Cistanche Tubulosa מגן על נוירונים דופמינרגיים באמצעות ויסות של אפופטוזיס וגורם נוירוטרופי הנובע מתאי גליה: in Vivo ו-in Vitro

מחלת פרקינסון (PD) היא מחלה נוירודגנרטיבית עם סימן ההיכר הפתולוגי של דופמין ניגרוסטריאטלי מופחת. בפרקטיקה הקלינית של הרפואה הסינית המסורתית (TCM), לננו-אבקה של Cistanche tubulosa יש השפעות טיפוליות על PD. כדי לזהות את המנגנון הטיפולי, מחקר זה בדק את ההשפעה המגנה של מינונים שונים של MPP פלוס רעילות הנגרמת בתאי MES23.5 באמצעות מבחן MTT וב-1-מתיל-4-פניל-1 ,2,3,6-עכברי PD (כלי רכב) המושרים על ידי טטרה-הידרופירידין (MPTP). אימונוהיסטוכימיה שימשה להערכת ציטומורפולוגיה וביטוי טירוזין הידרוקסילאז (TH). בדיקות התנהגות בכלי רכב, בדיקות נוזל כרומטוגרפיה בעלות ביצועים גבוהים (HPLC) בדופמין, אימונוהיסטוכימיה ואנליזה של Western blot שימשו כדי לזהות את הביטוי של TH, גורם נוירוטרופי (GDNF) שמקורו בקו תאי גליה, והקולטנים שלו. התוצאות שלנו הוכיחו ש-cistanche tubulosa nanopowder שיפרה את הכדאיות של תאים שטופלו ב-MPP פלוס, הגדילה את ביטוי ה-TH והפחיתה את מספר התאים האפופטוטיים. זה גם הגביר את ביטוי חלבון Bcl2 ודיכא את ביטוי חלבון Bax בתאים שטופלו ב-MPP פלוס באופן תלוי מינון.

בנוסף,cistanchetubulosa nanopowder שיפרה את הליקויים ההתנהגותיים בעכברי כלי רכב, הפחיתה את משך השחייה הנייח, הגבירה את היכולת לפעילות ספונטנית והגבירה את הביטוי של GDNF, קולטן משפחת GDNF אלפא (GFR 1) ו-Ret בתאים של ה-substantia nigra ( SN).

יתר על כן, ביטוי החלבון של GDNF, GFR 1 ו-Ret עלה לאחר טיפול במינונים שונים שלcistanchetubulosa nanopowder, עם הבדל משמעותי בין קבוצות המינון הגבוה לקבוצת הרכב. ביטוי החלבון של Bcl2 ו-Bax היה דומה in vivo ו-in vitro, מה שהצביע על כךcistancheל- tubulosa nanopowder יש השפעות אנטי-אפופטוטיות בנוירונים.

מוצר לחץ cistanche violacea

מבוא

מחלת פרקינסון (PD) היא מחלה נוירודגנרטיבית שכיחה המופיעה בקרב קשישים עם ביטויים פתולוגיים של אובדן נוירונים דופמינרגיים ב-substantia nigra (SN) עקב ניוון. חומרת המחלה נמצאת בקורלציה עם אובדן תאי עצב של דופמין (DA) ב-SN, מה שעולה בקנה אחד עם הדעה שהתהליך הנוירוניווני מתקדם במשך שנים רבות לפני הופעת תסמינים כלשהם (Sawle and Myers, 1993). האופי המתקדם של המחלה מציע אפשרויות מעניינות להתערבות טיפולית על ידי חסימת התהליך הנוירודגנרטיבי הבסיסי. החיפוש אחר פעולות חזקות וספציפיות הנגרמות על ידי טיפול של גורמים נוירוטרופיים על הישרדות נוירוני DA הוא אפוא בעל עניין רב.

גורמים נוירוטרופיים הם חלבונים חיוניים, כולל גורם גדילה עצבי (NGF), גורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF) וגורם נוירוטרופי שמקורו בתאי גליה (GDNF), אשר מקדמים צמיחת עצבים, התפתחות נוירולוגית, הדרכה אקסונלית ותפקוד עצבי. מבין כל הגורמים הנוירוטרופיים המגינים ומקדמים את תיקון הנוירונים הדופמינרגיים, ל-GDNF יש את ההשפעות החזקות ביותר (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). GDNF הוכח כבעל השפעות נוירוטרופיות חזקות על נוירוני DA במבחנה (Lin et al., 1993) ומפעיל השפעות נוירוטרופיות in vivo. הוכח כי GDNF מציל נוירוני DA ניגרלי ממוות תאי שנגרם כתוצאה מנגע לאחר אקסוטומיה כירורגית או רעלנית בחולדות (Beck et al., 1995; Kearns and Gash, 1995; Sauer et al., 1995) וחלקית גם לאחר מתן מערכתי של N-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) בעכברים (Tomac et al., 1995). השכיחות המוגברת של אפופטוזיס נוירוני והפחתת השפעות ההגנה של גורמים נוירוטרופיים, שעלולים להופיע על ידי גורמים פתולוגיים שונים, עומדים בבסיס ההתנוונות של נוירונים דופמינרגיים (Holden et al., 2006).

cistanchetubulosa היא תרופה צמחית שמקורה במספר צמחים מהסוג Cistanche. זוהי אפשרות טיפולית מרכזית לתסמונת מחסור בכליות הקשורה קשר הדוק להורמוני אנדרוגנים ברפואה הסינית המסורתית (TCM). עד כה, הרבה מחקרים קליניים ובסיסיים עלcistanchetubulosa הראו את הפעילות של מחלות ניווניות עצביות. הזיהוי של מרשמים לחיזוק הכליות של TCM בטיפול ב-PD עשוי לספק טיפול קליני חלופי ל-PD. Echinacoside (ECH) הוא מרכיב ביו-אקטיבי עיקרי המצוי בצמח המרפאcistanchetubulosa. מחקרים הראו את ההשפעות הטיפוליות של גליקוזידים של Cistanche ו-ECH, verbascoside (VER) ו-icariin (ICA) על מחלת אלצהיימר (AD), PD וחולי דמנציה כלי דם אחרים (Urano and Tohda, 2010; Wang et al., 2013 Wu et al., 2014). וו וחב'. (2014) הציע כי cistanche. תמציות טובולוזה שהכילו מספיק ECH ואקטאוזיד שיפרו את התפקוד הקוגניטיבי שנגרם על ידי A -42 באמצעות חסימת שקיעת עמילואיד והיפוך תפקוד נוירוני דופמינרגי כולינרגי והיפוקמפוס. טאו וחב'. (2015) מצא שגליקוזידים פנילאתנואידים מ-cistanche tubulosa (Ph Gs-Ct) מנעו בצקת מוחית בגובה רב על ידי הפחתת ביטוי החלבון וה-mRNA של AQP4 ברקמת המוח של מודלים של חולדות.

מחקרים קודמים הראו כי תרכובות צמחי מרפא סיניות, כולל שלושת המרכיבים שלcistanchetubulosa, epimedium ו-rhizoma polygonal, הקלו על נזק לנוירונים דופמינרגיים ורמות מוגברות של דופמין על ידי ויסות הביטוי של גורמים נוירוטרופיים (Wu et al., 2013).

לפיכך, עדיין לא ידוע האםcistancheהשפעות נוירו-פרוטקטיביות הנגרמות על ידי tubulosa הן ארוכות טווח, ועד כמה הצלה של נוירוני DA ניגרליים על ידי מתן GDNF יכולה להרשות לעצמה שימור משמעותי של התנהגויות מוטוריות הרלוונטיות לסימפטומטולוגיה של חיות PD. מחקר זה השתמש במתכון לחיזוק כליות TCM,cistanchetubulosa nanopowder, שקיבלה פטנט לאומי (מספר פטנט: 2011103028541) בסין והראתה בעבר השפעה טיפולית מסוימת ב-PD. המחקר הנוכחי, לפיכך, נועד לבחון את ההשפעות הנוירו-פרוקטטיביות וההתחדשות שלcistancheטיפול בטובולוזה ולחקור את האפופטוזיס בתאי MES23.5 וחולדות מובהקות התנהגותיות, ואת הרגולציה של GDNF, כפי שנמדדה על ידי סוללת בדיקות מטרה.

חומרים ושיטות

חומרים, ריאגנטים וציוד

cistanchetubulosa נרכשה מ- Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., בייג'ינג, סין. ECH, VER ו-ICA הגיעו מהמכונים הלאומיים לבקרת מזון ותרופות, סין. קו התאים הנוירונים הדופמינרגיים MES23.5 היה מתנת פרופסור ביאו צ'ן, המעבדה לנוירוביולוגיה, אוניברסיטת קפיטל רפואית, בייג'ינג, סין. 50 עכברים זכרים C57BL/6 (במשקל 20-25 גרם כל אחד) נרכשו משנגחאי SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (מספר רישיון: SCXK2012-0002), שנחאי, סין.

MPP plus, MTT וגלוטמין נרכשו מסיגמא-אלדריץ' (קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב); DMEM/F12 סרום בקר בינוני ועוברי נרכשו מחברת Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, ארה"ב); ו-MPTP, תקן DA ותקן חומצה הומונילית (HVA) נרכשו מ-Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, ארה"ב). נוגדני -actin, Bax, Bcl2, GDNF, GDNF משפחת קולטן אלפא (GFR 1), ונוגדנים Ret נרכשו מ- Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, ארה"ב); ערכת ריאגנטים לצביעה 3,3'-דיאמינובנזידין (DAB) נרכשה מ-Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Fujian, סין); וערכת הכנת דגימת ג'ל SDS-PAGE, ערכת זיהוי מוגברת כימילומינסנציה אולטרה-רגישה (ECL), ומבחן חומצה ביצינצ'ונינית (BCA) נרכשו ממכון ביו-טיים לביוטכנולוגיה (בייג'ינג, סין).

מחקר זה השתמש במכשירים הבאים: ELX800 קורא microplate (Bio Tek Winooski, VT, ארה"ב); חממת CO2 (Heraeus, Hanau, גרמניה); ג'ל DOC 2000 מערכת ניתוח הדמיית ג'ל, תא אלקטרופורזה ומיכל אלקטרופורזה (Bio-Rad, Hercules, CA, ארה"ב); מנתח חלבון DU-650 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, ארה"ב); צנטריפוגה מקורר במהירות גבוהה 5417R (אפנדורף, המבורג, גרמניה); טחנת כדורים פלנטריים כפולים SXQM (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, סין); טחנת מיקסר MM400 (Retsch GmbH, Haan, גרמניה); Agilent 1200 כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC; Agilent Technologies, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב); PowerPac Basic אלקטרופורזה, PowerPac Basic מערכת העברת ממברנה, Universal Hood II chemiluminescence imager, S1000 Thermal Cycler RNA מערכת שעתוק לאחור (Bio-Rad); מערכת Motic Med 6.0 לניתוח רקמות ותמונה (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, China).

הכנה שלcistanchetubulosa Nanopowder

cistancheטובולוזה נשקללה, ואז טוהרה והתייבשה. לאחר פירוק קונבנציונלי,cistancheאבקת tubulosa דקה הועברה דרך מסננת רשת 200- וייבוש בהקפאה. טחנת כדורים עם שליטה בטמפרטורה ובאנרגיה גבוהה שימשו להכנתcistanchetubulosa nanopoder. ראשית, גולמיcistanchetubulosa nanopowder הונחה במיכל טחינת כדור ואקום שהיה עמוס בכדורי טחינת קרביד. היחס בין כדורי הטחינה לננו-אבקת cistanche tubulosa נע בין 15:1 ל-5:1. כדי להשיג אבקה דקה, המהירות ומשך הזמן של טחנת הכדורים עתירת האנרגיה נקבעו ל-300 סל"ד ו-20 דקות, בהתאמה. האבקה העדינה נשקללה לעיבוד חומרים ננומטריים ועובדה בטחנת המיקסר בתדירות של 25/s ותנודה של שנות ה-20 לשלוש חזרות. PBS שימש להמסה והכנת תמיסה של 25 מ"ג/מ"ל, ולאחר מכן 30 דקות של בדיקת קול, חיטוי, ולבסוף אחסון ב-20 מעלות.

בקרת איכות של הרכיבים הפעילים שלcistanchetubulosa על ידי HPLC

ה-ECH וה-VER הכילו פליטת גרדיאנט עם סיליקה קשורה אוקטדצילסילאן כחומר מילוי, מתנול כפאזה ניידת A ו-0.1 אחוז תמיסת חומצה פורמית כפאזה ניידת B. אורך הגל לזיהוי היה 330 ננומטר. ה-ICA הכיל פליטת גרדיאנט עם סיליקה קשורה אוקטדצילסילאן כחומר מילוי ומים אצטוטריל (30:70) כשלב הנייד. אורך הגל לזיהוי היה 270 ננומטר. המדגם, הביקורת והביקורת השלילית נמדדו כ-10 μL כל אחד עבור הבדיקה.

תרבית תאים ומבחן MTT למדידת כדאיות של תאים מטופלים ב-MPP פלוס

תאי MES23.5 חוסנו עם 5 אחוז סרום עגל עוברי, 1 אחוז גלוטמין, 2 אחוז 50× תמיסה של Sato ו-DMEM/F12 מדיום עם 2 אחוז פניצילין/סטרפטומיצין. הם הודגרו ב-37 מעלות באינקובטור של 5 אחוז CO2 עם לחות רוויה. התאים בודדו והועברו עם 0.25 אחוז טריפסין ותרחיף התאים נקצר בשלב הצמיחה הלוגריתמי. תאים מבודדים עם צפיפות של 1 × 105 נזרעו לצלחות 96- מצופות פוליליזין, ולאחר מכן הוספת ריכוזים סופיים שונים (6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 ו-800 מיקרומול/ L) של MPP פלוס מדיה. תאי MES23.5 שהודגרו עם מדיום תרבות רגיל במשך 24 שעות ו-48 שעות שימשו כבקרות שליליות בניסויים במבחנה. התאים מקבוצות הטיפול השונות הודגרו עם מגיב MTT למשך 4 שעות. הפתרון בבארות הושלך לאחר מכן ונוספו 150 μL של DMSO ותנודה למשך 10 דקות. הספיגה של כל דגימה באורך גל של 570 ננומטר נמדדה באמצעות קורא מיקרו-לוחות אוטומטי. אחוז הכדאיות של התא (אחוז)=ממוצע הספיגה של קבוצת הניסוי/ספיגה ממוצעת של קבוצת הביקורת השלילית × 100 אחוז.

ריכוזים רלוונטיים של MPP פלוס מדיום נוספו לטיפול של 24 שעות בתאי MES23.5 תוך שימוש באותה גישה כמו לתרבית חוץ גופית. לאחר הטיפול, התמיסה בבאר נזרקה. מדיה המכילה ריכוזים שונים (10, 50, 100, 200, 250, 500 ו-1000 ug/mL) שלcistancheאבקת ננו- tubulosa נוספה לתאי MES23.5 בבארות שונות ונשארה לדגירה במשך 24 שעות ו-48 שעות. תאי MES23.5 שהודגרו עם מצע תרבות רגיל במשך 24 שעות ו-48 שעות שימשו כביקורות שליליות. תאי MES23.5 שהודגרו עם MPP פלוס מדיום שימשו ככלי הרכב. המדידות נעשו בשלושה עותקים עבור כל דגימה. הספיגה של קבוצות הטיפול והביקורת המקבילות נמדדה כדי לחשב את כדאיות התא.

ביטוי TH נמדד על ידי אימונוציטוכימיה

מתיcistanchetubulosa nanopowder היה ב-100, 200 ו-250 ug/ml, שיעור ההישרדות של התא עלה באופן משמעותי (איור 2G). לפיכך, בניסויים הבאים, בדקנו את שלושת הריכוזים: קבוצות במינון נמוך, במינון בינוני ובמינון גבוה. נבדקו שלושה שכפולים עבור כל אחד מה-cistancheקבוצות טובולוזה. גליונות כיסוי מעוקרים מצופים בפוליזין הונחו לתוך 6-צלחות באר. לאחר מכן, 5 × 104 תאים נזרעו בכל באר והודגרו במשך 24 שעות. המדיום הטרי הקונבנציונלי הוחלף בקבוצת הביקורת הרגילה וריכוז סופי של 100 מיקרומול/ליטר MPP פלוס מדיום הוחלף בקבוצות הטיפול הנותרות לדגירה למשך 24 שעות. לאחר מכן הוחלפו מדיות טריות קונבנציונליות בקבוצת הבקרה הרגילה וקבוצת הרכב, וריכוזים סופיים של 100, 200 ו-250 ug/mLcistancheננו-אבקת tubulosa הודגרה עם התאים למשך 24 שעות במינון נמוך, בינוני וגבוהcistancheקבוצות טיפול בטובולוזה, בהתאמה. תאי MES23.5 בקבוצות השונות נשטפו שלוש פעמים ב-PBS כדי להסיר את הסופרנטנט וקיבוע עוד יותר ב-4 אחוז פרפורמלדהיד למשך 15 דקות. לאחר שטיפה עם PBS, התאים הודגרו עם חוסם פרוקסידאז ב-37 מעלות למשך 30 דקות ולאחר מכן נשטפו שוב עם PBS. נעשה שימוש בתמיסת Triton X-100 של 0.2 אחוז לחדירת תאים למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטיפה עם PBS.

סרום עיזים רגיל הוסף לכל דגימה והודגר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן הוסר סרום העיזים הרגיל ונוגדן ראשוני מדולל 1:400 ב-PBS הוסף לכל דגימה והודגר ב-4 מעלות למשך הלילה. התאים בקבוצת הביקורת השלילית הודגרו עם PBS ב-4 מעלות למשך הלילה. לאחר שטיפה עם PBS, התאים הודגרו עם נוגדנים משניים המסומנים ביוטין בתא הלחות ב-37 מעלות למשך 20 דקות. כל דגימה נשטפה לאחר מכן ב-PBS וסומנה עם חזרת פרוקסידאז-סטרפטווידין מצומדות (תמיסת עבודה C) ב-37 מעלות למשך 20 דקות. לאחר שטיפה עם PBS, התאים נצבעו עם מגיב DAB בחושך למשך כ-1-10 דקות ופיתוח צבע חום נוטר במיקרוסקופ אור.

לאחר מכן כל דגימה נשטפה פעמיים במים מזוקקים למשך 1-2 דקות והגרעינים נצבעו נגדי בתמיסת המטוקסילין למשך 0.5-1 דקות. לאחר שטיפה יסודית של כל דגימה במים, התאים נטבלו באלכוהול 1 אחוז חומצה הידרוכלורית לצורך התמיינות ו- 1 אחוז אמוניה מימית, ולאחר מכן שטיפה יסודית של התאים במים. לאחר מכן התאים מכל דגימה התייבשו ב-70 אחוז אתנול למשך 2 דקות, 80 אחוז אתנול למשך 2 דקות, 90 אחוז אתנול למשך 2 דקות פעמיים, 95 אחוז אתנול למשך 2 דקות פעמיים, ו-100 אחוז אתנול למשך 2 דקות פעמיים. לאחר מכן התאים נטבלו בתמיסת קסילן למשך 2 דקות פעמיים והותקנו על שקופית זכוכית עם שרפים ניטרליים. במיקרוסקופ אור, כל דגימה עברה לכידת תמונה ובחירה אקראית של 5-10 שדות ראייה יעילים כדי לקבוע את הביטוי של חלבונים נבחרים בנוירונים דופמינרגיים המצוינים על ידי עוצמת החלקיקים החומים וכדי לכמת למחצה את תכולת החלבון לפי הערך האפור הממוצע שלו. .

קצב אפופטוזיס של תאי MES23.5 נמדד על ידי ציטומטריית זרימה

תאים דבקים נשטפו פעם אחת עם PBS. לבידוד תאים, נוספה כמות מתאימה של תמיסת טריפסין נטולת EDTA בטמפרטורת החדר והתמיסה בוצעה בפיפטציה בעדינות כדי לאפשר לתאים נצמדים להתנתק. לאחר מכן הוסף מדיום לתרבית תאים כדי לעצור את הטריפסיניזציה. התערובת הועברה לצינור צנטריפוגה חדש ולאחר מכן עברה צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-1500 סל"ד כדי לאסוף את התאים המבודדים. לאחר השלכת הסופרנטנט, גלולת התאים הושעתה מחדש בעדינות באמצעות PBS והתאים נספרו. כ-1 × 105 עד 5 × 105 תאים מורחקים מחדש הועברו לצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-1500 סל"ד והסופרנטנט הושלך. חמישה מיקרוליטר של תמיסת קושרת Annexin V-FITC נוספו לכדורית התא כדי להשהות מחדש בעדינות את התאים. נוספו עוד 5 μL של Annexin V-FITC וערבבו ביסודיות. חמישה מיקרוליטר של תמיסת יודיד פרופידיום שימשו לצביעה של תאים על ידי דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות זמן קצר לפני ציטומטריית הזרימה.

Western Blot Analysis עבור in vitro

התאים חולקו לקבוצה רגילה, MPP פלוס קבוצת טיפול, במינון נמוךcistancheקבוצת טיפול בטובולוזה, מינון בינוניcistancheקבוצת טיפול בטובולוזה, ובמינון גבוהcistancheקבוצת טיפול בטובולוזה. הביטוי של Bcl2 ו-Bax נמדד בכל אחד מהם. סך של 1 × 105 תאים לבאר בצלחת 6-הבאר שימשו למידול וטיפול בכל קבוצה לפני קצירת התאים. ליזאט מעורב, המכיל חיץ RIPA, מעכב פרוטאז ומעכבי פוספטאז, התווסף לליזה של התאים למשך 30 דקות על קרח. לאחר צנטריפוגה, הסופרנטנט שימש לניתוח חלבון. החלבון הכולל כמת באמצעות בדיקת BCA והופרד על ידי 10 אחוז SDS-PAGE. החלבונים המופרדים הועברו לממברנה והודגרו עם חיץ חוסם חלב רזה של 5 אחוז בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר מכן הודגרה הממברנה בנוגדן ראשוני (Bcl-2 0.34 מ"ג/מ"ל, Bax 0.11 מ"ג/מ"ל, דילול 1:200) ב-4 מעלות למשך הלילה. לאחר שלב כביסה, הממברנה הודגרה בנוגדן משני (0.5 מ"ג/מ"ל, דילול 1:5000) ב-4 מעלות למשך שעה ולאחר מכן במפתח ECL למשך 2 דקות לפיתוח קונבנציונלי. תוכנת Quantity One שימשה לניתוח חצי כמותי של ביטוי חלבון.

מודלים ניסויים של בעלי חיים וניהול תרופות

חמישים עכברים זכרים בני שבוע 8-ללא פתוגנים ספציפיים חולקו אקראית לחמש קבוצות: קבוצה רגילה, קבוצת טיפול MPTP (רכב), מינון נמוךcistancheקבוצת טיפול בטובולוזה, מינון בינוניcistancheקבוצת טיפול בטובולוזה, ובמינון גבוהcistancheקבוצת טיפול בטובולוזה. החיות אוכסנו בטמפרטורה של 20-22 מעלות עם גישה חופשית למזון ומים. לעכברים בקבוצה הרגילה הוזרק תוך צפק עם נפח שווה של תמיסת מלח רגילה במשך שבעה ימים רצופים. העכברים בקבוצות הטיפול האחרות הוזרקו תוך-צפקית עם MPTP (30 מ"ג/ק"ג/ד') במשך שבעה ימים רצופים כדי להקים כלי רכב.

במהלך מודל PD, העכברים במינון נמוך, במינון בינוני ובמינון גבוהcistancheקבוצות טיפול בטובולוזה ניתנו תוך קיבה בנפחים קליניים מקבילים של 4 גרם/ק"ג/ד, 8 גרם/ק"ג/ד ו-16 גרם/ק"ג/ד.cistanchetubulosa nanopowder, בהתאמה, במשך 14 ימים רצופים. העכברים בקבוצת הביקורת והרכב קיבלו תוך קיבה נפחים מקבילים של תמיסת מלח רגילה במשך 14 ימים רצופים. כל ההליכים הניסויים אושרו על ידי הוועדה האתית של אוניברסיטת פוג'יאן של TCM ובוצעו על פי העקרונות המקובלים בעולם לשימוש וטיפול בחיות מעבדה. כל המאמצים נעשו כדי למזער סבל של בעלי חיים במחקר זה.

מבחני התנהגות

מבחן שחייה (Zhu et al., 2014)

תיאום תנועת הגוף בעכברים נמדד במבחן השחייה. העכברים הונחו בנפרד במיכל מים (25 ס"מ גובה ו-10 ס"מ קוטר) המכיל 10 ס"מ מים ונבדקו בסביבה שקטה כדי לתעד את משך הנייח שלהם במשך 5 דקות.

מבחן שדה פתוח (Kawai et al., 1998)

פעילות תנועתית נמדדה באמצעות מבחן השדה הפתוח. העכברים נבדקו בסביבה שקטה ומוארת עמומה והונחו בנפרד במיכל אקרילי שקוף בגודל 30 ס"מ × 30 ס"מ × 15 ס"מ עם רשת הפרדה בגודל 6 ס"מ × 6 ס"מ בתחתיתו. לעכברים ניתנו 10 דקות להסתגל לסביבה ולאחר מכן נמדדו האמבולציה של מספר הרשת ותדירות הגידול של עכברים בודדים חמש פעמים רצופות כדי לקבל ערכים ממוצעים.

דגימת רקמות מוח

לפני דגימת רקמות, העכברים הוזנו באדליביטום עם גישה חופשית למים וקיבלו התערבות תרופתית במשך 14 ימים רצופים. ארבעה עכברים בכל קבוצה נבחרו ונערפו במהירות. ה-SN (Bregma: -2.75 מ"מ -2.92 מ"מ) מכל חיה בודד והונח על קרח. רקמות המוח נשטפו עם 0.9 אחוז תמיסת נתרן כלוריד קרה כקרח כדי להסיר כל דם ויובשו על נייר סינון לפני אחסון ב-80 מעלות. ארבעה עכברים מכל קבוצה הורדמו תוך צפק והחזה שלהם נפתח. לאחר מכן הוחדרה מחט אינפוזיה לחדר השמאלי של כל חיה. כדי להסיר דם במערכת הדם, נחתך תוספת הפרוזדור הימני ולבעל החיים הוזלף מי מלח נורמלי של 4 מעלות עד שהכבד החוויר כדי להבטיח זלוף עוקב. לאחר שהקולחים של הפרוזדור הימני התבררו, כל חיה טופלה ב-4 אחוז מקבע פרפורמלדהיד. לאחר הזילוף, רקמת המוח של כל חיה נותחה בזהירות וקיבועה לאחר מכן ב-4 אחוז פרפורמלדהיד למשך 24 שעות. לאחר מכן נשטפו רקמות מוח קבועות מתחת למים זורמים, התייבשו בסדרה מדורגת של תמיסות אתנול, ופונו בתמיסת קסילן. לאחר מכן טבילה פרפין והטבעה.

שינויים בכמות DA נמדדת על ידי HPLC

אבקת הננו SN מכל קבוצה הונחה באמבט קרח המכילה 0.9 אחוז תמיסת נתרן כלורי (יחס 1:9). רקמת המוח הומוגגה באמצעות משבש תאים אולטרסאונד ובוצעה בצנטריפוגה ב-1200 סל"ד למשך 20 דקות ב-4 מעלות כדי להשיג את הסופרנטנט. עבור HPLC, נעשה שימוש בעמודת Hypersil AA-ODS (2.1 מ"מ × 200 מ"מ, 5 מיקרומטר) בטמפרטורת עמודה של 30 מעלות. זיהוי פלואורסצנטי בוצע ב-280 ננומטר λex ו-340 ננומטר λem. נפח ההזרקה היה 10 μL.

ביטוי של TH, GDNF, GFR 1 ו-Ret מזוהה על ידי אימונוהיסטוכימיה

חלקי פרפין (5 מיקרומטר בעובי) של רקמת מוח בודדת בודדו מכל חיה והונחו באמבט מים חמים של 40 מעלות לצורך רידוד והדבקה לשקופיות זכוכית. כל שקופיות הרקמות הודגרו בתנור של 60 מעלות למשך 3-6 שעות, ולאחר מכן הסרת שעוות קסילן, התייבשות אתנול שיפוע והחזרת אנטיגן על ידי דגירה במאגר חומצת לימון וחימום במיקרוגל למשך 20 דקות. שקופיות הרקמה הודגרו בתמיסת H2O2 של 3 אחוז בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר שטיפה שלוש פעמים ב-PBS, שקופיות הרקמה הודגרו בסרום רגיל בתא סגור בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. צביעה אימונוהיסטוכימית בוצעה על פי הוראות היצרן. מנתח תמונה של Motic Med 6.0 שימש כדי לחשב את הערך של צפיפות אופטית משולבת בתאים הצבועים באופן חיובי.

ניתוח כתם מערבי ברקמות מוח של עכברים

מחקר זה העריך את ביטוי החלבון של טירוזין הידרוקסילאז (TH), GDNF, GFR 1, Ret, Bcl2 ו-Bax. הליסט המוח מכל קבוצה עבר הומוגגן למשך 3{{10}} דקות על קרח, ולאחר מכן צנטריפוגה בטמפרטורה נמוכה, 20,000 סל"ד, ב-4 מעלות למשך 5 דקות כדי לאסוף את הסופרנטנט. דגימות החלבון הופרדו בלחץ קבוע באמצעות ג'ל SDS-PAGE של 10 אחוז כמתואר לעיל. ריכוז הנוגדנים העיקרי: TH 0.15 mg/ml, GDNF 0.5 mg/ml, GFR 1 0.8 mg/ml, Ret 0.63 mg/ml, Bcl-2 0.34 mg/ml, and Bax 0.11 מ"ג/מ"ל. ההליך היה זהה לעיל.

ניתוח סטטיסטי

מחקר זה השתמש בתוכנה סטטיסטית SPSS 20.0 לעיבוד וניתוח נתונים. ערכי פרמטר הובאו כממוצע ± סטיית תקן (x¯

± S). ANOVA שימש לניתוח נתונים חד-גורם. נעשה שימוש במבחן LSD או Games-Howell כדי להשוות בין הקבוצות. P < 0.05 (או P < 0.01) נחשב הבדל מובהק סטטיסטית.

תוצאות

הרכיבים הפעילים שלcistanchetubulosa Nanopowder

בטווח של 200-400 ננומטר סריקה, ECH incistancheל- tubulosa ו-VER ב-330 ננומטר היה שיא הספיגה המקסימלי, שהופיע תוך 20 דקות. ל-ICA היו שיאי ספיגה מקסימליים ב-270 ננומטר והופיעו לאחר 20 דקות (איור 1A). התוצאות הראו שהדגימות השליליות לא הפריעו לזיהוי (איור 1B). לדגימות ולביקורת היו אותם פסגות כרומטוגרפיות ולדגימה השלילית לא היו כאלה. זה הראה ששאר המרכיבים בדגימה לא הפריעו לרכיב הנמדד. יתרה מכך, שלושת המרכיבים והפסגות הסמוכות יכולים להגיע לקו הבסיס של ההפרדה ודרגת ההפרדה הייתה גדולה מ-1.5.

cistanchetubulosa Nanopowder מופחת MPP plus - ציטוטוקסיות המושרה בתאי MES23.5

הכדאיות של תאי MES23.5 הופחתה באופן משמעותי עם עלייה בריכוזים של MPP plus. איור 2F מציג את הציטוטוקסיות המשמעותית של ריכוזים שונים של MPP פלוס.

cistanchetubulosa nanopowder הפחית את הציטוטוקסיות המושרה על ידי MPP פלוס והגברה את הכדאיות של תאי MES23.5. איור 2G מראה זאתcistancheמינונים של tubulosa nanopowder של 10-250 ug/mL הפעילו השפעות הגנה תלויות מינון על תאי MES23.5 שטופלו ב-MPP plus.

אפקט ציטומורפולוגי שלcistanchetubulosa Nanopowder

לתאי MES23.5 רגילים הייתה היצמדות טובה לתאים והם היו בצורת ציר עם גבולות תאים ברורים וסינפסות. תאי MES23.5 שניזוקו ב-MPP פלוס הציגו הידבקות והתכווצות תאים גרועים, ורבים הושעו במדיה עם סינפסות מכווצות. תאים אלה היו מצטברים, מכווצים ועגולים עם ואקוולים בפנים, והגרעינים התפרקו או קרסו.cistanchetubulosa nanopowder במינונים שונים שיפרה את הציטומורפולוגיה של תאי MES23.5 בדרגות שונות על ידי שיפור היצמדות התאים והפינוי הסינפטי של קבוצת הרכב. תאי MES23.5 במינון גבוהcistancheקבוצת הטיפול בטובולוזה הראתה מורפולוגיה שהיתה דומה לקבוצת הביקורת הרגילה (איורים 2A-E).

השפעה שלcistanchetubulosa Nanopowder על ביטוי TH ואפופטוזיס בתאים

איור 3 מציג הפחתה משמעותית בביטוי חלבון TH בקבוצת הרכב. ביטוי החלבון TH עלה באופן שונה בקבוצות שטופלו במינונים שונים שלcistanchetubulosa. עם זאת, בדיקת ה-LSD הראתה שאין הבדל משמעותי בין שלוש הקבוצות שטופלו.

איור 4 מציג את תוצאות הערכת האפופטוזיס באמצעות ציטומטריית זרימה. שיעור האפופטוזיס בקבוצת הרכב היה גבוה משמעותית מאשר בקבוצות האחרות. תאים שטופלו במינונים שונים שלcistanchetubulosa nanopowder הראה דרגות שונות של ירידה בשיעור האפופטוטי בהשוואה לקבוצת הרכב. תאים במינון בינוני וגבוהcistancheבקבוצת הטיפול בטובולוזה היה השיפור המשמעותי ביותר בשיעור האפופטוטיים בהשוואה לקבוצה השנייהcistancheקבוצות טיפול בטובולוזה. בדיקת LSD הראתה שאין הבדל משמעותי בין שתי הקבוצות שטופלו, אלא הבדל משמעותי בין הקבוצה במינון נמוך להן.

השפעה שלcistanchetubulosa Nanopowder על ביטוי חלבון Bcl2/Bax בתאים

איור 5 מראה שהביטוי של חלבון Bcl2 בתאים של קבוצת הרכב היה נמוך משמעותית בהשוואה לקבוצת הביקורת הרגילה. לעומת זאת, הביטוי של חלבון Bax בתאים של קבוצת הרכב היה גבוה משמעותית מאשר בקבוצת הביקורת הרגילה.cistancheקבוצות טיפול ב- tubulosa הראו ביטוי מוגבר של חלבון Bcl2 וירידה בביטוי חלבון Bax בתאי MES23.5 שטופלו ב-MPP plus. בין שלוש הקבוצות שטופלו, היו הבדלים משמעותיים בבדיקת ה-LSD. תופעות אלו היו תלויות מינון.

מבחני התנהגות

תוצאות מבחן השחייה הצביעו על כך שלעכברים בקבוצת הרכב יש משכי זמן נייחים ארוכים יחסית, שגדלו עם הזמן. ביום 14, לעכברים בקבוצת הרכב היה משך נייח ארוך יותר באופן משמעותי מאשר לעכברים בקבוצת הביקורת הרגילה. משך הזמן הנייח של העכברים במינון נמוךcistancheקבוצת הטיפול בטובולוזה לא הייתה שונה משמעותית מזו של העכברים בקבוצת הרכב. עם זאת, משך הנייח של העכברים במינון גבוהcistancheקבוצת הטיפול בטובולוזה הייתה פחותה משמעותית מזו של העכברים בקבוצת הרכב.

תוצאות בדיקת השדה הפתוח מצביעות על כך שלאחר נזק שנגרם על ידי MPTP בעכברים, העכברים בקבוצת הרכב הפגינו ירידה משמעותית ביכולתם לפעילות ספונטנית כפי שמוצגת על ידי תדירות הגידול. לאחר 14-יום ניהול שלcistanchetubulosa nanopowder, העכברים בקבוצות הטיפול במינון בינוני וגבוה היו בעלי תדירות גידול גבוהות משמעותית בהשוואה לעכברים בקבוצת הרכב (איורים 6A, B).

השפעה שלcistanchetubulosa Nanopowder על תוכן DA בעכברים

שינויים בתכולת ה-DA של ה-SN נקבעו על ידי HPLC. נמצא שתכולת ה-DA במוח של קבוצת הרכב הצטמצמה משמעותית. תכולת ה-DA במוחם של עכברי PD במינון נמוךcistancheקבוצת הטיפול בטובולוזה לא הייתה שונה משמעותית מהעכברים בקבוצת הרכב. למרות זאת,cistancheטיפול ב- tubulosa העלה את רמות DA במוחם של עכברי PD באופן תלוי מינון. המוח של עכברי PD שטופלו במינון גבוהcistancheלטובולוזה היה תכולת DA גבוה משמעותית מהמוח של עכברים בקבוצת הרכב (איור 6C).

השפעה שלcistanchetubulosa Nanopowder על ביטוי TH בעכברים

מספר התאים החיוביים ל-TH ורמת הביטוי של חלבון TH ב-SN של עכברי PD המושרים על ידי MPTP היו נמוכים יותר בהשוואה לעכברים בקבוצת הביקורת. לאחרcistancheטיפול ב- tubulosa, מספר התאים החיוביים ל-TH ורמת הביטוי של חלבון TH ב-SN של עכברי PD המושרים על ידי MPTP עלו, עם הבדל משמעותי בין המינון הגבוהcistancheקבוצת הטיפול בטובולוזה וקבוצת הרכב בבדיקת LSD; והיו הבדלים משמעותיים בין שלוש הקבוצות שטופלו (איור 7).

השפעה שלcistanchetubulosa Nanopowder על ביטוי חלבון של GDNF והרצפטורים שלו, GFR 1 ו-Ret בעכברים

ביטוי החלבון של GDNF והקולטנים שלו, GFR 1 ו-Ret, בתאים הצבועים באופן חיובי, הוערך באמצעות אימונוהיסטוכימיה. נעשה שימוש בניתוח Western blot כדי להעריך את רמות ביטוי החלבון ב-SN של קבוצות העכברים השונות. הממצאים עבור הקבוצות השונות היו דומים בשתי שיטות הזיהוי. הביטוי של GDNF וחלבוני הקולטנים שלו, GFR 1 ו-Ret, בתאים צבועים חיוביים ב-SN של העכברים בקבוצת הרכב היה נמוך משמעותית מאשר בעכברים בקבוצת הביקורת הרגילה. מינונים שונים שלcistancheטיפול ב- tubulosa הגדיל את מספר התאים GDNF-, GFR 1- ו-Ret-positive (איורים 8A-S).

ביטוי החלבון של GDNF, GFR 1 ו-Ret ב-SN של העכברים בקבוצת הרכב היה נמוך משמעותית מאשר בעכברים בקבוצת הביקורת. הגדלת ריכוזי הטיפול שלcistanchetubulosa nanopowder שיפרה משמעותית את הביטוי של חלבונים אלה. ביטוי החלבון של GDNF, GFR 1 ו-Ret ב-SN של העכברים במינון גבוהcistancheקבוצת הטיפול ב- tubulosa הייתה גבוהה משמעותית מאשר בעכברים בקבוצת הרכב (P < 0.01; איורים 8T, U).

השפעה שלcistanchetubulosa Nanopowder על ביטוי חלבון של Bcl2/Bax בעכברים

ביטוי חלבון Bcl2 הופחת באופן משמעותי וביטוי חלבון Bax הוגבר משמעותית ב-SN של עכברים בקבוצת הרכב (P < 0.01) בהשוואה לעכברים בקבוצת הביקורת הרגילה. מינון גבוהcistancheטיפול ב- tubulosa הגדיל באופן משמעותי את ביטוי חלבון Bcl2 והפחית משמעותית את ביטוי חלבון Bax במוחם של עכברי הרכב (P < 0.01; איור 9). בדיקת LSD הראתה שלא היה הבדל מובהק בין קבוצות המינון הבינוני והמינון הגבוה, אלא הבדל משמעותי בין הקבוצה במינון הנמוך להן.

דִיוּן

PD ואפופטוזיס

PD היא הפרעה נוירודגנרטיבית. לפי Zhang et al. (2005), השכיחות היא 10.7 אחוזים באוכלוסיה הסינית מעל גיל 55 ו-1.67 אחוז בקרב בני 65 ומעלה. מספר החולים ב-PD גדל מדי שנה עם האצת ההזדקנות העולמית, מה שמטיל עומס כלכלי כבד על משפחות החולים והחברה בכלל.

במוח, נוירונים דופמינרגיים מעורבים בעיקר בסינתזה ובהפרשה של DA. הם מופצים באופן נרחב במערכת העצבים המרכזית וממוקמים בעיקר ב-SN (80 אחוז). TH הוא האנזים המגביל את קצב המפתח לסינתזת DA.

לפיכך, עיכוב פעילות ה-TH מפחית את סינתזת ה-DA (Huot and Parent, 2007). השינויים הפתולוגיים והביוכימיים העיקריים של PD הם אפופטוזיס של נוירונים דופמינרגיים ב-SN, הפחתה משמעותית של DA nigrostriatal ויצירת גופי Lewy בנוירונים דופמינרגיים (דקסטר וג'נר, 2013). האטיולוגיה של PD כוללת גורמים גנטיים קשורים, גורמים סביבתיים והזדקנות מערכת העצבים (Allam et al., 2005). הפתוגנזה של PD נותרה לא ברורה ברפואה המודרנית. מאז שנות ה-60 המאוחרות, נעשה שימוש מוצלח בטיפול תחליפי לבודופה לטיפול ב-PD והוכר כנקודת מפנה מרכזית בטיפול ב-PD. עם זאת, היישום לטווח ארוך של טיפול זה גורם לתופעות לוואי והטיפול אינו מטפל בגורמים הבסיסיים ל-PD (Del Sorbo and Albanese, 2008). לכן, מחקר פעיל עבור תרופות חדשות או שיטות טיפול המכוונות להגנה על נוירונים דופמינרגיים הוא חיוני לטיפול ב-PD.

במחקרים קודמים, היישום של תווית dUTP nick end-תווך מתווכת דאוקסינוקלאוטידיל טרמינלית הצביע על כך ש-0.6 אחוז -4.8 אחוזים מהנוירונים הדופמינרגיים ב-SN של חולי PD הראו אפופטוזיס (Mochizuki et al., 1996). מיקרוסקופ אלקטרוני הראה מאפיינים אפופטוטיים, כולל עיבוי כרומטי וגופים אפופטוטיים בתאים דופמינרגיים (Anglade et al., 1997). Tompkins et al. (1997) ביצעו ניתוח אולטרה-סטרוקטורלי של נתיחות של רקמות מוח מחולים עם PD, AD ומחלת Lewy מפוזרת (DLBD). הם מצאו גופים אפופטוטיים בשכבה הצפופה של ה-SN בחולי PD ו-DLBD, מה שסיפק עדות חותכת לאפופטוזיס עצבי ב-PD ומחלות קשורות. לכן, הפחתה או דיכוי של אפופטוזיס בנוירונים דופמינרגיים הם יסודיים לטיפול ב-PD.

מחקרים קודמים הראו ש-MPTP גרם לתסמינים דמויי PD. MPTP חוצה את מחסום הדם-מוח ועובר חילוף חומרים על ידי מונואמין אוקסידאזים מסוג B באסטרוציטים. לאחר מכן הוא מומר ל-MPP plus רעיל, המצטבר במיטוכונדריה של נוירונים דופמינרגיים דרך צריכת החלבון של הטרנספורטר DA. כך הוא מייצר עודף רדיקלים חופשיים של חמצן המעכבים את פעילות קומפלקס I של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית וסינתזת ATP. אירועים אלה מעודדים עוד יותר היווצרות רדיקלים חופשיים ותגובות עקה חמצונית ובסופו של דבר מובילים לניוון ומוות של נוירונים דופמינרגיים.

לפיכך, מחקר זה השתמש ב-MPP פלוס כדי להקים כלי מבחנה בנוירונים דופמינרגיים MES23.5 ו-MPTP כדי לגרום לעכבר רכב לאימות הדדי. על פי התוצאות של בדיקת MTT, MPP plus הפחית משמעותית את הכדאיות של תאי MES23.5, דבר המצביע על כך ש-MPP plus היה ציטוטוקסי לנוירונים דופמינרגיים. התוצאות גם הוכיחו זאתcistanchetubulosa שיפרה ביעילות את הביטוי של חלבונים אנטי-אפופטוטיים ועיכבה את העלייה של אפופטוזיס המושרה על ידי MPP plus.

ד ו-GDNF

GDNF הוא גורם נוירוטרופי, שבודד לראשונה על ידי Lin et al. (1993). לין וחב'. (1993) גם הראו של-GDNF היו השפעות תזונתיות ספציפיות על נוירונים דופמינרגיים במוח האמצעי של חולדות. GDNF, נורטורין (NTN), תפיסה (PSP) וארטמין (ART) מהווים את משפחת ה-GDNF. הם חלבוני הפרשה דומים מבחינה מבנית וקשורים תפקודית (Kotzbauer et al., 1996; Baloh et al., 1998; Milbrandt et al., 1998; Woodbury et al., 1998).

קולטן GDNF מורכב משני מרכיבים. הרכיב הראשון, GFR , מקובע לממברנה החיצונית של glycosylphosphatidylinositol (GPI) ומעוגן לפני השטח של connexin. המרכיב השני הוא חלבון רט. מחקר הראה כי ישנם ארבעה סוגים שונים של GFR: GFR 1, GFR 2, GFR 3 ו-GFR 4. GFR 1 הוא קולטן בעל זיקה גבוהה של GDNF (Onochie et al., 2000; Chen et al., 2001; Lindahl et al., 2001). חלבון רט הוא קולטן פונקציונלי של GDNF. מולקולת ההומודימר של GDNF נקשרת ישירות ל-GFR 1 ליצירת קומפלקסים ומקיימת אינטראקציה עם Ret, וכתוצאה מכך לדימריזציה והפעלה של Ret. עקב הזרחון האוטומטי של Ret, Ret מפעיל מספר מסלולי איתות נפוצים של TH. בהיעדר חלבון Ret, GDNF גורם לזרחון חלבון של MAPK, PI-3 ו-PLC-, בנוסף לביטוי mRNA ופעילות תפקודית של C-fos דרך חלבון הקולטן שלו, GFR 1 (He et al., 2008).

מחקרים הוכיחו כי ל-GDNF הייתה ההשפעה המגנה החזקה ביותר על נוירונים דופמינרגיים (Rangasamy et al., 2010; Campos et al., 2012). בכלי רכב המשתמשים ב-MPTP ו-6-הידרוקסידופמין (6-OHDA) כדי לגרום נזק בנוירונים דופמינרגיים, GDNF מגן על נוירונים דופמינרגיים על ידי הפחתת אפופטוזיס וקידום צמיחה אקסונלית כדי לגרום להתמיינות תאי גזע (Lucas et al., 2012; Littrell et al., 2013). לין וחב'. (1993) הראו ש-GDNF קידם באופן ספציפי את הכדאיות, הבידול והצמיחה האקסונלית של נוירונים דופמינרגיים כדי לקדם את קליטת DA בנוירונים. המחקר גם הראה ש-GDNF לא רק מנע רעילות חריפה אלא גם הקל על רעילות ארוכת טווח של MPP plus או 6-OHDA בנוירונים דופמינרגיים, בנוסף מונע מוות של תאים בתאים לחוצים או פגומים (Yu et al., 2010). בנוסף, GDNF קידמה שגשוג והתמיינות של תאי גזע עצביים לכיוון נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון (Lindsay, 1995) כדי להציל נוירונים דופמינרגיים מניוון רטרוגרדי (Hong-Juan et al., 2011).

מחקרים הראו שביטוי GDNF ב-SN הופחת משמעותית בכלי רכב של בעלי חיים (Yang et al., 2010). זה מצביע על כך שזה עשוי להיות אחד המנגנונים של פתוגנזה בחולדות PD. הזרקת GDNF של 5-15 ug/d GDNF לחדר הרוחבי או הסטריאטום של חית רכב המושרה על ידי MPTP במשך שלושה חודשים רצופים קידמה תיקון ניגרוסטריאטלי של המערכת הדופמינרגית בחיית הרכב (Grondin et al., 2002). מחקרים על טיפול GDNF עבור PD בכלי חיים של בעלי חיים הראו כי הזרקה תוך מוחית של GDNF לאזורי מוח שונים, כגון SN, גרעין caudate והחדר הצדי, שיפרה הפרעות תנועה הקשורות למודלים של PD של בעלי חיים, כולל ירידה בפעילות מוטורית, קשיחות שרירים רעד (Grondin et al., 2002).

עם זאת, GDNF לא יכול לעבור ישירות דרך מחסום הדם-מוח. לכן, הזרקה מוחית מקומית של GDNF כרוכה בסיכון משמעותי ובקשיים ביישום קליני. יישומים להחדרת GDNF אקסוגני באמצעות מיקרוספירות בשחרור מבוקר, כמוסות בשחרור מושהה וגנים ויראליים עדיין נחקרים (Liang et al., 2010; Yang et al., 2010; Qiao et al., 2012). בהתחשב במגבלות של טכניקות שונות להחדרת GDNF אקסוגני למוח, סוכנים נוירו-פרוטקטיביים המקדמים את שחרור ה-GDNF האנדוגני חשובים ליישום קליני.

PD וcistanchetubulosa Nanopowder

PD שכיח יותר בקרב מבוגרים בגיל העמידה ובקשישים. התיאוריה של TCM סבורה ש-PD ממוקמת בעיקר במוח והיא נובעת בעיקר ממחסור בכבד ובכליות, בנוסף לאנרגיה חיונית ואי ספיקת דם. לפי תיאוריה זו, טיפול ב-PD אמור להתמקד אפוא בהמרצת הכליות ומח העצם. יאנג וחב'. (2010) השתמשו בניסויים קליניים אקראיים, כפול סמיות ומבוקר פלצבו ומצאו שטיפול משולב באמצעות Madopar ומתכונים לחיזוק כליות מקל על הפרעות בתפקוד המוטורי של חולי PD. תוצאת הטיפול הייתה טובה יותר מטיפול בודד באמצעות Madopar. יעילות הטיפול של מונותרפיה מסוג TCM או מרשם תרכובות ב-PD אושרה במודלים של PD של בעלי חיים ויישומים קליניים. יישומי TCM לחיזוק הכליות וקידום זרימת הדם הפחיתו את מינון המונותרפיה ל-PD באמצעות Madopar. כמה מחקרים העלו ש-TCM שיפר את הסימפטומים של PD והגן על נוירונים דופמינרגיים, שייתכן שהיו קשורים קשר הדוק לקידום ביטוי GDNF אנדוגני (Hong-Juan et al., 2011; Qiao et al., 2012).

התרכובת מחזקת הכליות המשמשת במחקר זה,cistanchetubulosa nanopowder, הכילה Cistanche, epimedium ו-Rhizoma polygonal. מחקר מודרני מצביע על כך שההרכב הכימי של Cistanche הוא ECH, המגן על נוירונים דופמינרגיים ב-SN בעכברי PD המושרים על ידי MPTP, ומעכב את הפחתת ה-DA וה-DA Transporter (Zhao et al., 2010). בנוסף, הוא מונע 6-הפחתה הנגרמת על ידי OHDA ב-DA ומגן על נוירונים דופמינרגיים סטריאטליים (Chen et al., 2007). Epimedium מעכב את ההפעלה של caspase-3 וממלא תפקידים נוירו-פרוטקטיביים (Liu et al., 2011). פלבנואידים אפי-מדיום מקדמים ביעילות שגשוג והתמיינות של תאי גזע עצביים (Yao et al., 2010).

במחקר זה,cistanchetubulosa nanopowder התנגדו לעלייה באפופטוזיס המושרה ב-MPP פלוס באופן תלוי מינון. זה שיפר משמעותית את ביטוי ה-TH בכלי המבחנה והיו לו השפעות אנטי-אפופטוטיות משמעותיות בנוירונים דופמינרגיים. עכברי הרכב המושרה על ידי MPTP הראו הפרעות התנהגותיות והפחיתו משמעותית את ביטוי ה-TH ברקמות המוח האמצעי ורמות DA, שהם מאפיינים פתולוגיים אופייניים של PD. מינונים שונים שלcistanchetubulosa nanopowder קיצרה את משך הזמן הנייח, הגבירה את הפעילות האוטונומית, שיפרה הפרעות התנהגותיות, העלתה רמות DA במוח והגברת ביטוי ה-TH בכלי רכב. תוצאות אלו הצביעו על כךcistanchetubulosa nanopowder הפעילה השפעות הגנה על נוירונים דופמינרגיים, ובכך שיפרה את הפרעות ההתנהגות של כלי רכב. מינונים שונים שלcistanchetubulosa nanopowder הגביר את הביטוי של חלבון GDNF וחלבוני הקולטנים שלו במוח של עכברי כלי רכב. טיפול במינון גבוה של cistanche tubulosa העלה באופן משמעותי את ביטוי Bcl2 והפחית את ביטוי Bax, מה שהצביע על כך ש- cistanche tubulosa nanopowder עשוי לקדם ביטוי והפרשת GDNF במוח העכבר הפגוע ב-MPTP. בנוסף, זה עשוי להפעיל השפעות נוירוטרופיות בנוירונים דופמינרגיים ולמזער אפופטוזיס נוירוני באמצעות תפקידי התמיכה הנוירוטרופיים של GDNF.

מחקר זה הוכיח זאתcistanchetubulosa nanopowder הפעילה השפעות הגנה בנוירונים דופמינרגיים הן במבחנה והן ב-in vivo והגדילה את ביטוי ה-TH לשיפור תכולת ה-DA. זה גם שיפר הפרעות התנהגותיות בעכברי רכב המושרה על ידי MPTP, מווסת את ביטוי החלבון של GDNF וחלבוני הקולטנים שלו ב-SN, והיו לו השפעות אנטי-אפופטוטיות בעכברי PD. המנגנון העומד בבסיס ההשפעות הקליניות שלcistanchetubulosa nanopowder ב-PD עשויה להיות כרוכה בהגדלת התוכן של GDNF אנדוגני במוח ובכך להפחית את הנזק לנוירונים דופמינרגיים.

תרומות מחברים

QX ו-WF הם המחברים הראשונים של העבודה, S-FY, Y-BC, WQ ו-S-YC השתתפו בעבודה הניסיונית, ו-JC עיצב והנחה את העבודה.

הצהרת ניגוד אינטרסים

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים כלשהם שעלולים להתפרש כניגוד עניינים אפשרי.

תודות

העבודה נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של מענקי מחוז פוג'יאן (פרויקט 2015J01686), קרן המחקר המדעי של הוועדה הלאומית לבריאות ותכנון המשפחה של הרפובליקה העממית של סין (פרויקט WKJ-FJ-38), Chen Keji קרן לפיתוח רפואה אינטגרטיבית (פרויקט CKJ2014012), והנושא המרכזי של אוניברסיטת פוג'יאן לרפואה סינית מסורתית (פרויקט X2014010-נושא).

For more information:1950477648nn@gmail.com