בנייה של מועמדים לחיסון כימריים חדישים לנגיף גנוטיפ VII מחלת ניוקאסל

תַקצִיר: גנוטיפ VII נגיף מחלת ניוקאסל (NDV) גרם למגפה במדינות רבות ובדרך כלל גורם לתוצאות קטלניות בתרנגולות נגועות. למרות שחיסוני NDV מוחלשים מסחריים קיימים יכולים לספק הגנה אידיאלית נגד גנוטיפ VII NDV, הם אינם יכולים למנוע לחלוטין זיהום ונשירה ויראלית, והגנוטיפ של חלק מזני החיסון אינו יכול להתאים לזן הנפוץ. במחקר זה, על מנת לבנות חיסון חי מוחלש תרמו-יציב ותואם גנוטיפ VII, השתמשנו בזן HR09 ארסי של גנוטיפ VIII כעמוד השדרה והחלפנו את גן ה-F שלו בגן ה-F שלו עם זה של זן הגנוטיפ VII DT-2014. בינתיים, אתר הביקוע של הגן F של DT-2014 עבר מוטציה לזה של חלבון מחלקה IF וחלבון F מסוג avirulent Class II, בהתאמה. התוצאות הראו ששני הנגיפים הכימריים, המכונים rcHR09-CI ו-rcHR09-CII, חלקו קינטיקה דומות של גדילה ויציבות תרמית עם זן HR09 של ההורים שלהם. בדיקות זמן מוות ממוצעות (MDT) ומדד פתוגניות תוך-מוחי (ICPI) הראו ששני הנגיפים הכימריים היו מוחלשים מאוד. למרות שגם NDVs כימריים וגם זן חיסוני לה סוטה יכולים לספק הגנה מלאה לתרנגולות מחוסנות מפני האתגר של זן גנוטיפ VII ZJ1 ארסי, שני ה-NDVs הכימריים יכולים לגרום לרמה גבוהה יותר של תגובת נוגדנים נגד זן ZJ1 ויכולים להפחית באופן משמעותי את הנשירה הוויראלית בהשוואה ל. זן חיסון לה סוטה. לסיכום, המחקר שלנו בנה שני מועמדי חיסון NDV תרמו-יציב כימריים התואמים NDV, אשר סיפקו הגנה מלאה מפני האתגר של גנוטיפ VII NDV ארסי.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

מילות מפתח: וירוס מחלת ניוקאסל; יציבות חום; וירוס כימרי תואם גנוטיפ VII; חלבון F; יעילות הגנה; נשירה ויראלית

1. הקדמה

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), הגורם למחלת ניוקאסל (ND), שייך לסוג Orthoavulavirus בתת-משפחת Avulavirinae ממשפחת Paramyxoviridae [1]. ל-NDV יש גנום RNA חד-גדילי בעל חוש שלילי, המקודד נוקלאופרוטאין (N), פוספופרוטאין (P), חלבון מטריקס (M), חלבון היתוך (F), חלבון המגלוטינין-נויראמינידאז (HN) וחלבון גדול (L) ) [2]. בהתבסס על האבולוציה של זני NDV, ניתן לחלק את ה-NDV לשתי מחלקות: האחת היא וירוסים מסוג I, עם גודל גנום של 15,198 נוקלאוטידים; אחד נוסף הוא וירוסים מסוג II, עם גודל גנום של 15,186 או 15,192 [3]. בהתבסס על הפתוגניות שלו, NDV סווג לשלושה פתוטיפים: lentogenic, mesogenic ו-velogenic [4]. ניתן לסווג את ה-NDV לשתי מחלקות, האחת היא NDV מחלקה I המבודדת בעיקר מציפורי בר ותמיד נגרמת לתרנגולות. השני הוא סוג II NDV, אשר נמצא בציפורים ביתיות ובאוויר, כולל זנים ארסיים ואווירולנטיים כאחד [1,5,6]. חלבון F של NDV מסונתז לראשונה כמבשר לא פעיל, F0, אשר מבוקע לשתי יחידות משנה פעילות F1 ו-F2 על ידי פרוטאז תאי מארח [7]. חלבון F הפעיל יכול לתווך את היתוך של ממברנות ויראליות ותאיות [8]. חוקרים מצאו שמוטיב אתר המחשוף של חלבון F הוא גם אינדיקטור לארסיות של NDV. דווח כי זן הארסיות עבור תרנגולות הראה מוטיב אתר ביקוע של 112R/KR-QK/RR↓F 117, בעוד ש-NDVs עם אריסיות נמוכה הם בעלי מוטיב של 112G/EK/R-QG/ER↓L 117 באותו אזור [9,10]. לכן, שינוי מוטיב אתר הביקוע של חלבון F הוא דרך יעילה להחליש את ה-NDV הארס [11,12]. למרות תפקידו החשוב בארסיות של NDV, חלבון F הוא גם תורם עיקרי לחסינות ההגנה של חיסונים תואמים גנוטיפ [13]. חיסון נגיף תרמי יכול להקל על האחסון וההעברה שלו, במיוחד עבור כמה מחוזות מרוחקים שבהם תחבורה בשרשרת הקרה אינה זמינה. בעבר, זן NDV יציב תרמי טבעי, שנקרא HR09, בודד במעבדה שלנו ויכול היה להישאר זיהומי במשך יותר משעה אחת בטיפול של 56 מעלות צלזיוס [14]. לאחר מכן, באמצעות מערכת גנטית הפוכה, נמצא שהשאריות 315 ו-369 בחלבון HN היו אחראים ליכולת העמידות שלו לחום [15]. מכיוון ש-HR09 הוא זן ארסי, שינינו את אתר המחשוף שלו של חלבון F מ-112RRQKR↓F 117 למוטיב אוירולנטי 112GRQGR↓L 117 באמצעות מערכת גנטית הפוכה ומצאנו שהנגיף הרקומביננטי rHR09 יכול לספק הגנה מלאה מפני האתגר של גנוטייפ VII זן ארסי של NDV [16]. יתר על כן, ה-HR09 המוחלש שימש עוד כווקטור חיסון לביטוי הגן HA של נגיף שפעת העופות תת-סוג H9N2 (AIV), אשר גם סיפק הגנה אידיאלית מפני האתגר של H9N2 AIV [17]. במחקר זה, כדי לבנות חיסון NDV מוחלש תרמו יציב ותואם גנוטיפ VII, השתמשנו בזן HR09 ארסי של גנוטיפ VIII NDV תרמו יציב בתור עמוד השדרה והחלפנו את גן ה-F שלו בזה של זן הגנוטיפ VII DT-2014. בינתיים, אתר הביקוע של הגן F של DT-2014 עבר מוטציה לזה של חלבון NDV F סוג I וחלבון NDV F מסוג avirulent Class II, בהתאמה. התוצאות הראו ששני הנגיפים הכימריים חולקים קינטיקה דומה של גדילה ויציבות תרמית עם ה-HR09. בנוסף, בדיקות זמן המוות הממוצע (MDT) ומדד הפתוגניות התוך-מוחית (ICPI) הראו ששני הנגיפים הכימריים שייכים לזן אוירולנטי. שניהם יכולים לגרום לרמה גבוהה של תגובת נוגדנים כנגד עצמם ונגד זן גנוטיפ VII ZJ1 בתרנגולות מחוסנות, יכלו להפחית משמעותית את נשירת הנגיף, ולספק הגנה מלאה מפני המתמודדים עם זן ZJ1. לסיכום, המחקר שלנו מספק שני מועמדים לחיסון תרמו-יציב כימרי לגנוטיפ VII NDV.

היתרונות של cistanche tubulosa-לחזק את המערכת החיסונית

לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Enhance Immunity

【בקש עוד】 דוא"ל:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. חומרים ושיטות

2.1. תאים ווירוסים

תאי BSR-T7/5, שורת תאים סלקטיבית מתאי BHK שיכולה לבטא את פולימראז ה- T7 RNA, מתורבתים עם מדיום איגל שונה (DMEM, Gibco) של Dulbecco בתוספת של 15% סרום בקר עוברי (Pan Biotech, גרמניה) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ארה"ב) בטמפרטורה של 37 ◦C בחממת 5% CO2. ביצי תרנגולת עוברות נטולות פתוגן ספציפיות (SPF), שניתן להשתמש בהן להפצה של NDV, נרכשות מ- Beijing Boehringer Ingelheim Vital Biotechnology Co., Ltd. מצוידים במעבדה שלנו.

2.2. בניית פלסמיד

הפלסמיד, המכונה pNDV/rHR09, נבנה על ידי שיבוט רצף הגנום באורך מלא של גנוטיפ VIII HR09 עם המוטציה בחלבון F לתוך וקטור TVT7R (0.0) [16]. הגן F של זן הגנוטיפ VII DT-2014, שהיה לו דמיון גבוה לזני הגנוטיפ VII הרווחים של NDV, הוגבר, והמוטציות של אתרי המחשוף שלו נוצרו באמצעות מוטגנזה מכוונת אתרים. לאחר מכן, הגן F ב-pNDV/rHR09 הוחלף בגן DT-2014 F שעבר מוטציה. כל רצפי הפריימר המשמשים במחקר זמינים לפי בקשה.

2.3. הצלה של וירוס רקומביננטי

במחקר זה, שני מועמדים לחיסון NDV כימרי חולצו כפי שתואר קודם [18]. ההליכים העיקריים מתוארים להלן: ראשית, פלסמידים NDV באורך מלא שהכילו את אתרי המחשוף שעברו מוטציה בגן F של NDV DT-2014, המכונים pNDV/rcHR09-CI ו-pNDV/rcHR{{4} }CII, הועברו עם שלושת הפלסמידים המסייעים pCI-NP, pCI-P ו-pCI-L באמצעות ריאגנט Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, ארה"ב) לפי הוראות היצרן. שנית, הנוזלים האלנטואיים מביצי תרנגולת שעברו SPF נוספו ב-12 שעות ו-36 שעות לאחר ההעברה, בהתאמה. שלישית, ה-lysates של התא כולו נאספו ב-72 שעות לאחר ההעברה והוגדרו להקפאה/הפשרה שלוש פעמים. לבסוף, ה-lysates של התא הוזרקו לתוך 10-ביצי תרנגולות שעברו SPF בנות יום למשך 3-5 ימים, והנוזלים האלנטואיים נאספו ועברו בדיקת HA לקיומם של NDVs כימריים שניצלו.

2.4. RT-PCR ו-QRT-PCR

ה-RNA הופץ באמצעות ריאגנט TRIzol (Merck, Darmstadt, גרמניה) מהנוזלים האלנטואיים שנאספו מביצי תרנגולות עוברות נגועות, ולאחר מכן הועתק לאחור ל-cDNA באמצעות ערכת סינתזה PrimeScript™ 1st Strand cDNA (Takara, בייג'ינג, סין). האורך המלא של רצף הגנום של NDV שניצל הוגבר באמצעות 10- פריימרים זוג (זמין לפי בקשה). רמות הנשירה של הנגיף כמתו על ידי RT-PCR כמותי מוחלט בזמן אמת באמצעות מכשיר Life Technology. בקצרה, דגימות ספוגית cloacal וספוגית קנה הנשימה נאספו ב-3- ו-5-ימים שלאחר אתגר (dpc), לאחר מכן ה-RNA חולץ, הועבר לעלילה לאחור ל-cDNA והועבר ל-PCR כמותי בזמן אמת. (QRT-PCR) לכימות נשירה ויראלית. כמות הנשירה הויראלית חושבה כממוצע ± SD של רמת ה-mRNA של כל הספוגיות שנאספו. רצפי הפריימר וה-Probe המשמשים בזיהוי נשירה ויראלית זמינים לפי בקשה.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

2.5. עקומת גדילה ויראלית

קינטיקה של גדילה של NDVs שונים נמדדה ב10-ביצי תרנגולת עוברות בנות יום. בקצרה, ה-NDVs דוללו והוזרקו לתוך 10-ביצי תרנגולת עוברות בנות יום על ידי חיסון אלנטואי. הנוזל האלנטואי נאסף ב-24-, 48-, 72- ו-96- שעות לאחר הזיהום. ה-EID50 של כל דגימה חושב בשיטת Reed and Muench [19].

2.6. מבחן עמידות חום

היציבות התרמונית של כל וירוס נמדדה כפי שתואר קודם [18]. בקצרה, כל וירוס עם 108 EID50 טיטר ב-0.1 מ"ל לכל בקבוקון הועבר לאמבט מים עם 56 ◦C, ואז הדגימות נאספו ב-10-, 20-, {{ 8}}, 40-,50- ו-60-דקות לאחר הדגירה. לבסוף, טיטר הנגיף נמדד בשיטת EID50.

2.7. קביעת ארסיות ויציבות

הארסיות של כל וירוס הוערכה על ידי יישום מבחן זמן המוות הממוצע (MDT) ב10-ביצי תרנגולת עוברות SPF בנות יום, כפי שתואר קודם לכן [20,21]. בקצרה, הנוזל האלנטואי שנאסף של כל זן NDV כימרי דולל מ-10-6 ל-10-9 בסדרת פי 10- והוחדר לביצי תרנגולת עתיקות SPF בנות יום עם 5 לכל קבוצה. עם 100 ליטר מכל דילול. לאחר מכן, ביצי התרנגולות המעוברות המאותגרות הודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והונרו במשך 7 ימים בסך הכל. מותה של כל קבוצה תועד, וערך ה-MDT חושב. בנוסף, בדיקת ה-ICPI בתרנגולות SPF 1-בנות יום נמדדה גם כדי לבדוק את הארסיות של הנגיף הכימרי. בקצרה, הנגיף הכימרי דולל בסדרה 10-כפולה באמצעות PBS והוזרק לתוך 1-ביצי תרנגולת עוברות SPF בנות יום. הביצים שהודגרו הודלקו במשך 8 ימים בסך הכל וערך ה-ICPI חושב. כדי להעריך את היציבות של שני ה-NDVs הכימריים, הם הופצו בביצי תרנגולת שעברו 10-בנות יום SPF באמצעות חיסון אלנטואיס במשך סך של 20 מעברים, ולאחר מכן נמדדו ערכי MDT ו-ICPI של מעברים נבחרים.

2.8. חיסון עוף ואתגר

בסך הכל 48 8-תרנגולות SPF בנות יום חולקו באופן אקראי לארבע קבוצות, ושלוש קבוצות חוסנו עם 106 EID50 של rcHR09-CI, rcHR09-CII וזן La Sota ב 100 μL DMEM דרך המסלול האוקולונאלי, בהתאמה. לתרנגולות בקבוצת הביקורת הוזרק 100 μL DMEM. הסרום של תרנגולות מחוסנות נאסף ב-7-, 14- ו-21 ימים לאחר החיסון (dpi) לקביעת טיטר נוגדנים. ב-21 dpi, התרנגולות אותגרו עם 105 EID50 NDV גנוטיפ VII ZJ1 זן דרך המסלול האוקולונאלי. ספוגיות cloacal ו-oropryngeal נאספו ביום 3- ו-5-אחרי האתגר (dpc) לגילוי המשך של נשירה ויראלית. הסימנים הקליניים והמוות נרשמו כל יום עד 14 dpc.

2.9. קביעת טיטר נוגדנים בסרום

טיטר הנוגדנים נגד NDV נמדד בשיטת עיכוב ההמגלוטינציה (HI) כפי שתואר קודם [22].

2.10. אמירה אתית

החיסון והאתגר של התרנגולות אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת יאנגג'ואו (מס' YZUDWLL-201904-002; תאריך: 4 בפברואר 2019).

יתרונות cistanche לגברים - מחזקים את המערכת החיסונית

2.11. ניתוח סטטיסטי

הנתונים מוצגים כאמצעים ± סטיות תקן (SDs), והם התקבלו משלושה שכפולים. המובהקות הסטטיסטית בין קבוצות שונות נותחה על ידי שיטת ה-t-test של הסטודנט באמצעות תוכנת GraphPad Prism 7.0 (La Jolla, CA, ארה"ב). (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001).

3. תוצאות

3.1. סכימה לבניית שני NDVs כימריים

גנוטיפ VII NDV מופץ ברחבי העולם ולעיתים קרובות גורם לתוצאות קטלניות לתרנגולות ולציפורים רגישות אחרות [23]. בעבר, בודדנו זן גנוטיפ תרמו יציב VIII NDV HR09, שיכול לשמור על זיהומיות במשך יותר מ-60 דקות כאשר הוא מודגר ב-56 ◦C [14]. במחקר זה, על מנת ליצור מועמד חיסון מוחלש יציב תרמי נגד גנוטיפ NDV VII, השתמשנו ב-HR09 כעמוד השדרה והחלפנו את הגן F עם זה של זן VII DT-2014; בינתיים, אתרי המחשוף בו עברו מוטציה מ-112RRQRR↓F 117 לאתרי ביקוע חלבון מסוג NDV F 112ERQER↓L 117 והזן הנגיף של אתרי ביקוע חלבון מסוג NDV F Class II 112GRQGR↓L 117 באורך מלא. הגנום HR09 עם חלבון F שעבר מוטציה סומנו כ-prcHR09-CI ו-prcHR09-CII, בהתאמה (איור 1).

איור 1. אסטרטגיה סכמטית לבניית שני NDVs כימריים. הגן F של זן HR09 התרמו-יציב גנוטיפ VIII הוחלף בגן F שעבר מוטציה של זן הגנוטיפ VII DT-2014.

3.2. בניית ה-NDV הכימרי rcHR09-CΙ ו-rcHR09-CⅡ

כדי לבנות את הנגיפים הכימריים, הפלסמידים prcHR09-CI או prcHR09-CII הועברו יחד עם שלושת הפלסמידים המסייעים, pCI-NP, pCI-P ו-pCI-L לתוך תאי BSR-T7/5 , שיכול לבטא T7 RNA פולימראז. 72 שעות לאחר מכן, כל ה-lysate של התא נקצר והוזרק לתוך ביציות עוברות SPF 10-בנות יום, והנוזלים האלנטואיים נאספו 4 ימים לאחר הדגירה. כדי לבדוק את אתרי המחשוף של שני הנגיפים הכימריים שניצלו, בוצע ניסוי ה-PCR של הגן F והתוצרים עברו רצף; התוצאות הראו שאתרי המחשוף הועברו בהצלחה ל-112ERQER↓L 117 ב-rcHR09-CI (איור 2A) ו-112GRQGR↓L 117 ב-rcHR09-CII (איור 2B), בנפרד. לבסוף, הגנום באורך מלא של שני ה-NDVs הכימריים התרמו-יציבים הוגבר באמצעות 10 זוגות של פריימרים, והתוצאות הראו שהן מכילות rcHR09-CI (איור 2C) ו-rcHR09-CII (איור 2D) הגנום באורך מלא של NDV. יחד, נתונים אלה הוכיחו ששני הנגיפים הכימריים היציבים התרמולוגיים נבנו בהצלחה.

איור 2. בנייה ואימות של ה-NDV rcHR09-CI ו-rcHR09-CII הכימריים. ה-RNA הכולל של וירוסים שניצלו חולץ ותעתוק לאחור ל-cDNA, הגן F של rcHR09-CI (A) ו-rcHR09-CII (B) הוגבר והוגדר לרצף. האורך המלא של ה-NDV הכימרי rcHR09-CI (C) ו-rcHR09-CII (D) הוגבר באמצעות 10 זוגות של פריימרים, ו-S1-S10 הם הייצוג שלהם.

3.3. מאפיינים ביולוגיים של ה-NDV הכימרי rcHR09-CI ו-rcHR09-CII

כדי לבדוק אם החלפת הגן F משפיעה על שכפול של NDV, בוצעה קינטיקה של גדילה בביצי תרנגולת עוברות בנות יום 10- על ידי מדידת EID50 שלהן. ה-NDVs הודללו והודגרו ב10-ביצי תרנגולות מעוברות בנות יום, והנוזל האלנטואי נאסף ב-24-, 48-, 72- ו-96- שעות לאחר הדגירה. תוצאות ה-EID50 הראו שגם ה-rcHR09-CI הכימרי שניצל וגם rcHR09-CII חלקו קינטיקה דומה של גדילה עם זן ה-HR09 ההורי שלהם (איור 3A), מה שהוכיח שלהחלפת הגן F לא הייתה השפעה על שכפול של HR09.

איור 3. המאפיינים הביולוגיים של ה-NDV rcHR09-CI ו-rcHR09-CII הכימריים. (א) לשני ה-NDV rcHR09-CI ו-rcHR09-CII הכימריים יש קינטית גדילה דומה לזן האימהי שלהם HR09. עקומת הגדילה של שני הנגיפים הכימריים והזן האימהי שלהם HR09 נמדדו בשיטת EID50 בביצי תרנגולת שעברו 10-בנות יום SPF. (ב) שני ה-NDV הכימריים rcHR09-CI ו-rcHR09-CII חולקים את היציבות התרמונית עם HR09. סך הכל 108 EID50 של זני NDV rcHR09-CI, rcHR09-CII, HR09 ו-La Sota הודגרו ב-56 ◦C עבור 10-, 20-, {{21 }}, 40-, 50- ו-60-דקה, בהתאמה. לאחר מכן, הטיטרים של ארבעת ה-NDVs נמדדו בשיטת EID50.

מכיוון שזן HR09 היה זן NDV יציב תרמי, נבדק גם האם החלפת חלבון F השפיעה על היציבות התרמונית שלו. כל וירוס כימרי ו-HR09 עם אותו טיטר וירוס (108 EID5{{50}}) טופלו באמצעות 10-, 20- , 30-, 40-, 50- ו-60-דקות מתחת ל-56 ◦C. לאחר מכן, טיטר הנגיף נמדד על ידי ביצוע בדיקת EID50. התוצאות הראו ששני הנגיפים הכימריים והזן ההורי שלהם HR09 יכולים להישאר זיהומיים במשך יותר מ-60 דקות, בעוד שהזן הלא יציב לה סוטה פשוט נשאר זיהומי למשך לא יותר מ-20 דקות (איור 3B). נתונים אלה הצביעו על כך שהנגיפים הכימריים rcHR09-CI ו-rcHR09- 218 CII עדיין היו יציבים תרמיים. במחקר זה, הגן F של VIII HR09 הוחלף בגן F שעבר מוטציה של VII DT- 2014 כדי לקבל שני NDVs כימריים מוחלשים. כדי להעריך את הארסיות של rcHR09-CI ו-rcHR09-CII כימרי, זוהו ערכי MDT ו-ICPI. התוצאות הראו שערך ה-MDT של כל שני ה-NDVs הכימריים היה גדול מ-120 שעות. כביקורת, ערך ה-MDT של זן HR09 של ההורים שלהם היה 57.6 שעות. ערכי ה-ICPI של rcHR09-CI ו-rcHR09-CII היו אפס, כביקורת, ה-ICPI של HR09 היה 1.8 (טבלה 1). הארסיות של NDV המבוססת על ערך MDT סווגה לשלוש קבוצות: וולוגני (מתחת ל-60 שעות), מזוגניות (60-90 שעות) ולנטוגניות (יותר מ-90 שעות). בינתיים, ערך ICPI הוא גם קריטריון נפוץ לקביעת הארסיות של NDV: וולוגני (מתחת ל-60 שעות), מזוגני (60-90 שעות), ולנטוגני (יותר מ-90 שעות): וולוגני (1.5-2.0), מזוגני (0.7). -1.5), ולנטוגני (0.0-0.7) [24]. ביחד, נתונים אלה מוכיחים שגם ה-rcHR09-CI הכימרי שניצל וגם rcHR09-CII היו מוחלשים מאוד על ידי שינוי אתרי המחשוף של חלבון F.

טבלה 1. הערכת הפתוגניות והיציבות של שני ה-NDVs הכימריים (סה"כ 20 מעברים).

בנוסף, היציבות של שני ה-NDVs הכימריים זוהתה על ידי דגירה של 20 מעברים בביצי תרנגולות מעוברות בנות יום 10-, ומעברים 10 ו-20 נבחרו למדידת ערכי MDT ו-ICPI. התוצאות הראו כי ערכי ה-MDT של מעבר 10 ומעבר 20 היו כולם גדולים מ-120 שעות, וערכי ה-ICPI של מעבר 10 ומעבר 20 היו כולם אפס (טבלה 1). נתונים אלה הראו שלאחר 20 מעברים בביצי תרנגולות מעוברות 10-בני יום, לערכי ה-MDT וה-ICPI של שני NDVs כימריים לא היה הבדל משמעותי, מה שהוכיח ששני ה-NDVs הכימריים שניצלו היו יציבים יחסית.

3.4. רמת נוגדנים גבוהה HI הושרה לאחר חיסון של ה-NDVs הכימריים

כדי לבדוק אם החיסון של ה-NDVs הכימריים שניצלו יכול לעורר את תגובת הנוגדנים בתרנגולות, 48 8-תרנגולות SPF בנות יום חולקו לארבע קבוצות. קבוצות שונות חוסנו עם 106 EID50 של rcHR09-CI, rcHR09-CII, זן La Sota או 100 µL DMEM דרך המסלול האוקולונאלי, בהתאמה. הסרום של תרנגולות מחוסנות נאסף ב-7-, 14- ו-21 ימים לאחר החיסון (dpi) לקביעת טיטר נוגדני HI. נוגדן HI של סרום שנאסף נגד זן ה-NDV המחוסן הראה שלא היה הבדל משמעותי בין הסרום של rcHR09-CI, rcHR09-CII ו-La Sota ב-7 dpi. יתרה מכך, עם הזמן, כיטר נוגדני HI גדל בסרום של 14 ו-21 dpi, ולא היה הבדל משמעותי בין שלוש הקבוצות (איור 4A)

איור 4. הנגיפים הכימריים גרמו לרמה גבוהה של תגובת נוגדנים. תרנגולות ה-SPF חוסנו עם 106 EID50 rcHR09-CI, rcHR09-CII, וזן החיסון המסחרי La Sota דרך המסלול האוקולונאלי, בהתאמה. הסרום נאסף ב-1-, 2-, ו-3 שבועות לאחר החיסון, טיטר הנוגדנים נמדד בשיטת HI נגד עצמם (A) וה-cross HI antibody titer נגד ZJ1 (B). (ns: אין הבדל משמעותי; * p < 0.05; ** p < 0.01).

בנוסף, זוהה טיטר נוגדני HI נגד זן ZJ1 על מנת להעלות את השפעות החיסון של NDVs כימריים כנגד גנוטיפ VII NDV. התוצאות הראו שלא היה הבדל משמעותי בין שלוש הקבוצות המחוסנות של NDVs ב-7 dpi, וטיטר הנוגדנים HI גדל עם הזמן. בשונה מטיטר נוגדני HI נגד זן מחוסן, טיטר נוגדני HI נגד זן ZJ1 של rcHR09-CI- ו-rcHR09-קבוצות המחוסנות CII היו גבוהים משמעותית מהקבוצה המחוסנת של לה סוטה ו-rcHR 09-קבוצת CI גרמה לטיטר נוגדני HI הגבוה ביותר מבין שלוש הקבוצות הללו (איור 4B).

3.5. נשירה ויראלית הופחתה כאשר התרנגולות המחוסנות אותגרו עם זן גנוטיפ VII ZJ1 ארסי

במחקר זה, תרנגולות SPF שחוסנו אותגרו בזן גנוטיפ VII ZJ1 כדי להעריך את ההשפעה המגנה של וירוסים כימריים כנגד גנוטיפ VII NDV. ב-21 dpi, התרנגולות המחוסנות אותרו בזן 105 EID50 ZJ1, וספוגיות cloacal ו-oropryngeal מכל התרנגולות המאותגרות של כל קבוצה נאספו בימים 3- ו-5- שלאחר האתגר (dpc ) לזיהוי נשירה ויראלית. התוצאות הראו שהחיסון של קבוצות rcHR09-CI, rcHR09-CII ו-La Sota יכול להפחית את הנשירה הוויראלית בספוגיות cloacal (איור 5A, C) וספוגיות אור-לוע ב{{11} } ו-5-dpc (איור 5B, D) בהשוואה לקבוצת הביקורת. בהשוואה לקבוצת La Sota, הנשירה הוויראלית בשני NDVs כימריים הייתה נמוכה משמעותית מזו שבקבוצות מחוסנות לה סוטה, מה שהוכיח כי לשני ה-NDVs הכימריים יש יעילות הגנה טובה יותר מזן La Sota נגד האתגר של גנוטיפ VII NDV.

איור 5. כמות QRT-PCR של נשירת NDV ZJ1 בתרנגולות מאותגרות. התרנגולות אותגרו עם 1{{10}}6 EID50 NDV גנוטיפ VII ZJ1 זן ב-21 ימים לאחר החיסון. דגימות ספוגית cloacal (A,C) ודגימות ספוגית פה-לוע (B,D) נאספו ב-3- ו-5-ימים שלאחר האתגר, ורמות הנשירה הנגיפית של NDV ZJ כמתו באמצעות QRT- PCR. הערכים הוצגו כערכים ממוצעים ± סטיית תקן (ממוצע ± SD) בכל קבוצה. (ns: אין הבדל משמעותי; * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001).

3.6. שני NDVs Chimeric סיפקו הגנה מלאה מפני האתגר של זן גנוטיפ VII ZJ1

מכיוון שהאתגר של זן גנוטיפ VII ZJ1 יכול להוביל לתוצאות קטלניות, למעט זיהוי של נשירה ויראלית, מוות של תרנגולות מאותגרות תועד גם כל יום עד 14 ימים. התוצאות הראו שכל התרנגולות בקבוצת הביקורת הראו סימנים קליניים של דיכאון רוחני, הפרעה בדרכי הנשימה, שלשולים, ומתו ב-5- עד 6-dpc, ולא היו סימנים קליניים ולא היו תרנגולות מתות ב-rcHR{ קבוצות {4}}CI, rcHR09-CII ו-La Sota עד 14 dpc (איור 6), מה שהוכיח שכל ה-NDVs הכימריים ו-La Sota החיסונים יכולים לספק הגנה מלאה מפני האתגר של גנוטיפ VII NDV.

איור 6. Chimeric NDV rcHR09-CI ו-rcHR09-CII מספקים הגנה מלאה מפני האתגר של ZJ1. ב-3 שבועות לאחר החיסון, התרנגולות אותגרו עם 106 זני EID50 ZJ1. מצב ההישרדות נוטר במשך 14 ימים בסך הכל.

4. דיון

למרות מספר סוגים של חיסוני NDV שנמצאים בשימוש בעולם, ה-ND עדיין מתרחש במקומות רבים בעולם. בעיה אחת עשויה להיות הגנוטיפ של זן החיסון אינו תואם לזן הנפוץ. חיסונים אלה שאינם מתאימים לגנוטיפ יכולים לספק הגנה מסוימת מפני האתגר של NDVs ארסיים; עם זאת, הם אינם יכולים להגן על התרנגולות מפני זיהום, ואינם יכולים להפחית ביעילות את הנשירה הויראלית [25,26]. הגנוטיפ Class II VII NDV הוא גנוטיפ עיקרי הנפוץ באזורי המזרח התיכון, אפריקה ואסיה; עם זאת, החיסונים המשמשים במקומות אלה הם בדרך כלל זני גנוטיפ II La Sota ו-B1, שאינם אותו גנוטיפ עם זנים נפוצים [27-29]. במחקר זה, כדי ליצור מועמד חיסון תרמו-יציב תואם גנוטיפ VII, זן גנוטיפ VIII HR09 שימש כעמוד השדרה, ונבנו שני מועמדי חיסון גנוטיפ VII התואמים כימריים כדי למלא את הצורך בחיסון לגנוטיפ VII. עד כה, פותחו מספר מועמדים לחיסון NDV עמידים בחום. ה-NDV V4 התרמו-יציב הראשון בודד מהפרובנטרקולוס של תרנגולות ב-1966 [30]. V4 היה זן lentogenic טבעי, ותוצאות ניתוח פילוגנטי הראו שהוא שייך לגנוטיפ II NDV. בשונה מ-V4, הזן התרמי היציב HR09 ששימש במחקר שלנו היה שייך לזן ארסי [14]. אם אנחנו רוצים להכניס אותו לשימוש קליני, הדבר הראשון שצריך לעשות הוא לקבוע כיצד להפוך אותו כזן אוירולנטי. הודות לפיתוח המערכת הגנטית ההפוכה, הבנייה של מועמדי חיסון NDV תואמי גנוטיפ אוירולנטי השיגה התקדמות משמעותית. מכיוון שהוכח שאתר הביקוע של חלבון F הוא הקובע הארסיות העיקרי של NDV [31], דרך פשוטה ליצור את ה-NDV המוחלש היא החלפת אתר הביקוע של חלבון F בזן הארס עם זה של הזן האווירולנטי. בינתיים, דווח שחלבון F הוא חלבון אימונוגנטי חשוב שיכול לגרום לנוגדן הנטרול להגן על התרנגולות המחוסנות מפני האתגר של NDV ארסי [32-34]. בנוסף, דווח כי אתר המחשוף של NDV יכול להשפיע על התגובה החיסונית בתרנגולות מחוסנות [11]. במחקר זה, החלפנו את הגן F של HR09 תרמי יציב בגן F של זן DT-2014 ארסי של NDV גנוטיפ VII; בינתיים, אתרי המחשוף של DT-2014 עברו גם מוטציה לאלו של זני ה-NDV האווירולנטיים של Class I ו- Class II, בהתאמה (איור 1).

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

כצפוי, תוצאות קביעת הארסיות הראו ששני שני ה-NDVs התרמו-יציבים הכימריים מוחלשים מאוד (טבלה 1). בינתיים, נמצא גם ששני שני ה-NDVs הכימריים הראו קינטיקה צמיחה דומה לזן HR09 ההורי שלהם (איור 3A). מכיוון שחלבון HN היה החלבון העיקרי שהיה אחראי ליציבות התרמונית של HR09, שני ה-NDVs הכימריים עדיין שמרו על היציבות התרמונית בדיוק כמו זן ה-HR09 ההורי שלהם (איור 3B). מחקרים מרובים דיווחו שחיסון NDV תואם גנוטיפ יכול לגרום לרמה גבוהה יותר של תגובה חיסונית הומורלית, והוא יעיל יותר בהפחתת נשירה ויראלית מאשר חיסון הטרולוגי, למרות החיסונים התואמים לגנוטיפ וגם החיסונים ההטרולוגיים יכולים להגן על התרנגולות הנגועות מפני סימנים קליניים ברורים. מוות [35–37]. במחקר זה, טיטר הנוגדנים HI נמדד ב-7-, 14- ו-21-dpi, תוצאות טיטר הנוגדנים כנגד הרכבת המחוסנת הראו שאין הבדל משמעותי בין rcHR{ {13}}זני CI, rcHR09-CII ו-La Sota (איור 4A), בעוד שהנוגדן HI נגד זן הגנוטיפ VII ZJ1 הראה ששני ה-NDVs הכימריים התרמו-יציבים גרמו לרמה גבוהה משמעותית מזן La Sota, ובין כל שלושת ה-NDVs המחוסנים, rcHR09-CI גרמה לרמה הגבוהה ביותר של נוגדן HI (איור 4B). תוצאה זו הייתה עקבית עם דיווחים קודמים לפיהם אתר המחשוף של חלבון F יכול להשפיע על תגובת החסינות של מועמדים לחיסון בתרנגולות. ניסוי האתגר של גנוטיפ VII ZJ1 הראה שכל שלוש הקבוצות המחוסנות הראו הפחתה משמעותית בנשירה נגיפית בהשוואה לקבוצת הביקורת, ושני ה-NDVs התרמו-יציבים הכימריים יכלו להפחית את הנשירה הוויראלית בצורה יעילה יותר מאשר זן La Sota (איור 5). עקומת ההישרדות הראתה שכל זני rcHR09-CI, rcHR09-CII ו-La Sota יכולים לספק הגנה מלאה מפני האתגר של זן ZJ1 (איור 6). יחד, נתונים אלה הראו ששני ה-NDV הכימריים התואמים לגנוטיפ VII שנבנו במחקר זה יכולים לספק הגנה יעילה מפני האתגר של זן גנוטיפ VII ZJ1, ויכולים להפחית את נשירת הנגיף בצורה יעילה יותר מאשר זן La Sota. לסיכום, מחקר זה בנה שני מועמדים לחיסון כימרי תרמו-יציב NDV, המשתמשים בזן הגנוטיפ VIII NDV ארסי HR09 כעמוד השדרה והחליפו את גן ה-F שלו בזה של זן הגנוטיפ VII DT-2014. בינתיים, אתר ביקוע חלבון F של DT-2014 עבר מוטציה מ-112RRQRR↓F 117 ל-112ERQER↓L 117 ו-112GRQGR↓L 117, בהתאמה. שני ה-NDVs הכימריים משמרים את היציבות התרמונית של HR09, ובדיקות הארסיות של MDT ו-ICPI מצביעות על כך שהם מוחלשים בהצלחה. שני ה-NDVs הכימריים יכולים לגרום לרמה גבוהה של תגובת נוגדנים, להפחית באופן משמעותי את הנשירה הנגיפית, ולספק הגנה מלאה מפני האתגר של זן גנוטיפ VII ZJ1 ארסי.

הפניות

1. דימיטרוב, קמ; אבולניק, ג; Afonso, CL; אלבינה, ע.; בהל, ג'; ברג, מ.; בריאנד, FX; בראון, IH; צ'וי, ק"ש; צ'וואלה, א; et al. מערכת סיווג פילוגנטי מאוחדת מעודכנת ומינוח מתוקן לנגיף מחלת ניוקאסל. לְהַדבִּיק. ג'נט. Evol. 2019, 74, 103917. [CrossRef] [PubMed]

2. de Leeuw, O.; Peeters, B. רצף נוקלאוטידים מלא של וירוס מחלת ניוקאסל: עדות לקיומו של סוג חדש בתוך תת-משפחת Paramyxovirinae. ג'נרל וירול. 1999, 80 Pt 1, 131–136. [CrossRef]

3. צ'גלדי, א'; Ujvári, D.; Somogyi, E.; ווהמן, E.; ורנר, או.; Lomnizzi, B. קטגוריית גודל הגנום השלישי של סרוטיפ 1 של פרמיקסו-וירוס עופות (נגיף מחלת ניוקאסל) והשלכות אבולוציוניות. Res. 2006, 120, 36–48. [CrossRef]

4. גנר, ק.; דאס, מ.; סינהא, ש; נגיף מחלת קומאר, ס. ניוקאסל: מצב נוכחי והבנתנו. Res. 2014, 184, 71–81. [CrossRef]

5. קבילוב, מ.ר; Alikina, TY; Yurchenko, KS; גלושצ'נקו, AV; גונבין, ק"ו; Shestopalov, AM; Gubanova, NV רצפי גנום מלאים של שני זני נגיף מחלת ניוקאסל מבודדים מברווז בר ויונה ברוסיה. הכרזת הגנום 2016, 4, ה01348-16. [CrossRef]

6. רן, ש.; שי, X.; וואנג, י.; טונג, ל.; גאו, X.; ג'יה, י.; וואנג, ה.; מניפה, מ.; ג'אנג, ש.; Xiao, S.; et al. אפיון מולקולרי של זן וירוס מחלת ניוקאסל Class I שבודד מיונה בסין. אביאן פאתול. 2016, 45, 408–417. [CrossRef]

7. Morrison, TG מבנה ותפקוד של חלבון היתוך paramyxovirus. ביוכים. ביופיס. Acta 2003, 1614, 73–84. [CrossRef]

8. Bossart, KN; Fusco, DL; Broder, CC Paramyxovirus כניסה. עו"ד Exp. Med. ביול. 2013, 790, 95–127. [CrossRef]

9. קולינס, MS; בשירודין, JB; אלכסנדר, DJ סיפק רצפי חומצות אמינו באתר ביקוע חלבון היתוך של נגיפי מחלת ניוקאסל, המציגים שונות באנטיגניות ובפתוגניות. קֶשֶׁת. וירול. 1993, 128, 363–370. [CrossRef]

10. פנדה, א.; הואנג, ז'; אלנקומארן, ש.; רוקמן, DD; Samal, SK תפקידו של אתר מחשוף חלבון היתוך בארסיות של וירוס מחלת ניוקאסל. מיקרוב. פתוג. 2004, 36, 1-10. [CrossRef]

11. קים, ש.ש; חן, ז; יושידה, א.; פלדוראי, א.; Xiao, S.; Samal, SK הערכה של רצפי אתר ביקוע של חלבון היתוך של וירוס מחלת ניוקאסל בחיסונים תואמים לגנוטיפ. PLoS ONE 2017, 12, e0173965. [CrossRef] [PubMed]

12. מנוחרן, ו.ק.; Varghese, BP; פלדוראי, א.; Samal, SK השפעת רצף אתר ביקוע חלבון היתוך על יצירת חיסון גנוטיפ VII לנגיף מחלת ניוקאסל. PLoS ONE 2018, 13, e0197253. [CrossRef] [PubMed]

13. קומאר, ש.; נייאק, ב.; קולינס, PL; Samal, SK הערכת חלבוני נגיף F ו-HN של מחלת ניוקאסל בחסינות מגן על ידי שימוש בוקטור פרמיקסו-וירוס עופות רקומביננטי מסוג 3 בתרנגולות. J. Virol. 2011, 85, 6521–6534. [CrossRef] [PubMed]

14. קאו, י.; ליו, ש.; ג'אנג, X.; הא.; Wu, Y. רצף הגנום המלא של זן וירוס ניוקאסל עמיד בחום HR09. הכרזת הגנום 2017, 5, ה01149-17. [CrossRef] [PubMed]

15. רואן, ב.; ג'אנג, X.; ג'אנג, סי; דו, פ.; מנג, ג; גואו, מ.; וו, י.; Cao, Y. שאריות 315 ו-369 בחלבון HN תורמים לעמידות התרמית של וירוס מחלת ניוקאסל. חֲזִית. מיקרוביול. 2020, 11, 560482. [CrossRef] [PubMed]

16. רואן, ב.; ליו, ש.; חן, י.; ניו, X.; וואנג, X.; ג'אנג, סי; גואו, מ.; ג'אנג, X.; קאו, י.; Wu, Y. יצירה והערכה של מועמד לחיסון של גנוטיפ VIII מוחלש ועמיד לחום נגיף מחלת ניוקאסל. עופות. Sci. 2020, 99, 3437–3444. [CrossRef]

17. ג'אנג, X.; בו, ז; מנג, ג; חן, י.; ג'אנג, סי; קאו, י.; Wu, Y. יצירה והערכה של וירוס מחלת ניוקאסל רקומביננטי תרמי המבטא את ה-HA של נגיף שפעת העופות H9N2. וירוסים 2021, 13, 1606. [CrossRef]

18. וון, ג.; חן, ג; גואו, ג'; ג'אנג, ז'; שאנג, י.; שאו, ה.; Luo, Q.; יאנג, ג'; וואנג, ה.; וואנג, ה.; et al. פיתוח וקטור חיסון נגד וירוס מחלת ניוקאסל תרמו-יציב לביטוי של גן הטרולוגי. ג'נרל וירול. 2015, 96, 1219–1228. [CrossRef]

19. LaBarre, DD; Lowy, RJ שיפורים בשיטות לחישוב הערכות טיטר וירוסים מ-TCID50 ומבחני פלאק. J. Virol. שיטות 2001, 96, 107–126. [CrossRef]

20. אלכסנדר, די ג'יי מחלת ניוקאסל ופראמיקסו-וירוסים אחרים של עופות. Rev. Sci. טק. Int. כבוי. אפיזוט. 2000, 19, 443–462. [CrossRef]

21. יו, XH; צ'נג, JL; שו, ג'; ג'ין, JH; שיר, י.; ז'או, ג'; Zhang, GZ תפקידים של גנים חלבוניים הקשורים לפולימראז בנגיף הנגיף של מחלת ניוקאסל. חֲזִית. מיקרוביול. 2017, 8, 161. [CrossRef] [PubMed]

22. מעמרי, י. מערך, פ.; גאו, ש.; García-Sastre, A.; שטיינמן, ר.מ; Palese, P.; Nchinda, G. נגיף מחלת ניוקאסל המבטא חלבון gag HIV ממוקד תאים דנדריטים גורם לתגובה חיסונית חזקה ספציפית ל-Gag בעכברים. J. Virol. 2011, 85, 2235–2246. [CrossRef] [PubMed]

23. עיד, אע"מ; חוסיין, א.; חסנין, או.; אלבקרי, RM; דיינס, ר.; Sadeyen, J.-R.; אבדיאן, HMF; Chrzastek, K.; Iqbal, M. Newcastle Disease Genotype VII שכיחות בעופות וציפורי בר במצרים. וירוסים 2022, 14, 2244. [CrossRef] [PubMed]

24. חג'אזי, ז; Tabatabaeizadeh, SE; טורוגי, ר.; פרזין, ח.; Saffarian, P. גילוי ואפיון ראשון של תת-גנוטיפ XIII.2.1 וירוס מחלת ניוקאסל שבודד מתרנגולות בחצר האחורית באיראן. וטרינר. Med. Sci. 2022, 8, 2521–2531. [CrossRef] [PubMed]

25. Tsai, HJ; Chang, KH; צנג, CH; פרוסט, קמ; Manvell, RJ; אלכסנדר, DJ אפיון אנטיגני וגנוטיפי של נגיפי מחלת ניוקאסל שבודדו בטייוואן בין 1969 ל-1996. וטרינר. מיקרוביול. 2004, 104, 19–30. [CrossRef]

26. קפצ'ינסקי, ד"ר; King, DJ הגנה על תרנגולות מפני מחלה קלינית גלויה וקביעת נשירה נגיפית בעקבות חיסון עם חיסונים זמינים מסחרית לנגיף מחלת ניוקאסל לאחר אתגר עם נגיף ארסי מאוד מהתפרצות מחלת ניוקאסל האקזוטית בקליפורניה 2002. חיסון 2005, 23, 3424–3433. [CrossRef] [PubMed]

27. צ'ו, ש'; קים, SJ; Kwon, HJ רצף גנומי של וריאנט אנטיגני של וירוס מחלת ניוקאסל שבודד בקוריאה. גנים של וירוסים 2007, 35, 293–302. [CrossRef]

28. חאן, ת"א; Rue, CA; רחמני, SF; אחמד, א.; Wasilenko, JL; מילר, PJ; Afonso, CL אפיון פילוגנטי וביולוגי של מבודדי וירוס מחלת ניוקאסל מפקיסטן. ג'יי קלין. מיקרוביול. 2010, 48, 1892–1894. [CrossRef]

29. ליו, י.; שמש, ג; צ'י, מ'; וון, ה.; זאו, ל.; שיר, י.; ליו, נ.; Wang, Z. אפיון גנטי וניתוח פילוגנטי של וירוס מחלת ניוקאסל מסין. לְהַדבִּיק. ג'נט. Evol. 2019, 75, 103958. [CrossRef]

30. Simmons, GC הבידוד של נגיף מחלת ניוקאסל בקווינסלנד. אוסט. וטרינר. י' 1967, 43, 29–30. [CrossRef]

31. טויודה, ט.; Sakaguchi, T.; אימאי, ק.; Inocencio, NM; גוטו, ב.; המאגוצ'י, מ.; Nagai, Y. השוואה מבנית של אתר הפעלת המחשוף של הגליקופרוטאין היתוך בין זנים ארסיים ואווירולנטיים של וירוס מחלת ניוקאסל. Virology 1987, 158, 242–247. [CrossRef] [PubMed]

32. דינג, ל.; חן, פ.; באו, X.; לי, א.; ג'יאנג, י.; הו, י.; Ge, J.; זאו, י.; וואנג, ב.; ליו, ג'. et al. נגיפים רקומביננטיים של דלקת המעי של ברווז המבטאים את הגן F של נגיף מחלת ניוקאסל (NDV) מגנים על תרנגולות מאתגר NDV קטלני. וטרינר. מיקרוביול. 2019, 232, 146–150. [CrossRef] [PubMed]

33. Jia, W.; ג'אנג, X.; וואנג, ה.; טנג, ש; שו, ג'; Zhang, G. בנייה ויעילות חיסונית של זן חיסון נגד הרפס וירוס הודו רקומביננטי המבטא חלבון היתוך של נגיף גנוטיפ VII של מחלת ניוקאסל. וטרינר. מיקרוביול. 2022, 268, 109429. [CrossRef] [PubMed]

34. שאו, י.; סאן, ג'; האן, ז; Liu, S. נגיף גרון דלקתי רקומביננטי המבטא חלבון F של נגיף מחלת ניוקאסל מגן על תרנגולות מפני וירוס גרון זיהומיות ואתגר נגיף מחלת ניוקאסל. חיסון 2018, 36, 7975–7986. [CrossRef]

35. מילר, PJ; קינג, די ג'יי; Afonso, CL; Suarez, DL הבדלים אנטיגנים בין זני נגיף מחלת ניוקאסל מגנוטיפים שונים המשמשים בניסוח חיסון משפיעים על נשירה ויראלית לאחר אתגר אלים. חיסון 2007, 25, 7238–7246. [CrossRef]

36. מוחמד, מ.ה.; עבדלעזיז, AM; קומאר, ש.; אל-חביב, מ.א.; Megahed, MM השפעת המגוון הפילוגנטי של אתגר וירוס מחלת ניוקאסל וולגני על נשירת וירוסים לאחר חיסון DNA הומולוגי והטרולוגי בתרנגולות. אביאן פאתול. 2016, 45, 228–234. [CrossRef]

37. וג'יד, א'; בשאראת, א.; ביבי, ת.; Rehmani, SF השוואה של הגנה ונשירה ויראלית בעקבות חיסון עם זני נגיף מחלת ניוקאסל מגנוטיפים שונים המשמשים בניסוח חיסון. טרופ. אנים. בריאות פרוד. 2018, 50, 1645–1651. [CrossRef]