ביטוי Clr-f מווסת הומאוסטזיס חיסוני וכליות מטבולי Ⅱ

נגעים צינוריים וגלומרולריים בכליות בעכברים חסרי Clr-f.

הבדיקה הראשונית שלClr-f−/− קטעי כליה חשפו מספר שינויים בקורטקס הכלייתי. להעריךנגעים היסטופתולוגיים, קטעי כליה מוכתמים ב-PASמארבעה 12-שבועות ו-WTClr-f-/- עכברים הוערכו בצורה עיוורת (איור.2א). נוכחות משתנה של נגעים צינוריים פרוקסימליים ודיסטליים נצפתה בClr-f-/- כליות שכללו, פיטום תאי אפיתל צינורי, עקירה גרעינית ואובדן גבולות מברשת (איור.2א; לוחות עליונים). במקרים נדירים, נמצא נמק צינורי בצורה של הצטברות פסולת נמקית luminal ואובדן אפיתל מוחלט בחלק מהאזורים שנבדקו. הClr-f−/− כליות הוצגו גם כןפתולוגיות גלומרולריות(תאנה.2א; לוחות תחתונים), עם אזורים של עיבוי מוקדי של טופים גלומרוליים, שגשוג מינימלי של פיברובלסטים פריגלומרולרי הקשור לפיברוזיס בין-סטיציאלי קל, ונגעים חמורים יותר עם מזנגיוליזה, מפרצת נימיות שהתקדמו להפרעה בולטת של הגלומרולי ונוכחות מתמדת של פסולת תאי נמק בחלל התא. . ציון פתולוגיה גלומרולרית חשף מספר משמעותי שלנגעים גלומרולרייםבעכברים חסרי Clr-f בהשוואה לחברי המלטה ל-WT (איור.2ב). מיקרוסקופיה אלקטרונית גילתה נזק חמור לפודוציטים, מחיקת תהליך כף הרגל של פודוציטים ועיבוי משמעותי שלמרתף גלומרולריממברנה (GBM) (איור.2C,D).

לחץ ל-cistanche herba למחלת כליות

כדי להעריך אם היו משקעי אימונוגלובולינים בכליות, הקשורים באופן אופייני לפתולוגיות שנצפו, צבענו קטעי קליפת כליות של כליות WT ו-Clr-f-/- על נוכחותם של נוגדני IgA, IgM ו-IgG על ידי IF (איור 2E ). כליות Clr-f−/− מציגות צביעת IF ברורה דומיננטית של משקעי IgA גלומרולריים מלווה במשקעי IgM מובהקים ונוכחות פחותה אך עקבית של משקעי IgG. כמו כן, זיהינו דפוסים דומים של משקעי טובולו-אינטרסטיציאליים IgA, IgM ו-IgG בכליות Clr-f-/-. חלבון משלים C3 זוהה באופן נרחב גם בכליות Clr-f-/- אך לא בכליות WT (איור 2F).

Clr-f נדרש לתפקוד תקין של הכליות.

כדי להעריך את ההשפעה של פתולוגיות Clr-f−/− על תפקוד הכליות, ניתחנו את הרכב הדם והשתן מבני זכר בני שבוע Clr-f−/− ו-WT. מצאנו עלייה צנועה, אך בעלת משמעות סטטיסטית, ביחס השתן-חלבון לקריאטינין (UP/CR) בעכברי Clr f -/- בהשוואה לעכברי WT, עם עליה בקריאטינין בסרום, אך רמות חלבון בשתן דומות בהשוואה ל-WT עכברים, כמו גם הפרשה חלקית דומה של נתרן (FENa) (איור 2G). בהתחשב בביטוי הצינורי של Clr-f, הערכנו אם לחץ הדם של העכבר Clr-f−/− בעכברים בני שבוע ו-24- Clr-f−/− הושפע. עכברי Clr-f-/- הפגינו ירידה שולית אך לא מובהקת סטטיסטית בלחץ הדם בהשוואה לחברי המלטה של ​​WT (איור 2H). תוצאות אלו מראות שסינון כליות תקין משתנה בהיעדר Clr-f, אך Clr-f אינו מראה תפקידים משמעותיים בהומאוסטזיס של אלקטרוליטים בכליות או בוויסות לחץ הדם.

תעתיק כליות Clr-f-/− מראה חוסר ויסות בחילוף החומרים.

לחקור את תהליכי התעתיק הבסיסיים האחראים ל-Clr-f-/-פתופנוטיפים של כליות, ביצענו רצף RNA על כליות של 7-, 13- ועכברי WT ו-Clr-f−/− בני שבוע 24-. גנים המבוטאים בצורה דיפרנציאלית (DEGs) בעכברי Clr-f-/- בהשוואה לעכברי WT נחקרו על ידי ניתוח העשרה תפקודית וניתוח פתוטייפ תעתיק (איור 3A). מיפינו רשתות אינטראקציה של תהליכים ביולוגיים מועשרים מניתוח העשרה של סט גנים (GSEA) של DEGs שזוהו בכל גיל (איור 3B). הניתוח שלנו הראה העשרה של גנים הקשורים למחזור התא שהווסרו בכליות של 7-עכברי Clr-f-/- בני שבוע. לאחר 13 שבועות, תהליכים מטבוליים, הובלה, מוות של תאים ותגובות לחומרים רעילים הועשרו מ-DEG עם ביטוי מוגבר בכליות Clr-f-/-, בעוד שהרכבת cilium לא תנועתית, שעתוק DNA ועיבוד הועשרו מ-DEG עם ירידה בביטוי. הכליות של עכברי Clr-f-/− בני שבוע 24- הראו גם העשרה של תהליכים מטבוליים, ותחבורה בין DEGs עם ביטוי מוגבר, כמו גם תהליכים המווסתיםמחזור הדם, בעוד מוות תאים, חסינות ותהליכי ויסות איתות של גורם גדילה טרנספורמציה-ביתא (TGF) הועשרו מ-DEG עם ירידה בביטוי.

כדי ללכוד תהליכים הקשורים לגיל העומדים בבסיס מומים בכליות Clr-f-/−, ניתחנו גנים השייכים לארבעה דפוסים דינמיים של ביטוי דינמי: DEGs שגדלים עם הגיל, יורדים עם הגיל, או עולים או יורדים זמנית בגיל 13 שבועות. ניתוח העשרה תפקודית של תהליכים ביולוגיים, תפקודים מולקולריים ומסלולים מוגדרים בקרב קבוצות אלו גילה כי DEGs עם ביטוי הגובר מגיל 7 עד 24 שבועות בכליות Clr-f-/- היו מיוצגות יתר במסלולים מטבוליים של שומנים, בעוד DEGs קשורים לתאים- הידבקות המצע ירדה בביטוי מגיל 7 עד 24 שבועות (איור 3C). DEGs עם עלייה חולפת בביטוי בגיל 13 שבועות היו קשורים בעיקר לנשימה מיטוכונדריאלית, בעוד DEGs עם ירידה חולפת בביטוי ממופה למסלולי מחזור התא. בתוך ארבע הקטגוריות הללו של ביטוי דינמי היו שלושה תת-צבירים המייצגים דפוסי ביטוי דיפרנציאליים שבהם גודל השינוי בביטוי בין 7 ל-13 שבועות היה דומה, גבוה או נמוך ממידת השינוי בין 13 ל-24 שבועות. , בהתאמה (איור 3C). התהליכים הביולוגיים המועשרים והתפקודים המולקולריים מכל תת-צביר של גנים היו נבדלים במידה רבה על פני ארבעת דפוסי הביטוי הדינמיים העיקריים שזוהו אך שיקפו תהליכים תאיים חופפים או קשורים בכל קבוצה. בסך הכל, פרופיל התעתיק של כליות Clr-f-/- חושף חוסר ויסות דינמי ומתפתח של חילוף החומרים, התפקוד וההומאוסטזיס התאי.

עכברי Clr-f−/− צוברים שומן.

העלייה המזוהה הקשורה לגיל ב-DEGs הקשורה למטבוליזם של שומנים הביאה אותנו לחקור נתוני ביטוי של עכברי WT ו-Clr-f-/- עבור גנים ידועים הקשורים לליפידים. רוב תעתיקי הגנים הללו היו מוגברים בעכברי Clr-f-/- (איור 4A) ועמדו בקנה אחד עם עליות במשקעי שומן בטני ופרירנל בעכברי Clr-f-/- בגיל 24 שבועות (איור 4B). למרות שעכברי Clr-f-/- ו-WT הפגינו משקל גוף דומה (איור 4C), משקל השומן הבטני בעכברי Clr-f-/- היה גבוה יותר באופן משמעותי, מה שמעיד על כך שרקמת השומן אחראית לשיעור מוגבר של Clr-f −/− משקל גוף של עכבר (איור 4D). זיהינו גם הצטברות שומנים חוץ רחמיים בתוך הכליות של עכברי Clr-f-/-, כפי שהוכח על ידי צביעה מוגברת של ORO של כליות עכברים Clr f -/- (איור 4E). מכיוון ששומן פרי-רנלי ונוכחות שומן בין-סטיציאלי בכליה קשורים לגורמי סיכון מטבוליים של CKD21, שיערנו האם Clr-f מגן מפניאטיולוגיות של סוכרתאוֹהפרעות מטבוליות הקשורותקשור לCKD.

לכליות עכברים Clr-f-/− יש קווי דמיון והבדלים בפרופיל תעתיק למחלת כליות אנושית.

הצטברות שומנים חוץ רחמיים בכליה קשורה להדלקה, פיברוזיס, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה ומוות תאים22,23. כדי להעריך אם כליות Clr-f-/− דומות למחלות כליה מוגנות, השווינו את הפרופיל התעתיק של כליות Clr-f-/− לפרופילי ביטוי שפורסמו של רקמת כליות ו/או דם מתורמים אנושיים עם CKD, נפרופתיה סוכרתית(DN), לופוס נפריטיס (LN), אוIgA נפרופתיה(IgAN) (איור 5A). Clr-f-/- פרופלי תעתוק כליות מקובצים בדם מחולי IgAN ורקמות גלומרולריות של חולי DN (איור 5B). השוואה של פרופילי ביטוי של Clr-f−/− ו-IgAN על ידי ניתוח העשרה תפקודית הראתה עליות מקבילות בביטוי גנים הקשורים לתגובות תחמוצת תגובתיות, למוות תאים, פרוטאוליזה ומטבוליזם של אמיד, כמו גם ירידה משותפת בביטוי גנים הקשורים לממברנה. תהליכי סחר, ארגון שלד ציטו, איתות PI3K-AKT, מחזור תאים ומטבוליזם DNA/RNA (איור 5C). לעומת זאת, מערכי ביטוי הכליות של Clr-f-/− נבדלו מ-IgAN, עם ביטוי מוגבר של גנים השייכים למסלולי האיתות AGE-RAGE, ErbB, TNF/MAPK ו-Rap1, ותהליכים של ספיגה חוזרת של וזופרסין מווסתת מים ופעילות ליזוזום, וירידה בביטוי של גנים היו שייכים ל-adherens junction, הרכבת cilium לא תנועתית, מחזוריות תאים, מטבוליזם של DNA ואותות TGF. ממצאים אלו מצביעים על כך שבדומה ל-IgAN, תהליכים תאיים של בקרת גדילה, הומאוסטזיס ותיקון, אינם מוסדרים גם בכליות Clr-f-/-, תוך שינוי בחילוף החומרים, איתות מתח, ומבנה אפיתלותפקוד ייחודיים לכליות Clr-f−/−.

כליות חסרות Clr-f מציגות דלקת וחדירת תאי חיסון.

בהתחשב בתפקידים האימונומודולטורים הידועים לחלבוני Clr, בדקנו את תרומת התא החיסוני לClr-f−/− פתולוגיית כליות. ניתחנו את הרכב תאי החיסון של כליות שלמות של עכברים 12-בת שבוע ו-Clr-f−/− על ידי ציטומטריית זרימה. הניתוח שלנו גילה עלייה משמעותית במספר הנויטרופילים, תאי T ותאי B, אך ללא הבדל במספר תאי NK, ILC או מקרופאגים בכליות (איור 6A). ניתוח של התפלגות פריגלומרולרית של תאי מערכת החיסון בתוך קליפת הכליה של כליות WT ו-Clr-f-/- לפי IF, ראינו הצטברויות גלומרולריות של תאי CD45+ (איור 6B). תיוג של CD11c, F4/80, NKp46 ו-CD3, סמנים המעידים על DCs, מקרופאגים, NK/ILCs ותאי T בהתאמה, חשף הצטברות תוך-גלומרולרית של תאי CD11c+ (איור 6C), והצטברויות פריגלומרולריות של F4/{{ תאי 16}}, NKp46+ ו-CD3+ בכליות Clr-f−/− (איור 6D). כימות חזותי של אוכלוסיות תאי חיסון שהתגלו בגלומרולי אישר עלייה משמעותית בנוכחות כל אחת מאוכלוסיות תאי חיסון אלה בכליות של עכברי Clr-f-/- בהשוואה לעכברי WT (איור 6E). הסתננות חיסונית במחלת כליות אוטואימונית מוגברת על ידי הפרשת צינורית של IL-12 המביאה לפציעה על ידי תאים מפרישים IFN24-26. לפיכך, בדקנו את כליות WT ו-Clr-f−/− על נוכחותם של ציטוקינים אלה וצפינו בצביעה של IL-12 ו-IFN בתאים של Tubulointerstitium של הכליה Clr-f−/− (איור 6F, ז).

מאחר ש-Clr-f נחשב כאות לבריאות התא לתאים המבטאים NKR-P1G, שיערנו שהחדירה החיסונית הכלייתית בעכברי Clr-f-/- נובעת בחלקה מנוכחות מוגברת של לימפוציטים המבטאים NKR-P1G בכליה. ניתוח של ביטוי NKR-P1G על תאי TCR + T בכליות ו-NK1.1+ תאי NK בעכברי WT ו-Clr f −/− על ידי ציטומטריית זרימה לא הראו הבדלים בעוצמת הקרינה הממוצעת של צביעה NKR-P1G על NK כלייתי תאים, אך עלייה בצביעה NKR-P1G של תאי T כליות בעכברי Clr-f-/- (איור 6H)

איור 5. השוואה בין פרופילי תעתיק של עכברי Clr-f-/- ו-CKDs אנושיים. (א) טבלה של קבוצות נתונים של פרופיל ביטוי גנים של 15 הפרעות כליות אנושיות לעומת עכברי Clr-f-/- בני שבוע 13-. מקור ההתייחסות למקורות קבוצת הנתונים של פרופיל הביטוי האנושי מצוין בעמודת המחקר. (ב) מטריצת דמיון המציגה מקבץ היררכי של פרופילי ביטוי גנים דיפרנציאליים בפאנל (א). הקו המקווקו האדום בתוך הדנדרוגרמה מציין את רמת ההפרדה של אשכולות המטריצה. (ג) השוואה של 4531 DEG (Log2 FC; Padj.<0.05) of 13-week-old Clr-f−/− mice (group 0) and IgAN patients. Gene set enrichment from 4 DEG clusters: (I) upregulated in both Clr-f−/− mice and IgAN patients, (II) upregulated in Clr-f−/− mice and downregulated IgAN patients, (III) downregulated in Clr-f−/− mice, and upregulated IgAN patients, and (IV) downregulated in both Clr-f−/− mice and IgAN patients. Heat maps were constructed using Morpheus (https://sofware.broadinstitute. org/morpheus).

מחסור ב-Clr-f גורם לאוטואימוניות ופתוגנזה בלתי תלויים ב-T-ו-B. כדי להבהיר את התרומה החיסונית לפתולוגיית הכליות של עכברי Clr-f−/−, בדקנו עכברי Clr-f−/− שהיו חסרים גם בתאי T ו-B, באמצעות זן העכברים החסרים Rag1- (Rag1−/−Clr-f−/−). מכיוון שלעכברי Rag1-/-Clr-f-/- חסרים נוגדנים, נוכל להעריך פתוגנזה הקשורה ל-Clr-f בהיעדר שקיעת אימונוגלובולינים. ניתוח של הכליות Rag1-/-Clr-f-/- גילה נגעים גלומרולריים המעידים על גלומרולופתיה שגשוגית קלה ואזורים של פיברוזיס גלומרולרי (איור 7A). ציון פתולוגיה גלומרולרית הראה מספר גבוה יותר באופן משמעותי של גלומרולים עם נגעים ב- Rag1-/-Clr-f-/- בהשוואה לעכברי Rag1-/- (איור 7B). ניקוד של קטעי כליות Rag1-/-Clr-f-/- זיהו עליות בשגשוג אנדוקפילרי, סהרונים, גלומרולוסקלרוזיס או טרשת מקטעית מוקדית, ופיברוזיס בין-תאי וניוון צינורי, עם עלייה משמעותית בנוכחות תאי מסנגיאלי (איור 7C) .

כדי להעריך את תרומת תאי T ו-B להצטברות השומנים שנצפתה בעכברי Clr-f-/-, מדדנו משקל גוף כולל ומשקל שומני בטני ב- Rag1-/-Clr-f-/- ביחס לעכברי Rag1-/-. משקל הגוף Te Rag1-/-Clr-f-/- היה נמוך משמעותית מקבוצת הביקורת Rag1-/- (איור 7D), בעוד משקל השומנים בבטן עלה משמעותית (איור 7E), אם כי במידה פחותה מזו שנצפה ב- עכברי Clr-f-/− בהשוואה לעכברי WT (174 מ"ג שומן עלו לעומת 274 מ"ג בממוצע).

לבסוף, כדי לחקור את התורמים החיסוניים למומים בכליות אלה, בדקנו את כליות Rag1-/-Clr-f-/- עבור נוכחות של IL-12 ו-IFN ותאי חיסון חודרים כליות. ניתוח IF של כליות Rag1-/-Clr-f-/- גילה נוכחות מוגברת של IL-12 ו-IFN (איור 7F,G). כמו כן, ראינו הצטברות פריגלומרולרית נרחבת של תאי CD45+ בכליות Rag1−/−Clr-f−/− (איור 7H), אשר נמצאה מורכבת מ-CD11c+, F4/80+ וכן Nkp46+ תאי. ממצאים אלה מצביעים על כך שמנגנונים בלתי תלויים בתאי T ו-B הם המתווכים העיקריים של פתולוגיה כלייתית בעכברים חסרי Clr-f.

השירות התומך של Wecistanche - יצואנית ה-cistanche הגדולה בסין:

דוא"ל:wallence.suen@wecistanche.com

ווטסאפ/טלפון:+86 15292862950

קנה לפרטי מפרטים נוספים:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

קבל תמצית CISTANCHE אורגנית טבעית עם 25% אכינאקוסיד ו-9% אקטוזיד לזיהום בכליות