Dendrimer-tesaglitazar Conjugate גורם לשינוי פנוטיפ של מיקרוגליה ומשפר את פגוציטוזיס עמילואיד† חלק 2

בדיקות ביולוגיות במבחנה

תרבית תאים. קו תאים מיקרוגליאלי עכברי BV2 התקבל מבית החולים לילדים של מישיגן לתרבות תאים.

בשנים האחרונות, מדענים מצאו שתרבית תאים קשורה קשר הדוק לזיכרון האנושי. מחקרים הראו כי באמצעות חקר תרבית תאים ניתן לגלות את המנגנונים המולקולריים בתהליך הזיכרון והלמידה, ובכך לשפר את היכולת הקוגניטיבית והזיכרון האנושיים.

תרבית תאים מתייחסת לתהליך של הצבת תאים ביולוגיים במצע תרבית המכיל חומרים מזינים חיוניים לגידול ולהתרבות בתנאי מבחנה. תאים הם היחידות הבסיסיות של החיים, ותרבות תאים מספקת למדענים פלטפורמה לחקור את התנהגות התא ופעילויות החיים. באמצעות חקר התאים, מדענים גילו מידע רב על צמיחת נוירונים וקשרים סינפטיים. ממצאים אלה יכולים לא רק לעזור לבני אדם להבין טוב יותר כיצד המוח פועל, אלא גם לעזור לפתח טיפולים ותרופות חדשות.

מחקרים בשנים האחרונות הראו כי תרבית תאים קשורה קשר הדוק גם לזיכרון האנושי. מדענים מצאו כי היווצרות ותחזוקה של זיכרון אנושי דורשות הרבה ויסות מולקולרי ומסירת אותות. למנגנוני מסירת וויסות האותות הללו יש קווי דמיון רבים עם המנגנונים בתרבית תאים. על ידי לימוד מנגנוני מסירת האותות והוויסות בתרבית תאים, מדענים יכולים להבין טוב יותר את הזיכרון ואת מנגנוני הלמידה האנושיים.

בנוסף, כמה מחקרים הראו גם שתרבית תאים יכולה לשפר את הזיכרון האנושי ואת יכולת הלמידה בדרכים מסוימות. למשל, באמצעות שיטה הנקראת "גירוי חשמלי", ניתן לעורר את פעילות התאים והחיבור בין נוירונים, ובכך לשפר את היכולת הקוגניטיבית של האדם ואת השפעות הלמידה. למרות ששיטה זו נמצאת עדיין בשלב מחקר מעבדתי, היא צפויה להפוך לשיטת אימון קוגניטיבית חדשה בעתיד.

לסיכום, יש קשר הדוק בין תרבית תאים לזיכרון האנושי. באמצעות חקר התאים, נוכל להבין טוב יותר את המנגנון הקוגניטיבי האנושי ומנגנון הזיכרון וגם לסייע בפיתוח שיטות טיפול חדשות ושיטות אימון קוגניטיביות. הבה נצפה לתרומת הטכנולוגיה של תרבית תאים לאנושות בעתיד! ניתן לראות שאנו צריכים לשפר את הזיכרון, ו-Cistanche יכולה לשפר משמעותית את הזיכרון מכיוון של-Cistanche יש השפעות נוגדות חמצון, אנטי דלקתיות ואנטי-אייג'ינג, שיכולות לסייע בהפחתת חמצון ותגובות דלקתיות במוח, ובכך להגן על בריאות המוח. מערכת העצבים. בנוסף, Cistanche יכול גם לקדם צמיחה ותיקון של תאי עצב, ובכך לשפר את הקישוריות והתפקוד של רשתות עצביות. השפעות אלו יכולות לסייע בשיפור הזיכרון, יכולת הלמידה ומהירות החשיבה, ויכולות גם למנוע את התרחשותם של הפרעות בתפקוד קוגניטיבי ומחלות ניווניות.

לחץ על יודע תוספי מזון כדי להגביר את הזיכרון

תאי BV2 תורבו במדיה Modified EaglesMedium (DMEM) של Dulbecco עם 10% סרום עוברי עוברי מומת בחום (HI FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) ב-37 מעלות ו-5% CO2.

ברגע שהתאים הגיעו למפגש בבקבוק התרבות, התאים הועברו לבקבוק חדש תוך שימוש ב-0.05% טריפסין-אתילן-דיאמין חומצה טטרה-אצטית (EDTA). עבור הניסויים, תאי BV2 נזרעו ב-DMEM עם 5% HIFBS ו-1% P/S. 24-48 שעות מאוחר יותר, התאים עוררו ב-100 ננוגרם ml-1 (300 EU ml-1) של LPS במשך 3 שעות כדי לאפשר לתאים להיכנס לפנוטיפ פרו-דלקתי (M1) כדי לדמות את הסביבה הנוירו-דלקתית הקיימת במחלות נוירולוגיות רבות.

לאחר מכן, התאים טופלו יחד עם LPS ו- Tesa חופשי או D-Tesa בריכוזים משתנים עבור 48 ידיים ולאחר מכן נאספו הסופרנטנט והתאים לעיבוד. תאים שמעולם לא טופלו ב-LPS (ללא LPS) ותאים שטופלו ב-LPS בלבד בכל עת (ללא LPS) שימשו כקבוצות הביקורת. תמיסות מלאי חינם של Tesa ו-D-Tesa עוקרו תוך שימוש במסנני פולי(אתר סולפונים) 0.2 מיקרומטר.

D-Tesa היה מסיס במדיה התא. Tesa הומס על ידי שימוש ב-Dimethylsulfoxide (DMSO) בריכוז סופי של פחות מ-0.1% (v/v). ציטוטוקסיות, בדיקת תחמוצת חנקן ו-TNF-ELISA. עבור בדיקת ציטוטוקסיות, תאים טופלו כמתואר לעיל בצלחת 96-, ולאחר מכן הוערכה ציטוטוקסיות של Tesa ו-D-Tesa חופשית על ידי מבחן MTT בהתאם להוראות היצרן.

עבור מבחן תחמוצת החנקן, תאים טופלו כמתואר לעיל בצלחות של 12-בארות, ולאחר מכן נאספו סופרנטנטים מהתאים המטופלים ומיד רמות תחמוצת החנקן כומתו על ידי ביצוע פרוטוקול היצרן עבור מגיב Griess.

עבור TNF-ELISA, תאים טופלו כמתואר לעיל בצלחות של 12-בארות, ולאחר מכן נאספו הסופרנטנטים מהתאים המטופלים ואוחסנו ב-80 מעלות עד שהם מוכנים לעיבוד נוסף.

לאחר מכן הופשרו דגימות על קרח וה-TNF-ELISA הופעל לפי פרוטוקול היצרן. למחקרים אלה, הן D-Tesa והן Tesa החופשי עברו צלילים והוסבבו עד ששניהם היו מסיסים לחלוטין. כדי להמיס את Tesa חופשית, הוא הוסב לראשונה ב-DMSO לפני דילול, כאשר הריכוז הסופי של DMSO היה מתחת ל-0.1%(v/v) עבור כל דגימות Tesa החופשיות.

מכיוון ש-D-Tesa היה מסיס במדיה לתרבות תאים, DMSO לא התווסף לדגימות אלו. עבור מחקרים במבחנה, כמות שווה של תרופה חופשית או מצומדת הונחה על תאים בקבוצות החופשיות של Tesa ו-D-Tesa.

PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR). תאים טופלו כמתואר לעיל בצלחות באר 12-, ולאחר איסוף הסופרנטנט, נאספו תאים ב-Invitrogen™ TRIzol™ Reagent (מ-Fisher Scientific) ו-RNA הוצא לפי פרוטוקול היצרן. הריכוז והטוהר של ה-RNA שהתקבל נותחו באמצעות Nanodrop.

כמויות שוות ערך של RNA מכל דגימה הומרו ל-cDNA על ידי ביצוע פרוטוקול היצרן עבור ערכת שעתוק הפוך של High CapacitycDNA (מ-Applied Biosystems מאת Thermo Fisher Scientific).

ה-cDNA שהתקבל נוצל לניתוח qRT-PCR תוך שימוש במגיב הירוק FAST-SYBR וביצוע פרוטוקול היצרן. ערכי Ct חושבו על ידי המכונה והנתונים נותחו תוך שימוש בשיטת 2−ΔΔCt.

עבור כל סמן שונה, ערך ΔΔCt חושב על ידי הפחתת ה- ΔCt עבור קבוצת No LPS מה- ΔCt עבור כל דגימה. ערך ΔCt היה ערך Ct עבור הגן המעניין פחות ה-Ct עבור GAPDH עבור כל דגימה נתונה.

לאחר שחושב 2−ΔΔCt עבור כל הקבוצות, כולן נורמלו לקבוצת ללא LPS, ובכך נתנו לרמת הביטוי היחסית של קבוצת ללא LPS של 1.0 עבור כל הסמנים. רצפי הפריימר קדימה ואחורה השתמשו ב-forqRT -PCR מוצגים בטבלה שלהלן. כל הרצפים נכתבים מ-5′→3′.

בנוסף, פרימרים זמינים מסחרית נרכשו מ-BIORAD עבור iNOS/Nos2 (qmmuCID0023087), TLR4 (qmmuCID0023548), CD206/Mrc1 (qmmuCID0012670),TGF- 1 (qmmuCID0017)(qmmuCID0017)(qmmuCID0017),{02CID 1 (qmmuced0024846), CD36 (qmmucid0014852), Ide(qmmuced0049796), MMP9 (qmmucid0021296), CCL1(qmmuced0038249), TLR8 (qmmuced0039837), CD0mmucid (08mm 6404), ו-PPAR (qmmucid0018821). בדיקת פגוציטוזיס.

ההשפעה של Onphagocytosis של Tesa ו-D-Tesa חופשית של עמילואיד נקבעה באמצעות שיטה שדווחה בעבר.47 בקצרה, HiLyte™ Flour 488-מסומן -amyloid1–42 (מ-Anaspec Inc.) הומס ב-DMSO (ריכוז DMSO סופי) מתחת ל-0.5% (v/v)) ומדולל ל-5 µg ml-1 ב-PBS.

לאחר טיפול בתאים עם Tesa ו-D-Tesa עם סכימת הטיפול המפורטת לעיל, תמיסת העמילואיד הונחה על התאים למשך שעתיים. לאחר מכן, התאים נשטפו שלוש פעמים עם תמיסת מלח מאוזנת של האנק עם קטיונים דו ערכיים (סידן ומגנזיום), הוסרו מהבארות באמצעות טריפסין, והושפו מחדש במאגר FACS (מ-Invitrogen).

דגימות אוחסנו על קרח, והופעלו מיד על מכונת זרימה SH800 זרימה ציטומטריית תאים, והנתונים נותחו עם התוכנה הקשורה.

השער נקבע באמצעות תאים שלא טופלו בעמילואיד פלואורסצנטי, והתוצאות המוצגות הן אחוז התאים מכל קבוצה שהפגינו פלואורסצנטיות מעל פלואורסצנטי רקע.

עוצמת הפלורסנט הממוצעת (MFA) של HiLyte™ 488-ששכותרתו עמילואיד דווחה גם עבור כל קבוצה. בדיקה זו בוצעה בכפולות. סטטיסטיקה. כל הנתונים המוצגים הם תוצאה של שלושה ניסויים נפרדים, כל אחד מבוצע בשלושה עותקים אלא אם צוין אחרת. GraphPad Prism 5 ו- Microsoft Excel שימשו לביצוע סטטיסטיקה.

בוצעו מבחני t של סטודנט דו-זנבתי-זוגיים, עם BonferroniCorrection. המבחן של גראבס שימש לקביעת חריגים. נעשה שימוש ב-GraphPad Prism 5 עבור Windows כדי לשרטט נתונים (סן דייגו, קליפורניה). הנתונים המוצגים הם הממוצע + SEM.

תוצאות ודיון

סינתזה ואפיון של D-Tesa

כדי לאפשר אספקה ​​ממוקדת, תוך-תאית לתאי מיקרוגליה מופעלים במוח, Tesa היה מצומד קוולנטי על פני השטח של G4-PAMAM-OH עם קשרי אסטר ניתנים לפירוק בין התרופה למקשר הדנדרימר (איור 1).

בשלב הראשון, Tesa (1) הגיב עם טטרה-מתילן גליקול אזיד (TEG-azide)(2) כדי לייצר Tesa-TEG-azide (3), שיש לו קישור אסטר בין התרופה למקשר (איור 1A).

HPLC של תרכובת (3) הראה זמן שמירה של 13.4 דקות עם טוהר של יותר מ-99% (איור S1B†). ספקטרום המסה של (3) הראה שיא של 610.13 [M + 1]+ התואם למשקל המולקולרי של Tesa-TEG-azide המאשר עוד יותר את היווצרות המוצר (איור S2†). בנפרד, G4-PAMAM-OH dendrimer (4) הגיב עם חומצה 5-הקסינואית באמצעות תגובת אסטריפיקציה לייצור D-YNE (5) (איור 1B).

לבסוף, Tesa-TEG-azide (3) ו-D-YNE (5) הגיבו על ידי תגובת הלחיצה היעילה ביותר של נחושת-קטליזדאזיד-אלקין (CuAAC) לייצור D-Tesa (6) (איור 1B).48 NMR 1H אישר את הסינתזה המוצלחת של כל תוצרי הביניים והתוצר הסופי; D-Tesa (6) הכיל את הפסגות האופייניות של פרוטונים דנדרמריים ו-Druglinker המדגימים את הסינתזה המוצלחת של D-Tesa (איור 2A).

NMR של המצומד הסופי של D-Tesa גילה כי ממוצע של עשר מולקולות של Tesa הוצמדו לכל דנדרמר. HPLC אישר צימוד קוולנטי מוצלח, שכן D-Tesa הפגין שינוי הן מה-D-YNE והן מה-TesaTEG-אזיד (איור 2B ו-S1†).

ל-Tesa מסיסות מימית נמוכה, המוערכת ב-0.0035 mg mL−1.49 הצימוד של Tesa onhydroxyl dendrimer שיפרה את מסיסותו במים במספר סדרי גודל מאומדן זה. D-Tesa הייתה מסיסות במים ב-22 מ"ג מ"ל-1, ומכיוון ש-Tesa מהווה כ-19% מהמסה של D-Tesa, 4.2 מ"ג מ"ל-1 שווה ערך ל-Tesa הוסבבו (איור 3A).

המסיסות המוגברת שמעניק הדנדרימר מגבירה את קלות הניסוח ומסירה את הצורך בחומרי עזר רעילים.50 יתרונות אלו מתווספים כולם ליכולתו המעולה של הדנדרימר לספק תרופות חופשיות על פני BBB למיקרוגליה in vivo, ועלולים להפחית את דרוש מינון להשגת אפקט טיפולי.18–28 לבסוף, ל-D-Tesa היה גודל ממוצע של 7.75 ± 0.29 ננומטר (איור S3†), ופוטנציאל זיטה של ​​2.86 ± 0.38 mV (מדידה N=5 ו-N=3, בהתאמה).

שחרור תרופות

תכננו את D-Tesa לשחרר את Tesa תוך תאי בתוך ה-pH הנמוך וסביבת הריכוז הגבוה של אסטראז, איננדוזומים/ליזוזומים של מיקרוגליה פעילה. דיווחנו בעבר שהדנדרמרים של PAMAM חודרים בעיקר לתאים דרך אנדוציטוזיס שלב נוזלי, והשלפוחיות המכילות את המצומדים הופכות לליזוזומים.51

הדגמנו D-Tesa ב-37 מעלות במאגר נתרן ציטראט (pH 5.5) בנוכחות אסטראזות כדי לחקות את התנאים של ליזוזומים, כפי שבוצעו קודם לכן. 52-54 חקרנו גם שחרור בתנאים המחקים תנאי פלזמה (מלוחים עם חוסם פוספט [PBS] ] חיץ, pH 7.4).

בתנאי פלזמה, רק כ-1.5% מה-Tesa משתחרר לאחר 48 שעות, ופחות מ-20% מה-Tesa משתחרר ביום ה-25, מה שמצביע על יציבות הפלזמה של המצומד (איור 3B).

בתנאים ליזוזומליים, כ-60% מ-Tesa משתחררים מ-D-Tesa בתוך 48 השעות הראשונות, ובתוך 19 יום, כמעט 100% מ-Tesa משתחררים. תוצאות אלו מוכיחות ש-D-Tesa מספק שחרור מתמשך ומופעל של התרופה החופשית במשך השבועיים הראשונים המודגרים בתנאים ליזוזומאליים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.

בנוסף, השחרור המינימלי של Tesa בתנאי פלזמה מדומה (קבוצת pH 7.4) במהלך 48 השעות הראשונות הוא משמעותי, מכיוון שזהו זמן מחזור הדם הטיפוסי של G4-PAMAM-OH לפני פינוי הכליות, סביר להניח ש-Tesa ישוחרר מהגוף. מצומדים לפני שהם מגיעים למיקרוגליה.24

D-Tesa הפחית את הביטוי של סמני M1 והגדיל את סמני M2

כדי להעריך את היכולת של D-Tesa לגרום לשינוי פנוטיפ M1 ל-M2, הערכנו את יכולתו של D-Tesa לשנות את הביטוי של סמני M1 ו-M2 במבחנה באמצעות קו תאים מיקרוגליאלי של עכברים (BV2).

תאי BV2 נוצרו על ידי הנצחת תאי מיקרוגליה עכברים והוכחו כחלופה מתאימה לתאי מיקרוגליה ראשוניים כדי לחקור את התגובה הדלקתית של המיקרוגליה.55,56 בניסויים שלנו, כדי לחקות את הסביבה הנוירו-דלקתית הקיימת במספר מחלות נוירולוגיות, טיפלנו מראש במיקרוגליה ב-100 ng ml−1 (300 אנדוטוקסינוניטים (EU) למ"ל) LPS למשך 3 שעות.

לאחר מכן, טיפלנו בתאים יחד עם LPS ו- Tesa חופשי או D-Tesa במשך 48 שעות, ולאחר מכן אספנו את הדגימות. טיפלנו בתאים בריכוזים של 1.5, 15 ו-150 µM ללא Tesa או D-Tesa, על בסיס תרופה שווה.

בדיקת MTT הוכיחה כי Tesaor D-Tesa חופשי בריכוזים אלה לא גרם לציטוטוקסיות (איור S4†). מחקר ראשוני למציאת מינון נעשה עם Tesand D-Tesa כדי לקבוע את המינון היעיל ביותר של Tesa ו-D-Tesa.

טיפול ב-1.5 ו-15 µM חופשיים של Tesa ו-D-Tesadid אינו משנה את הפרשת תחמוצת החנקן או TNF-, כפי שנקבע על ידי מגיב Griess ו-TNF-ELISA, בהתאמה (איור S5†). בהתבסס על תוצאות אלו, לא ניתחנו את הריכוזים הנמוכים הללו במבחני ה-qRT-PCR שלנו.

במחלות ניווניות רבות, פונקציה נוירוטוקסית מרכזית אחת של מיקרוגליה פרו-דלקתית, M1, היא הפרשתם של מיני חמצן תגובתיים (למשל תחמוצת חנקן) ההורגים ישירות נוירונים.57,58 לאחר מכן, הונחה כי אסטרטגיה טיפולית אחת פוטנציאלית תהיה הפחתת הפרשת מולקולות אלו.

הערכנו את היכולת של D-Tesa להשיג את האפקט הזה. לאחר גירוי LPS, D-Tesa הפחית את רמות ה-mRNA המופרשות של תחמוצת החנקן וסינתאז (iNOS)-mRNA המופרש פי 3.7- (p < 0.0001) ו-2-פיפול (p {{ 7}}.011), בהתאמה, בהשוואה לתאים שטופלו רק ב-LPS (ל-LPS בלבד) (איור 4A ו-B).

מצד שני, Free Tesa הפחית את התחמוצת החנקן המופרשת בצורה מתונה יותר (פי 1.4-, p=0.004) ולא הובילה לירידה משמעותית בביטוי ה-iNOS mRNA (איור 4A ו-B ).

D-Tesa היה הרבה יותר יעיל מאשר Tesain בחינם, דיכוי הפרשת תחמוצת החנקן. לאחר מכן, בהתאם ל-ifmicroglia הם בפנוטיפ M1 או M2, microglia מגביר את ה-iNOS או Arginase 1 (Arg1) כדי לבצע חילוף חומרים של L-arginine לייצור תחמוצת החנקן לתגובת הרג הפתוגן M1 שלהם, orornithine ואוריאה עבור תגובת ריפוי הפצעים M2, בהתאמה. 59

בהתאם לוויסות הירידה שלו של iNOS, D-Tesa העלה את רמות ה-mRNA Arg1 2-פיפול (p=0.011) בהשוואה לבקרת ה-LPS בלבד, בעוד ש-Tesa החופשית לא גדלה את הביטוי באופן מובהק (p=0 .40) (איור 4ג).

D-Tesa, ובמידה פחותה Tesa החופשית, שינו את המיקרוגליה משחרור ציטוטוקסי ניטריקוקסיד לחילוף חומרים של L-arginine לריפוי פצעים, שיש לו השלכות בהפחתה ופוטנציאלית של היפוך הנוירוטוקסיות הנגרמת על ידי מיקרוגליה בניוון עצבי.5-7,10

הרגולציה של רמות iNOS ורמות תחמוצת החנקן המופרשות עם טיפול ב-D-Tesa היא על ידי עבודה קודמת שהדגימה שהליגנד הטבעי של PPAR (15-deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2) הפחית את הביטוי והפרשת ה-iNOS ואת תחמוצת החנקן ב-LPS שטופלו. מיקרוגליה ראשונית.60

IL-10, IL-4 ו-TGF- 1 הם כולם ציטוקינים המופרשים על ידי מיקרוגליה M2 המופעלת לחלופין שיכולה לעורר סביבה נוירו-מגן ואנטי-דלקתית במוח.58,61,62לכיוון במטרה זו, D-Tesa הגדיל את הביטוי של IL-105.5-fold (p=0.011) ו-IL-4 8.2-fold (p { {15}}.013) בהשוואה לבקרת LPS בלבד (איור 4D ו-E).

Free Tesa לא העלה משמעותית את רמות IL-10 או IL-4, אם כי הממוצעים היו פי 1.7-(p=0.066) ו-2.{{7} }קפל (p=0.11) גבוה יותר, בהתאמה, עבור microglia שטופלו ב-Tesa בהשוואה לבקרות-LPS בלבד (איור 4D ו-E). בנוסף, D-Tesa הגדילה את הביטוי של TGF- 1 2.3-fold (p=0.015) andfree Tesa לא שינה משמעותית את הביטוי (איור 4F).

לפיכך, D-Tesa גורם להפרשה של ציטוקינים אנטי דלקתיים לאחר טיפול ב-LPS של מיקרוגליה, אשר יכול להפחית את הסביבה הנוירוטוקסית, פרו-דלקתית, הקיימת במחלות ניווניות עצביות.5-7,10

ביטוי המושרה על ידי D-Tesa של סמני תת-סוג M2-

CD206, Ccl1 ו-TLR8 הם סמנים ספציפיים עבור תת-הסוגים M2a, M2b ו-M2c microglia, בהתאמה.58 D-Tesa upregulatedCD206 expression 4.{{10 קיפול }} (p < 0.001), Ccl1 3.5- קיפול (p < 0.005), וקיפול TLR8 5- (p < 0.01), בעוד ש-Tesa החופשית לא הגדילה משמעותית את הביטוי של כל אחד משלושת הסמנים הללו (איור 5A–C).

נתונים אלו מראים שמיקרוגליה שטופלה ב-D-Tesa מדגימה ויסות-על משמעותי של סמנים של כל שלושת תת-הסוגים של M2, מה שמסכים עם ההבנה שפנוטיפ מיקרוגליה הוא פלסטי ולא בינארי.63-65

המינוח M1/M2 מפשט יתר על המידה את המורכבות שמיקרוגליה יכולה להתקיים בספקטרום של מצבי הפעלה; לאורך הרצף הזה, אופיינו שלושה פנוטיפים מובהקים של M2 (M2a, M2b ו-M2c), ו-D-Tesa משרה ביטוי של סמנים התואמים לכל אחד מהמצבים הללו. חלבונים על ידי הגברת הוויסות של קולטני השואבים, תיקון רקמות ופעולות אנטי דלקתיות.

M2b microglia הם כמו M1 microglia בכך שהם מבטאים IL-1, TNF- ו-IL-6; עם זאת, M2b נבדלים מ-M1 microglia בכך שהם מבטאים IL-10 ברמות גבוהות ומווסתות למטה את ביטוי iNOS. מקרופאגים M2b ומיקרוגליה מעוררים תאי Th2 T, מה שמעיד על אחד התפקידים של M2b בהשראת תגובה אנטי דלקתית.

M2cmicroglia מעורבים בריפוי פצעים, שיפוץ רקמות, ספיגה של ברזל והפעלת STAT3 המפחיתה איתות פרו-דלקתי.58,61,63,66פעילות ה-PPAR של Tesa מעוררת לולאת הזנה קדימה שגורמת לביטוי מוגבר של PPAR וחלבון האותות שלו במעלה הזרם (STAT6), שהם שניהם סמני M2a.58D-Tesa הגדיל את הביטוי של PPAR 2.3-פיפול (p=0.0036)ו-STAT6 3.4- קיפול (p < 0.001), בעוד ש-Tesa בחינם הגדילהSTAT6 1.8-פיפול (p=0.011) ללא עלייה משמעותית בביטוי PPAR (1.58-הגדלה, p=0.17) (איור 5D ו-E).

הביטוי המוגבר של STAT6 ו-PPAR מביא לייצור גנים אנטי דלקתיים ועיכוב של אותות פרו-דלקתיים על ידי עיכוב פעילות NF-κB. מכיוון שניתן להשרות M2a microglia על ידי טיפול במיקרוגליה עם IL-4, אשר מאותת דרך STAT6 ו-PPAR, הוויסות העליונה של שני חלבוני האיתות במורד הזרם עלול לגרום לקיטוב M2a בהזנה קדימה.68

במבחנים שלנו, הפעלת LPS העלתה את רמות IL-6, TNF- ו-IL-1, וטיפול ב-D-Tesa הגביר עוד יותר את הביטוי של ציטוקינים אלה (איור S6A–D†), מה שסביר להניח עקב D-Tesa השראת הפנוטיפ M2b (איור 5B).

Free Tesa הגדיל את הביטוי של IL-6 ולא שינה משמעותית את ביטוי ה-TNF-ו-IL-1 (איור S6A–D†). בעוד שהציטוקינים הללו מופרשים על ידי M1 microglia, M2b microglia מבטאים גם ציטוקינים אלה.58,61 CD86 הוא סמן של M1 ו-M2b microglia, והוא מוגבר עם טיפול ב-D-Tesa (איור S6E†).

בנוסף, המדכא של איתות ציטוקינים (SOCS) הוא משפחה של חלבונים תוך תאיים המווסתים את הקיטוב הפנוטיפי של מיקרוגליה על ידי דיכוי מסלולי איתות מרובים המופעלים על ידי ציטוקינים.69 SOCS1 הוא אחד ממשפחה זו, והוכח כי הוא מעכב LPS/TLR4 תיווך איתות NF-κB ו-JAK2, ובכך הפחית את כמות ה-TNF-, IL-1 ו-IL-6 המשוחררים על ידי M1 microgliath דרך מסלול LPS/TLR4.

D-Tesa מגביר את הביטוי של SOCS1 בהשוואה לבקרת LPS בלבד (איור S6F†), מה שמרמז על כך שהעלייה ב-IL-6, TNF- ו-IL-1 שמציג D-Tesa יכולה להיות בגלל אינדוקציה של פנוטיפ M2b ולא באמצעות שיפור של הפנוטיפ LPS/TLR4, 1-מעורר M.

יתר על כן, אותות LPS דרך TLR4 וכדי למנוע הפעלה תאית מוגזמת, למיקרוגליה יש מנגנון משוב שלילי לפיו הפעלת TLR4 מובילה לירידה בביטוי של TLR4.70

טיפול עם Tesa ו-D-Tesa בחינם העלה את ה-TLR4levels פי 3.6- (p < 0.001) ופי 3.7- (p < 0.001), בהתאמה (איור 5F), מה שמציע כי Tesa ו-D-Tesa שינו את מסלול איתות המשוב השלילי האופייני לLPS/TRL4.

For more information:1950477648nn@gmail.com