פוטנציאל קוסמוטי של תמציות שמקורן בשאריות תעשיית הדיג: פסולת סרדינים ומסגרות דג בקלה חלק 1

תַקצִיר: תעשיית הדיג מייצרת כמויות גדולות של פסולת (20-75 אחוזים (w/w) ממשקל הדגים הנלכד הכולל). השחזור של תרכובות ביו-אקטיביות משאריות ושילובן בקוסמטיקה מייצג הזדמנות שוק מבטיחה ועשויים לתרום לייצוא בר קיימא של המגזר. בעבודה זו אופיינו תמציות עשירות בחלבון המתקבלות בטכנולוגיות בלחץ גבוה (CO2 סופר-קריטי ומים תת-קריטיים) מפסולת סרדינים (Sardina pilchardus) וממסגרות דג בקלה (Gadus morhua) לגבי הפוטנציאל הקוסמוטי שלהם. פעילויות נוגדות חמצון, אנטי דלקתיות ואנטי-בקטריאליות הוערכו באמצעות כימי (מבחן ORAC), אנזימטי (עיכוב של אלסטאז וטירוזינאז), רגישות לאנטי-מיקרוביאלית (Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus ו-Cutibacterium acnes) ומבחנים מבוססי תאים (בקרטינוציטים-Haas) . תמציות סרדינים הציגו את הפעילות האנטיבקטריאלית הגבוהה ביותר, והקטע שהושג באמצעות טמפרטורות מיצוי גבוהות יותר (250 ◦C) וללא שלב הסרת השומן הוכיח את ערכי הריכוז המינימלי המעכב (MIC) הנמוכים ביותר (1.17; 4.6; {{24} }.59 מ"ג/מ"ל עבור K. pneumoniae, S. aureus ו-C. acnes, בהתאמה). דגימות של דגי בקלה שחולצו בטמפרטורות נמוכות יותר (90 ◦C) היו החומרים האנטי-דלקתיים היעילים ביותר (ריכוז של 0.75 מ"ג/מ"ל הפחית את רמות IL-8 ו-IL-6 ב-58% ו-47%, בהתאמה , ביחס לבקרה החיובית). תכולת תראונין, ולין, לאוצין, ארגינין ותכולת החלבון הכוללת בתמציות הודגשה בהתאמה גבוהה עם הפעילות הביולוגית המדווחת (R2 גדול מ-0.7 או שווה ל-0.7). תוצאות אלו תומכות ביישום הפוטנציאלי של תמציות מפסולת תעשיית הדיג במוצרים קוסמטיים בעלי פעילות ביו-אקטיבית.

גליקוזיד של cistanche יכול גם להגביר את הפעילות של SOD ברקמות הלב והכבד, ולהפחית באופן משמעותי את תכולת הליפופוסצין וה-MDA בכל רקמה, תוך ניקוי יעיל של רדיקלי חמצן תגובתיים שונים (OH-, H₂O₂ וכו') ומגן מפני נזקי DNA הנגרמים על ידי OH-רדיקלים. לגליקוזידים פנילתנואידים של Cistanche יש יכולת ניקוי חזקה של רדיקלים חופשיים, יכולת צמצום גבוהה יותר מאשר ויטמין C, משפרים את פעילות ה-SOD בתרחיף זרע, מפחיתים את תכולת ה-MDA ובעלי השפעה הגנה מסוימת על תפקוד קרום הזרע. פוליסכרידים של Cistanche יכולים להגביר את הפעילות של SOD ו-GSH-Px באריתרוציטים וברקמות ריאה של עכברים מתבגרים שנגרמו על ידי D-galactose, כמו גם להפחית את תכולת ה-MDA והקולגן בריאה ובפלזמה, ולהגדיל את תכולת האלסטין. אפקט ניקוי טוב על DPPH, הארכת זמן ההיפוקסיה בעכברים מזדקנים, שיפור הפעילות של SOD בנסיוב, ועיכוב ניוון פיזיולוגי של ריאות בעכברים מזדקנים בניסוי. עם ניוון מורפולוגי תאי, ניסויים הראו כי ל-Cistanche יש יכולת נוגדת חמצון טובה ובעלת פוטנציאל להיות תרופה למניעה וטיפול במחלות הזדקנות העור. יחד עם זאת, לאכינאקוסיד ב-Cistanche יש יכולת משמעותית לסלק רדיקלים חופשיים של DPPH ובעל יכולת לנטרל מיני חמצן תגובתיים ולמנוע פירוק קולגן הנגרמת על ידי רדיקלים חופשיים, וכן יש לו אפקט תיקון טוב על נזקי אניון רדיקלים חופשיים של תימין.

לחץ על מוסף Cistanche Tubulosa

【למידע נוסף:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

מילות מפתח: וולוריזציה של זרמי פסולת דגים; פעילות נוגדת חמצון; פעילות אנטי דלקתית; פעילות אנטי - מיקרוביאלית; אנטי אייג'ינג; אנטי-היפרפיגמנטציה; מוצרי קוסמטיקה

1. הקדמה

עם החיפוש המתמיד אחר חדשנות, במיוחד עבור חומרים פעילים, תעשיית הקוסמטיקה צומחת והוכיחה את הכוונה להחליף רכיבים שמקורם בנפט לקראת תרכובות טבעיות [1]. תכונות נוגדות החמצון של מרכיבים פעילים טבעיים יכולים לסייע במניעת מספר בעיות עור הנגרמות על ידי מתח חמצוני והזדקנות [2,3]. הזדקנות העור יכולה להיגרם הן על ידי גורמים פנימיים (כגון דלקת או קיצור טלומרים) והן מגורמים חיצוניים (סביבתיים) [4]. הזדקנות העור מובילה לאובדן קולגן בוגר ושינויים במטריקס החוץ-תאי (ECM) אשר פוגע בתפקוד המחסום, וכתוצאה מכך מראה יבש ורגישות לתוקפנות חיצוניות, מה שמגביר את הסיכון להפרעות עור [5]. תהליך זה יכול להיות מואץ על ידי מספר אנזימים, כגון אלסטזות, מטריצות מטלופרוטאינים (MMPs) והיאלורונידאזות שיכולות לגרום לפירוק ECM [6], או אפילו על ידי הצטברות של מיני חמצן תגובתיים (ROS) שעלולים לסכן את תפקוד התא התקין [7]. גורמים סביבתיים, כגון חשיפה לקרינת UV, מובילים ליצירת כמויות גבוהות של ROS שגורמות לאותן תגובות מולקולריות ותאיות כמו ההזדקנות הפנימית, אך עם השפעות מוגברות. חשוב לציין, ROS יכול להעצים את הפעילות של אנזימים הקשורים להזדקנות העור או תהליכי פיגמנטציה של העור [8,9], ולפיכך נוכחותם של נוגדי חמצון n ממלאת תפקיד חשוב בתחום הקוסמטי.

בשנת 2018, צריכת הדגים העולמית הוערכה על ידי FAO לעמוד על 20.5 ק"ג לפיתה [10], מה שמוביל לכמויות גדולות של תוצרי לוואי, בעיקר עור ועצמות. השאריות שנוצרו תואמות ל-20-75 אחוז (w/w) ממשקל הדגים הנלכד הכולל, מה שעלול להוביל לבעיות סביבתיות [11,12]. עם זאת, שאריות אלו עדיין מכילות כמות משמעותית של שומנים, חלבונים ומינרלים ויש להגדיר אותן בצורה נאותה. בשנים האחרונות, תמציות מפסולת שנוצרה על ידי תעשיית הדגים הראו תכונות פעילות כגון נוגדת יתר לחץ דם, נוגדת חמצון, אנטי-מיקרוביאלית, נוירו-פרוטקטיבית, אנטי-היפרגליקמית, אנטי-אייג'ינג ואנטי-דלקתית [13-19]. דגי בקלה אטלנטיים (Gadus rhea) וסרדין (Sardina pilchardus) הם מהדגים הנצרכים ביותר בפורטוגל וחלקים שמקורם בשאריותיו הראו פוטנציאל תזונתי מבטיח, כגון פעילויות נוגדות חמצון, נוגדות שגשוג או אנטי דלקתיות [11,20-22]. עם זאת, מכיוון שהפליטה וההחלפה של פסולת תעשיית הדגים עדיין בשלב מוקדם, יש הרבה מקום לבחון הזדמנויות עבור התעשייה להמיר פסולת זו למוצרים ביולוגיים בשוק בעלי ערך גבוה, כולל מרכיבים קוסמטיים.

בעבודה קודמת, חקרנו את השימוש בטכנולוגיות בלחץ גבוה (CO2 סופר-קריטי ומים תת-קריטיים), כדי לבודד שברים ביו-אקטיביים מפסולת סרדינים וממסגרות של דגי בקלה עם יתרונות בריאותיים מבטיחים [11,22]. עבור פסולת סרדינים, הדגמנו כי על ידי יישום שלב ראשון עם פחמן סופר קריטי (ScCO2) (להסרת חלקי שומנים) ואחריו תהליך מיצוי עם מים תת-קריטיים (SW) ניתן היה להשיג הידרוליזטים של חלבונים עם פוטנציאל נוגד חמצון גבוה והשפעה אנטי-פרוליפרטיבית ב תאי סרטן המעי הגס [22]. מיצוי/הידרוליזה של מים תת-קריטיים יישמנו גם כדי להשיג תמציות מועשרות בחלבונים, פפטידים וחומצות אמינו ממסגרות של דגי בקלה והראינו שטמפרטורות עיבוד נמוכות יותר (90 ◦C) מעדיפות מיצוי של תרכובות בעלות פוטנציאל אנטי דלקתי בתא אפיתל מעי אנושי. דגם [11]. רוב החלבונים הקיימים בתמציות מסגרת דג בקלה הם קולגן ושברי קולגן. תרכובות אחרות כוללות כמויות מינוריות של שומנים, אפר וכמה סוכרים. תמציות סרדינים היו עשירות בפפטידים וחומצות אמינו, והיו גם שומנים, אפר וסוכרים. מאחר שחלבונים ופפטידים שמקורם בדגים עשויים להפוך למשאב חשוב עבור תעשיות קוסמטיקה, מטרת המחקר הנוכחית היא להעריך עוד יותר את הפוטנציאל הפעיל של תמציות אלו המופקות מפסולת עיבוד דגים ומוצרי לוואי הנגרמים על ידי הערכת הפוטנציאל הקוסמוטי שלהם [23] . למטרה זו, יושמו מגוון של מבחני כימיקלים, אנזימטיים ומבוססים על תאים כדי לחקור את ההשפעות נוגדות החמצון, אנטי-הזדקנות, אנטי-היפר-פיגמנטציה, אנטי-דלקתיות ואנטי-מיקרוביאליות של הדגימות שחולצו. כמו כן בוצעו מחקרי מתאם כדי לזהות את המרכיבים הביו-אקטיביים העיקריים בעלי פוטנציאל קוסמוטי.

2. חומרים ושיטות

2.1. ריאגנטים

3,4-דיהידרוקסי-ל-פנילאלנין (L-DOPA), טירוזינאז פטריות, אלסטאז לבלב חזירי (PPE) סוג III, N-סוצ'יניל-אלא-אלא-פ-ניטרואניליד (AAAPVN), טריס ({ {11}}אמינו- 2-הידרוקסי-מתיל-פרופאן-1,3-דיול), 2,20 -אזוביס (2-מתיל-פרופיונאמידין)דיהידרוכלוריד (AAPH) ו-20 ,70 -dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) נרכשו מ-Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ארה"ב). מרק מולר הינטון (CAMHB) מותאם לסידן נרכש מ-BD (Sparks, MD, ארה"ב). עירוי מוח-לב (BHI) נרכש מ-Avantor (Radnor, PA, ארה"ב). שקיות AnaeroGen™ Compact נרכשו מ- Oxoid (Hampshire, בריטניה). PrestoBlue™, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), סרום בקר עוברי מושבת בחום (FBS) ו-Penicillin-Streptomycin התקבלו מ-Invitrogen (סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב). קו תאים קרטינוציטים לא גידוליים שהונצחו בבני אדם HaCaT הושג מ- Cell Line Service (Eppelheim, גרמניה). ערכות פיתוח אנושיות IL-8 ו-IL-6 Mini TMB ELISA הושגו מ-Peprotech (לונדון, בריטניה). כל שאר הריאגנטים והממסים ששימשו במחקר הנוכחי היו בדרגה אנליטית ונרכשו מספקים זמינים.

2.2. דגימות

התמציות ששימשו בעבודה זו היו אלו שפותחו במחקרים הקודמים שלנו שהתמקדו באופטימיזציה של תהליך [11,22]. בקצרה, מסגרות דג בקלה סופקו על ידי Pascoal ו- Filhos SA (Gafanha da Nazaré, פורטוגל) והורכבו מעמוד שדרה של דגים ושריר דבוק. פסולת סרדינים, עשויה ראשים, קוצים וקרביים, סופקה על ידי Conservas A Poveira SA (Póvoa de Varzim, פורטוגל). ההרכב הקרוב של חומרי הגלם בהם נעשה שימוש הוצג בעבודותינו הקודמות [11,22]. חלבון (47 אחוזי משקל) ואפר (39 אחוזי משקל) היו המרכיבים העיקריים של מסגרות דג בקלה, עם כמויות קטנות של שומנים ופחמימות (2 אחוז משקל ו-0.3 אחוז משקל, בהתאמה). קולגן נמצא כחלבון העיקרי במסגרות של דגי בקלה, ובמקרה זה, הוא מהווה כ. 65 אחוז מתכולת החלבון הכוללת של הפסולת המקורית. לעומת זאת, סרדין הוא דג שמן, ולכן הפסולת שלו הרבה יותר עשירה בשומנים מאשר מסגרות של דגי בקלה. פסולת סרדינים הראתה תכולת שומנים של 26 אחוזי משקל ותכולת חלבון של 52 אחוזי משקל, השאר היו אפר (17 אחוזי משקל) ופחמימות (3 אחוזי משקל).

התמציות ממסגרות של דגי בקלה (Cf1, Cf2, Cf3 ו-Cf4) ופסולת סרדינים (S1, S2 ו-S3) שנבחרו לעבודה זו הושגו בטכנולוגיית לחץ גבוה במנגנון בקנה מידה מעבדה כפי שתואר קודם [11,22 ,24] תוך שימוש בתנאים המסוכמים בטבלה 1. בקצרה, 60 גרם של מסגרות של דג בקלה טחון או פסולת סרדינים (מנוחה או ללא שומן) הוכנסו לכור בלחץ גבוה שהוכנס לתנור. משאבת המים הופעלה בקצב הזרימה הרצוי (כ-10 מ"ל/דקה) והלחץ הוגדר ל-100 בר. ברגע שהלחץ הגיע לערך הזה, התנור החשמלי הופעל, והניסוי התחיל. התמציות השונות נאספו במשך 30 דקות בטמפרטורות שונות (90-250 ◦C). תמציות S1 ו-S3 התקבלו לאחר תהליך הסרת שומן של פסולת הסרדינים על ידי ScCO2 לפני מיצוי SW. ניסויי מיצוי מים תת-קריטיים הוכפלו. עבור כל דגימה שהופקה, נלקחו 25 מ"ל בשלושה עותקים, ליקעו ושקלו כדי לחשב את תפוקת המיצוי המתאימה. נתונים אנליטיים - תכולת חלבון - מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן (SD) של משולש. המידע בנוגע לאפיון של תמציות אלו במונחים של תכולת חלבון, פרופיל חומצות אמינו, תרכובות מינרלים עיקריות או מתכות רעילות ומתכות כבדות מתואר בעבודות הקודמות שלנו [11,22].

פתרונות מלאי של Cf1, Cf2, Cf3, Cf4 ו-S2 הוכנו ב-Milli-Q H2O בריכוז של 100 מ"ג/מ"ל. הדגימות האחרות, כלומר S1 ו-S3, הומסו ב-DMSO (300 ו-550 מ"ג/מ"ל, בהתאמה) בגלל מסיסותן הנמוכה יותר במים. הדגימות הוקפאו ונשמרו ב-20 ◦C עד לשימוש נוסף. עבור מבחני סלולר, הדגימות עוקרו בעבר על ידי חום (121 ◦C, 15 דקות) בחיטוי (Tuttnauer 3870 el, Breda, הולנד).

2.3. בדיקת קיבולת ספיגת רדיקלי חמצן (ORAC).

בדיקת ORAC בוצעה כדי להעריך את יכולת נוגד החמצון של הדגימות כלפי רדיקלי פרוקסיל (ROO• ), בעקבות השיטה שפותחה על ידי Huang וחב'. [25], עם כמה התאמות כפי שדווח בעבר [26]. בקצרה, במיקרו פלטה שחורה של 96-באר, 150 µL די-נתרן פלואורססאין (0.3 µM) נוספו ל-25 µL של דילול דגימות והודגרו למשך 10 דקות ב-37 ◦C. לאחר מכן, התגובה התחילה על ידי הוספת 25 μL של 2,20 - Azobis (2-amidinopropane) דיהידרוכלוריד (AAPH, 153 mM), ופלורסנטיות (Ex/Em 485 ± 20/528 ± 20 ננומטר) נמדדה למשך 40 דקות ב-37 ◦C בקורא מיקרו-צלחות פלואורסצנטי FLx800 (FL800 Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, ארה"ב). הוכנה עקומה סטנדרטית באמצעות 5, 10, 20, 30 ו-40 מיקרומטר של (6-הידרוקסי-2,5,7,8-tetramethylchroman-2- חומצה קרבוקסילית (Trolox )). כל התמיסות הוכנו בתמיסה מלוחה פוספטית (PBS), 75 mM, pH 7.4. התוצאות מבוטאות כמיקרומול של קיבולת נוגדת חמצון מקבילה ל-Trolox לגרם של תמצית (מיקרומול TEAC/g תמצית).

2.4. מבחנים אנזימטיים

2.4.1. בדיקת עיכוב אלסטאז

בדיקה זו התבססה על עבודתם של Wittenauer et al. [27] עם כמה שינויים כפי שתואר קודם [6]. פעילות מעכבת אלסטאז נקבעת על ידי שיטה ספקטרופוטומטרית באמצעות אלסטאז לבלב חזיר (PPE) ו-N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (AAAPVN) כמצע האנזים, על ידי ניטור שחרור p-nitroaniline ב-41{ {19}} ננומטר. PPE הומס ב-100 mM Tris (2-amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol)-HCl חיץ (pH=8.0) לריכוז של 1 מ"ג/מ"ל ומאוחסן ב-20 ◦C במנות. ביום הבדיקה, נלקח מנה ומדולל במאגר לריכוז של 0.03 U/mL, 10 μL הועמסו בבארות של לוחות המיקרוטיטר יחד עם 100 μL ממאגר Tris-HCl ו-30 μL. של כל דגימה. לאחר 20 דקות של דגירה מוקדמת ב-25 ◦C, התגובה התחילה על ידי הוספת 40 μL של המצע AAAPVN (0.55 mM). הספיגה נמדדה במשך 20 דקות לאחר הוספת AAAPVN בקורא צלחות של BioTek Instruments EPOCH 2 ספקטרופוטומטר. החישובים בוצעו כמתואר במשוואה (1), כאשר A control ו-Asample מייצגים את הספיגה ב-410 ננומטר בהעדר או נוכחות של המדגם, בהתאמה. מכיוון ש-DMSO שימש להמסת דגימות S1 ו-S3, ממס זה נבדק גם הוא והשתמש בו כבקרת דגימות אלו. הפוטנציאל של התמציות לעכב אלסטאז הוערך עם ריכוזים גדלים, כדי לקבוע יחסים תלויי מינון ולקבוע את ערכי החצי המקסימליים המעכבים (IC50), המציינים את היכולת של כל דגימה בעיכוב פעילות אנזימטית בהיקף של 50 אחוז.

כל התוצאות מבוטאות כערכים ממוצעים של IC50 עם הגבול התחתון והעליון של רווח סמך של 95 אחוז, המתקבלים משלושה ניסויים בלתי תלויים לפחות.

2.4.2. בדיקת עיכוב טירוזינאז

הפוטנציאל לעיכוב טירוזינאז של התמציות הוערך באופן ספקטרופוטומטרי באמצעות טירוזינאז פטריות ו-L-DOPA כמצע [28]. טירוזינאז הופך את L-DOPA ל-dopaquinone, אשר יעשה מחזוריות ברצף ליצירת דופאכרום. ניתן לראות את היווצרות הדופאכרום על ידי מדידת הספיגה ב-475 ננומטר. המצע הוסף לאנזים בנוכחות דילול הדגימה, לריכוז סופי של 30 U/mL טירוזינאז ו-2.5 mM L-DOPA. מכיוון ש-DMSO שימש להמסת דגימות S1 ו-S3, ממס זה נבדק גם הוא והשתמש בו כבקרת דגימות אלו. לאחר דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, נמדדה הספיגה ב-475 ננומטר בספקטרופוטומטר של BioTek Instruments EPOCH 2. כל הריאגנטים הוכנו במאגר נתרן פוספט (SPB; 0.1 M, pH 6.8), שהוכן על ידי ערבוב דיהידראט דו-בסיסי נתרן פוספט ומונו-בסיסי נתרן פוספט, והחישובים בוצעו כמתואר במשוואה (1). כל התוצאות מבוטאות כערכים ממוצעים של IC50 עם הגבול התחתון והעליון של רווח סמך של 95 אחוז, המתקבלים משלושה ניסויים בלתי תלויים לפחות.

2.5. בדיקת רגישות לאנטי מיקרוביאלית

מיקרואורגניזמים היעד שנבחרו עבור מבחני הפעילות האנטיבקטריאלית היו החיידקים הגראם-שליליים Klebsiella pneumoniae CECT 8453 והחיידקים הגרם-חיוביים Staphylococcus aureus ATCC 6538 ו-Cutibacterium acnes ATCC 6919T. עבור K. pneumoniae CECT 8453 ו-S. aureus ATCC 6538, מבחני בוצעו על פי שיטת מיקרודילול המרק של הנחיות CLSI M07-A10 כפי שתוארו קודם לכן על ידי Rodrigues et al. [29]. בקיצור, תמיסות מיצוי חולקו בצלחת מיקרוטיטר 96- עגולה 96- ו2-מהלו באופן סדרתי במרק מולר הינטון מותאם לסידן (CAMHB; BD, Sparks, MD, ארה"ב) כדי להשיג טווח ריכוז של תמיסות. החיסון הוכן בשיטת הגידול להשגת תרחיף הומוגני בתמיסת מלח. החיסון המותאם היה מדולל בנוסף ב-CAMHB כדי להבטיח שבעקבות החיסון, כל באר מכילה בסביבות 5 × 104 CFU. הצלחות הודגרו בתנאים אירוביים ב-37 ◦C למשך 16 עד 20 שעות. עבור C. acnes, המבחנים בוצעו כמתואר קודם לכן עם שימוש בעירוי מוח-לב (BHI) (Avantor, Radnor, PA, ארה"ב) במקום CAMHB ועל ידי דגירה של לוחות המיקרוטיטר למשך 70-74 שעות ב-37 ◦ C בצנצנות אנאירוביות המכילות את מערכת יצירת האטמוספירה AnaeroGen™ Compact (אוקסויד, המפשייר, בריטניה).

עבור כל תמיסה מנותחת, בקרה חיובית (CAMHB או BHI וחיסון מדולל), בקרת סטריליות בינונית (לא מחוסנת CAMHB או BHI), ובקרת סטריליות תמצית (תמיסת מיצוי לא מחוסנת פי 2- ב-CAMHB או BHI) בוצעו בהתאם. ערכי ריכוז מעכב מינימלי (MIC) היו הריכוז הנמוך ביותר של דגימה שעיכבה בעליל את הצמיחה של חיידקים לאחר הדגירה. בעת הצורך, ערכי MIC אושרו באמצעות מגיב כדאיות התא PrestoBlue™ (Invitrogen, San Diego, CA ארה"ב) בהתאם להנחיות היצרן. ערך MIC נוסף, המכונה MIC*, נקבע גם הוא והוגדר כריכוז הנמוך ביותר של דגימה שבה גידול חיידקים הושפע ויזואלית ודיפרנציאלית בהשוואה לבקרה החיובית. ערכי ריכוז קוטל חיידקים מינימליים (MBC) דווחו כריכוז הנמוך ביותר של דגימה שהוביל לירידה של 99.9 אחוזים לפחות בספירת חיידקים ברי קיימא בהשוואה לחיסון הראשוני ולמשך זמן דגירה שווה. התוצאות הובעו כחציון של הערכים שהתקבלו לאחר שלושה שכפולים ביולוגיים. מכיוון ש-DMSO שימש להמסת דגימות S1 ו-S3, ממס זה נבדק גם כדי לוודא שהריכוז הסופי בו נעשה שימוש לא הפריע למיקרואורגניזם היעד, ומכאן הבדיקה.

2.6. מבחנים מבוססי תאים

2.6.1. תרבית תאים

קו תאים קרטינוציטים אנושיים HaCaT (CLS, גרמניה) תורבת במדיום סטנדרטי של Dulbecco's Modified Eagle (DMEM) בתוספת של 10 אחוז (v/v) סרום בקר עוברי (FBS) ו-1 אחוז (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין. התאים נשמרו באופן שגרתי כמונו-שכבות בצלוחיות תרבות בגודל 75 סמ"ר והודגרו ב-37 מעלות צלזיוס עם 5 אחוז CO2 באווירה לחה.

2.6.2. ציטוטוקסיות חוץ גופית

מבחני ציטוטוקסיות בוצעו על פי עבודות קודמות [6]. בקצרה, תאי HaCaT נזרעו בצפיפות של 1.4 × 105 תאים/סמ"ר בצלחות של 96 בארות. לאחר 3 ימים, תאים הודגרו עם ריכוזים שונים של כל דגימה (Cf1; Cf2; Cf3; Cf4; S2—50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, {{30} }.78, 0.39; S1—3, 1.5, 0.75, 0.38, {{40}}.19, {{51 }}.09, 0.05, 0.02; S3—5.5, 2.75, 1.38, 0.69, 0.34, 0.17, 0.09, 0.04 מ"ג/מ"ל) מדולל במדיום תרבית (מדיום DMEM המכיל 0.5 אחוז FBS). בארות המכילות תאים שהודגרו רק עם מצע תרבות בתוספת של 0.5 אחוז (v/v) של FBS שימשו כביקורת. בקרות ממס עם 50 אחוז מים או 1 אחוז DMSO במצע תרבות בוצעו גם כדי לא לכלול רעילות ממס. לאחר 24 שעות של דגירה, הכדאיות של התא הוערכה באמצעות PrestoBlue® (5 אחוזים v/v במצע תרבות) למשך 2 שעות ב-37 ◦C, 5 אחוז CO2, לפי הוראות היצרן. לאחר מכן, הקרינה של כל באר נמדדה (Ex./Em. 560 ± 20/590 ± 20 ננומטר) בקורא microplate FLx800 פלואורסצנטי (BioTek Instruments, Winooski, VT, ארה"ב). כדאיות התא התבטאה כאחוז תאים ברי קיימא ביחס לבקרה. שלושה ניסויים עצמאיים בוצעו בשלושה עותקים.

2.6.3. פעילות נוגדת חמצון תאית

פעילות נוגדת החמצון הסלולרית הוערכה בעקבות שיטות שתוארו בעבר [6,30], עם כמה שינויים. בקצרה, תאי HaCaT נזרעו בצפיפות של 1.4 × 105 תאים/סמ"ר בצלחות של 96 בארות, והיווצרות של ROS תוך תאי נוטרה באמצעות 20,70 -דיאצטט דיכלורופלואורססין ( DCFH-DA) כבדיקה ניאון. 72 שעות לאחר הזריעה, התאים נשטפו עם PBS והודגרו עם ריכוזים לא רעילים של הדגימות (0.1875 מ"ג/מ"ל; 0.375 מ"ג/מ"ל; 0.75 מ"ג/מ"ל) בתוספת 25 מיקרומטר DCFH-DA ב-PBS למשך שעה אחת. לאחר מכן, התאים נשטפו שוב עם PBS והודגרו עם מעורר הלחץ (600 מיקרומטר AAPH ב-PBS) למשך שעה. לאחר מכן, הקרינה נמדדה בקורא הקרינה FL800 microplate (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, ארה"ב) (Ex/Em 485 ± 20/528 ± 20 ננומטר). התוצאות מבוטאות כאחוז ROS ביחס לבקרה הלא מטופלת (תאים שטופלו ב-DCFH-DA ו-AAPH). שלושה ניסויים עצמאיים בוצעו בשלושה עותקים.

2.6.4. הערכה של הפרשת IL-6 ו-IL-8

ניסויים בוצעו כמתואר קודם [31], עם מספר שינויים. בקצרה, תאי HaCaT נזרעו בצפיפות של 1 × 1 05 תאים/cm2 בצלחות של 12 בארות. לאחר 3 ימים, תאים עוררו עם 15 מיקרוגרם/מ"ל של ליפופוליסכרידים (LPS) מ-Escherichia coli והודגרו יחד עם שלושה ריכוזים שונים של כל תמצית ({{10}}.1875 מ"ג/מ"ל; {{ 14}}.375 מ"ג/מ"ל; 0.75 מ"ג/מ"ל) מדולל במדיום תרבית (מדיום DMEM המכיל 0.5 אחוז FBS). תאים שהודגרו רק עם LPS ותאים שהודגרו עם מדיית תרבית בלבד שימשו כבקרות חיוביות ושליליות, בהתאמה. לאחר 24 שעות, הסופרנטנטים נאספו, עברו צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-2000 גרם, ואוחסנו ב-80 ◦C עד ניתוח נוסף. רמות IL-6 ו-IL-8 הוערכו על ידי מבחן אימונוסורבנטי מקושר אנזים (ELISA), באמצעות ערכות זמינות מסחרית (PeproTech; לונדון, בריטניה), לפי הוראות היצרן, עם ספיגה שנמדדה ב-450 ננומטר. עם תיקון אורך גל מוגדר ל-620 ננומטר בספקטרופוטומטר של מיקרו-לוח (EPOCH 2, BioTek Instruments, Winooski, VT, ארה"ב). התוצאות מבוטאות כאחוז IL-6 או IL-8 ביחס לבקרה החיובית (תאים מגורים עם LPS). שלושה ניסויים עצמאיים בוצעו בשלושה עותקים.

2.7. ניתוח סטטיסטי

תוצאות ניתוח מבוססות ORAC ותאים מבוטאות כערך הממוצע ± SD, המתקבל משלושה ניסויים עצמאיים לפחות. עבור מבחני האנזימטיות והציטוטוקסיות, ערכי ה-IC50 נקבעו מעקומות מינון-תגובה דרך חלקות log10 באמצעות GraphPad Prism 8.4.3. תוכנה (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, ארה"ב). התוצאות מוצגות כ-IC50 עם רווח סמך של 95 אחוז. ניתוח סטטיסטי של התוצאות בוצע באמצעות התוכנה הקודמת. כאשר אומתו שונות הומוגנית והתפלגות נורמלית של הנתונים, התוצאות נותחו על ידי ניתוח שונות של שונות (ANOVA), ולאחר מכן מבחן Tukey להשוואות מרובות. במקרה של שונות הטרוגנית או אם הנתונים לא היו מופצים בצורה נורמלית, בוצעה מבחן t של Student לא מזווג מתאים כדי לקבוע אם הממוצעים שונים באופן משמעותי. ערך p קטן מ-0.05 או שווה ל-0.05 התקבל כמובהק סטטיסטית בכל המקרים. תוצאות בדיקת הרגישות לאנטי-מיקרוביאלית מבוטאות כערך החציוני, המתקבל משלושה ניסויים בלתי תלויים לפחות.

3. תוצאות ודיון

This study aims to investigate the cosmeceutical potential of protein-rich extracts that were produced by high-pressure technologies from fishery industry wastes, namely sardine wastes and codfish frames [11,22]. The selection of extracts was based on previous results regarding their characterization and process conditions. For codfish, all extracts were selected aiming at evaluating the impact of the extraction temperature on the recovery of compounds with promising bioactive effects on the skin. For sardine extracts, only three extracts derived from both defatted and non-defatted raw materials, processed at higher temperatures (190  and 250 ◦C) and with the highest extraction yield (>נבחרו 45.7 גרם/100 גרם. התוצאות לגבי תכולת החלבון הכוללת של כל תמצית מוצגות בטבלה 1.

3.1. פעילות נוגדת חמצון, אנטי אייג'ינג ואנטי-היפרפיגמנטציה

ההשפעה הקוסמטית הפוטנציאלית של התמציות נבדקה תחילה באמצעות מבחני כימיים ואנזימטיים כדי להעריך את ההשפעות נוגדות החמצון, האנטי-אייג'ינג ואנטי-היפרפיגמנטציה שלהן. ליכולת נוגדת החמצון, מבחן ה-ORAC נבחר מכיוון שהוא מודד את יכולתן של דגימות לסלק ROS רלוונטי ביולוגית, כלומר רדיקלי פרוקסיל, הנחשבים לאחד הגורמים העיקריים להזדקנות העור [2,32]. ההשפעה האנטי-אייג'ינג הוערכה גם באמצעות עיכוב אלסטאז מאחר שאנזים זה דווח כאחראי לפירוק של אלסטין וחלבוני ECM אחרים [6]. עבור אפקט אנטי-היפרפיגמנטציה, נעשה שימוש במבחן טירוזינאז, כדי להעריך את היכולת של דגימות לעכב את ייצור המלנין. טבלה 2 מסכמת את ערכי ה-ORAC וה-IC50 של כל התמציות.

התוצאות שלנו מראות שתמציות סרדינים ודג בקלה הציגו פעילות נוגדת חמצון והשפעות מעכבות על פעילות אנזימים אלסטאז וטירוזינאז. מבין דגימות סרדינים, S1 הראה את ערך ה-ORAC הגבוה ביותר (1.94 ± 0.08 µmol TEAC/mg תמצית) ואחריו S3 ו-S2. תוצאות אלו הן על ידי הערכת נוגדי חמצון קודמת באמצעות שיטה חלופית (2,2-בדיקת דיפניל-1-picrylhydrazyl-DPPH) שבה התמצית S1 הציגה את ערכי ה-IC50 הנמוכים ביותר [22]. יכולת הניקוי הגבוהה יותר כלפי רדיקלי פרוקסיל של דגימת S1 יכולה להיות נגזרת מפפטידים עם רצפי חומצות אמינו שונים הקיימים בתמציות שכן אינטראקציות ביניהם יכולות להשפיע על יכולת ניקוי הרדיקלים [33]. בנוסף, תרכובות שנוצרו ב- Maillard או תגובות תרמו-חמצון אחרות עשויות להשפיע על פעילות נוגדת החמצון של הדגימות [34]. למרות ערך ה-ORAC הנמוך ביותר, דגימות S2 ו-S3 היו אלה עם הקיבולת הגבוהה ביותר בעיכוב פעילויות טירוזינאז ואלסטאז, בהתאמה.

מבין תמציות דגי בקלה, הוכח כי Cf4 הוא בעל פעילויות נוגדות חמצון ואנטי-היפרפיגמנטציה הגבוהות ביותר. ניתוח SEC-GPC של התמציות הראה כי פפטידים במשקל מולקולרי יורד התקבלו בעת הגדלת טמפרטורת המיצוי עד ל-250 ◦C [11]. יכולת עיכוב האלסטאז של דגימה זו נמצאת בטווח הערכים שנמצאו עבור תמציות Cf אחרות, כלומר Cf1 ו-Cf3. עם זאת, עבור הריכוזים שנבדקו, שתי תמציות אלו לא הראו פעילות מעכבת כלפי טירוזינאז.

בספרות, כמה דיווחים מראים שתמציות מתוצרי לוואי ימיים מציגות פעילות נוגדת חמצון רלוונטית ועיכוב של טירוזינאז. לדוגמה, תמציות המופקות מתוצרי לוואי ימיים (Scophthalmus maximus) על ידי הידרוליזה אלקלית, הוכיחו פעילות נוגדת חמצון הנגישה באמצעות מבחני כימיים שונים: 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) יכולת סילוק רדיקלים ( 36.12 אחוזים לגבי בקרה), שיטת ABTS (2,20 -azinobis-(3-ethyl-benzothiazoline-6-סולפונית) שיטת (12.81 מיקרוגרם BHT/mL) ומבחן הלבנת קרוצין (8.{ {28}}3 מיקרוגרם Trolox/mL) [35]. במחקר אחר, מיצוי אנזימטי של מדוזה מומלחת באלום (Lobonema smithii) הראתה לייצר הידרוליזטים בעלי פעילות נוגדת חמצון גבוהה (IC{{20}}. 9 מ"ג/מ"ל עבור מבחני ABTS e DPPH) ופוטנציאל מעכב טירוזינאז, עם ערכי IC50 הנעים בין 14.1 ל-24.5 מ"ג/מ"ל [36], שהם באותו סדר גודל כמו אלה שהתקבלו בעבודה זו בנוסף, תמציות עם ערכי נוגדי חמצון דומים (ערכי ORAC – 0.4 עד 3.5 מיקרומול TEAC/mg תמצית) התקבלו מסוג אחר של שאריות תעשיית המזון, כלומר זרמי פסולת ייצור יין [6]. עם זאת, תמציות שאריות היקב הללו הציגו יכולות מעכבות גבוהות יותר של טירוזינאז (IC50 מ-4.0 עד 0.14 מ"ג/מ"ל) ואלסטאז (IC50 מ-3.4 עד 0.1 מ"ג מיצוי/מ"ל) מאלה שהתקבלו בעבודה זו, כנראה בשל נוכחותן של תרכובות פנוליות. המוכרים כבעלי מספר ביולוגיות. חשוב להזכיר שבמחקר שלנו השתמשנו בטירוזינאז פטריות כדי לסנן את השפעת אנטי-היפרפיגמנטציה של תמציות, שכן אנזים זה נמצא בשימוש נרחב במבחני תפוקה גבוהה [37]. עם זאת, מכיוון שיש כמה מחלוקות לגבי הדמיון וההומולוגיה של אנזים זה עם טירוזינאז יונקים/אנושיים [38-40], יש לשקול מחקרים עתידיים הכוללים שורות תאים יונקים כדי להעריך את ההשפעה הפוטנציאלית נגד היפרפיגמנטציה של תמציות סרדינים ודגי בקלה.

כדי לזהות אילו תרכובות יכולות להיות אחראיות לתגובה הביו-אקטיבית של תמציות, בוצעו מחקרי מתאם בין נתוני הפעילות הביולוגית והרכב חומצות האמינו של התמציות שדווחו בעבר [11,22] (טבלה S1). עבור פעילות נוגדת חמצון, המתאמים הגבוהים ביותר (R2 גדול מ-{4}}.7 או שווה ל-0.7) התקבלו בין ערך ORAC לבין סה"כ תריונין, ולין חופשי, כמו גם לאוצין חופשי וסך הכל עבור כל התמציות. במקרה של דגימות סרדינים, התקבל מתאם גבוה (R2 גדול או שווה ל-0.94) עבור תוכן טריפטופן חופשי וסך הכל. בהתאם לכך, כל חומצות האמינו הללו דווחו בעבר כבעלי תכונות נוגדות חמצון במספר מערכות מודל [41-43]. עבור פעילויות עיכוב אלסטאז וטירוזינאז, מקדמי המתאם הגבוהים ביותר (R2 גדול מ-{12}}.8 או שווה ל-0.8) התקבלו עבור תכולת החלבון הכוללת וארגינין חופשי, בהתאמה, מה שמצביע על כך שלתרכובות אלו עשוי להיות תפקיד חשוב בפוטנציאל אפקט אנטי-אייג'ינג ואנטי-היפרפיגמנטציה של תמציות זרמי פסולת של תעשיית הדגים.

【למידע נוסף:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】