נגישות כרומטין וביטוי מיקרו-RNA בתאי אבות נפרון במהלך התפתחות הכליה

למידע נוסף:ali.ma@wecistanche.com

אנדרו קלגסטון^1,2,3, אנדרו בודנר^2,3, דבורה מלטה סרקווירה^2,3, Yu Leng Phua^2,5,6,אליסה לולר^8,9,10, קריסטי בוגס⁷, אנדראס פנינג^8,10,ז'קלין הו^2,3*ודניס קוסטקה^1,4*

¹המחלקה לביולוגיה התפתחותית, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת פיטסבורג, פיטסבורג, הרשות הפלסטינית, ארה"ב²מרכז המחקר רנגוס, בית החולים לילדים UPMC של פיטסבורג, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב³המחלקה לרפואת ילדים, החטיבה לנפרולוגיה, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת פיטסבורג, הרשות הפלסטינית, ארה"ב⁴המחלקה לביולוגיה חישובית ומערכות ומרכז פיטסבורג לביולוגיה ורפואה אבולוציונית, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת פיטסבורג, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב⁵המחלקה לרפואה גנטית וגנומית, המחלקה לרפואת ילדים, בית החולים לילדים UPMC של פיטסבורג, פיטסבורג, הרשות הפלסטינית, ארה"ב⁶המחלקה לפתולוגיה, מעבדת גנטיקה ביוכימית קלינית, בית החולים לילדים UPMC של פיטסבורג, פיטסבורג, הרשות הפלסטינית, ארה"ב⁷המחלקה לרפואת ילדים, החטיבה לגסטרואנטרולוגיה, הפטולוגיה ותזונה, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת פיטסבורג, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב.⁸ביולוגיה חישובית,⁹מדעי הביולוגיה, ו¹⁰המכון למדעי המוח, אוניברסיטת קרנגי מלון, פיטסבורג, הרשות הפלסטינית, ארה"ב

תַקצִיר

נפרונים של יונקים מקורם באוכלוסייה שלתאי אבות נפרון, ושינויים בתעתיקים של תאים אלה תורמים להפסקת הנפרוגנזה, גורם חשוב למספר הנפרונים. כדי לאפיין את ביטוי המיקרו-RNA (miRNA) ולזהות אזורים מווסתים ל-cis, אספנו תאי אבות נפרון מעכברכליותביום העובר 14.5 וביום אפס לאחר הלידה ונבדקו ביטוי RNA קטן וכרומטין נגיש ל-transposase. זיהינו ביטוי של 1,104 miRNA (114 עם שינויים בביטוי), ו-46,374 אזורים נגישים לכרומטין (2,103 עם חוסר נגישות לשינויים). בכל הגנום, הנתונים שלנו מדגישים תהליכים כמו התמיינות תאית, נדידת תאים, אינטראקציות מטריצה ​​חוץ-תאית ומסלולי איתות התפתחותיים. יתרה מזאת, הם מזהים אלמנטים cis-רגולטוריים מועמדים חדשים עבור Eya1 ו- Pax8, שניהם גנים בעלי תפקיד בהתמיינות תאי אבות נפרון. לבסוף, אנו מקשרים miRNAs המשתנים ביטוי, כולל let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p ו-miR{{ 20}} עמ', עם רכיבי cis-רגולציה מועמדים וגנים מטרה. ניתוחים אלה מדגישים לוקוסים רגולטוריים משוערים חדשים עבור miRNA באבות נפרון.

מבוא

היחידה הפונקציונלית שלכִּליָההוא הנפרון, המשמש לסינון פסולת ולשמירה על הומאוסטזיס תקין של מים, חומצה-בסיס ואלקטרוליטים בגוף. מספר הנפרונים משתנה מאוד בבני אדם (בדרך כלל בין מאתיים אלף ליותר ממיליון נפרונים (Hugson et al., 2003)) ומתבסס לפני הלידה בבני אדם (בערך ביום שלאחר הלידה 2-3 בעכברים (Hartman et al. ., 2007; Hinchliffe et al., 1991)). נפרונים אינם יכולים להתחדש לאחר הלידה, וירידה בכמות הנפרונים קשורה לסיכון מוגבר למחלת כליות כרונית ויתר לחץ דם (Bertram et al., 2011). מספר הנפרונים, בתורו, נקבע במידה רבה על ידי אוכלוסיית תאים הנקראיםתאי אבות נפרון(Cebrian et al., 2014b). בשלבים האחרונים שלכִּליָההתפתחות, אבות נפרונים מגבירים את נטייתם להתמיין, מה שמדלדל בהדרגה את אוכלוסייתם ומסמן את הפסקת הנפרוגנזה בסופו של דבר (Hartman et al., 2007; Rumballe et al., 2011; Volovelsky et al., 2018). להבנת המנגנונים המווסתים את הפסקת הנפרוגנזה יש השלכות משמעותיות על קביעת הקניית הנפרון והסיכון למחלת כליות לאחר מכן.

בְּמַהֲלָךכִּליָהפיתוח, חידוש עצמי של אבות Cited1 plus /Six2 plus nephron נגרמים להפוך לאבות Cited1-/Six2 plus, ולאחר מכן להתמיין ל-Wnt4-המבטאים שלפוחית ​​כליה בתגובה ל-Wnt9b/ -catenin (McMahon et al., 2016; Rumballe et al., 2011). שינויים תעתיקים מהותיים באבות נפרון מוקדמים לעומת מאוחרים כוללים גנים ומסלולים המשפיעים על הזדקנות תאי גזע, בפרט, mTor והמדכא שלו hamartin (S. Chen et al., 2015; Volovelsky et al., 2018). אכן, המרטין נחשב כגורם לחוסר רגישות לאיתותים להתחדשות עצמית של אבות נפרון, ובדרך זו תורם להפסקת הנפרוגנזה (S. Chen et al., 2015). בהתאם לרעיון שלאבי נפרון מוקדמים יש נטייה גדולה יותר להתחדשות עצמית, היא התצפית שנגישות הכרומטין מועשרת לאתרי קישור של גורמי שעתוק תאי נפרון הליבה, כולל Six2 ו-Wt1 בהשוואה לאבות נפרון מאוחרים (Hilliard et al. , 2019). גורמי שעתוק אלה הוכחו כקושרים רצפי משפרים הממוקמים ב"נקודות חמות רגולטוריות" בגנום (O'Brien et al., 2018). האינדוקציה של אבות נפרון מתרחשת עקב עלייה ברמות -קטנין, מה שגורם להפעלה של קומפלקסים Lef1/Tcf7 בגנים המוכנים להפעלה של תוכנית הנפרוגנזה (Park et al., 2012), והוצע להסתבך עם Tcf7l1 ו-Tcf7l2 להקים ולתחזק לולאות כרומטין רגולטוריות המאפשרות הפעלת גנים (Guo et al., 2021).

לחץ כדיאבקת Cistanche tubulosa לטיפול במחלת כליות

מחקרים אחרונים השפיעו על microRNAs (miRNA) בוויסות הפסקת הנפרוגנזה. miRNA הן מולקולות RNA קצרות ולא מקודדות המכוונות לתעתיקי RNA שליח (mRNA) להפחתת התרגום או פירוק משופר באמצעות קומפלקס ההשתקה המושרה על ידי RNA (RISC) (ברטל, 2009). החלבון Lin28b הוא מדכא ידוע של משפחת-7המותר של miRNAs (Heo et al., 2008). ביטוי Lin28b יורד באבות נפרון ככל שהנפרוגנזה מתמשכת, וזה עולה בקנה אחד עם עלייה בביטוי של משפחת let-7 miRNA (Yermalovich et al., 2019). יתר על כן, אינדוקציה מותנית של ביטוי Lin28b בשושלת Wt1- גורמת לדיכוי של let-7 miRNA, וזה מספיק כדי להאריך את הנפרוגנזה (Yermalovich et al., 2019). לא ידוע אם miRNAs אחרים מווסתים את העיתוי של נפרוגנזה. בנוסף, בעוד שמשפרים המווסתים ביטוי RNA ארוך שאינו מקודד במהלך נפרוגנזה זוהו (Nishikawa et al., 2019), אף אחד מהם לא הוכח כמווסת את ביטוי ה-miRNA באבות נפרון.

במחקר זה, ביקשנו לזהות בו-זמנית miRNA חדשנית התורמת להפסקת הנפרוגנזה, יחד עם מאפיינים פוטנציאליים של cis-רגולציה. לכן, כדי לצפות בשינויים בביטוי ה-miRNA ובנגישות הכרומטין בין יום 14.5 עוברי (E14.5) ליום אפס שלאחר הלידה (P0), הפקנו מערכי נתונים מותאמים של mRNA-seq ו-ATAC-seq מבסיסי ולא-מעבר.תאי אבות נפרוןבנקודות שתי זמן אלו. זיהינו 114 miRNAs שמתבטאים בצורה דיפרנציאליתתאי אבות נפרוןבין שתי נקודות זמן אלו, כמו גם 2,103 אזורים של נגישות כרומטין משתנה שאנו מכנים אזורים נגישים דיפרנציאליים (DARs). ניתוחי העשרה של יעדי הגנים החזויים של ה-miRNA המשתנה באופן משמעותי, כמו גם בין המיקומים הגנומיים של DARs מרמזים על מסלולים המשפיעים על התמיינות תאי אפיתל, נדידת תאים, אינטראקציות מטריצה ​​חוץ-תאית ומסלולי איתות התפתחותיים מרכזיים כמו Wnt, Notch ו-TGF- איתות . אנו צופים בשינויים משמעותיים בנגישות בכרומטין ומציגים שורות ראיות מרובות המצביעות על שני אזורים גנומיים כמשפרים משוערים עבור הגנים Eya1 ו- Pax8 בתאי אבות נפרון. לבסוף, זיהינו שינויים עקביים בנגישות הכרומטין ובביטויי miRNA עבור 33 זוגות של miRNAs ו-DARs, כולל let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a{ {11}}p, ו-miR-9-3p, ומציגים גני מטרה משוערים המתבטאים באבות נפרון עבור miRNAs המבוטא דיפרנציאלי.

תוצאות

בידוד של אוכלוסיות תאי אבות נפרון מ-E14.5 ו-P0כליות

תאי אבות נפרוןבודדו על ידי בחירה חיובית עבור Itg 8 ב-E14.5 או ב-P0, וכל דגימה חולקה לביצוע mRNA-seq, ATAC-seq ובקרת איכות (איור משלים 1 AB). PCR כמותי (qRT-PCR) אישר כי הגנים של סמן אבות נפרון Six2 ו-Cited1 (Huang et al., 2016) באים לידי ביטוי גבוה בדגימות אבות נפרון מבודדות ביחס לכלל.כִּליָה, יותר מסמנים לסוגי תאים אחרים (כולל ניצן שופכן (Caleb) (Cebrian et al., 2{{10}}14a), תאי אנדותל (Pecan) (Kobayashi et al., 2008), סטרומה כלייתית (Pdgfr) (S. Chen et al., 2015) ושלפוחית ​​כליה (Lhx1) (Brunskill et al., 2014) (איור משלים 1 C). לגבי מין, המלטה ששימשה לדגימות E14.5 נעה בין 27 אחוז עד 50 אחוז נקבות, והמלטה לדגימות P0 נעה בין 31 אחוז ל-75 אחוז נקבה. בממוצע, דגימות E14.5 היו 38 אחוז נקבות, ודגימות P0 היו 49 אחוז נקבות (איור משלים 1 ד'). אלה מזדקנים בקפידה אוכלוסיות תאי אבות נפרון תואמות אפשרו לנו לנתחנגישות כרומטיןוביטוי RNA קטן באותם שלבי התפתחות בשתי נקודות זמן (E14.5 ו-P0).

לאבות נפרון מוקדמים ומאוחרים יש פרופילי שעתוק מיRNA ברורים

רצף RNA קטן זיהה 1,104 תעתיקי miRNA ידועים וזיהה 114 miRNA המראים שינוי משמעותי בביטוי בין דגימות E14.5 ו-P{{10}} (שיעור גילוי שגוי ( FDR)=0.05; טבלה משלימה 1). מחצית מה-miRNA שבא לידי ביטוי דיפרנציאלי מראים ביטוי מוגבר ב-P0 בהשוואה ל-E14.5, וניתוח הרכיבים העיקרי מדגיש הומוגניות רבה יותר בביטוי ה-miRNA בין דגימות E14.5 בהשוואה ל-P0 (איור 1A). התקבצות היררכית חושפת קיבוץ ברור של miRNA לאלו בעלי ביטוי גדל והולך בין E14.5 ו-P0, בהתאמה (איור 1B). בני משפחת-7 ה-miRNA הם בין ה-miRNA המבוטאים ביותר שזוהו, ואנו מציינים שכל בני המשפחה עם שינויים משמעותיים מראים ביטוי מוגבר ב-P0 (לא מוצגים נתונים). זה עולה בקנה אחד עם תוצאות המראות שהפחתה בביטוי Lin28b מובילה לעלייה רחבה בביטוי המשפחתי-7 במהלך הנפרוגנזה (Yermalovich et al., 2019). מירנאים אחרים בעלי ביטוי גבוה משמעותית ב-P0 כוללים את miR-429-3p, חבר במשפחת miR-200 הידוע כמשפיע על התמיינות פודוציטים (Z. Li et al., 2016), ושניהם miR{{30 }}a-5p ו-miR-125b-5p. שני האחרונים מהם ידועים כמדחיקים תמלילים של Lin28 בסביבות סלולריות שונות (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). miRNA עם ביטוי נמוך משמעותית ב-P0 כולל את האנגיוגנזה- (S. Wang et al., 2008) וקידום התפשטות (Schober et al., 2014) miR-126.

הכלי DIANA miRPath מאפשר ניתוח מסלול KEGG של miRNA בהתבסס על יעדי הגנים שלהם, כפי שנחזה על ידי micro T-CDS (Vlachos et al., 2015). אנו מוצאים ש-miRNA עם השינויים הגדולים ביותר בביטוי בין E14.5 ל-P0 (למעלה או למטה) הם אלו המווסתים מסלולים בעלי תפקידי מפתח בנפרוגנזה (איור 1C, איור משלים 2). לדוגמה, Tgf- מופרש על ידי תאי סטרומה שמסביב כדי לקדם התמיינות של אבות נפרון (Rowan et al., 2{{50}}18), ואנו מציינים ביטוי מופחת בקרב miRNA של אבות נפרון המתמקד במשפיענים במורד הזרם של "מסלול איתות TGF" (מסלול KEGG mmu04350, p-value 1.45e- 6). "מסלול איתות MAPK" (mmu04010) משפיע על הארגון וההתחילות של אבות נפרון להתמיינות, והוא מסדיר את האינטראקציות שלהם עם המטריצה ​​החוץ-תאית (ECM) באמצעות Itg 8 (Ihermann-Hella et al., 2018). אנו מציינים מספר משמעותי של miRNAs בוויסות מעלה ומטה המכוונים לגנים שונים במסלול איתות MAPK זה (ערכי p של 3.5e- 6 ו-3.0e- 4 עבור רשימות למעלה ולמטה, בהתאמה) . לבסוף, מסלול KEGG "אינטראקציית קולטן מטריצה ​​חוץ תאית (ECM)" (mmu04512) הוא המסלול המועשר בצורה משמעותית ביותר שזוהה, והגנים המרכיבים שלו ממוקדים בצורה משמעותית הרבה יותר על ידי miRNA שעולה בביטוי עם הזמן (p-value של 7.4e{ {32}} בין הגדלת ה-miRNA לעומת 1.1e-2 בין הירידה). גנים הקשורים ל-ECM ממוקדים על ידי כמה מה-miRNA המובעים והגדלים באופן משמעותי ביותר שאנו מזהים, כולל miR-196a-5p, miR-148a-3p, miR -125a-5p, and let-7f-5p. בפרט, miR-196a-5p הוא ה-miRNA המבוטא הגבוה ביותר בדגימות שלנו, והוא רואה עלייה של פי 8- בין E14.5 ל-P0. תעתיקי גנים שהיו היעדים החזויים של miRNA (באמצעות TargetScan (Agarwal et al., 2015)) עם ביטוי מוגבר ב-P0 כוללים את Bach2, קישור מולקולרי מוצע בין מסלולי MAPK/AP1 ו-Six2/-catenin לחידוש והבחנה עצמית באבות נפרון, בהתאמה (Hilliard et al., 2019).

כדי לזהות יעדים משוערים של miRNAs בעלי ביטוי דיפרנציאלי באבות נפרון, השתמשנו בביאור חישובי של miRNAs שסופק ב-miRDB (Y. Chen & Wang, 2020), ובאינטראקציות הניסיוניות של miRNA-mRNA מבסיס מרגמה (HY Huang et al., 2020), בשילוב עם מערך הנתונים של רצף RNA חד-תא מסוג E14.5 שנוצרו בעבר (Bais et al., 2020). לפיכך, יצרנו רשימה של אינטראקציות פוטנציאליות של miRNA-mRNA המבוססות על ביטוי דיפרנציאלי של ה-miR בין E14.5 ל-P0 באבות נפרון עם שינוי מקביל בביטוי גן היעד בין אבות נפרון מתחדשים ו-primed, כמו גם פריים ו-progenitors. מבדיל אבות נפרון (איור 2). הניתוח שלנו מצביע על כך ש-Meis2 ו-Hmga2 הם יעדים פוטנציאליים למשפחת -7 של miRNAs באבות נפרון (איור 2), עם ירידה בביטוי של Meis2 ו-Hmga2 הקשורים לביטוי מוגבר של בני משפחת -7. בהבדלים או מזדקנים של אבות נפרון. גורם השעתוק Meis2 בא לידי ביטוי חזק באבות נפרון ובסטרומה הכלייתית במהלךכִּליָההתפתחות (Lam et al., 2014), וקשורה לוויסות של שגשוג תאים בהקשרים אחרים (Abruzzese et al., 2019). Hmga2 הוא חלבון שאינו קושר לכרומטין, הוא מתבטא מאוד בתאי גזע, והוא נקשר למגוון גידולים מזנכימליים (Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014). באופן דומה, יש הגדלת ביטוי Jag1 הקשורים לירידה בביטוי של miR-34b-5p, miR-983p ו-miR-200a-3p בהבחנה או אבות נפרון מזדקנים (איור 2). Jag1 הוא ליגנד מפתח באיתות Notch שהביטוי שלו גדל ככל שאבות נפרון מתבדלים (Chung et al., 2016). כל יעדי ה-miRNA החזויים או המוערים עבור גנים עם שינויי ביטוי בין אבות נפרון מתחדשים, מתקדמים ומבדילים, זמינים ב- Supplemental.

איור 1. שינויים מהותיים בביטוי ה-miRNA בין אבות נפרון E14.5 ו-P0. א) ניתוח מרכיבים עיקריים מראה שנקודת זמן התפתחותית תורמת עיקרית לשונות ביטוי ה-miRNA. ב) מפת חום המתארת ​​ביטוי יחסי של כל ה-miRNA המשתנה באופן משמעותי. עמודות המכילות דגימות E14.5 משמאל מסומנות בירוק בהיר, ועמודות עם דגימות P0 מימין מסומנות בירוק כהה. ג) העשרה של גנים ממסלולי KEGG ספציפיים בין יעדי גנים חזויים של מירנה מווסתת מעלה ומטה (פסים אדומים וכחולים, בהתאמה). ערך ה-p המינימלי הכלול הוא 1e-5.

איור 2. אינטראקציות miRNA-mRNA עם תפקיד אפשרי בהזדקנות תאי אבות נפרון והתמיינות. מוצגים miRNA (עיגולים) ו-mRNA (ריבועים). miRNAs עם ביטוי מוגבר בין E14.5 ל-P0 מוצגים באדום, miRNAs שיורדים מוצגים בכחול. גני מטרה מוערים (מ-mirDB ו-mir TarBase) עם ביטוי הולך וגובר בין חידוש עצמי, הכנה או הבחנהתאי אבות נפרון(Bais et al., 2020) מוצגים באדום, mRNA עם ירידה בביטוי בכחול. קצוות מ-mirDB ו-mirTarDB שאינם עולים בקנה אחד עם שינויים בביטוי שנצפו הושמטו אך נכללים בטבלה משלימה 2.

לאבות נפרון מוקדמים ומאוחרים יש סביבות כרומטין ברורות

נתוני ATAC-seq מאבות נפרון E14.5 ו-P0 אפשרו לנו לזהות 46,374 אזורים של כרומטין נגיש (עם שיעור גילוי בלתי ניתן לצמצום (Boleu et al., 2015) סף של {{ 22}}.1, ראה (איור משלים 3 C, טבלה משלימה 3), בשילוב בין דוגמאות ונקודות זמן. נציין שהנתונים שלנו תואמים את הנחיות ATAC-seq של פרויקט ENCODE (ENCODE, nd) (איור משלים 3 A, ב) וכי אנו רואים שיעורי שימור מוגברים בקרב פסגות IDR מאשר בביקורות אקראיות (איור משלים 3 D). מבין ה-IDRs שאנו מדווחים, 3,576 מכילים משפרים שתועדו ב- VISTA (Visel et al., 2007) ו/או מסדי נתונים משפרים של FANTOM5 (de Rie et al., 2017) ו-13,495 מכילים רצפי DNA עם תפקידים רגולטוריים חזויים ברקמת עכבר או סוג תא אחד לפחות לפי EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020).

ניתוח רכיבים עיקריים (מותאם להבדלים בין המינים בין דגימות) גילה קיבוץ ברור של דגימות לפי נקודת זמן התפתחותית (איור 3A). כדי לזהות לוקוסים גנומיים עם שינויים בנגישות לכרומטין, השווינו את האות ATAC-seq בין דגימות E14.5 ו-P0. צפינו ב-2,103 DAR, השולטים ב-FDR ב-10 אחוז. מתוכם 1,323 (55 אחוזים) הראו נגישות מוגברת ב-P0 בהשוואה ל-E14.5, וקיבוץ היררכי חשף הבחנה ברורה בין DARs הנפתחים ונסגרים בין E14.5 ל-P0, בהתאמה (איור 3B).

טביעות רגל של גורם שעתוק זוהו באמצעות HINT והותאמו לחלבונים קושרים ל-DNA באמצעות מוטיבים ממסד הנתונים HOCOMOCO 11 (Kulakovskiy et al., 2018). בין 431 המוטיבים שנבדקו, DARs המכילים טביעות רגליים עבור מספר חלבוני גורמי שעתוק הקשורים לנפרוגנזה מראים עלייה בנגישות בין E14.5 ל-P0. מבין טביעות הרגל השוכנות ב-DAR שמגדילות את הנגישות בממוצע, שש המובילות שייכות לטביעות רגליים של גורמי תמלול המותאמות ל-Pax8 ({{10}}.15), Six2 (0.14), Cebpd (0.13), Six4 (0.13), יוני (0.12) ו-Fos (0.11). טביעות הרגל המצוינות בסגירת DARs כוללות את גורמי שעתוק E2F2 ו-E2F4, אשר ידועים כמשפיעים על התקדמות מחזור התא (Gaudet et al., 2011) וכמעודדים שגשוג תאים (D. Wang et al., 2000) בהקשרים תאיים אחרים (איור משלים). 4).

כדי להעריך את ההקשר הביולוגי של פתיחה וסגירה של DARs, השתמשנו בכלי Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool (GREAT) (McLean et al., 2010) כדי להדגיש מערכי גנים עם העשרה של אזורי כרומטין משתנים קשורים. בעזרת גישה זו, אנו מזהים תהליכים ביולוגיים של Gene Ontology (GO) הקשורים בקשר הדוק להתפתחות אבות נפרון: בפרט, התהליך המועשר ביותר מבין DARs הפותחים הוא "ויסות התמיינות תאי אפיתל" (GO:0030856, Binomial Q-value {{3 }}.5e-5), ו"וויסות חיובי של התמיינות תאי אפיתל" (GO:0030858, Binomial Q-value=5e-3) הוא בין 10 המובילים המועשרים בצורה המשמעותית ביותר ( איור משלים 5). שניהם תואמים לעלייה בנטייה של אבות נפרון לעבור מעברים מזנכימליים לאפיתל (MET) כשהם מתבדלים (S. Chen et al., 2015). מסלולים נוספים מועשרים באופן משמעותי כוללים "וויסות חיובי של נתיב איתות חריצה" (GO:0045747, Binomial Q-value=2e-5), התואם את התפקיד של איתות Notch בקידום התמיינות אב נפרון ( Chung et al., 2016). 10,083 ה-DARs הסוגרים שזוהו לא חשפו מונחי GO משמעותיים בהתבסס על קריטריוני ברירת המחדל של GREAT למשמעות (ראה איור משלים 5).

איור 3. הבדלים בנגישות הכרומטין מאפיינים את E14.5 לעומת P0תאי אבות נפרון.א) ניתוח רכיבים עיקריים של דגימות ATAC-seq מדגיש נקודות זמן התפתחותיות כמקור עיקרי לשונות. ב) מפת חום המציגה אזורי IDR המשתנים באופן משמעותי על פני דגימות ATAC-seq. דוגמאות/עמודות E14.5 מסומנות בירוק בהיר, ודגימות/עמודות P0 מסומנות בירוק כהה. ג) מונחי תהליך ביולוגי GO מועשרים עבור אזורים גנומיים הנפתחים בין E14.5 ל-P0 לפי GREAT, מדורג לפי ערך P בינומי, FDR פחות או שווה ל-0.001.

לאחר מכן, חקרנונגישות כרומטיןבאזורים של הגנום המכילים מקדמים ומשפרים לגנים בעלי תפקידים שפורסמו בהתמיינות תאי אבות נפרון. בין אלה, גורם התעתוק Six2 הוא קריטי לשמירה על ריבוי פוטנציאל שלתאי אבות נפרון(Self et al., 2006), ובכל הדגימות, צפינו בכרומטין נגיש המקיף את האמרגן שלו ומשפר Six2 ידוע ~ 50kb במעלה הזרם של Six2 אתר התחלת שעתוק (TSS) (O'Brien et al., 2018) (איור 4A, B, אזורים מוצללים כחולים). כמו כן, אנו מציינים אזורים של כרומטין נגיש על האמרגן ומשפר שפורסם עבור החלבון Gdnf (איור 4D, E), המופרש על ידי אבות נפרון כדי לקדם הסתעפות ניצני השופכן (Sanchez et al., 1996; Vega et al., 1996 ). משפר זה ממוקם ~ 113kb במעלה הזרם של מקדם הגנים וידוע כמגיב לאיתות Wnt בהקשר של פיתוח אבות נפרון (Park et al., 2012). בעוד שהמקדם עבור Gdnf לא משתנה באופן משמעותי עם הזמן, המשפר המוער מגביר משמעותית את חוסר הנגישות. אנו מציינים גם אזורים של כרומטין נגיש הסובבים משפר שפורסם פעיל באבות נפרון עבור Eya1 הממוקם ~325kb במעלה הזרם של ה-TSS של הגן (Park et al., 2012) (איור משלים 6). Eya1 הוא גורם שעתוק שמקיים אינטראקציה עם Six2 כדי לשמור על ריבוי פוטנציאל של אבות נפרון (J. Xu et al., 2014).

אנו צופים בכמה DARs שאינם חופפים תכונות רגולטוריות ידועות, אך מקיפים אזורים שצפויים להיות בעלי פעילות משפרת עבור גנים ספציפיים במגוון סוגי תאי עכברים, כפי שמצוין ב-EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020). בנוסף למשפר שפורסם של Eya1 (Park et al., 2012) (איור משלים 6), DAR סוגר באחד האינטרונים של Eya1 (איור 5A-B) מקיף אזור שצפוי להיות בעל פעילות משפרת על הגן Eya1 בעכבר תאי אבות עצביים וגרנולוציטים-מונוציטים (Gao & Qian, 2020). בהתאם להפחתה בפעילות המשפרים, ראינו בעבר שהביטוי של Eya1 מופחת באבות נפרון מבדילים באמצעות נתוני E14.5 scRNA-seq (איור משלים 7) (Bais et al., 2020). זה תואם את נתוני ה-ChIP-seq שפורסמו באבות נפרון ראשוניים מסוג E16.5 המראים חוסר בסימן המשפר הפעיל, H3K27ac, וחוסר קשירה מ-Ctnnb1, Lef1, Six2 ו-Tcf7 (איור 5) (Guo et al. ., 2021). משפר פוטנציאלי זה מכיל גם טביעות רגל של גורם שעתוק עבור Hoxd10 בשיאו, גורם שעתוק חיוני להתמיינות ואינטגרציה של אבות נפרון במהלך מעברים מזנכימליים לאפיתל (MET) (Yallowitz et al., 2011).

DAR שמגביר את חוסר הנגישות בכרומוזום 24 חופף לאזור כרומטין עם פעילות משפרת חזויה עבור גורם השעתוק Pax8 בתאים שתורבתו מכליות עכבר, אפיתליה מעיים ורחם (Gao & Qian, 2020). Pax8 מיותר חלקית עם Pax2, אך נדרש לפחות אחד משני גורמי התעתוק הללו באבות נפרון עבורכִּליָהפיתוח (Bouchard et al., 2002; Narlis et al., 2007). ראינו בעבר שביטוי Pax8 עולה באבות נפרון מובחנים ומובחנים (איור משלים 7), ואנו מציינים עלייה משמעותית בנגישות ב-DAR המקיפה תכונה רגולטורית זו. אזור זה קשור גם לסימן משפר פעיל, H3K27ac, וקשירה של Ctnnb1, Lef1, Six2 ו-Tcf7 בנתוני ChIP-seq שפורסמו מאבות נפרון ראשוניים של E16.5 (איור 5) (Guo et al., 2021). אנו צופים במספר טביעות רגל של גורמי שעתוק שנופלים בתוך שיא הנגישות השמור ביותר של DAR זה, כולל שניים עבור Sall1, גורם גרעיני הידוע כמשפיע על נפרוגנזה (Kanda et al., 2014), ושבע טביעות רגל מקובצות באופן הדוק עבור אצבע אבץ הקשורה ל-MYC חלבון (Maz), גורם שעתוק שהוכח כבעל השפעות תלויות מינון עלכִּליָההתפתחות בבני אדם ועכברים (Haller et al., 2018). טבלה משלימה 3 מכילה רשימה מלאה של האזורים הנגישים שאנו מוצאים, כמו גם סטטיסטיקות הנגישות הדיפרנציאלית שלהם, ביאורים עבור גנים, אקסונים ומקדמים שהם חופפים, ורשימות של טביעות רגל של גורמי שעתוק מפתח הקשורים לנפרוגנזה שזוהו.

איור 4. פרופילי ATAC-seq במיקומי רגולציה ידועים ומשוערים. עבור כל פאנל מלמעלה למטה, היבטים מציינים העשרה של קיפול שלנגישות כרומטיןבדוגמאות E14.5 ו-P0, כאשר IDRs ו-DARs מזוהים כהדגשים בכחול (IDR בלתי משתנה) ובירוק (פתוח DAR). ואדום (סגירת DAR). הפן הבא מתאר הערות גנים, מיקומים נוקלאוזומליים (אפור) ואזורים ללא נוקלאוזומים (אדום) שנמדדו בדגימות E14.5 ו-P0 מאוחדות, וציוני שימור PhastCon60 (שחור מציין 1{{ 12}}שימור 0 אחוז, לבן 0 אחוז נשמר. א) מקדם וגוף גנים של גורם השעתוק Six2. ב) Enhancer for Six2 שפורסם על ידי Park et. אל. ג) משפר נגיש דיפרנציאלי עבור Gdnf עם נגישות מוגברת ב-P0. ד)מקדם עבור Gdnf.

איור 5. DARs חופפים משפרים פוטנציאליים חדשים עבור גנים הקשורים לנפרוגנזה. A ו-C) לוחות מתארים מפה של אזור 1MB המקיף גן מעניין, עם גנים מקודדי חלבון בירוק והאינטראקציה המוצעת של משפר/מקדם כלולאה שחורה . B ו-D) מלמעלה למטה, לוחות מתארים העשרה של קיפולנגישות כרומטיןנמדד בדגימות E14.5 ו-P0, כאשר IDRs מסומנים בירוק (פתיחה) ואדום (סגירה), ולאחר מכן מדידות ChIP-seq באזורים אלה שנמדדו על ידי Guo et. אל. באב נפרון ראשוניתאים(Guo et al., 2021). הפאנל השלישי מתאר הערות גנים (כחול) ואלמנטים רגולטוריים חזויים מ-Enhancer Atlas 2.0 (אדום), והפאנל הרביעי מציין טביעות רגל של גורמי שעתוק שזוהו בנתוני ATAC-seq. הפאנל החמישי מתאר נוקלאוזומים (אפור) ו-NFRs (אדום), והפאנל התחתון מציין שימור. א) אזור 1MB המכיל את גוף הגן של Eya1 ומשפר Eya1 פוטנציאלי כ-325kb במעלה הזרם. ב) אזור של 4.5kb המכיל את המשפר הפוטנציאלי Eya1. ג) אזור 1MB המכיל את לוקוס הגן Pax8 ומשפר חזוי. ד) אזור של 4.5kb המכיל את המשפר החזוי ואת ה-DAR החופף שלו.

תחומים הקשורים טופולוגית עוזרים לזהות יחסי משפר פוטנציאליים-miRNA

תחומים הקשורים טופולוגית (TADs) הם אזורים בקנה מידה מגה-בסיס של ארגון כרומטין מסדר גבוה הנובעים מאריזת הכרומטין לתוך הגרעין במרחב תלת מימדי (Dixon et al., 2012), ואינטראקציות משפר-מקדם מוגבלות בדרך כלל ל אלמנטים בתוך אותו TAD (Symmons et al., 2014). הערכנו TADs מאבות נפרון באמצעות הערות שנוצרו מתאי גזע עובריים של עכברים (ESCs) (Y. Wang et al., 2018). כדי לבדוק אזורים מווסתים אפשריים של miRNA, עשינו מתאם שינויים בנגישות כרומטיןעם miRNA שבא לידי ביטוי דיפרנציאלי בתוך אותו TAD. בסך הכל, 42,778 אזורים נגישים ייחודיים (כ-92 אחוזים) ממוקמים בתוך TADs עם הערות, ומתוכם 30,626 (כ-72 אחוז) אינם חופפים למקדם ידוע. זה כולל 2,103 DAR, עם 1,180 ו-923 פתיחה וסגירה לאורך זמן, בהתאמה. 15 DARs פותחים חולקים TAD עם מיRNA אחד או יותר עם ביטוי מוגבר בין E14.5 ל-P0, ותשעה DARs סוגרים חולקים TAD עם מירנה אחד או יותר עם ירידה בביטוי. איור 6 מסכם גישה זו וממחיש מרחקים בין DARs ל-miRNA התואם שלהם, שנעים בין 27 קילו-בייטים ליותר מ-1 מגה-ביט (ממוצע: 447 קילו-בייטים). טבלה 1 מפרטת סטים של קשרי DAR - miRNA אפשריים, כאשר DAR אחד רשום לכל miRNA תואם.

בין צמדי ה-mirna-enhancer המצוינים, אנו מציינים שלושה מעניינים במיוחד. ראשית, זוהה DAR פתיחה 120 kb במורד let-7c-5p ו-73 kb במורד ה-miR-125b-5p, המשויך ל-Six2 אתר קישור במערך נתונים שפורסם בעבר ב-E16.5 nephron progenitor ChIP-seq (איור 7A) (Guo et al., 2021). Let-7c-5p הוא אחד ה-let-7 miRNAs המבוטאים ביותר שאנו מזהים, וידוע כי משפחת let-7 מדחיקה גם תעתיקי Lin28b (Slack & Ruvkun, 1997; Zhu et al., 2011). אנו מציינים כי Hmga2 ו-Meis2 מזוהים גם כמטרות חדשות פוטנציאליות של משפחת let-7 באבות נפרון (איור 2). כמו כן, הוכח כי miR-125b-5p מדכא את תעתיקי Lin28 בסוגי תאי דם ואב (Chaudhuri et al., 2012). שנית, miR-9-3p הוא ההשלמה ההפוכה ל-miR-9-5p, מירנה שהוכח לאחרונה כמגן מפניכִּליָהפיברוזיס על ידי מיקוד למסלולים מטבוליים (Fierro-Fernández et al., 2020). אנו מזהים ירידה גדולה מפי 10- בתעתיקי miR-9-3 בין אבות נפרון E14.5 ו-P0, וזיהינו אלמנט רגולטורי פוטנציאלי במרחק של כ-249kb משם (איור 7B). אנו צופים בטביעות רגל של גורמי שעתוק עבור Snai1 ו- Snai2 ב-DAR המשויך, אשר הוכחו כמקדמים מעברים אפיתל-למזנכימליים (EMT) (Sundararajan et al., 2019). לבסוף, התאמנו את miR-181a-2-3p ללוקוס cis-רגולטורי בין-גני אפשרי 131kb במעלה הזרם על כרומוזום 2, שם אנו מציינים טביעת רגל של גורם שעתוק עבור גורם השעתוק Wt1, מווסת מפתח של אב נפרון הישרדות (Kreidberg et al., 1993), ו-Six2 מקשר במערך נתונים שפורסם של E16.5 nephron progenitor ChIP-seq (איור 7C) ) (Guo et al., 2021).

טבלה 1. שינויים בביטוי miRNA, תואמים ל-DAR אחד או יותר באותו TAD.

איור 6. מציאת משפר מועמד - זוגות יעד-miRNA. א) תרשים זרימה המציין כיצד אזורי נגישות קיבלו עדיפות לרגולציה אפשרית של ביטוי ה-miRNA. ב) מיקומים גנומיים של כל מיRNA מוקרן ביחס למשפר המועמד שלהם (פס אנכי כתום). קנה המידה של השינוי בקפל ה-log2 שלהם מוצג על ציר ה-y, ו-miRNA עם ביטוי עולה או פוחת מודגשים בירוק ובאדום, בהתאמה.

איור 7. ארבעה משפרים פוטנציאליים - זוגות מירנה מטרה. TADs מודגשים באפור, מיושרים לפי נקודות התחלה, ומצוירים באותו סקאלה כדי להמחיש גודל יחסי. גנים ידועים מ-Ensembl מוצגים בסגול, ואזורים כהים יותר מציינים אקסונים. הנגישות היחסית ב-E14.5 ו-P0 מוצגת כחלקי עמודות מעל ומתחת לקו השחור האופקי, בהתאמה, כמו גם בתרשים משובצים הממחישים את ה-pileup ב-DAR שצוין יחד עם נתוני ChIP-seq שפורסמו על ידי Guo et. . אל. (Guo et al., 2021). טביעות רגל של גורם תמלול המזוהות על ידי HINT רשומות באנרים כתומים. עלילות בר בפאנלים נפרדים בצד ימין מציינים ביטוי מירנה (ירוק) ואירועי החדרת Tn5 מנורמלים באזורי משפר מוצעים (כתום). א) בן המשפחה let-7 let-7c-5p מתבטא מאוד בתאי אבות נפרוןוהוא מותאם ל"שיא_54636" במרחק של 119kb באזור בין-גני. ב) miR-9-3p מותאם למרחק של 249kb DAR. ג) miR-181a 2-3p נמצא במרחק של 131kb מ-"peak_5887", משפר בין-גני אפשרי.

דִיוּן

במחקר זה, ביקשנו לזהות בו-זמנית miRNA חדשנית התורמת להפסקת הנפרוגנזה, יחד עם מאפיינים פוטנציאליים של cis-רגולציה. זיהינו 114 miRNA שבאים לידי ביטוי דיפרנציאלי בתאי אבות נפרון, וכן 2,103 DARs, ב-E14.5 בהשוואה ל-P0כליות. אנו צופים בתכונות מרובות המנבאות משפרים משוערים חדשים עבור הגנים Eya1 ו- Pax8 בתאי אבות נפרון. לבסוף, זיהינו עקביותנגישות כרומטיןושינויי ביטוי miRNA עבור 33 זוגות של miRNA ו-DARs, כולל let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p, ו miR-9-3p, ומציגים גני מטרה משוערים המבוטאים באבות נפרון עבור miRNAs המבוטא דיפרנציאלי. יחד, הנתונים שלנו מוכיחים ששינויים מהותיים לאבות נפרון ותלויים בשלב הנפרוגנזה באים לידי ביטוי בסביבת הכרומטין של תא האב ובתעתיק ה-miRNA שלו.

בין השינויים שאנו רואים בתעתיק מיRNA של אבות הנפרון, אנו מציינים עלייה נרחבת בביטוי בכל משפחת ה-let{{0}} ככל שהאבות מתבגרים. זה עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים: חלבון Lin28b ומשפחת ה-let-7 של miRNAs נוגדים הדדית ויוצרים מתג דו-יציב השולט על ביטוי -7 של מתן ביונקים (Zhu et al., 2011), וב- אבות נפרון, המעבר לביטוי מוגבר -7 משפיע ישירות על העיתוי של הפסקת הנפרוגנזה (Yermalovich et al., 2019). אנו רואים גם ביטוי מוגבר של miR-125b-5p, הידוע גם כמדחיק ביטוי של Lin28b בהקשרים סלולריים אחרים (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). משפחת let-7 ו-miR-125b-5p הם בין 114 miRNA שמתבטאים בצורה דיפרנציאלית בין E14.5 ו-P0 באבות נפרון, מה שמרמז על תפקידם של מירנאים בהתפתחות אבות נפרונים אינו מוגבל לאפשר-7/Lin28b. לדוגמה, miRNAs אשר יורדים בביטוי כוללים שני חברים ממשפחת miR-200, אשר דווח כי היא ממלאת תפקיד בהתמיינות פודוציטים (Z. Li et al., 2016):miR-200b -3p ו-miR-429-3עמ'. בהמשך, אנו רואים ירידה בביטוי של miR-126a 5p, הידוע כמקדם כלי דם (Schober et al., 2014; S. Wang et al., 2008). זה עשוי לשקף את השושלת המזנכימלית הנפוצה של אבות כלי דם ונפרונים, ואת המחויבות של תת-קבוצה של תאים אלה להפוך לאבות נפרוניים.

ניתוחי נתיב של יעדי גנים חזויים של מיRNAs משתנים באמצעות DIANA miRPath (Vlachos et al., 2015) מראים העשרה MAPK ו-TGF- אותות, שניהם מווסתים מרכזיים של אבות נפרון (Hilliard et al., 2019; Ihermann-Hella et al., 2018 ). מספר מסלולי KEGG אחרים גם מיוצגים יתר על המידה בין יעדי הגנים החזויים של מירנאים מווסתים למעלה, כולל מסלולים הקשורים למטריצה ​​החוץ-תאית, ציטושלד האקטין והידבקות מוקדית: כל ההיבטים המכריעים של הגירה תאית, התמיינות, הסתעפות, התקשרות, קיטוב והתפשטות. (Rozario & Desimone, 2010). גנים הקשורים ל-ECM ממוקדים על ידי כמה מה-miRNAs המבוטא והגדל באופן משמעותי ביותר שאנו מזהים, כולל התמליל המבוטא הגבוה ביותר שאנו מזהים: miR-196a-5p. ידוע כי miR-196a-5p מכוון ל-Col1a1, Col1a2 ו-Col3a1 - גנים המווסתים למעלה באבות נפרונים חסרי Pax2- שעוברים התמיינות טרנסדיפרנציאטיבית לסטרומה הכלייתית (ניימן et al. אל., 2017). לפיכך, ביטוי מוגבר של miR-196a-5 עשוי להיות בעל תפקיד בחיזוק גבולות השושלת ככל שהאבות מזדקנים. יתרה מזאת, אנו מזהים אינטראקציות יעד פוטנציאליות של miRNA-mRNA שעשויות לתרום להפסקת הנפרוגנזה, כולל וויסות-על של משפחת let-7 שעשויה למקד ל-Hmga2 ו-Meis2 (הקשורים לשגשוג תאים) (Abruzzese et al. ., 2019; Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014; Mugford et al., 2009) כאשר אבות הנפרון מזדקנים. ל-Hmga2 אין תפקיד ידוע בכִּליָההתפתחות. עם זאת, מייס2 נחשב כבעל חפיפה תפקודית עם גורם השעתוק הקשור Meis1, אשר ידוע כנדרש להתפתחות הכליות (Hisa et al., 2004). אנו גם שמים לב לוויסות מטה של ​​miRs (miR-34b-5p, miR-983p ו-miR-200a-3p) שעשויים למקד Jag1, שידוע כבעל וויסות מעלה וחשוב בהתמיינות נפרונים (Chung et al., 2016).

יחד עם תעתיק ה-miRNA המשתנה, מדדנו בו-זמנית שינויים בסביבת הכרומטין של תא אבות הנפרון בין E14.5 ל-P0. אנו מתארים שני משפרים חדשים משוערים עבור Eya1 ו- Pax8, בהתבסס על (i) קרבתם למקדמי גנים אלה, (ii) השינויים שלהם בהתאמהנגישות כרומטיןבמהלך ההתפתחות בהתאם לשינויי ביטוי גנים פסאודו-זמן במהלך התמיינות, (iii) עקבות שלכִּליָההתפתחות גורמי שעתוק, (iv) שימור רצף, (v) עדות לתפקוד משפר ברקמות/סוגי תאים אחרים מ-Enhancer Atlas2.0 (Gao & Qian, 2020), ו-(vi) נתוני ChIP-seq ב-E16 .5 אבות נפרון עבור סימן של משפרים פעילים (H3K27ac) וקשירת גורם שעתוק של Ctnnb1, Lef1, Six2 ו-Tcf7. אנו רואים ירידה בנגישות הכרומטין עבור משפר Eya1, אשר עולה בקנה אחד עם תפקידו של Eya1 בקידום ריבוי פוטנציאל של אבות נפרון ועם דיווחים שאובדן של Eya1 גורם לאפיתליזציה מוקדמת של אוכלוסיית האבות (J. Xu et al., 2014; PX Xu et al., 1999). Pax8 וההומולוג שלו Pax2 תורמים למפרט שושלת של אבות נפרון (Bouchard et al., 2002), ואבות נפרון ללא לפחות אחד מהגנים הללו לא יעברו MET (Narlis et al., 2007). הנגישות המוגברת של הכרומטין שאנו מזהים עבור משפר Pax8 המשוער עולה בקנה אחד עם ביטוי מוגבר של Pax8 באפיתליה הכלייתית כאשר נפרונים מתבדלים.

ניתוח העשרה (McLean et al., 2010) של DARs חשף את "Regulation of Epithelial Differentiation" כמונח המועשר בצורה המשמעותית ביותר מבין אזורי הכרומטין הפותחים, מה שמצביע על כך שה-DARs שאנו מזהים עשויים להכיל תכונות רגולטוריות המניעות או מגיבות לאותות לבידול ופיתוח שלתאי אבות נפרוןלתוך סוגי תאי אפיתל. איתות חריץ הוא בין מונחי ה-GO המועשרים ביותר שזוהו בין DARs פותחים, ואצל אבות נפרון, ידוע שמסלול זה מדכא את ביטוי Six2 ומקדם התמיינות תאי אבות נפרון (Chung et al., 2016). בין הגנים המעורבים של מסלול זה נמצא Jag1, ליגנד מפתח באיתות Notch שדווח כי הביטוי שלו נמצא בקורלציה הפוכה לביטוי של Six2 ו-Hes1 (Chung et al., 2016). נציין ש-Jag1 הוא יעד מוער עבור שלושה miRNAs עם ביטוי הולך וגובר (miR34b-5p, miR98-3p ו-miR200a-3p, איור 2). לבסוף, אנו רואים העשרה של גנים הקשורים לשיפוץ כלי דם ולמורפוגנזה בפתיחת DARs, אם כי נראה שזו תוצאה של גנים משותפים בין מסלולי התפתחות אלה והתמיינות תאי אפיתל, כולל Jag1, Eya1, Hes1, Foxc1 ו- Hey2.

שינויים בנגישות כרומטיןביןתאי אבות נפרוןנמדדו במחקרים קודמים (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019).

בסך הכל, התוצאות שלנו עולות בקנה אחד עם מחקרים קודמים אלה, והדגישו גנים הקשורים ל-Notchsignaling ו-Pax8-. עם זאת, יש לציין כי ישנם כמה הבדלים ניסיוניים במחקרים קודמים אלה בהשוואה לדוח זה. בידוד של אבות נפרון המבטאים GFP באמצעות תא מופעל פלואורסצנציה מהעכבר הטרנסגני של Six2-TGC עשוי לבלבל על ידי הממצא שלאלל זה יש ירידה מדווחת במספר הנפרונים של כ-45 אחוזים (Hilliard et al. , 2019; Volovelsky et al., 2018). בנוסף, אבות נפרון מתורבתים (שגדלו במינון נמוך או גבוה של CHIR) הוכחו כבעלי תעתיקים שונים מאבות נפרון ראשוניים, מה שמצביע על כך שגם נגישות הכרומטין שלהם תהיה שונה (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019). מכיוון שמטרת המחקר שלנו הייתה להבין כיצד שינויים בנוף הכרומטין משפיעים על ביטוי ה-miRNA באבות נפרון מוקדמים לעומת מאוחרים, היה צורך בניתוח של אבות נפרון ראשוניים.

Cistanche עדיף לכליות

על ידי שילוב השינויים שנצפו בסביבת הכרומטין עם שינויים תואמים בביטוי ה-miRNA, אנו משלבים כמה זוגות משופרים של מירנה משוערים בהפסקת הנפרוגנזה לצורך מחקר נוסף. ה-miRNAs miR-125a-5p ו--7c-5p, למשל, רואים עלייה משמעותית בביטוי בין E14.5 ל-P0 , וזה מתאר על ידי חוסר הנגישות ההולכת וגוברת של DAR (chr16:77,719,058 77,720,407) באותו TAD. DAR זה משויך גם לאתר מקשר של Six2 (Guo et al., 2021), ועשוי לציין משפר שמשפיע על הביטוי של miR-125a-5p ו/או let{{18} }c-5p, אשר בתורו יכול לקדם בידול באמצעות הדחקה של Lin28b. באופן דומה, אנו רואים משפר אפשרי עבור miR 181a, הידוע כמאפנן ביטוי רנין בבני אדם (Marques et al., 2015) ונחשב למטרה טיפולית להפחתת רעילות נפרו בשל יכולתו לדכא BIRC6 ואפופטוזיס (Liu et al. אל., 2018). לבסוף, אנו רואים DAR סוגר הקשור ל-miR-9-3p שיש לו טביעות רגל של גורם שעתוק עבור החלבונים המגיבים לאיתות Wnt Snai1 ו-Snai2.miR-9-3p של המשלים ההפוכה, miR-9-5p, ידוע להגן מפניכִּליָהפיברוזיס (Fierro-Fernández et al., 2020), Snai1 ו-Snai2 הוכחו כמעודדים גרורות של קרצינומה בתאי סרטן עור של עכברים (Olmeda et al., 2008) ומעודדים מעברים אפיתל-למזנכימליים (EMT) בחולי סרטן (Sundararajan et al., 2019), בעוד ש-miR-9 ידוע כמקדם אנגיוגנזה והגירה של תאי אנדותל גידולים (Zhuang et al., 2012). עשוי להתקיים מנגנון שבו איתות Wnt מוגבר מביא לביטוי מופחת של Snai1 ו-Snai2, אשר בתורו מפחית את ביטוי miR-9-3p כדי לתמוך בהתמיינות של אבות נפרונים.

המחקר שלנו זיהה באופן מקיף שינויים בנוף הכרומטין ובתעתיק ה-miRNA של אבות נפרון במהלך התפתחות עוברית, וזיהינו אזורי cis-רגולציה מועמדים ו-miRNA שעשויים למלא תפקיד בהפסקת הנפרוגנזה. ניתוחי העשרה הן עבור נתוני mRNA-seq והן עבור נתוני ATAC-seq מספקים רמזים מפתים לגבי המנגנונים העשויים להיות מעורבים, כגון מסלולים המווסתים את ההתמיינות של אבות נפרון, כולל כ-Notch ו-TGF-. אנו מדווחים גם על שני אלמנטים רגולטוריים משוערים חדשים עבור Eya1 ו- Pax8, גנים הידועים כחשובים בכִּליָהפיתוח, ורצפים רגולטוריים פוטנציאליים עבור miRNA מפתח המעורבים בהפסקת הנפרוגנזה.

שיטות

זני עכברים

Wildtype CD-1 נקבות בהריון שהזדווגו בזמן התקבלו מ-Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, ארה"ב, RRID: MGI:5659424) וכןכליותwere collected from litters at embryonic day E14.5 or P0. All animals were housed in the vivarium at the Rangos Research Center at the UPMC Children's Hospital of Pittsburgh (Pittsburgh, PA, USA) and all animal experiments were carried out in accordance with the policies of the Institutional Animal Care and Use Committee at the University of Pittsburgh. The sex for each embryo or pup was identified by performing PCR on genomic DNA isolated from tail clippings using the following primers for the Y-chromosome gene Sry: SryF 5ʹ-GATGATTTGAGTGGAAATGTGAGGTA-3ʹ and SryR 5ʹ-CTTATGTTTATAGGCATGCACCATGTA-3', as previously published (McFarlane et al., 2013).

רצף וניתוח RNA קטן

סך RNA מבודד מהתאי אבות נפרוןשנותרו לאחר הסרת חלקיק התאים ATAC-seq הוגשה ל-Health Sciences Sequencing Core בבית החולים לילדים של UPMC בפיטסבורג להכנת ספרייה באמצעות ערכת ההכנה לספריית QIAseq miRNA (Qiagen 3315{{10}}2). רצף יחיד של ספריות mRNA-seq בוצע על Illumina NextSeq500, וספריות רוצו לעומק של כ-50 מיליון קריאה חד-קצה לכל ספריה. קריאות ברצף יושרו לאחר מכן לגנום mm10 של העכבר באמצעות חבילת Rsubread (Liao et al., 2019) (גרסה 2.0.1), וצוינו ל-miRNA ידוע המופיע ב-miRBase (גרסה 22) (Kozomara & Griffiths-Jones, 2014) עם פונקציית featureCounts של חבילת Rsubread. ביטוי דיפרנציאלי של miRNA ידוע נמדד באמצעות חבילת DESeq2 R (גרסה 1.26.0) (Love et al., 2014). החלק של קריאות מיושרות המובאות ל-miRNA ידוע, כמו גם חלק העוברים הנשיים לדגימה נכללו כקו-פקטורים במודל הבדיקה שהוגש ל-DESeq2. לאחר מכן זוהו miRNA שבא לידי ביטוי דיפרנציאלי תוך שליטה בשיעור הגילוי השגוי ב-5 אחוזים, וכיוון השינוי שלהם (עלייה לעומת ירידה) נקבע על סמך ערך השינוי הכפול שלהם ("עלייה" המצביע על ביטוי גבוה יותר ב-P0 בהשוואה ל-E14.5) . העשרה של מסלולים רגולטוריים בין יעדי גנים חזויים של miRNA עם הגדלת וירידה משמעותית בביטוי חושבה באמצעות כלי DIANA miRPath גרסה 3.0 (Vlachos et al., 2015). תעתיקי יעד חזויים עבור miRNA אוחזרו ממאגרי TargetScan (Agarwal et al., 2015) ו-miRDB (Y. Chen & Wang, 2020).

בידוד אב נפרון

כליותנותחו מהמלטה של ​​{{0}} עוברי E14.5 או גורי P0, וכל המלטה נחשבה לדגימה אחת. כליה אחת לדגימה שימשה לבידוד כולל של RNA כדי לשמש כ"בקרת כליה שלמה" בניתוחים הבאים (ראה להלן). בסך הכל נאספו שלוש דגימות בכל נקודת זמן. לאחר מכן בודדו תאים בקליפת המוח מכל דגימה באמצעות מיון תאים מופעל מגנטי (MACS) כפי שפורסם בעבר (Brown et al., 2011). בקצרה, הכליות עברו עיכול חלקי עם 2mM collagenase A (Roche 11088793001) ו-3.5mM pancreatin (Sigma P1625) בתמיסת מלח עם פוספט (PBS) למשך 15 דקות ב-37 מעלות. תגובת העיכול הופסקה באמצעות סרום בקר עוברי 100 אחוז קר (FBS), ותרחיף התאים נאסף והוחלף מחדש בתמיסת מלח קרה של Dulbecco (DPBS) עם 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) מעכב פרוטאז (Sigma-Aldrich 09108170910170910103709108101081010810810108108). התאים נשטפו והוקפאו מחדש במאגר בידוד קר כקרח המורכב מ-2 אחוז FBS ב-PBS, ולאחר מכן הודגרו עם חרוזים מגנטיים (ערכת Dynabeads FlowComp Flexi, ThermoFisher 11061D) ביו-טינילציה לנוגדנים עבור Integrin alpha 8 (Itg 8, R&D Systems AF4076) באמצעות ערכת תיוג חלבון ביוטין DSB-X (ThermoFisher D-20655). אבות נפרון שנקשרו לחרוזים אלה בודדו כפי שפורסם בעבר (Hemker et al., 2020) ואוחדו על פני כליות עבור כל דגימה. מנה של 50,000 תאי אבות נפרון עובד מיד דרךנגישות כרומטיןפרוטוקול הכנת הספרייה (ראה להלן), ו-RNA הכולל הופץ מתרחית התאים שנותרה באמצעות ערכת המיני Qiagen miRNeasy (Qiagen 217004).

כדי לאשר העשרה שלתאי אבות נפרוןיחסית לסוגי תאים אחרים, RNA הכולל בודד מאבות נפרון וכן משלםכליות(בקרת כליה שלמה, ראה לעיל), ו-PCR כמותי של שעתוק לאחור (qRT-PCR) עבור הסמנים הבאים בוצעו: סמני אבות nephron Six2 ו-Cited1 (L. Huang et al., 2016), ועבור Lhx1, Pdgfr, פקאן וקיילב המסמנים שלפוחית ​​כליה (Brunskill et al., 2014), סטרומה כלייתית (S. Chen et al., 2015), אנדותל (Kobayashi et al., 2008), וניצן שופכן (Cebrian et al., 2014a) ) תאים, בהתאמה; ראה גם איור משלים 1. Gapdh (Barber et al., 2005) שימש כגן משק בית וכימות יחסי חושב באמצעות שיטת 2-ΔΔCt (Livak & Schmittgen, 2001). פריימרים לתמלילים אלה כלולים בטבלה 2.

טבלה 2. פריימרים RT-PCR.

נגישות כרומטיןהכנה לספרייה

בערך 50,000תאי אבות נפרוןשימשו ליצירת כל ספריית רצף עבור ATAC-seq באמצעות ערכת הכנה לספריית Nextera DNA Flex (Illumina FC-121-1030) עם שינויים לפי שיטה שפורסמה בעבר (Buenrostro et al., 2013). בקצרה, התאים הושעו במאגר תמוגה לא-יוני קר כקרח המורכב מ-10mM Tris, 10mM NaCl, 3mM MgCl2, 1mM PMSF protease inhibitor ו-0.05% Triton X-100 בנפח למשך 10 דקות לליזה של התא. ממברנות תוך השארת ממברנות גרעיניות שלמות. גרעיני אבות נפרון שלמים הושעו מחדש במאגר טרנספוזיציה המכיל את האנזים טרנספוזז והודגרו ב-37 מעלות למשך 30 דקות. DNA גנומי חופשי ששוחרר בתהליך הטרנספוזיציה טוהר באמצעות ערכת MinElute PCR Purification (Qiagen 28004) ולאחר מכן הוכנס לאינדקס באמצעות פריימרים לאינדקס קדימה (i7) והפוך (i5) מ-Nexera Index Kit (Illumina FC-121-1011). קשירת אינדקס והגברת מקטעים הושגו באמצעות תוכנית המחזור התרמית של הגברה PCR של השיטה.

כדי לקבוע את המספר האופטימלי של מחזורי ההגברה הנדרשים עבור ספריית ATAC-seq, בוצעה תגובת לוואי qPCR באמצעות SsoAdvanced SYBR Supermix (BioRad 1725274) ו96-בוך C100 Thermal Cycler (Bio-Rad) כדי לחשב את המנורמל ערך כתב (Rn) עבור כל מחזור. מספר המחזור שבו התגובה הגיעה לשליש מהקרינה המקסימלית שלה זוהה כמספר האופטימלי של מחזורי הגברה שנותרו, והנפח הנותר של תגובת הטרנספוזיציה האינדקסית של ATAC-seq היה נתון למספר זה של מחזורים נוספים בהגברה הסופית תכנית. ספריות סופיות טוהרו באמצעות חרוזים מגנטיים של Ampure XP (Beckman Coulter A63881).

נגישות כרומטיןרצף

רצף קצה מזווג של ספריית ATAC-seq בוצע על Illumina NextSeq500 על ידי Health Sciences Sequencing Core בבית החולים לילדים UPMC של פיטסבורג, מרובב עם ריכוזי ספרייה שצפויים להניב 90 מיליון קריאות קצה מזווגות לכל דגימה . קריאות נקצצו באיכות באמצעות TrimGalore (BabrahamLab, 2014) (גרסה 0.4.3) במצב "--צימוד" ועם הגדרות ברירת מחדל אחרות. קריאות היו מיושרות לגנום mm10 (Church et al., 2011) באמצעות Bowtie2 (Langmead et al., 2009) (גרסה 2.3.1) עם ההגדרות "--local -q -X 2000 -- M". קריאות הנובעות משכפולים של PCR של אותו קטע DNA סומנו באמצעות פונקציית MarkDuplicates של Picard Tools (Broad Institute, 2016) (גרסה 2.10.9) עם הגדרות ברירת מחדל. קריאות שמופו בצורה מעורפלת ליותר ממיקום אחד בגנום הוקצו באקראי לאחד מהמיקומים הללו אם היו פחות מארבע אפשרויות, ובאופן אחר בוטלו (ENCODE, nd) (באמצעות סקריפט Python זמין בכתובת https://github. com/kundajelab/atac_dnase_pipelines, (Lee, 2017) עם ההגדרות "--paired-end -k"). Samtools (H. Li et al., 2009) (גרסה 1.3.1) שימשה לסינון קריאה משוכפלת, לא ממופה, מיותמת ומיטוכונדריה, כמו גם מיון ואינדקס של קובצי BAM. בקרת האיכות של נתוני ATAC-seq פעלה בהתאם להנחיות ה-ATAC-seq של פרויקט ENCODE (ENCODE, nd), וספריות מדגם נדגמו באופן אקראי כדי שכל אחת מהן מכילה 31 מיליון קריאה בקצה מזווג על מנת לנרמל את ההבדלים בגדלי הספרייה.

Cistanche יכול למנוע זיהום בכליות

זיהוי אזורי כרומטין נגישים

קבצי BAM המכילים קריאות ATAC-seq מסוננות הומרו לפורמט BED קצה מזווג באמצעות Bedtools' (Quinlan & Hall, 201{{20}}) (גרסה 2.26.0) 'מופצץ ' פונקציה עם הגדרות "- bed pe -mate1". אזורים של כרומטין נגיש זוהו באמצעות הכלי Based Model Analysis of ChIP-seq (MACS2, גרסה 2.1.1.20160309) אלגוריתם שיא שיחות רחב (Zhang et al., 2008), עם הגדרות "--פורמט BEDPE {{ 18}}g mm -p 0.01 --רחב --shift 37 --גודל טקסט 75 --שמור על כל --דגם". כדי לזהות אזורים נגישים בעלי בטחון גבוה, בוצעו השוואות זוגיות (של כל שילוב של עותקים מנקודת זמן נתונה) ושיעור הגילוי הבלתי ניתן לשחזור (IDR) (Q. Li et al., 2011) חושב באמצעות שימוש זמין לציבור. יישום Python (GitHub https://github.com/nboley/idr) (Boleu et al., 2015) עם הגדרות "--input-file-type broad peak --rank p.value {{ 35}}soft-IDR-threshold 0.1 --output-file-type bed". באופן ספציפי, עבור כל נקודת זמן הוגש קובץ BED משורשר של כל האזורים הנגישים באמצעות הארגומנט "--peak-list" עבור כל השוואה (לדוגמה, כאשר משווים בין שתי דגימות E14.5, כל הפסגות הרחבות של E14.5 נעשה שימוש בין שלושת ההעתקות). אזורי נגישות שהיו עקביים לפי IDR לפחות בשתי השוואות משוכפלות בזוגיות (עם מינימום של 20 אחוז חפיפה) שולבו לקבוצה מאוחדת של אזורים נגישים בעלי ביטחון גבוה ("אזורי IDR").

שינויים באזורי כרומטין נגישים

הנגישות של כל אזור IDR בתוך מדגם נתון כמתה על ידי ספירת מספר אירועי הטרנספוזיציה המתרחשים תוך נורמליזציה של רצף GC-תוכן על פני דגימות. זה הושג באמצעות סקריפט מותאם אישית (זמין במאגר התוכנה הנלווה, ראה נתונים משלימים). שינויים בנגישות זו נקבעו לאחר מכן על ידי השוואת ערכים אלו על פני נקודות זמן באמצעות חבילת התוכנה Limma-voom (גרסה 3.42.2) (Ritchie et al., 2006). כדי להסביר את מין העובר, חלק העוברים הנשיים בכל דגימה נכלל כקו-פקטור במודלים ליניאריים המשמשים לניתוח נגישות דיפרנציאלית, והוא הוסר כאפקט אצווה בהדמיות באמצעות פונקציית אפקט ההסרה של חבילת Limma. אזורים נגישים דיפרנציאליים של כרומטין (DARs) נחשבו נפתחים באופן משמעותי (נגישות מוגברת בין E14.5 ל-P0) או נסגרים (ירידה בנגישות בין E14.5 ל-P0) כאשר שולטים בשיעור הגילוי השגוי ב-10 אחוזים . ניתוחי העשרה פונקציונליים של פתיחה וסגירה של אזורים גנומיים נקבעו על ידי הגשת קואורדינטות מתאימות לכלי Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool (GREAT, זמין בכתובת http://great.stanford.edu/public/html/) (McLean et al., 2010 ). הערות של משפרים ידועים וחזויים אוחזרו ממאגרי FANTOM5 (Andersson et al., 2014), VISTA (Visel et al., 2007) ו-EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020).

טביעות רגל של גורם תמלול

טביעות רגל של גורמי שעתוק זוהו על ידי איחוד כל קבצי ה-BAM מאותה נקודת זמן, ולאחר מכן הפעלת תוכנת ה- Regulatory Genomics Toolbox (Hmm-based Identification of TF Footprints) (HINT) (גרסה 0.12.3), במיוחד מודל טביעת הרגל עבור ATAC נתונים -seq (זמינים בכתובת www.regulatory-genomics.org) (Z. Li et al., 2018). תוכנה זו הופעלה עם הגדרות "רמז ימין רמז --אורגניזם=מ"מ10 --at-seq --צמוד-קצה". טביעות הרגל סומנו לאחר מכן במוטיבים ידועים של כריכת עכבר ממסד הנתונים HOCOMOCO 11 (Kulakovskiy et al., 2018) באמצעות פונקציית התאמת המוטיבים של HINT עם ההגדרות "ניתוח מוטיב ימני תואם --אורגניזם=mm10". עקבות עם ציוני HINT מתחת ל-10 לא נכללו. לבסוף, דפוסי פעילות דיפרנציאליים בין טביעות רגל תואמות מוטיב נמדדו באמצעות הפונקציה הדיפרנציאלית של תוכנית RGT-HINT, עם הגדרות "רמז ימני דיפרנציאלי --אורגניזם=מ"מ10 --bc {{27} }NC 12 --פרופילי פלט". זוהו רמות הפעילות המשתנות באופן מובהק על סמך חיתוך ערך p של 0.05 (שיטת פרידמן-נמני).

Cistanche יכול לשפר את תפקוד הכליות

תצורה נוקלאוזומלית

קריאות מיושרות מאותה נקודת זמן אוחדו לקובץ BAM יחיד, וחבילת NucleoATAC (גרסה 0.3.4) שימשה לזיהוי דפוסים באורכי קריאה המרמזים הן על דיאדות נוקלאוזומליות קשורות והן על אזורים ללא נוקלאוזומים ( NFRs) (Schep et al., 2015). תוכנה זו הופעלה באמצעות הגדרות ברירת המחדל. נוקלאוזומים סומנו כאזור 146bp שמרכזו סביב כל אחד מהם שנקרא דיאדה נוקלאוזום.

ביטוי RNA חד תאי

נתוני ביטוי גנים חד-תאיים עובדו עבור כתב יד קודם (BioRxiv https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.16.300293v1) (Bais et al., 2020), והוחזרו מה- Gene Expression Omnibus (GEOID GSE158166). נתונים מעובדים המשולבים באיור משלים 7 כוללים סוגי תאים, רמות ביטוי גנים, הטבעות במידות נמוכות (tSNE) והערות פסאודו-זמן ביחס למסלול שנקבע בין אשכולות של אבות נפרונים מתרבים ומתבדלים. הגישה לנתונים ואורגנה באמצעות חבילת SingleCellExperiment R (Lun & Risso, 2019).

אינטראקציות של miRNA-mRNA בהזדקנות ובהתמיינות של תאי אבות נפרון

גנים בעלי ביטוי משתנה בין חידוש עצמי, הכנה והבדלהתאי אבות נפרוןהתקבלו מטבלאות משלימות 3 ו-4 שפורסמו על ידי Bais et al.. (FDR< 0.1="" for="" all="" genes,="" 99="" genes="" total).="" mirtarbase="" v8.0="" for="" the="" mouse="" was="" downloaded="" (https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/~mirtarbase/mirtarbase_2022/cache/download/8.0/mmu_mt="" i.xls)="" while="" mirdb="" version="" 6.0="" predictions="" were="" obtained="" from="" the="" mid="" b="" website="" (y.="" chen="" &="" wang,="" 2020);="" high-quality="" mirna-to-target-gene="" predicted="" interactions="" with="" a="" minimum="" score="" of="" 90="" were="" considered.="" annotated="" mir="" target="" genes="" and="" differentially="" expressed="" genes="" were="" then="" intersected="" using="" the="" r="" programming="" environment="" to="" generate="" figure="" 2="" and="" supplemental="" table="">

רצף חיסוני כרומטין באבות נפרון ראשוניים

נתוני רצף חיסוני כרומטין (ChIP-seq) עבור קישורים -catenin, Lef1, Six2 ו-Tcf7 באבות נפרון ראשוני אוחזרו מקבצי BedGraph בתוך מאגר GEO (GSE131119) עבור Guo et al., 2021. ערכי האותות הקיפול הועשרו ממוצעים על פני דגימות משוכפלות.

בדיקה לאיתור אלמנטים רגולטוריים המשפיעים על ביטוי מירנה

כדי לבדוק משפרים פוטנציאליים של miRNA, בימנו את ה-miRNA וה-DAR עם התחומים המשויכים טופולוגית (TADs) שבהם הם ממוקמים על סמך הערות mm10 מתאי גזע עובריים של עכברים, שהורדו מדפדפן הגנום התלת-ממדי (זמין בכתובת http://3dgenome .fsm.northwestern.edu/) (Y. Wang et al., 2018). אזורים שלנגישות כרומטיןו-miRNA נחשבו למשפרים מועמדים - זוגות מירנה אם הם תפסו את אותו TAD והראו שינויים עקביים בנגישות ובביטוי (הגברת הנגישות עם הגדלת ביטוי ה-miRNA ולהיפך). DARs נחשבו כ"תכונות רגולטוריות" אפשריות רק אם הם לא חופפים לקצה מקדם או אקסון ידוע. זוגות פוטנציאליים של miRNA ואלמנטים רגולטוריים משוערים קיבלו עדיפות אם הם 1) נפלו בתוך אותו TAD ו-2) חוו שינויים משמעותיים בין E14.5 ל-P0 (הגברת ביטוי ה-miRNA והגברת הנגישות לאזור IDR, ולהיפך) .

תודות

שלבי המקר ואבהה בייס תרמו לעיצוב ניסיוני. ריצוף עבור ATAC-seq ו-mRNA-seq בוצע על ידי ליבת ריצוף מדעי הבריאות בבית החולים לילדים UPMC של פיטסבורג.

אינטרסים מתחרים

לא הוכרזו אינטרסים מתחרים

מימון

AC נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לסוכרת ועיכול וכִּליָהמחלות במסגרת המכון הלאומי לבריאות (T32DK061296-17). DK נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית תחת המכון הלאומי לבריאות (R01GM115836). JH נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות במסגרת המכון הלאומי לבריאות (R01DK103776 ו-125015). DMC נתמך על ידי פרס פיתוח קריירה (NEPTUNE) למחקר תסמונת נפרוטית וממלגת פוסט-דוקטורט של מועצת המחקר המייעצת של בית החולים לילדים בפיטסבורג. YP נתמכה על ידי מענקים מבית החולים לילדים של UPMC בפיטסבורג ומהקונסורציום למחלות מיטוכונדריות בצפון אמריקה.

זמינות נתונים

משפרי עכבר חזויים אוחזרו מ-FANTOM5 (DOI: 10.1038/nature12787; קובץ זמין כאן), Vista (DOI: 10.1093/var/gkl822; קובץ זמין כאן), ו-EnhancerAtlas (DOI: 10.1093/var/gkz980 קבצים זמינים כאן); מסדי נתונים. גנום mm10 של העכבר והביאורים שלו הורדו דרך פרויקט הגנום של Illumina (זמין כאן). קובץ השרשרת העל להרמת קואורדינטות mm9 ל-mm10 אוחזר מדפדפן הגנום של UCSC (DOI: 10.1101/gr.229102; הקובץ זמין כאן). הערות TAD מתאי גזע עובריים של עכברים אוחזרו מדפדפן הגנום התלת-ממדי (DOI: 10.1186/s13059-018-1519-9; הקובץ זמין כאן). יעדי תמלול מירנה חזויים אוחזרו מ-TargetScan (DOI: 10.7554/eLife.05005, קובץ זמין כאן), ומ-miRDB גרסה 6 (DOI: 10.1093/var/gkz757, קובץ זמין כאן). נתוני ATAC-seq כולל מיקומי IDR/DAR, הערות ותוצאות העשרה דיפרנציאליות זמינים ב-GEO (GSE168339), כמו גם נתוני mRNA-seq כולל הערות ותוצאות ביטוי דיפרנציאלי (GSE168342). קוד מחשב המשמש לעיבוד וניתוח נתונים ולהפקת נתונים זמין בכתובת https://bitbucket.org/clugstonA/mirna_enhancers

בִּיבּלִיוֹגְרָפִיָה

Abruzzese, MP, Bilotta, MT, Fionda, C., Zingoni, A., Soriani, A., Petrucci, MT, Ricciardi, MR, Molfetta, R., Paolini, R., Santoni, A., & Cippitelli, M. (2019). גורם השעתוק של Homeobox MEIS2 הוא מווסת של הישרדות תאי סרטן ופעילות IMiDs במיאלומה נפוצה: אפנון על ידי Bromodomain ומעכבי חלבון Extra-Terminal (BET). מוות ומחלות תאים, 10(4). https://doi.org/10.1038/s41419-019-1562-9

Agarwal, V., Bell, GW, Nam, JW, & Bartel, DP (2015). חיזוי אתרי יעד יעילים של microRNA ב-mRNA של יונקים. ELife. https://doi.org/10.7554/eLife.05005

Andersson, R., Gebhard, C., Miguel-Escalada, I., Hoof, I., Bornholdt, J., Boyd, M., Chen, Y., Zhao, X., Schmidl, C., Suzuki, T. ., Ntini, E., Arner, E., Valen, E., Li, K., Schwarzfischer, L., Glatz, D., Raithel, J., Lilje, B., Rapin, N., … Sandelin, א' (2014). אטלס של משפרים פעילים על פני סוגי ורקמות של תאים אנושיים. טבע, 507(7493), 455–461. https://doi.org/10.1038/nature12787

בברהם לאב. (2014). לקצץ בשפע. בביואינפורמטיקה. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_בשפע

Bais, AS, Cerqueira, DM, Clugston, AS, Ho, J., & Kostka, D. (2020). ריצוף RNA חד-תא חושף פעילות דיפרנציאלית של מחזור התא באוכלוסיות תאים מפתח במהלך נפרוגנזה. BioRxiv. https://doi.org/https://doi.org/10.1101/2020.09.16.300293

Barber, RD, Harmer, DW, Coleman, RA, & Clark, BJ (2005). GAPDH כגן משק בית: ניתוח ביטוי GAPDH mRNA בפאנל של 72 רקמות אנושיות. גנומיקה פיזיולוגית. https://doi.org/10.1152/physiolgenomics.00025.2005

ברטל, DP (2009). זיהוי מטרות ופונקציות רגולטוריות של MicroRNA. תא, 136(2), 215–233. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.01.002.MicroRNA

Bertram, JF, Douglas-Denton, RN, Diouf, B., Hughson, MD, & Hoy, WE (2011). מספר נפרון אנושי: השלכות על בריאות ומחלות. נפרולוגיה ילדים, 26(9), 1529–1533. https://doi.org/10.1007/s00467-011-1843-8

Boleu, N., Kundaje, A., Bickel, PJ, & Li, Q. (2015). קצב גילוי בלתי ניתן לשחזור (2.0.3). https://github.com/nboley/idr

Bouchard, M., Souabni, A., Mandler, M., Neubüser, A., & Busslinger, M. (2002). מפרט שושלת נפרי של Pax2 ו- Pax8. גנים והתפתחות. https://doi.org/10.1101/gad.240102

..............

מתוך: Journal Pre-proof

2021 פורסם על ידי Elsevier Inc.