Cistanche: ייצור תחמוצת החנקן המושרה על ידי אכינאקוסיד בתאי אנדותל: תפקידים של קולטן אנדרוגן ומסלול PI3K-Akt

איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

LI GU, dANHONG LIAN, YIMEI ZHENG, WEI ZHOU, JINLEI GU ו-XIN LIU

מבוא

Cistancheהופמג. Et Link הוא עשב טפיל רב שנתי ממין משפחת ה- Orobanchaceae. הרבהCistanche, הגזע שלCistanche מדבריתג y . MA וCistanche tubulosa(Schenk) R. Weight, שימשו כחומר טוניק לטיפול במחסור בכליות, אימפוטנציה, לויקוריאה חולנית ועצירות סנילי (1), אשר עשויה להיות עקב ההשפעה הרגולטורית דמוי האנדרוגן או הורמוני המין (2).אכינאקוסייד(EcH; c35H46O20;

משקל מולקולרי, 786.73; איור 1), הוא אחד הגליקוזידים הפנילאתנואידים (PhGs) המבודדים מגבעולים של הרבהCistanche, ומציג תכונות ביולוגיות מרובות, כולל השפעות נוגדות חמצון, אנטי-הזדקנות, אנטי דלקתיות, השפעות מגינות על הכבד ונוירו-הגנה (3). חקירות פרמקולוגיה מודרניות הוכיחו כי מרכיבים שונים של הרבהCistanche, כולל EcH, acteoside, kankanose, kankanoside F ו- cistanoside F, מפגינים פעילות וסוריאלקסנטית (4).

האנדותל הוא מווסת קריטי של כלי הדם, ותחמוצת החנקן (NO) היא גורם מרגיע חשוב המשתחרר על ידי תאי האנדותל. על ידי התפזרות לתאי שריר חלק, NO מפעיל גואנילאט ציקלאז, מגביר את רמות הגואנוזין מונופוספט מחזורי (cGMP), ולאחר מכן מפעיל קינאזות חלבון תלויות cGMP (PKGs) כדי לקדם הרפיית שריר חלק (5). הוכח בעבר ש-EcH ב-350-400 µM פועל ישירות על שריר חלק של כלי הדם ומעכב שגשוג הנגרמת היפוקסיה בתאי שריר חלק של עורק ריאתי חולדה (6), בעוד ש-30-300 µM EcH גרם להרפיית כלי דם חריפה באנדותל- טבעות שלמות באופן תלוי ריכוז, וייצור cGMP משופר בשריר החלק של ה-corpus cavernosum של טבעות אבי העורקים המכווצים על ידי פנילפרין (7). על ידי פתיחת תעלות NO-cGMP-PKG-BKca בתאי שריר חלק, 100 או 300 מיקרומטר EcH דיכאו את התכווצות הנוראדרנלין בעורקי הריאה של חולדות, במיוחד בטבעות נטולות אנדותל (8). תאי אנדותל הם מווסתים מרכזיים של תפקוד הלב וכלי הדם, ובכמה מקרים נמצא שההרפיה התלויה באנדותל נבעה מחומר שניתן להעברה, כגון NO, ששוחרר מהאנדותל (9). עם זאת, המנגנון המולקולרי במעלה הזרם של ייצור NO המושרה על ידי EcH בתאי אנדותל כלי דם דורש חקירה נוספת.

באנדותל כלי הדם, יצירת NO מתווכת בעיקר על ידי סינתאז NO אנדותל (eNOS). מספר קבוצות הוכיחו שמסלול ה-phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) מפעיל את serine threonine protein kinase B (Akt), הגורם ל-eNOS זרחון ישיר בסרין 1177 (Ser1177) (10). הקולטן לאנדרוגן (AR) הוא חבר בתת-משפחת הקולטנים הגרעיניים s3, אשר משנה באופן קנוני את ביטוי הגנים. לוקליזציה של AR ל-caveolae בממברנת התא מעורבת

הוויסות הלא גנומי של תפקוד תאי האנדותל או ביטוי גנים על ידי הפעלת מפל c-Src/PI3K/Akt, שבסופו של דבר מביא לזרחון eNOS וייצור NO (11). בתאי אנדותל אנושיים של אבי העורקים, דווח כי טסטוסטרון מפעיל איתות PI3K/Akt וגורם במהירות לייצור NO עקב האינטראקציה הישירה של AR ותת-היחידה p85 של PI3K על מערכת הלב וכלי הדם (12). דווח כי EcH מחמיר תסמינים הקשורים למחסור בהורמונים ומפעיל את השפעותיו דמויות האנדרוגן עקב קשירה תחרותית ל-AR במקום לטסטוסטרון (2). לכן, המחקר הנוכחי שיער שמסלול PI3K/Akt עשוי להיות מעורב בייצור NO באמצעות זרחון eNOS תלוי AR המושרה על ידי EcH. מטרת המחקר הנוכחי הייתה להעריך את ההשפעות הבאות של EcH: i) אינדוקציה של ייצור NO וזרחון eNOS; ii) מעורבות של AR בזרחון eNOS; ו-iii) הפעלה של מסלול PI3K/Akt בתאי אנדותל וריד הטבור האנושי (HUVEcs), מודל ניסיוני ידוע לחקר הוויסות של תפקוד תאי האנדותל ואנגיוגנזה (13).

חומרים ו שיטות

כימיקלים ו ריאגנטים.EcH (טוהר, 92.5 אחוז) התקבל מהתקנים הלאומיים לתרופות במכון הלאומי לבקרת מזון ותרופות. נוגדנים נגד p-Akt (Ser473; מס' קטגוריה ab8805), Akt (מס' קטגוריה ab81283), p-eNOS (Ser1177; מס' קטגוריה ab184154) ו-eNOS (מספר קטגוריה ab76198) נרכשו מ-Abcam. המעכבים של nilutamide ו-IcI 182780 התקבלו מ-Sigma-Aldrich; Merck KGaA. L-NAME נרכש מ- Adamas-Beta, Ltd., ו-wortmannin נרכש מחברת Pribolab.

תָא תַרְבּוּת ותרופה יַחַס.HUVEcs התקבלו מ-Sciencell Research Laboratories Inc. ותורבתו במדיום תאי אנדותל (EcM; Sciencell Research Laboratories) עם 5 אחוז (v/v) סרום בקר עוברי (FBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.) ו-1 אחוז תא אנדותל. תוסף גדילה (ECGS) ב-37˚C (5 אחוז CO2 ו-95 אחוז לחות) (14). כשהגיעו למפגש, התאים עוכלו עם טריפסין וצופו ב-ECM עם 1 אחוז FBS ו-1 אחוז EcGS. עבור כל הניסויים, HUVEcs צופו בריכוז של 1x104/ml וגדלו עד שהגיעו למפגש. לפני הטיפול עם EcH או ממריצים אחרים, התאים הודגרו ב-ECM ללא פנול אדום ללא FBS ו- EcGS למשך 6 שעות כדי לגרום

עצירת גדילה. בניסויים המעכבים, HUVEcs הודגרו מראש עם אנטגוניסטים או מעכבים שונים, כולל 10 µM nilutamide, 10 µM IcI 182780, 0.5 mM L-NAME או 5 µM wortmannin, עבור 30 µM עם או בלי ECH, ב-37˚C. בכל הקבוצות, כולל הביקורת, נעשה שימוש ב-dMSO כממס בריכוזים שווים של 0.001 אחוז.

מדידה של תוך תאי NOproduction.

שינויים יחסיים בריכוז NO ציטוסוליים ב-HUVEcs נוטרו באמצעות בדיקת NO הפלורסנטית DAF-FM (Cayman Chemical Company), כפי שדווח בעבר (12). בקצרה, התאים הועמסו ב-5 µM DAF-FM דיאצטט למשך 20 דקות ב-37°C בצלחת מיקרוטיטר שחורה ונשטפו מספר פעמים עם PBS (pH 7.4). הקרינה נקבעה באורכי גל של עירור ופליטות של 495 ו-515 ננומטר, בהתאמה, באמצעות קורא מיקרו-צלחות ניאון (Biotek Synergy H4; BioTek Instruments, Inc.) ומיקרוסקופ הפוך קומפקטי (Nikon eclipse Ts2R; תאגיד Nikon).

מערבית כֶּתֶם אָנָלִיזָה.כפי שדווח בעבר (15), שכבות מונו-שכבות מתכנסות של תאים נשטפו פעמיים ב-PBS קר כקרח והוסרו עם חיץ RIPA (P0013d; Beyotime Institute of Biotechnology). ריכוז החלבון בסופרנטנט נמדד בשיטת בדיקת חומצה bicinchoninic (16). לאחר מכן, 30 מיקרוגרם חלבון הועמסו לכל נתיב, הופרדו באמצעות ג'לים של 10 אחוז פוליאקרילאמיד והועברו על גבי ממברנות פוליווינילידן דיפלואוריד. הממברנות נחסמו עם 5 אחוז חלב רזה למשך שעה אחת ב-25 מעלות צלזיוס. לאחר דגירה עם נוגדנים חד שבטיים נגד Akt (דילול 1:1,000), p-Akt (דילול 1:500), דילול eNOS (1:2,000) או p-eNOS (1 :1,000 דילול) ב-4˚C למשך הלילה, הממברנות נשטפו עם TBST (המכיל 0.1 אחוז Tween-20) 4 פעמים למשך ~15 דקות לכל כביסה ב-25˚C. לאחר מכן, הממברנות הודגרו עם נוגדנים משניים מצומדים חזרת פרוקסידאז (דילול 1:5,000; נוגדן נגד עכברים, קטלוגי מס' A0216, או נוגדן נגד ארנבות, קטגוריה מס' A0208, מכון ביוטיים של ביוטכנולוגיה) למשך שעה אחת ב-25 מעלות צלזיוס, וזוהה באמצעות ערכת כימילומינסנציה משופרת (קטגוריה מס' 32209, Thermo Fisher Scientific, Inc.). עוצמות הרצועה הוכמתו באמצעות תוכנת ניתוח ג'ל Image J, גרסה 1.8.0_112 (המכונים הלאומיים לבריאות).

קָטָן מִתעַרֵב (סִי) RNA הכנה ו טרנספקציה.ה-RNA הדו-גדילי הארוך סונתז על ידי ה-mRNA היעד של ה-AR והקולטן לאסטרוגן (ER) עם רצפים המוצגים בטבלה I. התנאים ל-nockdown של siRNA כללו טרנספקציה של HUVECs ב-70 אחוזי מפגש שנשמר בחומר שאינו אנטי-מיקרוביאלי. מצע תרבית בכלי תרבית 60 מ"מ מצופות קולגן. טרנספקציה של 5 nM AR-siRNA או 10 nM ER -siRNA עם ריאגנט Lipofectamine 3000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) בוצעה בנפרד, בהתאם לפרוטוקולים של היצרן. יעילות טרנספקציה הוערכה על ידי ניתוח כמותי-PcR של שעתוק הפוכה (RT-qPcR), כפי שדווח בעבר (17). תנאי הרכיבה התרמו-אופניים היו כדלקמן: 10 דקות ב-95˚C; 40 מחזורים של 95°C למשך 5 שניות ו-60˚C למשך דקה אחת, ועקומת התכה ב-95˚C למשך 15 שניות, 60˚C למשך דקה אחת ו-95˚C למשך 15 שניות; בוצעו שלושה שכפולים ביולוגיים בלתי תלויים עבור כל דגימה. הניסויים הבאים נערכו 48 שעות לאחר ההעברה. צמדי פריימר תוכננו באמצעות תוכנת Primer Premier v5.0 (PREMIER Biosoft) עם הרצפים הבאים: AR קדימה, 5'-GGTTAcAccAAAGGGcTAGAA-3' והיפוך, 5'-GAcTTGTAGAGAGAcAGGGTAGA-3'; ER קדימה, 5'-ccAGTAccA ATGAcA AGG GAAG -3' והיפוך, 5'-TcAcAGGAccAGAcTccATAA-3'; ו-GAPdH קדימה, 5'-cAGGGcTGcTTTTAAcTcTGGTAA-3' והיפוך, 5'-GGGTGGAATcATATTGGAAcATGT-3'.

סטָטִיסטִי אָנָלִיזָה.כל הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית התקן. השוואות סטטיסטיות בין קבוצות בוצעו באמצעות מבחן Kruskal-Wallis או ANOVA דו-כיווני עם מבחן הפוסט-הוק של Tukey להשוואות מרובות. פ<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

תוצאות

ECH גורם לא הפקה ו eNOSphosphorylation.כפי שמוצג באיור 2A ו-B, 1 µM ECH הגדיל באופן משמעותי את ייצור ה-NO התוך תאי ב-HUVEcs בהשוואה לתאי הבקרה השליליים, בעוד שהאפקט המעורר של EcH הוחלש לרמת הבקרה על ידי טיפול מקדים עם L-NAME. כדי להשיג את הריכוז האופטימלי, נבדק זרחון eNOS לאחר 60 דקות לאחר טיפול ב-ECH בריכוזים

של {{0}}, 0.01, 0.1, 1 ו-10 µM. התוצאות חשפו ש-EcH בריכוזים של 0.01-10 µM עשוי לגרום ל-eNOS זרחון ב-Ser 1177 באופן מובהק באופן תלוי ריכוז, כאשר הזרחון המקסימלי של eNOS נצפה ב-10 µM EcH (איור 2c ו-d). יתר על כן, זרחון eNOS ב-Ser1177 נבדק על ידי אנליזה של Western blot ב-0, 5, 15, 30, 60 ו-120 דקות לאחר הדגירה עם 1 µM EcH. נצפה כי זרחון eNOS הופעל במהירות על ידי EcH לאחר 5 דקות, והמשיך לעלות עד 30 דקות של דגירה (איור 2E ו-F). לאחר מכן, למרות טיפול ב-ECH, הגודל היחסי של זרחון eNOS נשאר יציב מ-30 דקות ואילך; לכן, EcH לא השפיע על ביטוי eNOS הכולל (איור 2c ו-E).

AR מתווך נוצר על ידי ECH לא הפקה ו eNOSההשפעות המפריעות של AR-siRNA-1 ו-ER -siRNA-2 היו המוצלחות ביותר בעיכוב הביטוי של AR ו-ER ב-HUVEcs במחקר הנוכחי (איור 3). לאחר מכן, אנטגוניסט לניתוח עיכוב פונקציה של AR ו-siRNA לניתוח אובדן פונקציה של AR יושמו כדי להעריך את המעורבות של AR בהפעלת eNOS הנגרמת על ידי EcH וייצור NO. כפי שמוצג באיור 4A, 1 µM ECH הגדיל באופן משמעותי את ייצור NO ב-HUVEcs (P<0.05). pretreatment="" with="" the="" ar="" antagonist="" nilutamide="" (10="" µm)="" abolished="" ech-induced="" no="" production,="" whereas="" ici182789="" (an="" er="" antagonist)="" did="" not="" exert="" the="" same="" effects.="" furthermore,="" the="" effects="" of="" sirna-mediated="" ar="" knockdown="" on="" no="" production="" were="" examined="" in="" cultured="" cells,="" indicating="" that="" no="" production="" was="" diminished="" by="" transfection="" with="" ar="" sirnas;="" however,="" it="" was="" not="" affected="" by="" er="" sirnas="" or="" control="" random="" sirnas="" (fig.="" 4b).="" representative="" western="" blots="" and="" semi-quantitative="" analysis="" (fig.="" 4c="" and="" d)="" revealed="" that="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" inhibited="" by="" nilutamide="" and="" ici182789,="" and="" that="" the="" inhibitory="" effect="" of="" nilutamide="" on="" ech-induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" higher="" compared="" with="" that="" of="" ici182789,="" which="" indicated="" that="" inhibi-="" tion="" of="" ar="" function="" had="" a="" greater="" impact="" than="" er="" on="" enos="" phosphorylation="" induced="" by="" ech.="" similarly,="" the="" phosphoryla-="" tion="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" reduced="" significantly="" in="" cells="" transfected="" with="" ar-sirna="" and="" er-sirna="" compared="" with="" the="" control="" random="" sirna;="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ar‑sirna="" on="" ech‑induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" stronger="" compared="" with="" that="" of="" er-sirna="" (fig.="" 4e="" and="" f).="" therefore,="" the="" aforementioned="" results="" suggested="" that="" ech="" may="" cause="" ar-dependent="" activation="" of="" enos="" to="" induce="" no="" production="" in="">

ECH מפעיל ה PI3K/Akt נָתִיב.במחקר הנוכחי, זרחון Akt ב-Ser473 נבדק 60 דקות לאחר הדגירה של EcH בריכוזים של 0, 0.01, 0.1 , 1 ו-10 מיקרומטר. התוצאות הצביעו על כך ש-EcH (0.01-10 µM) עשוי לעורר באופן משמעותי זרחון של Akt. רמות הביטוי היחסיות של p-Akt הגיעו לשיא של 1 ו-10 מיקרומטר של טיפול ב-ECH (איור 5A ו-B). יתר על כן, זרחון Akt נבדק על ידי אנליזה של Western blot ב-0, 5, 15, 30, 60 ו-120 דקות לאחר הוספה של 1 µM EcH לתרביות HUVEc. כפי שמוצג באיור 5c ו-d, EcH הגביר במהירות את הזרחון של Akt לאחר 5 דקות של דגירה, ורמת החלבון המקסימלית של p-Akt נצפתה לאחר 60 דקות. לעומת זאת, EcH לא השפיע על הביטוי הכולל של Akt (איור 5A ו-c). יתרה מכך, כדי לחקור את ההשפעה הפוטנציאלית של מסלול PI3K על זרחון eNOS, HUVEcs טופלו מראש עם מעכב PI3K wortmannin לפני יישום EcH. נמצא כי Wortmannin מפחית ייצור NO המושרה על ידי EcH לרמות הבסיס (איור 5E). תופעה דומה נצפתה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעת בחינת הקרינה של DAF-FM המושרה על ידי EcH (איור 5F). יתר על כן, לוורטמנין עשויה להיות היכולת לבטל זרחון מהיר של eNOS ב-HUVEcs (איור 5G ו-H). התוצאות שהוזכרו לעיל מצביעות על כך ש-EcH עשוי להפעיל זרחון של eNOS וייצור NO דרך מסלול PI3K/Akt.

דִיוּן

EcH היא תרכובת טבעית המבודדת מהרבהCistanche, בעל תכונות פרמקולוגיות שונות. הוכח בעבר כי EcH הפעיל אפקט הרפיית כלי דם תלוי אנדותל על ידי פתיחת תעלות NO-cGMP-PKG-BKca בתאי שריר חלקים של כלי הדם (7,8). הממצאים הנוכחיים מספקים עדות לכך ש-ECH הפעיל הפעלה תלוית AR של eNOS כדי לגרום לייצור NO עם מעורבות של מסלול האיתות PI3K/Akt בתאי אנדותל כלי דם.

כשכבה הפנימית ביותר של דופן כלי הדם, האנדותל יכול לחוש במהירות ולהגיב לשינויים בזרימת הדם, וכתוצאה מכך העברת אותות לתאי השריר החלק הבסיסיים על מנת לווסת את טונוס כלי הדם (18). דווח בהרחבה כי קיימות תרכובות מרחיבות כלי דם מרובות שמקורן באנדותל, עם החומר האב-טיפוס ביותרבהיותו NO, נוצר מהאיזופורם האנדותל של eNOS, מה שגורם לזרחון (19). בתנאים רגילים, eNOS נשאר לא פעיל כשהוא קשור לקאאולין, ומופעל עם רצף האירועים הבא באנדותלתאים: i) eNOS מתנתק מ-caveolin-1 ומתחבר ל-ca2 plus /caM; ii) חלבון הלם חום (HSP)90 מקדם eNOSדימריזציה ומעדיפה מבנה סטרי לגיוס Akt; וכן iii) calcineurin dephosphorylates Thr495 כדי לחזק את מצב ההפעלה (20). במחקר הנוכחי, ייצור NO גדל באופן משמעותי ב-HUVECs שטופלו ב-1 µM ECH. תופעה זו הייתה דומה לתוצאות קודמות, שבהן EcH הגביר את שחרור NO ועורר את הסינתזה של cGMP בטבעות אבי העורקים החזה של חולדה (7). יתר על כן, נראה כי שני אתרי זרחון, Ser1177 ו-Thr495, חשובים במיוחד לוויסות פעילות eNOS (20), והמחקר הנוכחי חשף כי EcH גרמה לזירחון חריף של eNOS ב-Ser1177 באופן תלוי ריכוז. בנוסף, הגירויים הקשורים להשפעות על רמות חלבון eNOS קובעים בעיקר את יציבות ה-mRNA של eNOS, ואם הגירוי נשמר לתקופה ארוכה יותר, שעתוק mRNA של eNOS מתרחש באמצעות חלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן וגורם גרעיני κB (20). ביחד, תצפיות אלו מצביעות על כך שההפעלה של eNOS ב-Ser1177 אחראית לסינתזה של NO המושרה על ידי EcH.

יתר על כן, מספר הולך וגדל של מחקרים הוכיחו ש-AR מתבטא בתאי אנדותל במספר רקמות אנושיות, מה שמצביע על תפקיד פוטנציאלי של אנדרוגנים והאנלוגים שלהם, הפועלים באמצעות תהליכים מתווכי AR, באפנון של אנדותל אנושי. הומאוסטזיס של תאים (21). במסלול הלא קלאסי PI3K/Akt, AR עשוי להפעיל את PI3K על ידי אינטראקציה ישירה עם תת-היחידה הרגולטורית PI3K p85 (22). המחקר הנוכחי הוכיח כי אנטגוניסט AR או AR siRNA הפחית את ייצור ה-NO ואת הזרחון של eNOS המושרה על ידי EcH ב-HUVEcs. דווח בעבר כי אסטרוגנים מעוררים זרחון של eNOS ומעוררים ייצור NO באמצעות הפעלת ER קלאסית בתאי אנדותל (23), והמתן של ECH משפר באופן משמעותי את הביטוי של ER ברחם (24). עם זאת, במחקר הנוכחי, ההשפעה של AR הייתה בולטת יותר בהשוואה לזו של ER על הפעלת eNOS הנגרמת על ידי EcH וייצור NO. בנוסף, נצפה כי EcH גרם לייצור NO חריף תוך דקות באמצעות הפעלת eNOS מעורבת ב-HUVEcs, מה שעולה בקנה אחד עם האופי הלא-גנומי של התגובה בתאי האנדותל. ה-AR קשור לחלבוני פיגום, כולל HSP90, HSP70 ו-kinase Src, בציטופלזמה, והוא יכול להיות מועבר אל הממברנה ממתחם AR תוך 5 דקות מטיפול בטסטוסטרון (23). בהתבסס על אסטרטגיית 'דייג המטרה', HSP90 זוהה כיעד המזוהה עם PhGs, מה שהצביע על כך ש-EcH עשוי להקל על הניתוק של AR מחלבוני הפיגום (25). מחקר אחר הציע כי בהיפותלמוס, EcH עשוי להשתלב עם כיס AR בחומצות אמינו Met-894 ו-Val-713 ולעכב את ההובלה של AR ציטופלזמי לגרעין (26). עם זאת, המנגנון הבסיסי שדרכו EcH מתווך טרנסלוקציה ציטופלזמית AR לממברנה דורש חקירה נוספת. לכן, נדרש מחקר נוסף כדי להבהיר את המנגנון שדרכו EcH משיגה הפעלת eNOS תלוית AR וכיצד זה עשוי להיות קשור לקישור ל-HSP90 בתאי אנדותל כלי דם.

מסלול PI3K/Akt הוא אחד ממפלי האיתות החשובים ביותר, שהפעלתם נגרמת על ידי ייצור phosphatidylinositol-3,4,{3}}trisphosphate כדי לקשור את תחום ההומולוגיה ה-N-terminal pleckstrin של Ser/ Thr kinase Akt. זה מקל על גיוס Akt לממברנת הפלזמה (27). מסלול PI3K/Akt עשוי למלא תפקיד חשוב בבקרה של הרפיה תלוית NO הנגרמת על ידי EcH.

המחקר הנוכחי חשף שייצור NO המושרה על ידי EcH הופחת באופן משמעותי כאשר התאים הודגרו עם מעכב PI3K wortmannin. דוח קודם הוכיח ש-15 מ"ג/ק"ג EcH הפעיל את מסלול האיתות PI3K/Akt בתאי מח עצם מדוכאים 5-fluorouracil (28). במחקר הנוכחי, מעכבי PI3K הפחיתו באופן משמעותי את זרחון eNOS המושרה על ידי EcH ב-Ser1177. יתר על כן, פעילות Akt הייתה מווסתת בעיקר על ידי מסלולים רגולטוריים במעלה הזרם, במיוחד זרחון תלוי PI3K ב- Ser473 (20). במחקר הנוכחי, EcH גרמה ל-Akt זרחון ב-Ser473 באופן תלוי מינון; באופן דומה, מחקר קודם הראה כי 5, 10 או 20 µM EcH הפעילו אפקט מגן על הלב כנגד טיפול באנוקסיה/פרפוזיה מחדש באופן תלוי מינון על ידי העלאת ויסות פוטנציאלית של p-Akt ו-SLc8A3 (29). ויסות התעתיק של הגן Akt נותר לא ידוע ברובו (30); לכן, המחקר הנוכחי התמקד בהשפעות הרגולטוריות שלאחר התמלול של EcH על Akt. בהתחשב בממצאים שהוזכרו לעיל, הסיק כי היישום של EcH ל-HUVEcs עשוי להוביל להפעלה של מסלול PI3K/Akt, אשר מזרחן eNOS, ובהמשך, מגביר את ייצור NO.

לסיכום, EcH הוא מוצר טבעי המבודד בעיקר מרבהCistanche.המנגנון הפוטנציאלי העומד בבסיס ייצור NO המושרה על ידי EcH בתאי אנדותל עשוי לכלול את הדברים הבאים (איור 6): i) EcH פועל כליגנד פונקציונלי של AR הממוקם ל-caveolae בממברנת התא; ii) PI3K נקשר לתחום ההידרופובי של Akt ב-Ser473 ומקל על גיוס Akt לממברנת התא; iii) הגיוס של אשדות PI3K/Akt מפעיל זרחון eNOS תלוי AR; ו-iv) יצירת NO מתווכת על ידי eNOS בתאי אנדותל. התצפית כי EcH גורם לייצור NO באמצעות זרחון תלוי AR של eNOS עם מעורבות של מסלול PI3K/Akt עשויה לתרום להבנה נוספת של ההשפעות הרפיות כלי הדם של EcH. יתר על כן, ה-ECH המכוון למסלולי NO שמקורם באנדותל עשוי להיות בגלל השפעות לא גנומיות. לכן, המחקר הנוכחי עשוי לסייע בבירור המנגנונים שבאמצעותם EcH מפעיל את ההשפעות הפרמקולוגיות שלו למניעת מחלות לב וכלי דם.

תודות

לא ישים.

מימון

המחקר הנוכחי נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס' 81503333).

זמינות שֶׁל נתונים ו חומרים

מערכי הנתונים שנוצרו ונותחו במהלך המחקר הנוכחי זמינים מהמחבר המתאים על פי בקשה סבירה.

מחברים תרומות

LG ו-XL הגו ועיצבו את הניסויים. dL ו-YZ ביצעו את הניסויים. WZ ו-JG ניתחו את הנתונים. LG ניסחה את כתב היד. XL בדק וערך את כתב היד. כל המחברים קראו ואישרו את כתב היד הסופי.

1202 GUet אל: EcHINAcOside מעורר ייצור תחמוצת חנקן על ידי AR-DEPENDENT PI3K/AKT PATHWAY

אֶתִיקָה הסכמה ו הַסכָּמָה ל לְהִשְׂתַתֵף

לא ישים.

סבלני הַסכָּמָה ל פרסום

לא ישים.

מתחרה תחומי עניין

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

הפניות

1. עמלת פרמקופאה סינית:Cistancheהרבה. בתוך: פרמקופיה של הרפובליקה העממית של סין 1. סנטר. Med. Sci. עיתונות, בייג'ינג, עמ' 135, 2015.

2. Jiang Z, Wang J, Li X ו-Zhang X: Echinacoside andCistanche tubulosa(שנק)R. wight משפר את נזקי האשכים והזרע המושרה על ידי ביספנול A בחולדות דרך אנזימים סטרואידוגניים מווסתים בציר הגונד. J Ethnopharmacol 193: 321-328, 2016.

3. Liu J, Yang L, dong Y, Zhang B ו-Ma X: Echinacoside, מוצר טבעי שלא יסולא בפז בטיפול בהפרעות נוירולוגיות ואחרות. מולקולות 23: piiE1213, 2018.

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S ו- Muraoka O: Phenylethanoid oligoglycosides ו-acylated oligosugars עם פעילות וסורילקסנטית מCistanche tubulosa. Bioorg Med chem 14: 7468-7475, 2006.

5. Arnold WP, ​​Mittal cK, Katsuki S ו-Murad F: תחמוצת החנקן מפעילה guanylate cyclase ומגבירה את רמות מונופוספט גואנוזין 3':5'-מחזוריות בתכשירי רקמה שונים. Proc Natl Acad Sci USA 74: 3203-3207, 1977.

6. Gai XY, Tang F, Ma J, Zeng KW, Wang SL, Wang YP, Wuren TN, Lu dX, Zhou Y ו-Ge RL: השפעה אנטי-פרוליפרטיבית של echinaco-side על תאי שריר חלקים בעורק הריאתי של חולדה תחת היפוקסיה. J Pharmacol Sci 126: 155-163, 2014.

7. He WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ ו-Tu PF: Echinacoside מעורר הרפיה תלוית אנדותל בטבעות אבי העורקים של חולדה באמצעות מסלול NO-cGMP. Planta Med 75: 1400-1404, 2009.

8. Gai XY, Wei YH, Zhang W, Wuren TN, Wang YP, Li ZQ, Liu S, Ma L, Lu dX, Zhou Y ו-Ge RL: Echinacoside גורם להרפיית כלי דם ריאתית של חולדה על ידי פתיחת NO-cGMP-PKG- ערוצי BKca והפחתת רמות ca2 פלוס תוך תאי. Acta Pharmacol Sin 36: 587-596, 2015.

9. Maruhashi T, Kihara Y והיגאשי Y: הערכה של הרחבת כלי דם בלתי תלויה באנדותל: מתודולוגיה לפרספקטיבות קליניות. J Hypertens 36: 1460-1467, 2018.

10. Ahmad KA, Ze H, chen J, Khan FU, chen X, Xu J ונגזרת על תאי אנדותל ורידי טבור אנושיים נגד פגיעה הנגרמת על ידי מתח חמצוני: מעורבות של נוגד חמצון ומסלולי איתות PI3k/Akt/eNOS/NO. Biomed Pharmacother 106: 1734-1741, 2018.

11. Yu J, Akishita M, Eto M, Koizumi H, Hashimoto R, Ogawa S, Tanaka K, Ouchi Y ו-Okabe T: Src kinase מתווך הפעלה לא-גנומית תלוית קולטן אנדרוגן של מפל איתות המוביל לסינתאז תחמוצת החנקן האנדותל. . Biochem Bioph Res commun 424: 538-543, 2012.

12. Yu J, Akishita M, Eto M, Ogawa S, Son B, Kato S, Ouchi Y ו-Okabe T: הפעלה תלוית קולטן אנדרוגן של סינתאז תחמוצת החנקן האנדותל בתאי אנדותל כלי דם: תפקידו של פוספטידילינוזיטול {{3} }kinase/Akt pathway.Endocrinology 151: 1822-1828, 2010.

13. Pittarella P, Squarzanti dF, Molinari c, Invernizzi M, Uberti F ו-Reno F: ריבוי והגירה תלויים ב-NO הנגרמת על ידי ויטמין D ב-HUVEc. J Steroid Biochem 149: 35-42, 2015.

14. He Y, Luan Z, Fu X ו-Xu X: ביטוי יתר של ניתוק חלבון 2 מעכב את האפופטוזיס המושרה על ידי גלוקוז גבוה של תאי האנדותל של וריד הטבור האנושי. Int J Mol Med 37: 631-638, 2016.

15. Xiao-Hong d, chang-Qin X , Jian-Hua H , Wen-Jiang Z ו-Bing S: Icariin מעכב הזדקנות תאי אנדותל המושרה על ידי הומוציסטאין הכוללת הפעלה של מסלול האיתות PI3K/AKT-eNOS. Pharm Biol 51: 433-440, 2013.

16. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano Md, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ and Klenk dc: מדידת חלבון באמצעות חומצה ביצינצ'ונינית. Anal Biochem 150: 76-85, 1985.

17. Gu L, Zhong X, Lian d, Zheng Y, Wang H ו-Liu X: ביו-סינתזה טריטרפנואידית ותגובת התעתיק הנגררת על ידי תחמוצת חנקן בתסיסה שקועה.גנודרמה צלילות. Process Biochem 60: 19-26, 2017.

18. Ellinsworth dc, Sandow SL, Shukla N, Liu Y, Jeremy JY and Gutterman dd: היפרפולריזציה שמקורה באנדותל והרחבת כלי דם כליליים: תפקידים מגוונים ומשולבים של חומצות אפוקסיות-איקוסטרינואיות, מי חמצן וצמתים מרווחים. Microcirculation 23: 15-32, 2016.

19. Freed JK and Gutterman dd: תקשורת היא מפתח: מנגנונים של איתות בין-תאי בהרחבת כלי דם. J cardiovasc Pharm 69: 264-272, 2017.

20. Quillon A, Fromy B and debret R: חישת מיקרו-סביבה של אנדותל המובילה להרחבת כלי דם בתיווך תחמוצת חנקן: סקירה של אותות עצביים וביומכניים. Nitric Oxide 45: 20-26, 2015.

21. Torres-Estay V, carreno dV, Francisco IF, Sotomayor P, Godoy AS and Smith GJ: קולטן אנדרוגן בתאי אנדותל אנושיים. J Endocrinol 224: 131-137, 2015.

22. deng Q, Zhang Z, Wu Y, Yu WY, Zhang J, Jiang ZM, Zhang Y, Liang H ו-Gui YT: פעולה לא-גנומית של אנדרוגנים מתווכת על ידי זרחון מהיר וויסות של סחר בקולטן אנדרוגנים. Cell Physiol Biochem 43: 223-236,2017.

23. דה אוליביירה TS, דה אוליביירה LM, דה אוליביירה LP, costa RMd, Tostes Rc, Georg Rc, costa EA, Lobato NS, Filgueira FP ו-Ghedini Pc: הפעלה של מסלול PI3K/Akt המתווך על ידי קולטני אסטרוגן אחראית להיווצרות אסטרון הפעלה וסקולרית של איתות cGMP. Vascul Pharmacol 110: 42-48, 2018.

24. Li F, Yang X, Yang Y, Guo c, Zhang c, Yang Z ו-Li P: פעילות אנטי-אוסטיאופורטית של אכינאקוסיד בחולדות שעברו ניתוח שחלות. Phytomedicine 20: 549-557, 2013.

25. Zeng KW, Liao LX, Wan YJ, Jiang Y ו-Tu PF: זיהוי מטרות פרמקולוגיות וניתוח יעילות של גליקוזידים פנילתנואידים מCistanchesהרבה המבוססת על אסטרטגיית 'דייג יעד'. chin Tradit Herbal drugs 49: 173-178, 2018.

26. Jiang Z, Zhou B, Li X, Kirby GM ו- Zhang X: Echinacoside מגביר את כמות הזרע בחולדות על ידי מיקוד לקולטן האנדרוגן ההיפותלמוס. Sci Rep 8: 3839-3850, 2018.

27. coffer PJ, Jin J and Woodgett JR: חלבון קינאז B (c-Akt): מתווך רב תכליתי של הפעלת קינאז 3- של פוספטידילינוזיטול. Biochem J 335, 1-13, 1998.

28. Wang S, Zheng G, Tian S, Zhang Y, Shen L, Pak Y, Shen Y ו-Qian J: Echinacoside משפר את התפקוד ההמטופואטי בעכברי מיאלו-דיכוי המושרה על ידי 5-FU. Life Sci 123: 86-92, 2015.

29. chen M, Wang X, Hu B, Zhou J, Wang X, Wei W ו-Zhou H: השפעות הגנה של echinacoside נגד פגיעת אנוקסיה/פרפוזיה חוזרת בתאי H9c2 באמצעות וויסות-מעלה של p-AKT ו-SLc8A3. Biomed Pharmacother 104: 52-59, 2018.

30. Abeyrathna P ו-Su Y: התפקיד הקריטי של Akt בתפקוד קרדיווסקולרי. Vascul Pharmacol 74: 38-48, 2015.