בקרת כוונון בתיווך CRISPRI של רמת ביטוי גנים עם RNA מהונדס עם מדריך יחיד ב-Escherichia Coli

תַקצִיר

Precise control of gene expression is essential for flux redistribution in metabolic pathways. Although the CRISPR interference (CRISPRi) system can effectively repress gene expression at the transcriptional level, it has still been difficult to precisely control the level without loss of specificity or an increase in cell toxicity. In this study, we developed a tunable CRISPRi system that performs transcriptional regulation at various levels. We constructed a single-guide RNA (sgRNA) library targeting repeat, tetraloop, and anti-repeat regions to modulate the binding affinity against dCas9. Each screened sgRNA could regulate the gene expression at a certain level between fully repressing and nonrepressing states (>45-קפל). sgRNAs אלו גם אפשרו ויסות מודולרי עם רצפי DNA יעד שונים. יישמנו מערכת זו כדי להפיץ מחדש את השטף המטבולי כדי לייצר נגזרות של violacein ביחס שניתן לצפות ולמטב את ייצור הליקופן. מערכת זו תעזור להאיץ את תהליכי אופטימיזציית השטף בהנדסה מטבולית וביולוגיה סינתטית.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Enhance Immunity

【בקש עוד】 דוא"ל:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

מבוא

מערכת סוג II Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) היא מערכת מחשוף DNA מונחית RNA המורכבת מ-CRISPR RNA (crRNA), CRISPR RNA (tracrRNA) המפעיל טרנס-הפעלה וחלבון Cas9 (1) ,2). Cas9 מ- Streptococcus pyogenes נמצא בשימוש נרחב בהנדסת גנום בשל תכונותיו המאפיינות היטב (3,4). הקומפלקס של החלבון spCas9, tracrRNA ו-crRNA קושר ומבקע את פרוטו-ספייסר היעד של DNA המשלים לרצף ה-spacer של 20 נוקלאוטידים (nt) של ה-crRNA בנוכחות 5'-NGG-3' protospacer מוטיב סמוך (PAM) ) רצף (5,6). כדי לפשט את המערכת, ניתן להשתמש ב-RNA מדריך כימרי יחיד (sgRNA) שבו crRNA ו-tracrRNA מחוברים על ידי קישור מלאכותי הנקרא tetraloop (5). זה מאפשר להחליף שני RNA נפרדים במולקולת RNA בודדת, מה שהופך את המערכת לניתנת יותר לניהול. אחת המערכות המבוססות על CRISPR, CRISPR interference (CRISPRi), משתמשת ב-Cas9 לא פעיל קטליטית (dCas9) על ידי החלפת חומצות אמינו מסוימות מכל תחום אנדונוקלאז (7). שינוי זה יוצר קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין (RNP) שיכול לכוון ולהיקשר ל-DNA מטרה ומפריע ל-RNA פולימראז (RNAP) כדי לעכב את התחלת שעתוק או התארכות (7). בניגוד לנוק-אאוט על-ידי מערכת CRISPR/Cas9, CRISPR מאפשר ביטול הפיך של גנים על-ידי ביטוי dCas9 או sgRNA תחת מקדם מושרה, מה שמאפשר גמישות רבה יותר בוויסות הגנים (7). מערכת CRISPRi השתיקה למעשה את גני המטרה פי מאות (7,8). דיכוי גנים ספציפיים למטרה מאפשרת פנוטייפ בתפוקה גבוהה באמצעות מאגר sgRNA רחב גנום (9) או מפנה מחדש את שטף הפחמן בחיידקים מהונדסים לעבר כימיקל היעד (10-12). בנוסף, הוכח multiplex CRISPRi במארחים שונים תוך שימוש במגוון שיטות לביטוי יציב של מספר sgRNAs, כולל מערכי crRNA ארוכים, אינטגרציה של מתג אחיזת רגליים ומערכי sgRNA לא חוזרים על עצמם (13-16). טכניקות אלה של עיכוב גנים מרובים בו זמנית נוצלו לביצוע משימות מורכבות יותר, כגון הפחתת תוצרי ביניים רעילים או חסימת מסלולים מתחרים בתסיסה חיידקית (13,16-19). עם זאת, הדחקה מלאה לא תמיד רצויה להנדסה מטבולית. יש לשלוט במדויק על רמות ביטוי הגנים כדי להשיג פעילות אנזים אופטימלית בין מסלולי הגדילה והייצור, איזון בריכוזי מבשר תוך תאיים והימנעות מהצטברות של תוצרי ביניים רעילים (20-22). טכניקות שונות פותחו כדי להנדס את יעילות ההדחקה של CRISPRi. מספר גורמים טופלו, כגון כמות החלבון sgRNA וחלבון dCas9 או הבחירה ב-sgRNA. שליטה בביטוי dCas9 או גם בביטוי dCas9 וגם ב-sgRNA באמצעות מקדם מושרה מווסת את הביטוי של גן מטרה פי יותר מפי 30- או 300-, בהתאמה (23,24). עם זאת, נצפה כי אפנון ריכוז dCas9 יכול להוביל ליעילות דיכוי לא עקבית בפרוטו-ספייסרים שונים (23). המספר המצומצם של מקדמים זמינים הניתנים להשראת גורם גם לאתגרי עיצוב למרות מאמצים רבים (25). אסטרטגיה נוספת היא החדרה של aptamer RNA ספציפי לליגנד לתוך ה-sgRNA, כאשר מולקולה קשורה קטנה יכולה לחשוף את הספייסר, ובכך לאפשר בקרה תלוית מינון של CRISPRi (26). ה-sgRNA הספציפי לליגנד מועיל אם זוג ליגנד ואפטאמר מתאים זמין. המרחק מאתר תחילת השעתוק והכיוון של קישור dCas9 משפיעים גם על היעילות של CRISPRi (7). התאמת המרחק בין אתר הקישור של sgRNA לאתר התחלת התעתוק יכולה לייעל את המסלול בהנדסה מטבולית (17,27,28). יעילות הכלאה בין רצפי ה-spacer וה-protospacer משנה גם את יעילות הקישור של RNP (29-31). לכן, אי התאמה שתוכננה מחוץ לאזור הזרע כדי לשנות את האנרגיה החופשית הוצגו כדי לגוון את יעילות CRISPRi (31,32). עם זאת, תכנון ה-sgRNA נדרש עבור כל רצף יעד חדש, והשגת הבדל משמעותי באנרגיה חופשית רק באמצעות אי התאמה יכולה להיות מאתגרת. יתרה מכך, קיימת אפשרות להגברת הכריכה מחוץ למטרה (33). עם זאת, זה עדיין מוגבל לדיכוי מדויק של ביטויי גנים מרובים בצורה מודולרית ללא קשר לרצף המטרה. במחקר זה, פיתחנו מערכת CRISPRi הניתנת לכוונון המווסתת את ביטוי הגנים בדיוק ובניבוי גבוהים. על ידי מיון תאים המבוסס על פלואורסצנטי איטרטיבי של ספריית sgRNA המכוונת לטטרלופ והאזור האגף שלה, השגנו יעילות דיכוי תעתיק עד פי 45- אפילו כאשר ה-DNA היעד משתנה. מערכת זו מאפשרת חלוקה מחדש צפויה של השטף המטבולי ללא מניפולציה של הגנום המארח או מסלולים סינתטיים, ומספקת כלי מבטיח לייעול מסלולים מטבוליים.

חומרים ושיטות

זני חיידקים, פלסמידים וריאגנטים

זנים ופלסמידים של Escherichia coli המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלה משלימה S1. פריימרים המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלה משלימה S2. הליכי שיבוט מתוארים בשיטות המשלימות. גני המטרה ורצפי ה-DNA שלהם עבור מערכת CRISPR מוצגים בטבלה משלימה S3. Mach1-T1R שימש עבור שיבוט כללי. הספרייה נבנתה באמצעות NEB 5-alpha Electrocompetent E. coli (NEB). תרביות שגרתיות לבניית פלסמידים וזנים בוצעו ב-37◦C במרק Luria-Bertani (LB) או על צלחת LB אגר המכילה אנטיביוטיקה מתאימה (34 גרם/מ"ל כלורמפניקול, 50 גרם/מ"ל ספקטינומיצין). PCR בוצע באמצעות Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB). פלסמידים ומוצרי PCR טוהרו באמצעות GeneAll® Exprep™ Plasmid SV Kit ו- Gel SV Kit (GeneAll Biotechnology). יעילות הדיכוי של מוטנטי sgRNA חומרי תרבות לילה רענון ל-OD600 של 0.05 והודגרה עד שהגיעה לערך שבין 0.6 ל-0.8. מדיית התרבות דוללה לאחר מכן ל-OD600 של 0.05 עם 20 ננוגרם/מ"ל של aTc והודגרה למשך 4 שעות. הקרינה של מושבה בודדת נמדדה ב-575 ננומטר/616 ננומטר באמצעות קורא Hidex Sense microplate (Hidex), וערך OD600 נקבע באמצעות ספקטרופוטומטר Jenway 7300 (Jenway). הקרינה היחסית חושבה כיחידות הקרינה לכל ערך OD600, כאשר הערך עבור PC מוגדר כ-100%.

השפעות של Cistanche tubulosa-טיפול בעצירות

סקר ספריית sgRNA

נעשה שימוש באותה שיטה תרבותית כמו זו שתוארה לעיל. אמצעי התרבות דוללו ל[תא]<10−7 cells/ml in PBS buffer (pH 7.4). The fluorescence distribution was obtained from 100,000 cells from each sample using S3e Cell Sorter (Bio-Rad), and 5000 cells for each fluorescence range were sorted in each iteration. Cells were overnight cultured in fresh media for the next iteration. Samples were obtained after the final iteration and spread to the LB agar plate. Each colony was inoculated into 100 l of LB media and overnight cultured in 96-well microplate shaking at 900 rpm by Hidex Sense microplate reader (Hidex). Overnight culture media was refreshed by diluting 3 l culture media in 97 l fresh media and incubated for 2 h. Culture media was re-diluted by mixing 6 l culture media with 94 l fresh media, and aTc was added. The fluorescence of every single colony was obtained at 575 nm/616 nm by Hidex Sense microplate reader (Hidex) after 6 h of incubation. The OD600 value from the microplate reader was converted to the OD600 value from the spectrophotometer.

מיצוי RNA

RNA כולל הוצא באמצעות RNeasy Mini Kit (Qiagen) רק כאשר miRNeasy Mini Kit (Qiagen) לכימות sgRNA, לאחר טיפול עם RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen) ואחסון ב-80◦C. עיכול DNA בעמודה באמצעות RNase-Free DNase Set (Qiagen) בוצע במהלך תהליך המיצוי. זיהום DNA אומת באמצעות PCR ללא שעתוק הפוך. הריכוז והטוהר של כל דגימה נקבעו באמצעות NanoDrop One (Thermo Scientific), והאיכות הוערכה באמצעות DNA 5K/RNA/CZE 24 LabChip (PerkinElmer) על LabChip GX Touch 24 (PerkinElmer).

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

ניתוח RT-qPCR

פריימרים עבור RT-qPCR נבעו ממלאי מעבדה או תוכננו באמצעות הכלי Primer3Plus (34) ומפורטים בטבלה משלימה S4. הגן CysG שימש כגן ייחוס (35) עבור כל ניסויי RT-qPCR. עקומה סטנדרטית נוצרה על ידי 10-קיפול דילול תבנית מ-107 עותקים/ליטר ל-10−1 עותקים/ליטר. גבול הכימות נקבע על ידי התאמת מספר ההעתקה וקצב ההגברה החיובי לפונקציה סיגמואידית וחישוב ערך מספר ההעתקה החיובי של 95%. הטווח הדינמי הליניארי הוגדר כמספר ההעתקה הנמוך ביותר שבו וריאציית ה-Cq המחושבת לאחור היא פחות מ-35%. ערכי Cq מעל 30 או כאלה שלא הוגברו בשליטה שאינה תבנית אושרו. נתוני עקומה סטנדרטיים זמינים בטבלה משלימה S5 ובאיור משלים S1. סה"כ 2.5 ננוגרם של RNA הכולל שימש בתגובת RT-qPCR של 10 ליטר עם ערכת Luna® Universal One-Step RT-qPCR (NEB). RT-PCR בוצע בשלושה עותקים על StepOnePlus™ RealTime PCR System (Applied Biosystems) עם השלבים הבאים: (i) שעתוק הפוך ב-55◦C למשך 10 דקות, ולאחר מכן דנטורציה ב-95◦C למשך דקה אחת; (ii) 40 מחזורים תרמיים ב-95◦C למשך 10 שניות ו-60◦C למשך דקה אחת; (iii) ניתוח עקומת ההיתוך ב-95◦C למשך 15 שניות ו-60◦C למשך דקה אחת, ואחריה רמפה מ-60◦C ל-95◦C בקצב של 0.3◦C/min. הכימות היחסי של RNA נקבע באמצעות שיטת delta-deltaCt (36) ונותחה עם תוכנת StepOnePlus™ (Applied Biosystems).

רצף RNA (RNA-seq) וניתוח נתונים

1.5 in biological duplicate. Total RNA was extracted by the abovementioned method, and ribosomal RNA (rRNA) was depleted using Ribo-Zero plus rRNA Depletion Kit (Illumina). cDNA libraries were constructed using KAPA Stranded RNA-Seq Kits (Kapa Biosystems), with an additional size-selection step using AMPure XP (Beckman Coulter). Adapters and primers used in this study are listed in Supplementary Table S2. The concentration was measured using a Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Scientific), and the size distribution of the cDNA was measured using X-Mark LabChip (PerkinElmer) on the LabChip GX Touch 24 instrument. The average cDNA length ranged from 390 to 450 bps. RNA-Seq was performed as >19M reads of 41 bp paired-end using NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cycles) (Illumina) on NextSeq 550 (Illumina). Data analysis was performed using the reference genome of E. coli BL21(DE3) complete genome (Genbank CP001509.3) with FastQC (v0.11.9) (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) (37), Bowtie (v1.2.3) (38) with trim3 option value of 3, samtools (v1.10) (39), and cufflinks (v2.2.1) (40,41). All samples between replicates had R2 >{{0}}.92 מבוסס על FPKM (שברים לכל קילו-בסיס של תמלילים למיליון קריאות ממופה). גנים שבא לידי ביטוי דיפרנציאלי התקבלו מסף של 1.5 (מבוסס לוג2-) ו-0.01 (ערך q).

ייצור ודגימה של פרוביולצין ופרודאוקסיוויולאצאין

לייצור violacein ו-prodeoxyviolacein, נעשה שימוש בהרכב המדיום הבא: 10.7 g/l K2HPO4, 5.2 g/l KH2PO4,1g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, 1 g/l MgSO4, { {17}}.2 גרם/ליטר תמצית שמרים, ו-1{{20}} גרם/ליטר גלוקוז. מדיית תרבות לילה רעננה ל-OD600 של 0.1 ותופחה עד שה-OD600 הגיע בין 0.6 ל-0.8. מדיית התרבות דוללה לאחר מכן ל-OD600 של 0.1 והוספה עם 500 ננוגרם/מ"ל aTc, 0.05 מ"מ IPTG ו-0.1 גרם לליטר L-טריפטופן לנפח סופי של 5 מ"ל. 300 ליטר של מדיית תרבית נדגמו ובוצעו בצנטריפוגה בסל"ד 14 000 למשך 5 דקות לקבלת גלולת תאים לניתוח HPLC, ו-300 ליטר של מדיית תרבית נדגמו לצורך מיצוי RNA.

ניתוח HPLC

לצורך ניתוח מסלול ביוסינתטי של violacein, גלולת התא הושעתה מחדש במתנול בנפח {{0}}, עברה צלילים במשך 5 דקות, בוצעה צנטריפוגה וסינון דרך מסנן ניילון {5.22-m. ניתוח HPLC פעל לפי השיטה (42) עם Poroshell 120 EC-C18, 4.6 × 150 מ"מ, עמודה של 4 מ' (Agilent). שני שלבים ניידים, A עם 0.1% חומצה פורמית ב-DDW ו-B עם 0.1% חומצה פורמית באצטוניטריל, שימשו בקצב זרימה של 0.6 מ"ל/דקה עם פרופיל הגרדיאנט הבא: 95% A למשך 1.5 דקות, העלאה של A מ-95 % עד 2% למשך 4 דקות, שמירה על 2% A למשך 2 דקות, העלאת A מ-2% ל-95% למשך 30 שניות, ושמירה על 95% A למשך 10 דקות. דגימות זוהו באמצעות גלאי PDA, ואזור HPLC נקבע ב-600 ננומטר עבור violacein ו-610 ננומטר עבור prodeoxyviolacein.

ייצור ודגימה של ליקופן

לייצור ליקופן, נעשה שימוש בהרכב המדיום הבא: 13.56 גרם/ליטר Na2HPO4,6g/l KH2PO4,2g NH4Cl, 1 גרם NaCl, 2 מ"ל של 1 MgSO4, 0.1 מ"ל של 1 M CaCl2 ו-4 גרם/ליטר של גלוקוז (22). נעשה שימוש ב-27 גרם/מ"ל של כלורמפניקול ו-50 גרם\מ"ל ספקטינומיצין. מדיית תרבות לילה רענון ל-OD600 של 0.1 לנפח סופי של 5 מ"ל. כאשר ה-OD600 הגיע בין 0.5 ל-0.6, התווסף aTc לריכוז הסופי של 500 ng/ml, וכאשר ה-OD600 הגיע בין 0.9 ל-1, התווסף IPTG לריכוז הסופי של 0.02 mM. הליקופן הופץ באמצעות אצטון, כמתואר בהפניה (22). ריכוז הליקופן התקבל מהספיגה ב-475 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר Jenway 7300 באמצעות עקומה סטנדרטית. 300 ליטר של מדיית תרבות נדגמו לצורך מיצוי RNA.

יתרונות cistanche לגברים - מחזקים את המערכת החיסונית

תוצאות ודיון

ההשפעות של המוטציות ב-sgRNA על יעילות הדיכוי של מערכת CRISPR

מערכת CRISPRi יכולה לדכא ביטוי גנים כאשר הקומפלקס הטרינרי dCas9–sgRNA–DNA נקשר בחוזקה זה לזה. שיערנו שניתן לשנות את יעילות ההדחקה של מערכת CRISPRi לרמה מסוימת על ידי אפנון היווצרות קומפלקס RNP. כדי לכמת את יעילות הדיכוי של מערכת CRISPR, תכננו מערכת דיווח קרינה המבוססת על המעגל הגנטי שבו dCas9 מ-S. pyogenes מושרה על ידי אנהידרוטטרציקלין (aTc), ושני הגנים הכתבים (mCherry) וגם וריאנטים של sgRNA באים לידי ביטוי באופן מכונן (איור 1א). לאחר הוספת aTc למדיום, קומפלקס טרינרי dCas9–sgRNA– DNA חוסם את השעתוק של גן הכתב, ורמת הקרינה מצביעה באופן הפוך על יעילות ההדחקה של מערכת CRISPR. ה-sgRNA מכיל 96 נוקלאוטידים (nts) בסך הכל. אזור הספייסר (20 הנ"ט הראשונות) נקשר לרצף ה-DNA של המטרה, ושאר 76 הנ"ט תורמים להיווצרות המתחם וליציבות. מכיוון שחוסר התאמה באזור הספייסר עלול לאבד את הספציפיות ולהגביר את ההשפעות מחוץ למטרה במערכת מבוססת CRISPR (33,43), האורך המרבי של ה-sgRNA שניתן להנדס הוא 76 nts. במקרה זה, יש לקבל גודל ספרייה של 476 (כ-1045), אך היא גדולה מכדי לבנות אותה. לפיכך, נדרש לצמצם את גודל הספרייה על ידי קביעת מיקומים ספציפיים על ה-sgRNA. ראשית חקרנו כיצד מוטציות ב-sgRNA בכל אזור משפיעות על ההדחקה במערכת CRISPR. מחקר קודם דיווח כי מוטציות ב-stem-loop 1 (sg mut01 ו-sg mut02) הובילו לירידה משמעותית בפעילות הנוקליאז של Cas9, בעוד מוטציות ב-stem-loop 2 (sg mut03) או stem-loop 3 (sg) mut04) לא השפיע על פעילותו (44). sgRNA משוחזר (sg mut05) המכיל מוטציות באזור גזע-לולאה 1 ובאזורי חזרה, טטרלופ, אנטי-חזרה ו-stem-loop 2, הפחיתו גם את פעילות הנוקלאז (44). עם זאת, במערכת CRISPRi, לכל חמש גרסאות ה-sgRNA הייתה השפעה מועטה על יעילות הדיכוי בהשוואה ל-sgRNA מסוג פרא (sg WT), כאשר כל וריאנט מציג רמת הקרינה של 2-4% בהשוואה לבקרה החיובית ללא אזור מרווח ( sg PC) (איור 1B). תוצאות אלו מצביעות על כך שהיווצרות קומפלקס dCas9-sgRNA פחות רגישה לשינוי רצף באזור גזע-לולאה 1 במערכת CRISPRi, בניגוד למערכת CRISPR/Cas9. שיערנו שהסרת אזורים הקשורים ליציבות הקומפלקס יכולה להיות נקודת התחלה לשלוט בביטוי ברמות מרובות יותר. לשם כך, בנינו sgRNA קטוע (sg trcSL1) חסר המקשר, stem-loop 2 ו-stem-loop 3. ל-sgRNA קטום זה יש מספר מינימלי של רכיבים והוכח כמפחית משמעותית את פעילות הנוקלאז ב-CRISPR/ מערכת Cas9 (5,44). כאשר נבדק במערכת CRISPRi, המוטנט הפגום הזה הציג רמת קרינה של 8% בהשוואה ל-sg PC, מה שמרמז שהוא עדיין יכול להיקשר ל-dCas9 ולדכא את הגן המעניין ברמה מסוימת אפילו עם ירידה ביציבות המתחם השלישוני (איור 1B). הניתוח המבני של קומפלקס RNP מצביע על כך שאזורי המקשר, גזע-לולאה 2 ו-stem-לולאה 3 של ה-sgRNA אחראים לייצוב הקומפלקס באמצעות האינטראקציות שלהם עם תחום הנוקליאז של dCas9, מה שמוביל לירידה משמעותית ב-indel יעילות במערכת CRISPR/Cas9 (44). לעומת זאת, החזרה: אזור אנטי-חזרה וגזע-לולאה 1 של ה-sgRNA מקיימים בעיקר אינטראקציה עם תחום הזיהוי ותחום האינטראקציה של PAM של dCas9 ואינם משפיעים באופן משמעותי על יעילות ה-indel במערכת CRISPR/Cas9 (44). תוצאה זו תומכת בתצפית ש-sg trcSL1 הפגין הפחתה משמעותית בפעילות נוקלאזות במערכת CRISPR/Cas9 תוך השפעה קלה על הזיקה הקישורית במערכת CRISPRi.

איור 1. בניית המערכת וההשפעה על יעילות הדיכוי על ידי מוטציית sgRNA. (א) מערכת שני פלסמידים לכימות יעילות ההדחקה. פלסמיד אחד עם מקור p15A מכיל את הגן dCas9 תחת פרומוטור הניתן ל-aTc ואת הגן mCherry תחת פרומוטור מכונן. הפלסמיד השני עם מקור cloDF13 מכיל sgRNA מסוג פרא או מוטנטי תחת מקדם מכונן. (ב) הקרינה היחסית של כל מוטנט sgRNA (sg mut01 ~ sg mut05 ו-sg trcSL1) ו-sg WT בהשוואה ל-sg PC. +1 עד + 20 הם רצף המרווחים שנקשר לגן mCherry. sg PC: sgRNA ללא spacer כבקרה חיובית, sg WT: sgRNA פראי. פסי שגיאה מציינים סטיית תקן (n=3). ערכי P נקבעו על ידי מבחן t לא מזווג. ns: לא משמעותי, **P< 0.01

שינוי יעילות היווצרות המורכבת עבור בקרת ביטוי מרובה רמות

Tetraloop הוא מקשר מלאכותי המחבר בין crRNA ו-tracrRNA במערכת CRISPR-Cas9 (5). מבנה הגביש של הקומפלקס הטרינרי, המורכב מ-dCas9, crRNA ו-tracrRNA, הראה שלטטרלופ ו-5 ו-3 האזורים האגפים שלו יש מגע מועט עם dCas9 (44). במקביל, אזורי חזרה: אנטי-חזרה וגזע-לולאה 1 הם קריטיים עבור המתחם הפונקציונלי (44). מכיוון שהוא אינו מקיים אינטראקציה ישירה עם dCas9, ה-tetraloop והאזורים האגפים שלו נחקרו כאתרים פוטנציאליים להנדסת sgRNA עם רכיבים נוספים, כגון שילוב רצפי aptamer לגיוס חלבונים נוספים ל-sgRNA (45,46). סביר שמוטציות באזור זה יכולות לגוון את הזיקה הקישורית בין sgRNA ל-dCas9 מבלי לשבש לחלוטין את הקומפלקס. ספרייה אקראית של 12- mer (4 nt של אזור ה-tetraloop ו-4 nt של 5 ו-3 אזורים אגפים, בהתאמה) נבנתה באמצעות sg trcSL1 כתבנית כדי להוריד עוד יותר את יעילות היווצרות המורכבים בין sgRNA ל-dCas9 (איור 2A ). יישמנו אסטרטגיית מיון דו-שלבית כדי להשיג מוטציות sgRNA שונות המכסות את יעילות הדיכוי בין sg WT (מצב מדחיק מלא) ו-sg PC (מצב לא מדחיק). חילקנו את הספרייה המקורית לספריות קטנות יותר עם טווחי עוצמת הקרינה שונים, ולאחר מכן זיהינו בנפרד את הקרינה של כל וריאנט sgRNA מהספרייה הקטנה יותר. התפלגות הקרינה של הספרייה המקורית שהושגה באמצעות ציטומטריית זרימה הייתה כמעט זהה לזו של sg PC (איור 2B). עם זאת, לאחר שלושה שלבי מיון רצופים, לכל ספריה (גבוה, בינוני ונמוך) היו 63%, 24% ו-14% רמות הקרינה החציוניות בהשוואה ל-sg PC, בהתאמה (איור 2B). 82 מושבות בודדו מספריות קטנות יותר אלה, עם רמות הקרינה שנעו בין 8% ל-104% (איור 2C). תוצאות אלו מצביעות על כך ששינוי ב-tetraloop והאזור האגף שלו של ה-sgRNA יכול לווסת את זיקת הקישור בין dCas9 ו-sgRNA ליעילות דיכוי שונות. ניתוח PCR כמותי (RT-qPCR) של 10 מוטציות sgRNA (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10, טבלה משלימה S6) עם אותות פלואורסצנטי שונים בין sg WT ו-sg PC בקרב 82 מושבות sgRNA, הראו שהעלייה ברמת הפלואורסנטיות של sgRNA , המצביע על כך שמערכת CRISPRi שלנו שולטת בביטוי הגנים ברמת התעתיק (איור משלים S2). מערכת ה-CRISPRi שלנו, הניתנת לכוונון, משתמשת ב-sgRNA מהונדסים, שיכולים להשיג עד פי 45-בקרת דיכוי, המאפשרת כוונון עדין של יעילות ההדחקה מבלי לשנות את כמויות ה-dCas9 או sgRNA. יתרון בולט של המערכת שלנו הוא שהיא יכולה לכוונן עדין את יעילות הדיכוי באמצעות גרסאות sgRNA ספציפיות ללא פוטנציאל לתוצאות לא רצויות, למרות שנדרשת שיבוט נוסף. יתר על כן, עקומת הצמיחה מעידה על כך שהמערכת שלנו אינה מטילה עומס סלולרי משמעותי (איור משלים S3). יתר על כן, RNA-Seq על שלוש גרסאות sg trcSL1 עם רמות שונות של יעילות דיכוי הראו שהביטוי של 51 עד 83 גנים השתנה, בניגוד ל-262 הגנים שהשתנו ב-sg WT (איור משלים S4). תוצאות אלו מצביעות על כך שלגרסאות sg trcSL1 היו השפעות מחוץ למטרה נמוכות אף יותר מאשר למערכת CRISPRi הקונבנציונלית. זה רלוונטי במיוחד ביישומי הנדסה מטבולית, שבהם ייעול מסלולים מטבוליים כרוך לעתים קרובות במניפולציה של גנים מרובים. היכולת לכוונן את ביטוי הגנים מבלי לגרום לתופעות לוואי שליליות יכולה להאיץ משמעותית את תהליך האופטימיזציה ולשפר את היעילות והפרודוקטיביות הכוללת של המערכת.

איור 2. מבנה ספריית sgRNA והקרנה של הספרייה. (א) פיגום sgRNA בשימוש במחקר זה. 12-mer המכיל tetraloop והרצף המקיף שלו עובר מוטציה אקראית מ-sg trcSL1 כדי להשיג ספריית sgRNA. (ב) התפלגות הקרינה המתקבלת מציטומטריית זרימה לפני (משמאל) ואחרי (מימין) מיון. כל הפצה מכילה 100,000 תאים. (ג) הקרינה של מושבות בודדות המתקבלות מ-(ב). פסי שגיאה מציינים סטיית תקן (n=2).

השפעות של כמות dCas9 ו-sgRNA על יעילות הדיכוי

מכיוון ששינוי הכמות של dCas9 או sgRNA יכול לשנות את יעילות ההדחקה של מערכת CRISPRi (23,24), חיוני לבחון את ההשפעה של כמות dCas9 ו-sgRNA על יעילות הדיכוי. בדקנו את הביצועים של המערכת שלנו בתנאים שונים על ידי שינוי הכמויות של dCas9 ו-sgRNA באמצעות עשרה מוטציות sgRNA (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10). שלושה ריכוזים שונים (20, 100 ו-500 ng/ml) של המשרה שימשו לביטוי dCas9. בהשוואה לרמת mRNA dCas9 כאשר נעשה שימוש ב-20 ננוגרם/מ"ל של משרה, היא הוגדלה עוד יותר פי 15- (100 ננוגרם/מ"ל) ופי 22- (500 ננוגרם/מ"ל) (איור משלים S5A ). יש חששות לגבי ביטוי יתר של dCas9 מכיוון שרמה גבוהה של dCas9 עלולה להיות רעילה לתאים (47,48) או לפעמים לא (49). עם זאת, קצב הגדילה הופחת בפחות מ-10% כאשר נעשה שימוש בעד 500 ננוגרם/מ"ל של aTc, על פי עקומות הגדילה בריכוזי מעורר שונים (איור משלים S6). זה מצביע על כך שלכמות dCas9 לא הייתה השפעה רעילה על E. coli בתנאים שנבדקו. יעילות ההדחקה שונתה באופן שולי כאשר הכמות השונה של dCas9 באה לידי ביטוי (איור 3A). זה היה עקבי עם מחקר קודם שמערכת CRISPRi הגיעה ליעילות הדחקה מקסימלית ב-[aTc]< 5 ng/ml when the same replication origin and promoter were used for the expression of CRISPRi components (24). We set the inducer concentration to 500 ng/ml to sufficiently supply dCas9 for further applications such as multiple gene regulation. The property that our system is less sensitive to the amount of dCas9 has advantages over the strategy of adjusting inducer concentration, as the dose-dependent induction of dCas9 might be varied due to the promoters, plasmid copy numbers, or host strains (50–53). Additionally, using CRISPR-based systems allows for the simultaneous targeting of multiple genes for editing or repression, making it an effective tool for multiplexing gene regulation (54). Our tunable CRISPRi system allows for the precise modulation of repression efficiency through sgRNA variants. With this approach, it would be possible to target multiple genes with varying levels of repression simultaneously. The previous study reported that stronger promoters for sgRNA expression lead to higher repression efficiency (24). To investigate the effect of the amount of sgRNA on repression efficiency in our system, two different promoters having different strengths were used (BBa J23100; J23100 and BBa K2753055; UPJ23119). Promoter UPJ23119 contains a UP element that interacts with E. coli RNA polymerase and expresses 16-fold more transcript than J23100 (55). However, the exact fold change may vary depending on the plasmids, genes, and host strains used. Our results showed that UPJ23119 doubled sgRNA expression in our system and had higher repression efficiency (Figure 3B and Supplementary Figure S5B). These results suggest that adjusting the amount of sgRNA can further expand the dynamic range of multi-level expression and provide precise modulation of repression efficiency.

איור 3. אפיון והמודולריות של מערכת CRISPRi הניתנת לכוונון. (א) הקרינה היחסית תחת ריכוזי ATc שונים (20, 100 ו-500 ננוגרם/מ"ל). (ב) הקרינה היחסית תחת מקדמים שונים (J23100 ו-UPJ23119). (ג) הקרינה היחסית תחת פרוטו-ספייסרים שונים. ציר ה-x מציין את הקרינה היחסית של mCherry, וציר ה-y מציין את הקרינה היחסית של lacI33-mCherry (אדום) ו-araC33-mCherry (כחול). 33 bp של רצפים נוספים מ-lacI ו-araC נוספו ל-5-סוף של mCherry (56). (ד) אנרגיה חופשית של 12-mer והקרינה היחסית. קווים מקווקוים מציינים מרווח חיזוי של 95% וקווים מלאים מציינים קו רגרסיה. לא ניתן היה להשיג את ערך dG של sg trcSL1c2 באמצעות mFold ולכן לא נכלל בניתוח. (א-ד) כל פסי השגיאה מציינים סטיית תקן (n=3).

מודולריות של מערכת CRISPRi הניתנת לכוונון

לגישה שלנו באמצעות גרסאות sgRNA ספציפיות כדי לשמור על רמת ביטוי מסוימת עבור DNA יעד יש פוטנציאל לשמש כמערכת מודולרית. כדי להדגים את ההיתכנות של מערכת CRISPRi הניתנת לכוונון למיקוד פרוטו-ספייסרים שונים, בנינו שני גני היתוך (lacI{{0}}mCherry ו-araC33-mCherry) על ידי הוספת רצפים של 33 bps מ-lacI ו-araC ל5 -סוף של mCherry (56). הגנום של E. coli BL21(DE3) (GenBank: CP001509.3) מכיל שני עותקים של רצף ה-protospacer עבור lacI33- mCherry ועותק אחד עבור araC33-mCherry. עם זאת, לרצפים הכרומוזומליים הללו אין רצפי PAM, ולכן לא ניתן למקד אותם על ידי קומפלקס dCas9-sgRNA (43). כאשר ה-sirnas תוכננו לכוון לכל פרוטו-ספייסר, יעילות הדיכוי נשמרה באופן עקבי עבור כל ה-protospacers מ-lacI33, araC33 ו-mCherry (איור 3C). ממצאים אלו מצביעים על כך שמערכת ה-CRISPRi הניתנת לכוונון יכולה לווסת ביעילות את ביטוי הגנים ברמה מסוימת ללא קשר לרצף הפרוטו-ספייסר. הסבר פוטנציאלי אחד לקשר הנצפה בין היווצרות קומפלקס RNP ויעילות הדיכוי הוא השינוי באנרגיה החופשית כאשר הקומפלקס נוצר. מקשר ה-tetraloop המלאכותי והאזור האגף שלו מכילים שני זוגות בסיסים A: U ו-G: C ווטסון-קריק וזוג בסיסים A:G שאינו ווטסון-קריק (44). מכיוון שהקישור של crRNA ו-tracrRNA חיוני להיווצרות המתחם, מוטציות המכוונות ל-tetraloop ישפיעו על זיקת הקישור בין dCas9 ל-sgRNA. זיקה זו ניתנת לחישוב מהפרש האנרגיה החופשית בין המצב התחום והבלתי מוגבל. עם זאת, חישוב האנרגיה החופשית של מצבים מוגבלים הוא מאתגר (57). הנחנו שהמבנה והיציבות הכוללים של המצב התחום אינם משתנים מאחר ש-sgRNA ממוינים מהספרייה לא שיבשו לחלוטין את תפקודו. יתר על כן, לטטרלופ והאזור האגף שלו יש מגע מועט עם dCas9 (44). לכן, זיקת הקישור בין dCas9 ל-sgRNA תושפע בעיקר מיציבות המבנה המשני של ה-tetraloop והרצף האגף שלו. בהתבסס על רעיון זה, חישבנו את האנרגיה החופשית של ה-tetraloop ורצפי הצד שלו באמצעות עובש (58). ההבדל באנרגיה החופשית של הקיפול עקב המוטציות מוגדר כהבדל בין האנרגיה החופשית של הרצף המוטציה לרצף הפראי. זה יכול להיות מחושב ישירות מהאנרגיה החופשית של קיפול של מוטנטים שכן אנרגיית הקיפול של הרצף הפראי קבועה ב-4.3 קק"ל/מול. ככל שהאנרגיה החופשית של הקיפול גדלה, אות הקרינה גדל (איור 3D). יעילות ההדחקה הייתה הגבוהה ביותר כאשר אנרגיית הקיפול של האזור המכיל טטרלופ הייתה קרובה או מתחת ל-0 קק"ל/מול וירדה באופן ליניארי כאשר אנרגיית הקיפול עלתה על 0 קק"ל/מול. תצפית זו מציעה שהיעילות של היווצרות מורכבות בין dCas9 ל-sgRNA נקבעת על ידי המבנה המשני של אזור ה-tetraloop, מה שעוזר להסביר את המודולריות של המערכת שלנו. יעילות ההדחקה של 85 sgRNA נוסף עם רצפי 12-מר שונים מהספרייה נמדדה כדי לאמת עוד יותר את הקשר הזה. זה גם הראה את המתאם שנצפה מגרסאות sg trcSL1 (איור 3D וטבלה משלימה S7), מה שמצביע על כך שמקשר ה-tetraloop ממלא תפקיד מכריע ביצירת קומפלקס RNP וכי מוטציות באזור זה יכולות להשפיע על היעילות של מערכת CRISPR. בנוסף, קשר זה מראה את האפשרות של עיצוב מבוסס מחשב של גרסאות sgRNA עם יעילות דיכוי רצויה.

יישום מערכת CRISPRi ניתנת לשינוי לפיזור מחדש של שטף במסלול הביוסינתטי של violacein ב-E. coli

Redistributing the metabolic flux is an important process in metabolic engineering to maximize the yield of target products (59,60). Because our system could precisely control gene expression by targeting any protospacer, we chose the violacein biosynthetic pathway as a model system for pathway redistribution. Violacein is an indole derivative compound that exhibits a deep purple color, originally produced by Chromobacterium violaceum (Figure 4A) (61). This compound is synthesized from L-tryptophan by five enzymes encoded by vioA, vioB, vioE, vioD, and vioC (62). Along with violacein (V), other indole derivatives such as proviolacein (PV), deoxyviolacein (DV), and prodeoxyviolacein (PDV) with different colors can also be produced (Figure 4A) (62). The production of violacein and deoxy violacein is an enzymatic process mediated by vioC, while the production of PV and PDV is a non-enzymatic process. We expressed the violacein biosynthetic pathway under the IPTG inducible promoter (63), and different trcSL1 variants were designed to target vioD to redirect the flux. It could effectively modulate the expression of vioD at the transcriptional level (Figure 4B). vioC was repressed by sg WT and showed high variation (Supplementary Figure S7), but the absolute copy number was kept at low levels (>100-פיפול) בהשוואה לגנים אחרים בחישוב מהעקומות הסטנדרטיות. לעומת זאת, הביטוי של אנזימים לא מוסדרים אחרים במסלול violacein (vioA, vioB ו-vioE) נותר ללא שינוי. תוצאות אלו מצביעות על כך שהמערכת שלנו יכולה לכוון ולווסת באופן ספציפי את הביטוי של גנים בודדים מבלי להשפיע על גנים אחרים במסלול. כימות ישיר של PV ו-PDV לא היה אפשרי עקב היעדר תקנים זמינים מסחרית לניתוח HPLC. כך מדדנו את הטיטרים ביחידות שרירותיות באמצעות שטח השיא של HPLC. הטיטר של המוצר הגיע למקסימום ב-8 שעות לאחר האינדוקציה ולאחר מכן ירד בהדרגה (איור משלים S8), אולי עקב הפיכת המוצר למוצרי לוואי אחרים, כגון כרומובירידנים, על ידי מנגנון לא ידוע (42,64). השיאים הקטנים שנצפו בספקטרום HPLC הצביעו על נוכחות של תוצרי לוואי קלים נוספים. מחקרים קודמים הוכיחו שניתן לחזות את הלוגריתם של הטיטר של כל מוצר ביחידות שרירותיות על ידי שילובים ליניאריים של חוזק המקדם של כל גן המעורב במסלול הביוסינתטי של violacein (42). מודל רגרסיה לוג-לינארית זה היה תקף גם במערכת שלנו, ותמלילי vioD מוגברים היו קשורים לייצור PV מוגבר (איור 4B). ידוע שהנדסת הפרוטור או 5 -UTR של כל גן המעורב במסלול הביוסינתטי של violacein אפשרה חלוקה מחדש של השטף ואופטימיזציה של המסלול (65,66). המערכת שלנו יכולה לעבוד כשיטה חלופית הממחישה את בקרת התעתוק מבלי לתמרן מקדמים המעורבים במסלול באמצעות sgRNA סינתטיים, שהם קצרים וניתן להרכיב אותם בשיטות חד-שלביות. הקרנה דרך מערכת CRISPRi הניתנת לכוונון מאפשרת לנתב מחדש את המסלול בשטף צפוי לפני מניפולציה ישירה של זני מארח או קלטות גנים, מה שעלול להאיץ את התהליך.

יישום מערכת CRISPRi הניתנת לכוונון לאיזון שטף הפחמן ב-E. coli המייצר ליקופן

ייצור יעיל של תרכובות יקרות ערך בהנדסה מטבולית מחייב איזון שטף הפחמן. מסלול ה-methylerythritol 4-phosphate (MEP) הוא מסלול מטבולי שמשתמש בחומרים מקדימים פשוטים כגון פירובט וגליצרלדהיד 3-פוספט (GAP) לייצור אבני בניין איזופרנואידים, דימתילאליל פירופוספט ואיסופנטניל (67,68) . מולקולות אלו מסנתזות גרניל פירופוספט, אשר הופך ל-Farnesyl pyrophosphate (FPP) (67,68). ליקופן, קרוטנואיד מוערך מאוד עם תכונות נוגדות חמצון חזקות ויישומים מגוונים בתעשיות שונות (69), מסונתז מ-FPP באמצעות סדרה של תגובות אנזימטיות מ- crtE, crtB ו- crtI (איור 4C) (22,70). מבשר ה-GAP חיוני לא רק עבור מסלול MEP אלא גם עבור מסלול הגליקוליזה (22). ירידה בביטוי של הגן gapA, המקודד לגליצראלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) במסלול הגליקוליזה, הוכח כמשפר את ייצור הליקופן על ידי הגדלת מאגר ה-GAP (22). לכן, התמקדנו ב-gapA עם חמש גרסאות, כולל שלוש גרסאות sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5 ו-sg trcSL1c6) שהראו יעילות דיכוי שונות, sg PC ו-sg WT. עם זאת, gapA הוא גן חיוני שלא ניתן להפיל לחלוטין (71,72). ניסיונות להדחיק את gapA עם CRISPRi קונבנציונלי באמצעות sg WT לא צלחו אפילו עם הדליפה הנמוכה של dcas9 תחת מקדם tet (73). מצד שני, דיכוי רב-רמות של ביטוי גן gapA באמצעות מערכת CRISPRi הניתנת לכוונון הושג ללא פגם בגדילה והביא לעלייה של פי 2.7- עם sg trcSL1c6 בייצור הליקופן בהשוואה לזן המבטא במלואו את הגן gapA לאחר 15 שעות של טיפוח (איור 4D ואיור משלים S9). דווח כי רק 10% מהביטוי הטבעי של הגן gapA מוביל למאגר מוגבר של GAP ללא שינוי משמעותי במטבוליטים במורד הזרם במסלול הגליקוליזה, כגון 2-פוספוגליצרט ו-3-פוספוגליצרט ( 22). ביחד, תוצאות אלו מוכיחות ש-CRISPRi הניתן לכוונון יכול לדכא במדויק ביטוי גנים במספר רמות ללא הנדסת כרומוזומים.

איור 4. יישום של מערכת CRISPRi הניתנת לכוונון עבור מסלול ביוסינתטי של violacein. (א) מסלול ביוסינתטי של Violacein ובניית הפלסמיד. חמישה גנים (vioA, vioB, vioC, vioD ו-vioE) האחראים לייצור violacein שובטו לתוך פלסמיד dCas9-. מיוצרים ארבעה מוצרים עיקריים (violacein, proviolacein, deoxyviolacein ו-prodeoxyviolacein). sg WT עבור vioC וחמש גרסאות sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6, sg trcSL1c8 ו-sg trcSL1c9) עבור vioD, המציגים יעילות דיכוי שונה, שוכפלו לתוך הפלסמיד השני. Trp: L-טריפטופן, V: violacein, PV: proviolacein, PDV: prodeoxyviolacein, DV: deoxyviolacein, PDVA: protodeoxyviolaceinic acid, PVA: protoviolaceinic acid. (ב) קשר בין תעתיקי vioD, קרינת mCherry וטיטר של PDV ו-PV. ציר ה-x מציין את ה-vioD ה-RNA היחסי המתקבל מ-RT-qPCR, ציר ה-y משמאל מציין את הקרינה היחסית של mCherry מאיור 3, וציר ה-y מימין מציין את היחס בין שטח HPLC. דגימות עם הערך הגבוה ביותר של vioD RNA נקבעו ל-100% לנורמליזציה. (ג) מסלול ביוסינתטי ליקופן ובניית הפלסמיד. שלושה גנים (crtE, crtB, crtI) האחראים לייצור ליקופן שובטו לתוך פלסמיד dCas9-. gapA היה ממוקד עם גרסאות sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6) ו-sg PC שובט לתוך הפלסמיד השני. Glc: גלוקוז, GAP: גליצרלדהיד 3-פוספט, 1,3- BPG: 1,3-ביספוספוגליצרט, DMAPP: דימתילאליל פירופוספט, IPP: איזופטנניל פירופוספט, FPP: פרנסיל פירופוס. (ד) קשר בין תעתיקי gapA, קרינת mCherry וייצור ליקופן. ציר ה-x מציין את RNA הפער היחסי המתקבל מ-RT-qPCR, ציר ה-y משמאל מציין את הקרינה היחסית של mCherry מאיור 3, וציר ה-y מימין מציין את הטיטר של הליקופן. (ב, ד) כל פסי השגיאה מציינים סטיית תקן (n=3).

סיכום

תכננו מערכת CRISPRi ניתנת לשינוי שיכולה לשלוט במדויק על ביטוי הגנים ברמה הרצויה. על ידי שינוי ה-tetraloop והאזור האגף שלו, sgRNA סינתטיים המכוונים לרצפי פרוטו-ספייסרים שונים יכולים לווסת את הגן ברמה מסוימת. יישמנו בהצלחה מערכת זו כדי לנתב מחדש את השטף המטבולי של עניין במסלול הביוסינתטי של violacein לייצור נגזרות אינדול ביחס שניתן לצפות מראש. בנוסף, הראינו שהשימוש ב-CRISPRi הניתן לכוונון הוביל לעלייה של פי 27- בייצור הליקופן, מה שמדגיש את הרבגוניות של המערכת שלנו לשיפור הייצור של תרכובות יקרות ערך אחרות. מערכת זו תאיץ את תהליכי אופטימיזציית השטף לפני מניפולציה קבועה של מידע גנטי של המארח, כגון החלפת המקדם או 5-רצפי UTR.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

הפניות

1. Sapranauskas,R., Gasiunas,G., Fremaux,C., Barrangou,R., Horvath,P. ו-Siksnys,V. (2011) מערכת Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas מספקת חסינות ב-Escherichia coli. Nucleic Acids Res., 39, 9275–9282.

2. Gasiunas,G., Barrangou,R., Horvath,P. ו-Siksnys,V. (2012) Cas9-crRNA ribonucleoprotein קומפלקס מתווך ביקוע DNA ספציפי לחסינות אדפטיבית בחיידקים. פרוק. נאטל. אקד. Sci. ארה"ב, 109, E2579–E2586.

3. Cong, L., Ran,FA, Cox, D., Lin,S., Barretto, R., Habib,N., Hsu, PD, Wu,X., Jiang, W., Marraffini, LA וחב' . (2013) הנדסת גנום מרובה באמצעות מערכות CRISPR/Cas. מדע, 339, 819–823.

4. Ran, FA, Hsu,PD, Wright, J., Agarwala, V., Scott, DA and Zhang,F. (2013) הנדסת גנום באמצעות מערכת CRISPR-Cas9. נאט. פרוטוקול, 8, 2281–2308.

5. Jinek,M., Chylinski,K., Fonfara,I.,Hauer,M.,Doudna,JA and Charpentier,E. (2012) אנדונוקלאז DNA מונחה כפול RNA שניתן לתכנות בחסינות חיידקית אדפטיבית. מדע, 337, 816–821.

6. Anders, C., Niewoehner,O., Duerst,A. ו-Jinek,M. (2014) בסיס מבני של זיהוי יעד DNA תלוי PAM על ידי אנדונוקלאז Cas9. טבע, 513, 569–573.

7. Qi,LS, Larson, MH, Gilbert, LA, Doudna,JA, Weisman,JS, Arkin,AP and Lim,WA (2013) ייעוד מחדש של CRISPR כפלטפורמה מונחית RNA לבקרה ספציפית לרצף של ביטוי גנים. תא, 152, 1173–1183.

8. Larson,MH, Gilbert,LA, Wang,X., Lim,WA, Weisman,JS ו-Qi,LS (2013) התערבות CRISPR (CRISPRi) לבקרה ספציפית לרצף של ביטוי גנים. נאט. פרוטוקול, 8, 2180–2196.

9. McGlincy, NJ, Meacham, ZA, Reynaud,KK, Muller, R., Baum, R. ו-Ingolia,NT (2021) ספריית מדריך התערבות CRISPR בקנה מידה גנום מאפשרת פרופיל פנוטיפי מקיף בשמרים. BMC Genomics, 22, 205.

10. Yoon,J. ו-Woo,HM (2018) הנדסה מטבולית בתיווך הפרעות CRISPR של Corynebacterium glutamicum לייצור הומו-בוטיראט. ביוטכנולוגיה. Bioeng., 115, 2067–2074.

11. Cleto,S., Jensen,JV, Wendisch,VF and Lu,TK (2016) הנדסה מטבולית של Corynebacterium glutamicum עם הפרעות CRISPR (CRISPRi). ACS Synth. ביול., 5, 375–385.

12. Zhang,GQ, Ren,XN, Liang,XH, Wang,YQ, Feng,DX, Zhang,YJ, Xian,M. ו-Zou,HB (2021) שיפור הייצור המיקרוביאלי של חומצות אמינו: מגישות קונבנציונליות ועד למגמות האחרונות. ביוטכנולוגיה. ביופרוק. E, 26, 708–727.

13. Kim,SK, Seong,W., Han,GH, Lee,DH and Lee,SG (2017) דיכוי מרובה מונחה CRISPR של גנים אנדוגניים של מסלול מתחרים להפניית שטף מטבולי ב-Escherichia coli. מיקרוב. תא עובדה, 16, 188.

14. Ellis,NA, Kim,B.,Tung,J. ו-Machner,MP (2021) כלי התערבות CRISPR מרובה לחקירת גנים ארסיים ב- Legionella pneumophila. Commun. ביול., 4, 157.

15. Siu,KH and Chen,W. (2019) gRNA עם אחיזת רגליים בשליטה בריבו עבור תפקוד CRISPR-Cas9 שניתן לתכנות. נאט. Chem. ביול., 15, 217–220.

16. Reis,AC, Halper,SM, Vezeau,GE, Cetnar,DP, Hossain,A., Clauer,PR and Salis,HM (2019) דיכוי סימולטני של גנים חיידקיים מרובים באמצעות מערכי sgRNA ארוכים במיוחד שאינם חוזרים על עצמם. נאט. ביוטכנולוגיה, 37, 1294–1301.

17. Tian,T., Kang,JW,Kang,A. ו-Lee,TS (2019) הפניית שטף מטבולי באמצעות הדחקה בתיווך CRISPRi מולטיפלקס קומבינטורי לייצור איזופנטנול ב-Escherichia coli. ACS Synth. ביול., 8, 391–402.

18. Gautam,R., Seibold,GM, Mueller,P., Weil,T.,Weiss,T., Handrick,R. ו-Eikmanns,BJ (2019) מערכת התערבות CRISPR כפולה הניתנת להשראה עבור מיקוד גנים מרובים ב- Corynebacterium glutamicum. פלסמיד, 103, 25–35.

19. Yao,L., Cengic,I., Anfelt,J. והדסון, EP (2016) דיכוי גנים מרובה בציאנובקטריה באמצעות CRISPRi. Acs Synth. ביול., 5, 207–212.

20. Lim,HG, Noh,MH, Jeong,JH, Park,S. ו-Jung,GY (2016) איזון מחדש אופטימלי של מסלול ייצור החומצה הידרוקסית-פרופיונית מגליצרול ב-Escherichia coli. ACS Synth. ביול., 5, 1247–1255.

21. Yang,Y., Lin,Y., Li,L., Linhardt,RJ ויאן,Y. (2015) ויסות חילוף החומרים של malonyl-CoA באמצעות RNA סינתטי אנטי-סנס לביוסינתזה מוגברת של מוצרים טבעיים. Metab. אינג', 29, 217–226.

22. Jung,J., Lim,JH, Kim,SY, Im,DK, Seok,JY, Lee,SV, Oh,MK and Jung,GY (2016) איזון מבשר מדויק לייצור איזופרנואידים על ידי שליטה עדינה של ביטוי gapA ב אי קולי. Metab. אינג', 38, 401–408.

23. Li,XT, Jun,Y., Erickstad,MJ, Brown,SD, Parks,A., Court,DL and Jun,S. (2016) tCRISPRi: בקרה חד-שלבית ניתנת לשינוי והפיכה של ביטוי גנים. Sci. נציג, 6, 39076.

24. Fontana,J., Dong,C., Ham,JY, Zalatan,JG and Carothers,JM (2018) ביטוי מוסדר של sgRNAs מנגינות CRISPRi ב-E. coli. ביוטכנולוגיה. J., 13, e1800069.

25. Kim,NM, Sinnott,RW and Sandoval,NR (2020) חיישנים ביולוגיים מבוססי גורמי שעתוק ומערכות הניתנות להשראה בחיידקים שאינם מודלים: התקדמות נוכחית וכיוונים עתידיים. Curr. דעה. ביוטכנולוגיה, 64, 39–46.

26. Kundert, K., Lucas,JE, Watters,KE, Fellmann, C., Ng,AH, Heineike,BM, Fitzsimmons,CM, Oakes,BL, Qu,J., Prasad,N. et al. (2019) שליטה ב-CRISPR-Cas9 עם sgRNAs המופעלים על ידי ליגנד ומבוטלים. נאט. Commun., 10, 2127.

27. Ferreira, R., Skrekas, C., Hedin, A., Sanchez, BJ, Siewers, V., Nielsen, J. ודוד, פ. (2019) כוונון עדין בסיוע מודל של חילוף החומרים המרכזי של פחמן בשמרים באמצעות רגולציה מבוססת9-dCas. ACS Synth. ביול., 8, 2457–2463.

28. Su,T., Guo,Q., Zheng,Y., Liang,Q., Wang,Q. ו-Qi,Q. (2019) כוונון עדין של hemB באמצעות CRISPRi להגברת 5-ייצור החומצה האמינו-לוולינית ב-Escherichia coli. חֲזִית. מיקרוביול., 10, 1731.

29. Zheng,T., Hou,Y., Zhang,P., Zhang,Z., Xu,Y., Zhang,L., Niu,L., Yang,Y., Liang,D., Yi,F . et al. (2017) יצירת פרופיל של סגוליות RNA חד-מדריך חושף רצף ליבה רגיש לחוסר התאמה. Sci. נציג, 7, 40638.

30. Jiang,W., Bikard,D., Cox,D., Zhang,F. ו-Marraffini,LA (2013) עריכה מונחית RNA של גנומים חיידקיים באמצעות מערכות CRISPR-Cas. נאט. ביוטכנולוגיה,

31, 233–239. 31. van Gestel,J., Hawkins,JS, Todor,H. ו-Gross, CA (2021) צינור חישובי לתכנון RNAs מדריכים עבור חוסר התאמה-CRISPRi. STAR Protoc, 2, 100521.

32. Hawkins,JS, Silvis,MR, Koo,BM, Peters,JM, Osadnik,H., Jost,M.,Hearne,CC,Weissman,JS,Todor,H. ו-Gross, CA (2020) Mismatch-CRISPRi חושף את יחסי הביטוי-כושר המשתנים של גנים חיוניים ב-Escherichia coli וב-Bacillus subtilis. Cell System, 11, 523–535.

33. Fortin,J.-P., Tan,J., Gascoigne,KE, Haverty,PM, Forrest,WF, Costa,MR and Martin,SE (2019) מיקוד של ריבוי גנים וסובלנות לחוסר התאמה יכולים לבלבל ניתוח של גנום- מסכי CRISPR רחבים מאוחדים. גנום ביול., 20, 21.

34. רוזן,ש. וסקאלצקי, ה. (2000) Primer3 ב- WWW עבור משתמשים כלליים ועבור מתכנתי ביולוגים. שיטות מול. ביול., 132, 365–386.

35. Zhou,K., Zhou,L., Lim,Q., Zou,R., Stephanopoulos,G. וגם, HP (2011) גנים התייחסות חדשים לכימות תגובות תעתיק של Escherichia coli לביטוי יתר של חלבון על ידי PCR כמותי. BMC מול. ביול., 12, 18.

36. Livak,KJ and Schmittgen,TD (2001) ניתוח של נתוני ביטוי גנים יחסיים באמצעות PCR כמותי בזמן אמת ושיטת 2(-Delta Delta C(T))). שיטות, 25, 402–408.

37. אנדרוז, ס. (2010) FastQC: כלי בקרת איכות לנתוני רצף תפוקה גבוהה. v0.11.9 ed.

38. Langmead, B., Trapnell, C., Pop,M. ו-Salzberg,SL (2009) יישור מהיר במיוחד ויעיל בזיכרון של רצפי DNA קצרים לגנום האנושי. Genome Biol., 10, R25.

39. Danecek, P., Bonfield, JK, Liddle, J., Marshall, J., Ohan, V., Pollard, MO, Whitwham, A., Keane, T., McCarthy, SA, Davies,RM et al. (2021) שתים עשרה שנים של SAMtools ו-BCFtools. Gigascience, 10, giab008.

40. Trapnell, C., Williams, BA, Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., Van Baren, MJ, Salzberg,SL, Wold, BJ and Pachter,L. (2010) הרכבה וכימות תמלול על ידי RNA-Seq חושף תמלילים ללא הערות ומעבר איזופורמים במהלך התמיינות תאים. נאט. ביוטכנולוגיה, 28, 511–515.

41. Trapnell, C., Hendrickson, DG, Sauvageau, M., Goff, L., Rinn, JL and Pachter,L. (2013) ניתוח דיפרנציאלי של ויסות גנים ברזולוציית תמלול עם RNA-seq. נאט. ביוטכנולוגיה, 31, 46–53.

42. Lee,ME, Aswani,A., Han,AS, Tomlin,CJ and Dueber,JE (2013) אופטימיזציה ברמת הביטוי של מסלול ריבוי אנזים בהעדר בדיקת תפוקה גבוהה. Nucleic Acids Res., 41, 10668–10678.

43. Hsu,PD, Scott,DA, Weinstein,JA, Ran,FA, Konermann,S.,Agarwala,V., Li,Y.,Fine,EJ,Wu,X.,Sham,O. et al. (2013) ספציפיות המיקוד של DNA של נוקלאזות Cas9 מונחות RNA. נאט. ביוטכנולוגיה, 31, 827–832.

44. Nishimasu, H., Ran,F., Hsu,P., Konermann,S., Shehata,S., Dohmae,N., Ishitani,R., Zhang,F. ונורקי,או. (2014) מבנה גביש של Cas9 במתחם עם RNA Guide ו-DNA יעד. תא, 156, 935–949.

45. Fu,Y., Rocha,PP, Luo,VM, Raviram,R., Deng,Y., Mazzoni,EO and Skok,JA (2016) פיגומי CRISPR-dCas9 ו-sgRNA מאפשרים הדמיה חיה בצבע כפול של רצפי לווין ולוקוסים בודדים מועשרים חוזרים. נאט. Commun., 7, 11707.

46. ​​Khosravi,S., Shindele,P., Gladilin,E., Dunemann,F., Rutten,T.,Puchta,H. והובן, א. (2020) יישום Aptamers משפר הדמיה חיה מבוססת CRISPR של טלומרים צמחיים. חֲזִית. Plant Sci., 11, 1254.

47. Nielsen, AA ו-Voigt, CA (2014) מעגלים גנטיים CRISPR/Cas מרובי כניסות המתממשקים לרשתות רגולטוריות מארחות. מול. סיסט. ביול., 10, 763.

48. Lee,YJ, Hoynes-O'Connor,A., Leong,MC and Moon,TS (2016) בקרה ניתנת לתכנות של ביטוי גנים חיידקיים עם ה-44, 2462-2473.

49. Vigouroux,A., Oldewurtel,E., Cui,L., Bikard,D. ו-van Teeffelen,S. (2018) כוונון היכולת של dCas9 לחסום שעתוק מאפשרת דפיקה חזקה וחסרת רעש של גנים חיידקיים. מול. סיסט. Biol., 14, e7899.

50. Zhang,Y., Shang,X., Lai,S., Zhang,G., Liang,Y. וון, טי. (2012) פיתוח ויישום של מערכת ביטוי הניתנת להשראת ארבינוז על ידי הקלת קליטת מעורר ב- Corynebacterium glutamicum. יישום סביבה. מיקרוביול., 78, 5831–5838.

51. Thompson,MG, Sedaghatian, N., Barajas, JF, Wehrs,M., Bailey,CB, Kaplan,N., Hillson,NJ, Mukhopadhyay,A. ו- Keasling, JD (2018) בידוד ואפיון של מוטציות חדשות במקור pSC101 המגדילות את מספר העותקים. Sci Rep-UK, 8, 1590. 52. Fricke,PM, Link,T., Gatgens,J., Sonntag,C., Otto,M., Bott,M. ו-Polen,T. (2020) פלסמיד ביטוי הניתן לכיוונון L-arabinose עבור חיידק החומצה האצטית Gluconobacter oxydans. יישום מיקרוביול. ביוטכנולוגיה, 104, 9267–9282.

53. Nguyen,TT, Nguyen,NH, Kim,Y., Kim,JR and Park,S. (2021) אפיון In vivo של מערכת המקדמים הניתנים להשראה של 3-הידרוגנאז הידרוקסי-פרופיוני ב-Pseudomonas denitrificans. Biotechnol Bioproc E, 26, 612–620.

54. McCarty, NS, Graham, AE, Studena, L. ו-Ledesma-Amaro,R. (2020) טכנולוגיות CRISPR משולבות לעריכת גנים וויסות שעתוק. נאט. קהילה, 11, 1281.

55. יאן, ש. ו-Fong,SS (2017) מחקר של השפעות כריכה של תעתוק חוץ-גופית ורעש באמצעות פרומטורים מכוננים בשילוב עם רצפי אלמנטים UP ב-Escherichia coli. ג'יי ביול. אינג', 11, 33.

56. Seo,SW, ​​Yang,JS, Kim,I., Yang,J., Min,BE, Kim,S. ו-Jung,GY (2013) עיצוב חזוי של אזור התחלת תרגום mRNA כדי לשלוט ביעילות התרגום הפרוקריוטי. Metab. אינג', 15, 67–74. 57. Kappel,K., Jarmoskaite,I., Vaidyanathan,PP, Greenleaf,WJ, Herschlag,D. ודאס,ר. (2019) בדיקות עיוורות של חיזוי זיקה של קשירת חלבון RNA. פרוק. נאטל. אקד. Sci. ארה"ב, 116, 8336–8341.

58. צוקר, מ. (2003) שרת אינטרנט Mfold עבור קיפול חומצת גרעין וחיזוי הכלאה. Nucleic Acids Res., 31, 3406–3415.

59. Xiong,B., Zhu,Y., Tian,D., Jiang,S., Fan,X., Ma,Q., Wu,H. ו-Xie,X. (2021) חלוקה מחדש של שטף של חילוף חומרים מרכזי של פחמן לייצור יעיל של l-טריפטופן ב-Escherichia coli. ביוטכנולוגיה. Bioeng., 118, 1393–1404.

60. Yao,R., Li,J., Feng,L., Zhang,X. והו,ה. (2019) (13)C הנדסה מטבולית מונחית ניתוח שטף מטבולי של Escherichia coli לייצור אצטול משופר מגליצרול. ביוטכנולוגיה. דלק ביולוגי, 12, 29.

61. דוראן, נ. ו-Menck,CF (2001) Chromobacterium violaceum: סקירה של נקודות מבט פרמקולוגיות ותעשייתיות. קריט. Rev. Microbiol., 27, 201–222.

62. Balibar,CJ and Walsh,CT (2006) ביוסינתזה במבחנה של violacein מ-L-טריפטופן על ידי האנזימים VioA-E מ- Chromobacterium violaceum. ביוכימיה, 45, 15444–15457.

63. Gwon,DA, Seok,JY, Jung,GY and Lee,JW (2021) אבולוציה מעבדתית אדפטיבית בסיוע ביו-חיישן לייצור violacein. Int. י.מול. Sci., 22, 6594.

64. Sanchez, C., Brana, AF, Mendez, C. ו-Salas,JA (2006) הערכה מחדש של המסלול הביוסינתטי של violacein והקשר שלו לביו-סינתזה של אינדולוקרבזול. Chem. ביו. Chem., 7, 1231–1240.

65. Jones,JA, Vernacchio,VR, Lachance,DM, Lebovich,M., Fu,L., Shirke,AN, Schultz,VL, Cress,B., Linhardt,RJ and Koffas,MA (2015) ePathOptimize: a גישה קומבינטורית לאיזון תעתיק של מסלולים מטבוליים. Sci. Rep., 5, 11301.

66. Zhang, Y., Chen, H., Zhang, Y., Yin, H., Zhou, C. ו-Wang,Y. (2021) הנדסה ישירה של RBS של אשכול הגנים הביוסינתטי לפריון יעיל של violaceins ב-E. coli. מיקרוב. עובדת תא, 20, 38.

67. Hunter,WN (2007) המסלול הלא-mevalonate של ביוסינתזה של מבשר איזופרנואידים. ג'יי ביול. Chem., 282, 21573–21577.

68. Rohmer,M. (1999) הגילוי של מסלול בלתי תלוי ב-mevalonate לביו-סינתזה של איזופרנואידים בחיידקים, אצות וצמחים גבוהים יותר. נאט. לְדַרבֵּן. רפ., 16, 565–574.

69. Muller,L., Caris-Veyrat,C., Lowe,G. ובוהם, V. (2016) ליקופן ותפקידו נוגד החמצון במניעת מחלות לב וכלי דם - סקירה קריטית. קריט. Rev. Food Sci. נוטר, 56, 1868–1879.

70. Miura,Y., Kondo,K., Saito,T., Shimada,H., Fraser,PD and Misawa,N. (1998) ייצור הקרוטנואידים ליקופן, בטא-קרוטן ואסטקסנטין בשמרי המזון Candida utilis. יישום סביבה. Microbiol., 64, 1226–1229.

71. Goodall,ECA, Robinson, A., Johnston,IG, Jabbari,S., Turner,KA, Cunningham,AF, Lund,PA, Cole,JA and Henderson,IR (2018) הגנום החיוני של Escherichia coli K{ {2}}. Mbio, 9, ה02096-17.

72. Baba,T., Ara,T., Hasegawa,M., Takai,Y., Okumura,Y., Baba,M., Datsenko,KA, Tomita,M., Wanner,BL and Mori,H. (2006) בנייה של Escherichia coli K-12 מוטציות נוק-אאוט של גן בודד בתוך מסגרת: אוסף Keio. מול. סיסט. ביול., 2, 2006.0008.

73. ברטרם, ר. והילן, וו. (2008) היישום של מדכא Tet בוויסות וביטוי גנים פרוקריוטיים. מיקרוב. ביוטכנולוגיה, 1, 2–16.