100 : 0 (ACN: מים) תוך 5 דקות.קצב הזרימה נשמר על 1 מ"ל דקה-1. ספקטרוסקופיה מסה.

ESI-MS בוצע בספקטרומטר מסה BrukermicroTOF-II תוך שימוש באצטוניטריל/מים (9:1) כמערכת ממס. היונים המולקולריים כפסגות פרוטונריות [M + nH]n+ או אדדוקטים [M + nX]n+ (X=Na, K או NH4) שימשו כדי לאשר את הנוסחה האמפירית.

פיזור אור דינמי ופוטנציאל ζ. נעשה שימוש ב-Zetasizer NanoZS (Malvern Instrument Ltd, Worchester, בריטניה) מצויד בלייזר He–Ne a50 mW (633 ננומטר) כדי לקבוע את גודל החלקיקים והפצת פוטנציאל ζ. D-Tesa הומס במים DI לריכוז של 0.2 מ"ג ml-1 עבור DLS וב-10 מ"מ נתרן כלורי לריכוז של 0.1 מ"ג ml-1 לפוטנציאל ζ.

המדידות נעשו ב-25 מעלות, תוך שימוש בזווית פיזור של 173 מעלות כפי שתואר קודם לכן.27,46מחקר שחרור תרופות. D-Tesa הומס בריכוז של 1 מ"ג ml-1 בתמיסת חיץ פוספט (pH 7.4) בתנאי פלזמה תמימים או בתמיסת נתרן ציטראט (pH 5.5) כדי לחקות תנאים ליזוזומים.

אסטראזים מכבד חזיר (מ-Sigma Aldrich) נוספו לתמיסת הנתרן ציטראט בתחילת מחקר השחרור וחודשו בערך כל 3 ימים במהלך המחקר.

כל בקבוקון הכיל דגימה של 15 מ"ל והם נוערו ללא הרף ב-37 מעלות למשך הניסוי. בנקודות זמן שונות נאספו דגימות כפולות של 200 μl מכל pH ופעילות האסטראז הופסקה לאחר מכן על ידי הוספת 200 μl מתנול. דגימות נקודת זמן של שעות אפס שימשו כבקרה.

הדגימות אוחסנו ב-80 מעלות כדי למנוע עוד יותר כל הידרוליזה. הדגימות נותחו עוד על ידי HPLC והשטח שמתחת לעקומה (ב-210 ננומטר) עבור שיא התרופה החופשית חושב. השטח מתחת לעקומה היה בקורלציה לכמות התרופה ששוחררה על ידי שימוש בעקומת כיול שבה בוצעו ריכוזים ידועים של Tesa חופשי על HPLC ב-210 ננומטר.

For more information:1950477648nn@gmail.com