שלפוחיות חיידקים חוסמות שכפול ויראלי במקרופגים באמצעות ציר TLR4-TRIF

תַקצִיר

חיידקים גראם שליליים מפרישים באופן טבעי שלפוחיות קרום חיצוני בגודל ננו (OMVs), שהם מתווכים חשובים של תקשורת ופתוגנזה. קליטת OMV על ידי תאי מארח מפעילה איתות TLR באמצעות PAMPs מועברים. בתור תאי חיסון חשובים, מקרופאגים מכתשיים ממוקמים בממשק האוויר-רקמת האוויר שבו הם מהווים את קו ההגנה הראשון מפני מיקרואורגניזמים וחלקיקים בשאיפה. עד כה, מעט ידוע על יחסי הגומלין בין מקרופאגים מכתשית לבין OMVs מחיידקים פתוגניים. התגובה החיסונית ל-OMVs ולמנגנונים הבסיסיים עדיין חמקמקה. כאן, חקרנו את התגובה של מקרופאגים אנושיים ראשוניים לשלפוחית ​​חיידקים (Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella enterica, Streptococcus pneumoniae) וצפינו בהפעלה דומה של NF-κB בכל השלפוחיות שנבדקו. לעומת זאת, אנו מתארים איתות IFN דיפרנציאלי מסוג I עם זרחון ממושך של STAT1 ואינדוקציה חזקה של Mx1, החוסם שכפול וירוס שפעת A רק עבור OMVs Klebsiella, E.coli ו- Salmonella. השפעות אנטי-ויראליות הנגרמות על ידי OMV היו פחות בולטות עבור OMVs Clear coli ללא אנדוטוקסין ו-OMV שטופלו ב- Polymyxin. גירוי LPS לא יכול לחקות את המצב האנטי-ויראלי הזה, בעוד שנוקאאוט TRIF ביטל אותו. חשוב לציין, סופרנטנט ממקרופאגים שטופלו ב-OMV גרם לתגובה אנטי-ויראלית בתאי אפיתל מכתשית (AEC), מה שמרמז על תקשורת בין-תאית הנגרמת על-ידי OMV. לבסוף, התוצאות אושרו במודל זיהום ex vivo עם רקמת ריאה אנושית ראשונית. לסיכום, Klebsiella, E.coli ו-OMVs Salmonella מעוררים חסינות אנטי-ויראלית במקרופאגים באמצעות איתות TLR4-TRIF להפחתת שכפול ויראלי במקרופאגים, AECs ורקמת ריאה. חיידקים גראם-שליליים אלו מעוררים חסינות אנטי-ויראלית בריאה באמצעות OMVs, עם השפעה מכרעת ועצומה על תוצאות זיהום משותף של חיידקים וויראליים.

מערכת חיסון מגבירה צמח cistanche

מילות מפתח

שלפוחיות חוץ-תאיות, שלפוחיות קרום חיצוני, זיהום משותף של חיידקים ונגיפים, דלקת ריאות, מקרופאג, תא אפיתל Alveolar, חסינות מולדת אנטי-ויראלית

מבוא

שלפוחיות ממברנה חיצוניות (OMVs) משתחררות באופן טבעי על ידי חיידקים גרם שליליים, שקוטרם מגיע עד 300 ננומטר. חיידקים גראם חיוביים מסוגלים באותה מידה לשחרר שלפוחיות ממברנה (MVs). כתוצאה מהביוגנזה שלהם, מבני קרום שומנים דו-שכבתיים אלה מכילים, בנוסף לתוכן הפריפלסמי, מרכיבים עיקריים של הממברנה החיידקית (החיצונית) כגון שומנים, חלבונים, ובמקרה של חיידקים גרם-שליליים, ליפופוליסכרידים (LPS) [1]. בנוסף לתפקידם בתקשורת חיידקית, OMVs נקשרו להשפעות פתוגניות ולהובלה של גורמי ארסיות, למשל VacA מהליקובקטר פילורי, רעלן Shiga מ-Shigella dysenteriae או ClyA מ-Escherichia coli enterohemorrhagic [2]. הוכחו OMVs אלה לתמרן תאי אפיתל ותגובות חיסוניות. הנוכחות של אנדוטוקסין חיידקי על פני השטח של OMV יחד עם דפוסים מולקולריים מועברים אחרים הקשורים לפתוגן (PAMPs) הופכים אותם לממריצים חזקים לתאי מערכת החיסון, שכן הם עדיין ניתנים לזיהוי על ידי הקולטנים שלהם [3]. מעורבותם של קולטנים מסוג Tolllike (TLR) וקולטנים דמויי Nod בתאי חיסון מולדים יכולים לעורר שחרור של ציטוקינים פרו-דלקתיים ואימונו-רגולטוריים, כולל גיוס נויטרופילים או הפרעה של צמתים הדוקים בשכבות תאי אפיתל [4]. סוג תאי חיסון חשוב אחד בריאה הוא מקרופאגים מכתשי (AMs), השוכנים בממשק האוויר-רקמות במככיות. באמצעות בליעה של חלקיקים בשאיפה, AMs מייצגים את קו ההגנה הראשון מפני מיקרואורגניזמים וחלקיקים על ידי phagocytosis והשפלה. בעת מפגש עם פתוגנים, מקרופאגים מציגים אנטיגנים לתאי חיסון אדפטיביים ומשחררים ציטוקינים פרו-דלקתיים. לפיכך, הם יכולים לפעול על תאי אפיתל מכתשית מסוג I ו-II (AECs) ותאי חיסון אחרים (קובץ נוסף 1: איור S1A). ניתן להפעיל AMs על ידי מספר PAMPs כדי לגרום לאיתות תוך תאי ואינדוקציה של דפוסי ביטוי גנים שונים באמצעות קולטנים חיסוניים מגוונים [5, 6], מה שמוביל לאיתות MyD88 או TRIF, אשר שניהם, בתורם, מעוררים תת-קבוצות שונות של גנים (קובץ נוסף 1 : איור S1B). יתר על כן, הם ממלאים פונקציות אחרות בהומאוסטזיס ריאתי ופתוגנזה, מה שהופך אותם למרכז איתות מרכזי ומתזמר בחסינות הריאות. נגיפי השפעת שייכים למשפחת ה-Orthomyxoviridae וגורמים לזיהומים בדרכי הנשימה העליונות והתחתונה, החל ממקרים קלים ועד חמורים. בעוד שרוב זיהומי וירוס השפעת העונתיים מגבילים את עצמם, חלק מהחולים מפתחים דלקת ריאות ותסמונת מצוקה נשימתית חריפה, אשר מוערכות לגרום לעד 650,000 מקרי מוות שנתיים ברחבי העולם [7]. וירוס שפעת A (IAV) מדביק בעיקר תאי אפיתל בדרכי הנשימה ומשתכפל בהם. הזיהום הנגיפי מוביל להפעלה ואיתות של קולטן לזיהוי דפוסים (PRR) באמצעות מספר גורמי שעתוק, כלומר גורם גרעיני kappa B (NF-κB) וגורם רגולטורי אינטרפרון (IRF)-3/7, אשר גורמים לסוג I ו-III ייצור אינטרפרונים (IFN). תגובת IFN בולטת זו גורמת כתוצאה מכך ל"מצב אנטי-ויראלי" תאי באופן אוטומטי ופרקריני [8]. בנוסף, מספר ציטוקינים וכימוקינים אחרים מופרשים עם זיהום. רשת הציטוקינים של הגנת המארח המווסתת היטב מגייסת אוכלוסיות של תאים חיסוניים לאתר הזיהום ומתזמרת תגובות חיסוניות מולדות ומסתגלות [9]. עם זאת, IAV יכול גם להדביק AMs, וכתוצאה מכך מספר מופחת דרסטי של AMs במהלך זיהום חריף, אשר צריך להקים מחדש כדי לפתור את הזיהום. ההפעלה של תאי חיסון מולדים והפרשת ציטוקינים מעודדי דלקת מובילים לגיוס של תאים מולדים נוספים, שליטה בזיהום ואיתחול תיקון רקמות [10, 11]. כאן אנו מנתחים את התגובה של מקרופאגים לשלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות והשפעתם על זיהום IAV שלאחר מכן.

יתרונות תוסף cistanche-איך לחזק את המערכת החיסונית

לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Enhance Immunity

【בקש עוד】 דוא"ל:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

חומר ושיטות

כימיקלים ונוגדנים

המדיום F12 של Ham הושג מ-GE Healthcare Europe (פרייבורג, גרמניה). RPMI-1640, DMEM, GlutaMAX, Penicillin/Streptomycin ו-FCS נרכשו מ-Life Technologies (Darmstadt, גרמניה). PBS נרכשה מחברת Capricorn Scientific GmbH (Ebsdorfergrund, גרמניה). Opti-MEM הושג מ-Thermo Fisher Scientific (פרנקפורט, גרמניה). Phorbol 12-myristat 13-אצטט (PMA) סופק על ידי Sigma-Aldrich Chemie (מינכן, גרמניה). LPS (Salmonella Minnesota R595, כיתה TLR) התקבל מ-Enzo Life Sciences (Lausen, שוויץ). Pam3CSK4 נרכש מ-Invivogen (סן דייגו, ארה"ב). מעכב JAK Ruxolitinib הושג מ-Biozol Diagnostics Vertrieb GmbH (Eching, גרמניה). Polymyxin B נרכש מ- Merck Millipore (Billerica, ארה"ב). נוגדנים התקבלו מ-Abcam (קיימברידג', בריטניה): Mx1 (ab95926), נוקלאופרוטאין שפעת (9G8); איתות תאים (קיימברידג', בריטניה): phospho-IRF-3 (Ser396)(4D4G), phospho-TBK-1 (Ser172)(D52C2), TBK-1 (61223S), phospho- STAT1 (Tyr)(58D6), STAT1 (D1K9Y), עכבר נגד ארנב (L27A9), IRAK-1 (4359S), phospho-p38 (Tr180/Tyr182)(9211S), p38 (9212S); Thermo Fisher Scientific: עז נגד עכבר (אלכסה עבור 488); ProteinTech: anti-IRF-3 (66670-1) או סנטה קרוז ביוטכנולוגיה (היידלברג, גרמניה): -אקטין (C4), אנטי-עכבר (mIgGκBPHRP, sc-516102). כל שאר הכימיקלים המיושמים היו בדרגה אנליטית ונרכשו ממקורות מסחריים.

תרבית חיידקים והכנת OMV/MV

זן L. pneumophila Corby wildtype טופל כפי שתואר קודם [12]. K. pneumoniae (#700721/ MGH78578), E.coli (#25922), ו-S. enterica serovar Typhimurium (#14028) התקבלו מאוסף American Type Culture (Rockville, MD, ארה"ב). ClearColi™ BL21 היה מבית BioCat GmbH (Heidelberg, גרמניה). S. pneumoniae D39 Δcps סופקו בחביבות על ידי Sven Hammerschmidt. חיידקים גודלו על לוחות אגר למשך הלילה (MacConkey: Kp, Ec, Sal; LB: Clear coli; לוחות אגר דם: Sp) ולאחר מכן שימשו לחיסון מדיה נוזלית (LB: Kp, Ec, Sal, Clear coli; THY: Sp) . חיידקים גודלו עד לשלב הלוגריתמי המאוחר ב-37 מעלות תחת ניעור מתמיד (MaxQ 6000, Thermo Fisher Scientific, Karlsruhe, גרמניה; למעט Sp). לאחר מכן נסחררו תרביות חיידקים שלוש פעמים (4,500×g, 15 דקות, 4 מעלות; Multifuge X3R, Thermo Fisher Scientific). שאר החיידקים הוסרו על ידי סינון סטרילי דרך נקבוביות של 0.22 מיקרון. הסופרנטנט רוכז עם מסנני חיתוך במשקל מולקולרי של 100 kDa (Merck KGaA, Darmstadt, גרמניה) והשלפוחיות טוהרו על ידי אולטרה צנטריפוגה או על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC). עבור אולטרה-צנטריפוגה, הסופרנטנט עבר אולטרה-צנטריפוגה ב-100,000×g, 3 שעות, 4 מעלות. לאחר שטיפת גלולת ה-OMV/MV שהתקבלה עם PBS סטרילי, חזרה על אולטרה-צנטריפוגה וכדורית השלפוחית ​​הומסה ב-PBS סטרילית. תכולת החלבון נקבעה על ידי ערכת בדיקת חלבון Pierce BCA לפי הוראות היצרן (Thermo Fisher Scientific), וכמויות חלבון שוות שימשו לניסויי גירוי. עבור SEC, הסופרנטנט רוכז ל-500 µL והועמס על עמודות מקוריות / 70 ננומטר Gen 2 (IZON Science LTD, ליון, צרפת), אשר נשטפו מראש ב-10 מ"ל PBS לפי פרוטוקול היצרן. שלפוחיות נחלקו באמצעות PBS סטרילי ונאספו חלקים של 500 μL. שלפוחיות נפלטו בשברים 7-12, אשר נקבעה על ידי ציטומטריית ננו-זרימה (nFCM; NanoFCM Co., Ltd, Nottingham, UK). השברים המכילים שלפוחית ​​מאוחדת רוכזו ל-200-400 μL באמצעות מסנני חיתוך משקל מולקולרי (Merck KGaA). ריכוז השלפוחית ​​של כל ההכנות נקבע על ידי nFCM וכמויות שוות של שלפוחיות שימשו לניסויי גירוי. הכנת OMV/MV של שתי שיטות הטיהור נבדקה לאיתור חיידקים מזהמים על ידי ציפוי ואחסון במנות בדרגה -20.

NFC

עבור nFCM כיוול מנתח ננו, (NanoFCM Co., Ltd, Nottingham, בריטניה) המצויד בלייזר 488 ננומטר עם חרוזי פוליסטירן 200 ננומטר (NanoFCM Co.) עם ריכוז מוגדר של 2.08×10^8 חלקיקים/ מ"ל ​​ומשמשים גם כאסמכתא לריכוז החלקיקים. בנוסף, חרוזי סיליקה מונודיפרסים (NanoFCM Co.) בארבעה גדלים שונים שימשו כתקן ייחוס לגודל כדי לכייל את גודל השלפוחיות. 1×PBS שעבר סינון טרי (0.1 מיקרומטר) נותח כאות רקע והופחתו משאר המדידות. כל היסטוגרמת הפצה או עלילת נקודות נגזרה מנתונים שנאספו במשך דקה אחת עם לחץ מדגם של 1 kPa. דגימות OMV דוללו עם סינון (0.1 מיקרומטר) 1×PBS, וכתוצאה מכך ספירת חלקיקים בטווח האופטימלי של 2,500-12,000 אירועים. ריכוז החלקיקים והתפלגות הגודל חושבו באמצעות תוכנת nFCM (NF Profession V1.08).

מיקרוסקופ אלקטרונים העברה (TEM)

רשתות נחושת מצופות פחמן (400 mesh) עברו הידרופיליזציה על ידי פריקת זוהר (PELCO easiGlow, Ted Pella, ארה"ב). חמישה μL של דגימות הוחלו על הרשתות ההידרופיליות, והוצבעו ב-2% (w/v) אורניל אצטט לאחר שלב כביסה קצר עם מים מזוקקים כפולים. דגימות נותחו עם מיקרוסקופ אלקטרוני תמסורת JEOL JEM-2100 תוך שימוש במתח תאוצה של 120 קילו וולט. התמונות נרכשו עם מצלמת F214 FastScan CCD (TVIPS, Gauting, גרמניה).

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

תרבית תאים

קווי תאים אנושיים (THP-1, A549, BEAS2B, Calu-3, HCC827) התקבלו מ-American Type Culture Collection. תאי Madin-Darby Canine Kidney II (MDCK II) נרכשו מ-ECACC-Sigma-Aldrich (Darmstadt, גרמניה). תאי THP-1 Dual™ (Dual) ו-THP-1 Dual™ TRIF-KO (TRIF-/−) נרכשו מ-Invivogen Europe (טולוז, צרפת). תאים טופחו ב-Ham's F12, DMEM או RPMI-1640 בתוספת של 1 מ"מ נתרן פירובט, 2 מ"ל גלוטמין וכן 10% FCS מושבת בחום בתנאי תרבית תאים. תאי THP-1 Dual™ טופחו ב-RPMI-1640 בתוספת 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 2 מ"מ גלוטמין, 10% FCS מושבתת בחום, 100 מיקרוגרם/מ"ל Normocin™ ו-25 מ"ל חיץ HEPES. תאי THP-1, Dual ו-TRIF−/− התמיינו בתאים דמויי מקרופאג על ידי תוספת של 20 ננומטר PMA למשך 24 שעות.

שיבוט של Mx1 לוקטור SparQ

רצף הקידוד של Mx1 נוצר מ-THP-1 cDNA על ידי Phusion PCR באמצעות Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, Ipswich, ארה"ב) לפי הוראות היצרן. HAtag נוסף על ידי איחוי רצף ה-HA ל-Reverse primer (חוש: 5'-atcggaTTCGAAATGGTTGTT TCCGAAGTGGAC-3', antisense: 5'-tccgatGCGGCC GCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGAACTGTAA}CGGAACATCGTATGGACTG מקטע ה-PCR כמו גם וקטור SparQ (Addgene, Watertown, ארה"ב) עוכלו עם אנזימי הגבלה BstbI ו-NotI (Thermo Fisher Scientific) וקשרו עם T4 DNA Ligase (New England Biolabs) לוקטור SparQ.

טרנספקציה של תאי HEK293T וייצור Lentivirus

תאי HEK293T הועברו טרנספקציה עם וקטור SparQ מדולל ב-Opti-MEM המכיל את הרצף של Mx1 ורצף GFP, וקטור האריזה הנגיפית psPAX2 ופלסמיד המעטפת pVSV-G (Addgene) עם Lipofectamine 2000 (Thermo) Fisher Scientific) לפי פרוטוקול היצרן. Lentivirus הופק וסופרנטנט המכיל וירוס נאסף כל יום במשך 72 שעות. הסופרנטנט סונן באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר ותאי THP -1 הועברו (ראה להלן). וקטור SparQ ריק ללא רצף Mx1 שימש להמרה של תאים ליצירת קו תא בקרה תואם (VC=בקרת וקטור).

התמרה של תאי THP-1

תאי THP-1 הועברו עם ה-lentivirus מהסופרנטנט המסונן של תרבית התאים HEK293T (ראה לעיל). Polybrene (4 מיקרוגרם/מ"ל, Sigma-Aldrich) נוספה כדי לשפר את יעילות ההמרה. תאים הודגרו למשך עד שישה ימים. תאים חיוביים ל-GFP מוינו על ידי ציטומטריית זרימה.

בידוד ובידול של BDMs

מונוציטים אנושיים מתורמים בריאים בודדו על ידי בחירה חיובית CD14 מגנטית מתאי דם מונו-גרעיניים היקפיים והתמיינו למקרופאגים שמקורם בדם (BDM) בנוכחות 1% ABserum אנושי כפי שתואר קודם [13].

גירוי OMV/MV של מקרופאגים

מקרופאגים אנושיים ראשוניים או תאי THP-1 מודגרים עם OMVs/MVs מטוהרים (1 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד עבור שלפוחיות מטוהרות באמצעות אולטרה-צנטריפוגה וריבוי שלפוחיות (MOV) של 1,000 עבור SEC מטוהרים שלפוחיות) עד 20 שעות במדיה שלמה. יישום מעכב נוסף בוצע שעה אחת לפני הטיפול בשלפוחית. מקרופאגים מגורים של Te שימשו לבידוד חלבון או RNA או לניסויי זיהום לאחר מכן. הסופרנטנט המכיל ציטוקינים שהתקבל שימש לניתוח ELISA או LDH או סינון סטרילי והשתמש בו לגירוי תאי אפיתל.

טיהור וירוסים וטיטרציה של וירוסים

טיהור וירוסים וטיטרציה של וירוסים בוצעו בתאי MDCK II כמתואר קודם [14]. הטיטר הנגיפי נקבע על ידי בדיקת פלאק כפי שתואר קודם לכן [15]. בקצרה, תאי MDCK II משולבים הודבקו בווירוס מדולל סדרתי או בסופרנטנט של רקמות (במדיום תרבית MDCK II ללא FCS). הנגיף הורשה לספוח לתאים למשך שעה אחת ב-37 מעלות. 10, החיסון הוחלף בחומר טרי (בתוספת של 1 ug/mL טריפסין שטופל ב-TPCK (עבור IAV) ו-1% Avicel® PH-101 (Sigma-Aldrich)). תאי MDCK II נצבעו בסגול קריסטל או תאים נגועים בווירוס נצבעו בנוגדן ראשוני (1:2,000) (נוקלאופרוטאין אנטי-שפעת עכברים, MCA400, Bio-Rad, גרמניה) והנוגדן המשני ( 1:4,000) (Goat Anti-Mouse IgGHRP, 170–6516, Bio-Rad, Germany) לבדיקת פלאק. הפלאקים נספרו ידנית והובאו כיחידות יוצרות פלאק (pfu) למ"ל.

יתרונות cistanche לגברים מחזקים את המערכת החיסונית

הידבקות בנגיף

לאחר 20 שעות גירוי קדם עם שלפוחית ​​חיידקים או סופרנטנט המכיל ציטוקינים, תאים נדבקו ב-IAV או בנגיף סטומטיטיס שלפוחית ​​(VSV). מקרופאגים נדבקו ב-H1N1 (A/WSN/33) או ב-VSV, בעוד שתאי אפיתל נדבקו ב-H1N1 (A/Hamburg/2009/PDM) שניהם במדיה טרייה ללא FCS. לאחר 1 שעה של חיסון, הוסר הנגיף החופשי והמדיה הוחלפה במדיה המכילה TPCK-טריפסין עבור IAV או מדיה ריקה עבור VSV. תאים הודגרו למשך עד 48 שעות כדי לאפשר שכפול רב מחזורי.

הכנת PCLS אנושי

רקמת ריאה נרכשה מחולים שעברו כריתת אונה עקב סרטן ריאות בבית הספר לרפואה בהנובר (MHH, Hannover, גרמניה). לניסויים נעשה שימוש רק ברקמות מחלקים נטולי מחלות מקרוסקופיים ומיקרוסקופיים של הריאה. פרוסות ריאה חתוכות בצורה מדויקת (PCLS) הוכנו כמתואר קודם [16]. שתי פרוסות רקמה לבאר טופחו בצלחת 24-באר בתנאים שקועים (DMEM/F12 בתוספת 1% פניצילין/סטרפטומיצין) ב-37 מעלות, 5% CO2 למשך הלילה.

זיהום IAV של PCLS

PCLS עוררו עם 1 מיקרוגרם/מ"ל של OMVs שטוהרו מ-L. pneumophila או K. pneumoniae מדולל ב-DMEM/F12 בתוספת 1% פניצילין/סטרפטומיצין ב-37 מעלות, 5% CO2 למשך 20 שעות. המדיה הוסרה ו-PCLS חוסן ב-25,000 pfu/באר ב-250 µL של וירוס השפעת A/California/04/2009(H1N1pdm). PCLS הודגרה ב-35 מעלות ונדנדה כל 15 דקות במהלך החיסון כדי לאפשר הדבקה הומוגנית בנגיף. לאחר מכן, החיסון נזרק והוחלף ב-DMEM/F12 בתוספת 1% פניצילין/סטרפטומיצין. לאחר דגירה של 48 שעות, הסופרנטנט נאסף לזיהוי וירוסים, שחרור LDH וכימות ציטוקינים. דגימות למדידות הציטוקינים נוספו עם קוקטייל מעכבי פרוטאז של 0.2% (P1860, Sigma-Aldrich, מינכן, גרמניה) ואוחסנו ב-80 מעלות עד לניתוח. PCLS הוקפאו ואוחסנו ב-80 מעלות עד לטיהור RNA כפי שתואר קודם [17].

LDH

בדיקת שחרור LDH בוצעה על פי הוראות היצרן באמצעות ערכת בדיקת ציטוטוקסיות ציטוטוקסיות של Pierce™ LDH המתקבלת מ-Roche (מנהיים, גרמניה) או Cytotoxicity Detection KitPLUS (LDH) (Roche, Merck). הספיגה נמדדה באמצעות קורא microplate infinite F200Pro (Tecan, Männedorf, שוויץ).

אליסה

ציטוקינים CXCL8/IL-8, CXCL10/IP-10 ו-IL-1 כומתו מסופרנטנט נטול תאים באמצעות ערכות ELISA זמינות מסחרית (R&D Systems, ויסבאדן, גרמניה) לפי הוראות היצרן הוראות.

בדיקת QUANTI‑blue™

לקביעת פעילות הכתב של SEAP בסופרנטנט של תרבית תאים מתאי THP-1 Dual ותאי TRIF-/− התואמים, בדיקת QUANTI-Blue™ בוצעה לפי פרוטוקול היצרן. בקצרה, סופרנטנט של תרבית תאים נאסף לאחר גירוי של תאים עם OMVs. תחילה, QUANTI-Blue™ Solution וסופרנטנט של תרבית תאים הוזרקו בצלחת עם תחתית שומן 96-. לאחר דגירה ב-37 מעלות למשך 150 דקות, נקבעה צפיפות אופטית ב-630 ננומטר בקורא microplate infinite F200Pro.

מבחן QUANTI‑luc™

כדי לקבוע את פעילות הכתב של Lucia luciferase בסופרנטנט של תרבית תאים מתאי THP{0}} Dual™ ותאי TRIF-/− התואמים, בדיקת QUANTI-Luc™ בוצעה לפי פרוטוקול היצרן. בקצרה, סופרנטנט של תרבית תאים הופרש בצלחת לבנה עם תחתית שומן 96-(BRAND GmbH & Co. KG, Wertheim, גרמניה). נוספה תמיסת מבחני QUANTI-Luc™ ומדידת זוהר בוצעה מיד עם זמן קריאה של 0.1 שניות בקורא מיקרופליט אינסופי F200Pro.

כתם מערבי

לקביעת ביטוי חלבון או זרחון, Western Blot בוצע כפי שתואר קודם [18].

הכנת RNA ו-PCR בזמן אמת

לצורך ניתוח ביטוי גנים, בידוד RNA בוצע על ידי מיצוי פנול-כלורופורם ותעתוק הפוך כפי שתואר קודם לכן [12]. לאחר מכן בוצע PCR כמותי בזמן אמת ב-ViiA7 (Thermo Fisher Scientific) עם Luna Universal qPCR Master Mix (New England BioLabs) וזוגות פריימרים ספציפיים. על ידי שימוש בשיטת 2−ΔΔCT [19], חושבה אינדוקציה של פי x והתוצאות נורמלו לתאי בקרה מתאימים. 18S: fwd: 5'-GACTCTTTCGAGGCCCTGTA-3', rev: 5'-CACCAGACTTGCCCTCCAAT-3' CXCL8: fwd: 5'-ACTGAGAGTGATTGAGAG TGGAC{{17} rev. {20}}' IFI44: fwd: 5'-TATCCAGACAGAGCAGCTACC-3', rev: 5'-ATAGAGAAGGCTAAGCCGCTTC-3' IFIT1: fwd: 5'-ATGCAGGAAGAACAT: 5'-ATGCAGGAAGAACAT:5'-ATGCAGGAAGAACAT:5 ′-TCTGGACACTCCATTCTATAGCG-3′ IFNA1: fwd: 5'-ACAGGAGGACCTTGATGCTC-3′, rev: 5'-TCTGCTGGATCAGCTCATGG-3′ IFNBCATG5: fwd:{100}{101} , rev: 5'-TGTCCTTGAGGCAGTATTCAAG-3' IL1B: fwd: 5'-AGCTCGCCAGTGAAATGATGG-3', rev: 5'-CAGGTCCTGGAAGGAGCACTTC-3′IL1BAGG:fCAGT:′CAGT:fCAGTGATG 58}}', rev: 5'-CACCATTTCTCCAGGGGCAT-3' Mx1: fwd: 5'-GGGCTTTGGAATTCTGTGGC-3', rev: 5'-CCTTGGAATGGTGGCTGGAT{{68}:'5NP} -GAAATTTCAAACAGCTGCACAAAG -3', rev: 5'-AATATGAGTGCAGACCGTGC-3' RPS18: fwd: 5'-GCGGCGGAAAATAGCCTTTG-3′, rev: 5'{CCGTT-GATCACAT}

אימונופלואורסצנטי

תאי THP{{0}} הובחנו על גבי כיסויים על ידי תוספת של 20 nM PMA והודגרו עם OMVs/MVs למשך 20 שעות. תאים הודבקו לאחר מכן ב-H1N1 (A/WSN/33; ריבוי הזיהום (MOI) 0.1) למשך 4 שעות. לאחר קיבוע של 15 דקות עם 3% פרפורמלדהיד, השקופיות נשטפו שלוש פעמים עם PBS וחוללו עם 0.2% טריטון X -100 ב-TBS (10 דקות, טמפרטורת החדר). לאחר חסימה (1% BSA ב-TBS/0.2% triton X-100), התאים הודגרו עם נוגדן -NP (1:250, בתמיסת חסימה). הנוגדן המשני (1:1000) יחד עם DAPI (1:2000) הודגרה למשך שעה אחת בחושך. כיסויי כיסוי רכובים נותחו במיקרוסקופ פלואורסצנטי (AxioVision, Zeiss, Jena, גרמניה).

אמירה אתית

ניסויים עם פרוסות רקמת ריאה אנושיות אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית הספר לרפואה בהנובר (MHH, Hannover, גרמניה) והם עומדים בקוד האתי של האיגוד הרפואי העולמי (מספר 2701–2015). כל החולים או קרוביהם נתנו הסכמה מדעת בכתב לשימוש ברקמת ריאה למחקר. כל תורמי הדם נתנו הסכמה מדעת בכתב (מספר אישור אתיקה: 161/17).

איור 1 אפיון שלפוחית ​​חיידקים ותגובה במקרופאגים אנושיים. הפרדה של שלפוחיות חיידקיות חוץ-תאיות מחלבונים חופשיים באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל מסופרנטנטות חיידקיות שונות (Legionella pneumophila (Lp), Klebsiella pneumoniae (Kp), Escherichia coli (Ec), Salmonella enterica serovar Typhimurium (Sal) ו-Streptoniaeococcus. ). ריכוז השלפוחית ​​בכל חלק נקבע על ידי ציטומטריה ננו-זרימה (nFCM) וחלבונים כומתו על ידי BCA. B הפצות גודל שלפוחית ​​של OMVs/MVs מטוהרים נקבעו על ידי NFC. C TEM תמונות של OMVs/MVs מטוהרים. סרגל קנה מידה=50 ננומטר. D-G ​​BDMs עוררו עם OMVs/MVs (1 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד) מחיידקים שונים או נותרו ללא טיפול לבקרה למשך עד 48 שעות. שחרור D CXCL8 נקבע על ידי ELISA והוא מתואר ב-ng/mL. ביטוי של IL1B (E) ו-IL12B (F) נקבע על ידי qPCR, התוצאות מנורמלות ל-RPS18 ומתוארות ביחס לתאי בקרה לא מטופלים. G לאחר דגירה של שעה אחת עם שלפוחית ​​חיידקים, ביטוי וזרחון של IRAK-1, p38 ו-TBK-1 נקבעו על ידי Western Blot. מוצגות תוצאות מייצגות של ארבעה שכפולים ביולוגיים עצמאיים. פסים מייצגים ערכים ממוצעים + SEM משלושה (B) לארבעה (D-F) ניסויים עצמאיים. סטטיסטיקה: 2-דרך ANOVA (DF); *עמ'<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; ns=not significant; n=3–4

סטָטִיסטִיקָה

הנתונים מוצגים כערכים ממוצעים + SEM עבור לפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים ביולוגית. נעשה שימוש בפריזמה 6.07 (GraphPad, La Jolla, ארה"ב). בדיקות ANOVA חד- או דו-כיווניות בוצעו עבור דגימות לא מזווגות. ערכי P פחות מ-0.05 או שווה ל-0.05 נחשבו מובהקים סטטיסטית. אם לא צוין אחרת, בוצעו בדיקות לעומת בקרה מקבילה (*).

זמינות נתונים וחומרים

כל הנתונים שנוצרו או נותחו במהלך מחקר זה כלולים במאמר זה ובקובץ המשלים שלו.

תוצאות

הפעלה פרו-דלקתית של מקרופאגים על ידי OMVs/MVs

כדי לבדוק את התגובה החיסונית המולדת של מקרופאגים ראשוניים מבני אדם (BDM) ל-OMVs/MVs מחיידקים שונים, שלפוחיות מ- Legionella pneumophila (Lp), Klebsiella pneumoniae (Kp), Escherichia coli (Ec), Salmonella enterica serovar Typhimurium (Sal). ) ו-Streptococcus pneumoniae (Sp) בודדו באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC). שברים נותחו עבור מספר שלפוחיות על ידי ציטומטריה ננו-זרימה (nFCM) ועל נוכחות של חלבונים על ידי BCA (איור 1A). שלפוחיות משברים 7-12 אספו ושימשו לניסויים. ל-OMVs/MVs היה פרופיל חלוקת גודל דומה (איור 1B), לא היו שונים בגודלם הממוצע (קובץ נוסף 1: איור S2A), רוכזו באופן שווה (קובץ נוסף 1: איור S2B), והוצגו באמצעות אלקטרון שידור. מיקרוסקופיה (TEM; איור 1C). BDMs עוררו עם OMVs/MVs למשך עד 48 שעות, התואמים לריכוזי שלפוחית ​​שווים של החיידקים השונים (קובץ נוסף 1: איור S2C). דגירה של BDMs עם שלפוחית ​​לא הייתה ציטוטוקסית (קובץ נוסף 1: איור S2D). OMVs/MVs גרמו באופן נרחב לביטוי ושחרור של CXCL8 ממקרופאגים (קובץ נוסף 1: איור S3A ו-1D), בעוד שהאינדוקציה של IL1B ו-IL12B mRNA הייתה תלויה בזמן ובמינים (איור 1E+F). שחרור IL-1 היה תלוי במין שממנו בודדו שלפוחית ​​החיידק (קובץ נוסף 1: איור S3B). למרות שזרחון של p38 היה דומה ב-BDMs לאחר שעה אחת של דגירת שלפוחית, רק OMVs מפירוק גראם שלילי של חיידקים של IRAK-1 וזרחון של TBK-1 אך לא MVs מגרם חיובי (איור 1G וקובץ נוסף 1: S4A-D).

איור 2 שלפוחיות חוץ-תאיות של חיידקים מפעילות תגובת אינטרפרון מסוג I ב-BDMs. BDMs עוררו עם OMVs/MVs (1 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד) מחיידקים שונים או נותרו ללא טיפול כביקורת. זרחון וביטוי של IRF-3 נקבעו לאחר שעה אחת של דגירת OMV/MV על ידי Western Blot. מוצגת תוצאה מייצגת של שלושה שכפולים בלתי תלויים ביולוגית. ביטוי של IFNA1 (B), IFNB (C), IFIT1 (E) ו-IFI44 (F) נמדד על ידי qPCR, התוצאות מנורמלות ל-RPS18 ומתוארות ביחס לתאי בקרה לא מטופלים. D זרחון של STAT1 נקבע על ידי Western Blot לאחר שעתיים של גירוי OMV/MV. מוצגת התוצאה המייצגת של ארבעה שכפולים ביולוגיים עצמאיים. זרחון G של STAT1 וביטוי של Mx1 נקבעו על ידי Western Blot לאחר 20 שעות של גירוי שלפוחית ​​חיידקים. מתוארות תוצאות מייצגות של ארבעה שכפולים ביולוגיים עצמאיים. פסים מייצגים ערכים ממוצעים + SEM מארבעה ניסויים עצמאיים. סטטיסטיקה: 2-דרך ANOVA; *עמ'<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=4

מלבד ההפעלה של NF-κB ו-AP-1 והמטרות במורד הזרם שלהם, איתות PRR יכול להוביל להפעלה של IRFs. לפיכך, נקבע זרחון של IRF-3. Kp/Ec/SalOMVs הגבירו זרחון של IRF-3 ב-BDMs (איור 2A), וכתוצאה מכך הביטוי של IFN I (איור 2B+C), זרחון במורד הזרם של STAT1 (איור 2D וקובץ נוסף 1: S4E) ואינדוקציה של גנים מעוררי אינטרפרון (ISGs; IFIT1, IFI44 ו-Mx1; איור 2E-G). מכיוון שאירועי זרחון הם בדרך כלל קצרי מועד וידועים כממלאים תפקיד קריטי בהחלפת מפלי איתות חיסוניים, זרחון של STAT1 נבדק גם 20 שעות לאחר הוספת Kp/Ec/SalOMVs (איור 2G וקובץ נוסף 1: S4F+G). הניסויים הראו ש-OMV לא רק מפעילים איתות פרו-דלקתי במקרופאגים אלא גם נגרמת איתות אנטי-ויראלי.

קדם-אינקובציה של OMV משנה את שכפול IAV במקרופאגים

Mx1 הוא גורם אנטי-ויראלי ידוע המעכב את שכפול IAV [20], אשר התבטא בטיפול Kp/Ec/SalOMV במקרופאגים. לפיכך שיערנו שקדם טיפול OMV משנה את השכפול הנגיפי. ניסויי זיהום IAV הוקמו בתאי THP-1, המבטאים רמות דומות של Mx1 בטיפול ב-Kp/Ec/SalOMV על רמות mRNA וחלבון (קובץ נוסף 1: איור S5A+B) ומעוררים זרחון של STAT1 , בעוד שכל חלבון STAT1 נשאר יציב (קובץ נוסף 1: איור S5C), עם זן H1N1 (A/WSN/33) שמדביק ומשתכפל במקרופאגים [21]. גירוי מראש של תאי THP-1 עם LpOMV/SpMV הגדיל את שכפול IAV 24 שעות לאחר הזיהום (pi) בהשוואה לבקרה נגועה (–-), בעוד שטיפול מקדים עם Mx1-השראת OMVs (Kp) /Ec/Sal) חסם שכפול IAV (איור 3A). בעוד שטיפול מקדים של TLR2/1 אגוניסט Pam3CSK4 יכול לחקות את ההשפעה שנצפה עם LpOMV/SpMV, שידוע שניהם מאותתים באמצעות TLR2/1 [12, 22, 23], LPS מסיס כאגוניסט TLR4 לא שיחזר את Kp/Ec אפקט /SalOMV (קובץ נוסף 1: איור S5D). ניתן לראות הבדלים בעומס IAV לאחר טיפול מקדים גם על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית כנגד הנוקלאופרוטאין הנגיפי (NP) (איור 3B). טיפול מקדים ב-Kp/Ec/SalOMV חסם את שכפול IAV והאזור החיובי ל-NP הצטמצם באופן משמעותי (איור 3C). לא ניתן היה להבחין בכך לאחר טיפול מקדים ב-LpOMV/SpMV. כדי לחקור אם אינדוקציה של Mx1 מספיקה עבור שכפול ה-IAV החסום שנצפה, Mx1 בוטח יתר על המידה (מין) במקרופאגים THP-1 כדי לחקות גירוי קדם של OMV (קובץ נוסף 1: איור S5E). זיהום IAV של תאי Mx1oex הביא להפחתה של האזור החיובי ל-NP חיסוני 4 h pi (איור 3D) ובשכפול ויראלי מופחת 6 h pi בהשוואה לבקרת וקטור ריקה (VC) (איור 3E) אם כי לרמה נמוכה יותר היקף בהשוואה לפרסטימולציית OMV (איור 3A). לסיכום, Kp/Ec/SalOMV הפעילו מקרופאגים בצורה פרו-דלקתית קלאסית וגרמו לגנים אנטי-ויראליים וכתוצאה מכך הפעלה של קולטן IFN-/(IFNAR), זרחון במורד הזרם של STAT1 וביטוי של Mx1, שיכולים להפריע ישירות לשכפול IAV ( איור 4א). כדי לאשר את החשיבות של איתות JAK/STAT להשראת תגובה אנטי-ויראלית שנצפה, הוחל מעכב JAK (JAKi) לפני גירוי שלפוחית. עיכוב JAK לא שינה את ביטוי CXCL8 המושרה על ידי Kp/SalOMV (איור 4B), אלא הפחית באופן משמעותי את Mx1 ב-mRNA (איור 4C) ואת רמת החלבון אפילו לאחר זיהום IAV (איור 4D וקובץ נוסף 1: S6A). בהתאם לכך, JAKi הפך את חסימת שכפול ויראלי המושרה על ידי OMV (איור 4E).

איור 3 Mx1-השראת OMVs חוסם שכפול וירוס שפעת A בתאי THP-1. שכפול וירוס Influenza A בתאי THP-1 מובחנים. תאים טופלו מראש עם OMVs/MVs (1 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד) או לא טופלו לבקרה (-). לאחר 20 שעות טיפול מקדים, תאים הודבקו ב-A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.001) למשך 24 ו-48 שעות. שכפול IAV נקבע על ידי qPCR כנגד IAV-NP מנורמל ל-18S. מוצגים ערכי ממוצע ± SEM של שלושה עד חמישה ניסויים עצמאיים. B תאי THP{17}} מובחנים טופלו מראש עם OMVs/MVs (1 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד) או לא טופלו עבור בקרה (-). לאחר 20 שעות טרום דגירה, תאים הודבקו ב-A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.1) למשך 4 שעות. לאחר הקיבוע, התאים נצבעו בנוגדן -influenza NP (צהוב) ו-DAPI (כחול). מוצגת תוצאה מייצגת מארבעה ניסויים ביולוגיים עצמאיים. C כימות של אזור NP חיובי (NP+) מ-(B). פסים מייצגים ערכים ממוצעים של ארבעה ניסויים עצמאיים + SEM. תאי D THP-1 המבטאים יתר על המידה Mx1 (Mx1oex) ותאי בקרת וקטור ריקים (VC) הודבקו בנגיף השפעת A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.1) למשך 4 שעות. לאחר קיבוע וצביעה אימונופלואורסצנטית עם -influenza NP, אזור ה-NP+ היה כמותי ומתואר ביחס לתאי VC. עמודות מציגות ערכים ממוצעים של ארבעה ניסויים עצמאיים + SEM. תאי E Mx1oex ו-VC הודבקו ב-A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.001) למשך 6 שעות. שכפול ויראלי נקבע על ידי בדיקת פלאק והתוצאות מתוארות כיחידות יוצרות פלאק (pfu) למ"ל. פסים מייצגים ערכים ממוצעים + SEM של ארבעה ניסויים עצמאיים. סטטיסטיקה: 2-דרך ANOVA (A), 1-דרך ANOVA (C), מבחן t לא מזווג (D+E); *עמ'<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=3–5

תגובה אנטי-ויראלית על OMVs תלויה ב-TLR4-TRIF

כדי לזהות את ה-PRR המעורב, אגוניסטים חיסוניים מסחריים יושמו לבד או בשילוב עם LPS כדי לחקות OMVs. עם זאת, לא נצפתה אינדוקציה של Mx1 שיקוף עם KpOMVs (קובץ נוסף 1: איור S7), מה שמצביע על הפעלה דיפרנציאלית וממושכת של מקרופאגים על ידי OMVs עקב הרכב הליגנד שלהם או הצגה מרחבית ל-PRRs. הקולטנים החיסוניים המעורבים הוערכו עוד יותר על ידי תאי כתב THP-1 לאיתות NF-KB ו-IRF (איור 5A). בטיפול ב-KpOMV, תאי THP-1 הראו ביטוי מוגבר משמעותית של חלבון Mx1 (איור 5B וקובץ נוסף 1: S6B), שאבד בתאי THP-1 חסרי TRIF (TRIF-/-) ​​( איור 5B וקובץ נוסף 1: S6B). אותו הדבר נצפה עבור מדווח ה-IRF (איור 5C), בעוד שהפעלת כתב NF-κB והשראת CXCL8 היו גבוהים גם בתאי THP-1 וגם TRIF-/- לאחר גירוי (איור 5D+E). ביטוי גנים תלויי STAT IFIT1, IFI44 ו-Mx1 הושרה על ידי גירוי KpOMV בתאי כתב THP -1 (איור 5E), בעוד שהוא הצטמצם באופן משמעותי בתאי TRIF-/- מגורים באותה מידה (איור 5E). זיהום IAV נוסף לאחר גירוי קדם הביא לירידה בשכפול הנגיפי, בעוד שמחיקת TRIF הצילה שכפול IAV (איור 5F). כדי לחקור אם KpOMVs מעוררים תגובה אנטי-ויראלית כללית במקרופאגים, תאים הודבקו בנגיף סטומטיטיס שלפוחית ​​(VSV), שהשתכפל בתאי בקרה, אך נחסם בתאים שטופלו מראש ב-KpOMV וניתן היה להציל אותם גם על ידי מחיקת TRIF (איור. 5G). מכיוון שההכרה של LPS באמצעות TLR4 חיונית עבור אנדוציטוזיס והפעלת TRIF, LPS על פני השטח של OMV נוטרל על ידי האנטיביוטיקה הליפופפטידית Polymyxin B (PB), וכתוצאה מכך ירידה של 50% בהשראת Mx1 (איור 6A+B וקובץ נוסף 1 : S6C), אך אין הבדל משמעותי בתעתוק CXCL8 תלוי NF-κB (איור 6C). שכפול ויראלי נחלץ לרמה הבסיסית לאחר גירוי מקדים של KpOMV+PB (איור 6D). מכיוון שעיכוב זיהוי LPS על ידי PB לא היה מספיק כדי לחסום לחלוטין את Mx1, OMVs מ-Clear coli (Cc) ללא אנדוטוקסין בודדו ושימשו לגירוי קדם. Cc מבטא שומנים A שונה ואינו יכול לעורר קומפלקס TLR4/MD2 משופעל [24]. CcOMVs לא גרמו ל-Mx1 (איור 6A+B וקובץ נוסף 1: S6C) ולא הפחיתו את שכפול IAV במקרופאגים (איור 6D). ידוע היטב שבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית מביא לבידוד משותף של מזהמים (למשל חלבונים או נספחים של תאים חיידקיים) לצד השלפוחיות. בהתאם להנחיות MISEV2018 [25], ניסויים מרכזיים חזרו על עצמם עם OMVs מבודדים באמצעות שילוב של אולטרפילטרציה (UF) וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC). גירוי של תאי כתב THP-1 עם KpOMV מטוהרים ב-UF-SEC הביא לאינדוקציה של Mx1 (קובץ נוסף 1: איור S8A) וכתב IRF (איור S8B), בעוד שהוא אבד במקרופאגים TRIF-/- ( קובץ נוסף 1: איור S8A+B). שכפול IAV נחסם בתאים שטופלו מראש ב-KpOMV וחולץ לאחר מחיקת TRIF (קובץ נוסף 1: איור S8C). פעילות כתב NF-KB נגרמה על ידי KpOMVs ללא קשר למצב ה-TRIF של התאים (קובץ נוסף 1: איור S8D).

איור 4 עיכוב של איתות JAK מציל שכפול וירוס שפעת A במקרופאגים. OMV מפעיל איתות TRIF-IRF במקרופאגים, אשר בתורו גורם לביטוי ושחרור IFN עם איתות IFNAR הבאים. IFNAR מאותת באמצעות JAK/STAT וגורם לביטוי של ISGs, אחד מהם הוא Mx1. זה מוביל לחסימה של שכפול IAV. תאי B–E THP-1 הודגרו מראש למשך שעה אחת עם מעכב JAK של 10 µM (JAKi) לפני הוספת OMVs (1 מיקרוגרם/מ"ל; Kp/Sal) למשך 2{{22 }} ח. ביטוי B-C CXCL8 (B) ו-Mx1 (C) נקבעו על ידי qPCR והתוצאות מנורמלות ל-RPS18 ומתוארות ביחס לבקרה לא מטופלת. עמודות מציגות ערכים ממוצעים של שלושה עד ארבעה ניסויים עצמאיים + SEM. תאים שטופלו מראש ב-D+E OMV הודבקו בנוסף ב-IAV (MOI 0.001). D Western blot מראה ביטוי חלבון Mx1 ב-0-3 שעות לאחר הזיהום (pi). שכפול ויראלי נקבע על ידי בדיקת פלאק 24 שעות לאחר ההדבקה. עמודות מציגות ערכים ממוצעים של ארבעה ניסויים עצמאיים + SEM. סטטיסטיקה: 1-דרך ANOVA (B+C+E); *עמ'<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; *compared to DMSO control, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=4

איור 5 OMVs משרה איתות אנטי ויראלי במקרופאגים באמצעות TRIF. תאי THP-1 דואלי מעוררים ביטוי של פוספטאז אלקליין עוברי (SEAP) מופרש לאחר הפעלת מסלול NF-KB וביטוי והפרשה של Lucia luciferase עם הפעלת מסלול IRF. בנוסף, הבדלו TRIF (פסים אפורים) ולאחר מכן עוררו עם -/− תאים בעלי נוק אאוט יציב של מולקולת המתאם TRIF. (BF) THP-1 תאי מדווח (=כפולים; פסים שחורים) ותאי TRIF-/− KpOMV (1 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 20 שעות או נותרו ללא טיפול לבקרה. לאחר הזמן המצוין נאספו סופרנטנט, RNA ו/או חלבונים. B נציג Western Blot תמונה של ביטוי חלבון Mx1. פעילות כתבת C+D Lucia (C) ופעילות כתב SEAP (D) נקבעה בסופרנטנט של תרבית תאים. אותו סופרנטנט שימש לקביעת הפעילות של שני הכתבים. E ביטוי mRNA יחסי עבור גני מטרה תלויי STAT ו-NF-κB (מלמעלה למטה: IFIT1, IFI44, Mx1, CXCL8) נקבע על ידי qPCR והתוצאות מנורמלות ל-RPS18 ומתוארות ביחס לבקרה כפולה לא מגורה. שינויים בקיפול שונו Log2. תאים הודבקו בנוסף ב-A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.1) למשך 24 שעות (F) או VSV (MOI 0.1) למשך 12 שעות (G). שכפול ויראלי נקבע על ידי בדיקת פלאק. עמודות מציגות ערכים ממוצעים של ארבעה (C-F) עד 5 (G) ניסויים עצמאיים + SEM. סטטיסטיקה: 2-דרך ANOVA (C–G); *עמ'<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; * compared to unstimulated Dual control, # as depicted in the graph; ns=not signifcant; n=4–5

איור 6 ביטוי Mx1 המושרה על ידי OMV אובד לאחר עיכוב LPS. תאי THP-1 הודגרו במשך 20 שעות עם OMVs (1 מיקרוגרם/מ"ל; Kp או Clear coli (Cc)) לבד או בשילוב עם 20 מיקרוגרם/מ"ל Polymyxin B (PB) או נותרו ללא טיפול לשליטה. ביטוי חלבון Mx1 נקבע על ידי Western Blot. מוצגת תוצאה מייצגת של שלושה ניסויים בלתי תלויים ביולוגית. ביטוי Mx1 B ו-CXCL8 C נקבעו על ידי qPCR. עמודות מציגות ערכים ממוצעים של ארבעה ניסויים עצמאיים + SEM. תאי D THP-1 הודגרו במשך 20 שעות עם OMVs (1 מיקרוגרם/מ"ל; Kp או Cc) לבד או בשילוב עם 20 מיקרוגרם/מ"ל PB או נותרו ללא טיפול לבקרה ולאחר מכן הודבקו בנוסף ב-A/WSN/33 (H1N1) (MOI 0.001). שכפול הנגיף נקבע על ידי בדיקת פלאק 24 שעות לאחר ההדבקה. עמודות מציגות ערכים ממוצעים של ארבעה ניסויים עצמאיים + SEM. סטטיסטיקה: 1-דרך ANOVA B–D; *עמ'<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; *compared to control, #compared to KpOMV; ns=not significant; n=3–4

ההשפעה המעכבת שכפול IAV של OMVs ניתנת להעברה ל-AECs

מכיוון שמקרופאגים אינם סוג התאים העיקרי לשכפול IAV בריאה ומכיוון ש-IFN I פועל גם פראקריני, נבדקה יכולת ההעברה של אפקט השכפול של IAV ל-AECs, שכן תאים אלו, בניגוד למקרופאגים, אינם מגיבים ישירות ל-OMVs/MVs ( קובץ נוסף 1: איור S9). Supernatant (SN) ממקרופאגים שטופלו ב-KpOMV גרם ל-Mx1 בתאי A549, בניגוד ל-LpOMV-SN (איור 7A), בעוד ש-CXCL8 הושרה לאחר שניהם (איור 7B). KpOMVSN הפחית את השכפול הנגיפי (איור 7C), אשר היה בקנה אחד עם ניסויי מקרופאגים ודפוס של אינדוקציה Mx1. כדי לאשר את התלות של ההשפעה המגבילה של IAV שנצפה על איתות JAK/STAT, KpOMV-SN שולב עם JAKi, חסימת אינדוקציה של Mx1 בטיפול ב-KpOMV-SN (איור 7A) ושחזור שכפול IAV (איור 7C). כדי לחקות את הרגולציה המורכבת של תהליכים חיסוניים בריאות, הוקמה זיהום IAV ex vivo של פרוסות ריאה חתוכות מדויקות (PCLS). Lp/KpOMVs לא היו ציטוטוקסיים ל-PCLS (איור 8A) והשילוב של OMV טרום-גירוי וזיהום IAV הביא לאינדוקציה של Mx1 (איור 8B) ושחרור CXCL10 (איור 8C). KpOMVs אך לא LpOMVs הפחיתו באופן משמעותי את שכפול IAV ב- PCLS (איור 8D). ההשפעות שנצפו בוטלו על ידי הדבקה ב-IAV מומתת UV (איור 8A-C). הממצאים שלנו מובילים למודל של דלקת ריאות שבה AMs מגיבים ל-OMVs מחיידקים גרם שליליים עם אינדוקציה של IFN I, תוך השראת תגובות אנטי-ויראליות באופן אוטוקריני ב-AMs ובאופן פאראקריני ב-AECs in vitro ובמודל PCLS ex vivo (איור 8E).

איור 7 השפעה מעכבת שכפול וירוס שפעת A של OMVs ניתנת להעברה ל-AECs. תאי THP-1 הודגרו עם LpOMV או KpOMV למשך 20 שעות או נותרו ללא טיפול לבקרה. הסופרנטנט (SN) עבר סינון סטרילי והשתמש בו לגירוי מקדים של תאי A549 למשך 20 שעות לבד או בשילוב עם 10 µM JAKi. ביטוי A+B Mx1 (A) ו-CXCL8 B נקבעו על ידי qPCR בנקודת הזמן של ההדבקה (0 h pi). עמודות מציגות ערכים ממוצעים של ארבעה ניסויים עצמאיים + SEM מנורמלים לתאי בקרה לא מטופלים. C תאי A549 שטופלו מראש הודבקו בנוסף בנגיף השפעת A/Hamburg/5/2009 (H1N1pdm) (MOI 0.01) למשך 24 שעות. שכפול ויראלי נקבע על ידי בדיקת פלאק. פסים הם ערכים ממוצעים של ארבעה ניסויים עצמאיים + SEM. סטטיסטיקה: 1-דרך ANOVA; **עמ'<0.01, ****p<0.0001; * compared to control-SN; # compared to KpOMV-SN; n=4

דִיוּן

מצאנו כי שלפוחיות מחיידקים שונים מעוררות איתות דיפרנציאלי במקרופאגים המסוגל להגביל את שכפול IAV בזיהום עוקב. בהתאם לספרות, OMVs מבודדים מ-Lp, Kp, Ec ו-Sal, ו-MVs מ-Sp היו דומים בגודלם [26-28]. מקרופאגים שהודגרו עם שלפוחית ​​חיידקים לא הראו ציטוטוקסיות [29, 30], אך גרמו לתגובה פרו-דלקתית. כל השלפוחיות הפעילו זרחון p38 ושחרור של CXCL8 ו-IL-1 ממקרופאגים אנושיים ראשוניים, בעוד שהיו הבדלים באינדוקציה של IFN I ובאותות שלהם במורד הזרם. אנחנו ואחרים כבר הראינו שאותות LpOMVs באמצעות TLR2 [12, 22] וגם SpMVs גרמו לדפוס הפעלה מובהק במקרופאגים [31]. LpOMVs/SpMVs הפעילו גנים מעודדי דלקת של יעד NF-κB, כפי שתואר עבור חיידקי המקור [12, 22, 31]. עם זאת, זיהוי של Kp/Ec/SalOMVs עוררה, בנוסף לגנים מטרה NF-κB, אינדוקציה של זרחון IRF-3 עם ביטוי IFNB במורד הזרם וזרחון ארוך טווח של STAT1 יחד עם אינדוקציה של ISGs, בטענה פעילה איתות IFNAR-JAK/STAT. OMVs נושאים LPS על פני השטח שלהם, אך לא ניתן היה לחקות את היכולת הפרו-דלקתית של OMVs עם LPS טהור. אנו ואחרים ראינו שמקרופאגים רגישים יותר ל-OMVs בהשוואה לאותה כמות של LPS טהור [32, 33]. OMVs מכילים סכום של אגוניסטים חיסוניים הדרושים להשראה של תגובה חיסונית חזקה [32]. אגוניסטים מסחריים של TLR ו-RIG-I לבד או בשילוב עם LPS לא יכלו לחקות את ההשפעה. הוכח בעבר כי ליפוזומים טעוני LPS גרמו להפעלה ממושכת יותר של TRIF-IRF-3 במקרופאגים בהשוואה ל-LPS חופשי [34]. על ידי שימוש במקרופאגים TRIF-/-, הראינו את התלות של אינדוקציה של ISG במולקולת המתאם הזו. יתר על כן, CcOMVs או OMVs נטולי אנדוטוקסין בשילוב עם LPSmasking PB היו מספיקים כדי לבטל את התגובה של מקרופאגים. זה מצביע על זיהוי של OMVs באמצעות TLR4 עם אנדוציטוזיס שלאחר מכן ואותות TRIF. בהתאם לכך, Kp/Ec/SalOMVs הצליחו לעורר הפעלה פרו-דלקתית של מקרופאגים באמצעות TLR4 המוביל לאיתות MyD88 וביטוי גנים תלוי NF-κB וכן איתות TRIF עם תגובת IFN I. זה עולה בקנה אחד עם ספרות המראה כי TLR4 ו-TRIF יחד נדרשים לאימונוגניות של Neisseria meningitidis OMVs בעכברים [35]. מכיוון ש-IFNs מסוג I הם מווסתים ראשיים של תגובות אנטי-ויראליות, שיערנו שזיהוי של Kp/Ec/SalOMVs משפיע על שכפול IAV. הדגמנו שמקרופאגים חסמו ביעילות את שכפול IAV ו-VSV לאחר טיפולים מוקדמים של OMV המפעילים TRIF, בעוד ש-TRIF-/- הצילו שכפול ויראלי. כדי לאתר את ההשפעה על איתות IFNAR, עיכוב JAK1/2 בשילוב עם OMVs, חסם בהצלחה אינדוקציה של STAT1-תלויה של Mx1 והצילו שכפול ויראלי במקרופאגים. השילוב של KpOMVs עם PB או יישום של CcOMVs ללא אנדוטוקסין לא הפחיתו את שכפול IAV במקרופאגים מכיוון שהם לא היו מסוגלים לגרום לגנים אנטי-ויראליים. מכיוון שתכשירי שלפוחית ​​חוץ-תאיים שהושגו באולטרה-צנטריפוגה מכילים חלבון חופשי וחיבורי תאים חיידקיים לצד השלפוחיות, תכשירי OMV נוצרו בנוסף באמצעות שילוב של סינון אולטרה וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל [25].

עשב סיני cistanche plant-Antitumor

תכשירי השלפוחית ​​הטהורים שהתקבלו היו מסוגלים באותה מידה לגרום לאיתות TRIF-IRF עם אינדוקציה במורד הזרם של Mx1 ושכפול ויראלי חסום בטענה להשפעה ישירה של שלפוחית. למרות שכספומטים הם קו ההגנה הראשון של הריאה, רוב הזיהום והשכפול של IAV בריאה אנושית מתרחשים ב-AECs [36]. לכן, AECs קיבלו גירוי עם OMVs, אך הם לא הגיבו לגירוי כמו מקרופאגים. רק שורת תאי האפיתל הסימפונות BEAS2B הגיבה עם ביטוי CXCL8, אך חסרה אינדוקציה של Mx1. מכיוון שיכולנו להראות ביטוי גנים אנטי-ויראלי בהתאם ל-TLR4 ו-TRIF במקרופאגים, אנו משערים כי ארבעת שורות תאי האפיתל שנבדקו אינם מבטאים TLR4 במידה דומה למקרופאגים וכי הם לא הצליחו לבצע אנדוציטוזיס של OMVs עם הפעלת TLR4. זה עולה בקנה אחד עם ספרות שמראה כי AECs אנושיים מבודדים אינם מגיבים ל-LPS כמו AMs מזווגים הגיבו [37]. מכיוון שקישרנו את המצב האנטי-ויראלי בעת דגירת OMV מראש ל-IFN I, השתמשנו בסופרנטנט של מקרופאגים מעוררי OMV כדי לעורר מראש AECs. המדיום המותנה של מקרופאגים מעוררי KpOMV, בניגוד לגירוי שלפוחית ​​ישיר, גרם לביטוי Mx1 בתאים אלה והפחית את שכפול IAV בניסויי זיהום הבאים. סופרנטנט ממקרופאגים שטופלו ב-LpOMV גרמה ל-CXCL8 בתאי אפיתל אך לא גרמה לאינדוקציה של Mx1 ולשינויים בשכפול הנגיפי. כדי לייחס את ההשפעה שנצפתה עם מדיה מותנית ל-IFN I, הסופרנטנט שולב עם מעכב JAK1/2, חסם אינדוקציה של Mx1, ולא השפיע על שכפול ויראלי. מכיוון שמשחקי הגומלין בין סוגי התאים השונים בריאה אנושית מורכבים יותר ולא ניתן לחקות אותו במלואו על ידי מדיה מותנית, הרחבנו את הגישה שלנו למקטעים ברי קיימא של רקמת ריאה מרוחקת אנושית, אשר נעשה בה שימוש נרחב למחקרים על אינטראקציות מארח-פתוגן כולל וירוס שפעת וזיהומים חיידקיים [38-41]. בניגוד למודלים המשמשים במבחנה, רקמת הריאה האנושית ex vivo שומרת על הארכיטקטורה התלת מימדית של הריאה ומאפשרת משחק גומלין פיזיולוגי בין סוגי התאים השוכנים בריאה, אך אין לה אפשרות לזרימה של תאי חיסון נוספים שגויסו. זיהום רצוף של PCLS מגורה KpOMV עם IAV הפחית את העומס הנגיפי בהשוואה לבקרות שלא טופלו מראש. מכיוון שכל ה-AECs שנבדקו במבחנה לא הגיבו לגירוי ישיר של שלפוחית ​​חיידקים, אנו משערים שבמודל ex vivo זה, ה-AMs הם סוג התא המגיב השולט. מכיוון שנבחר מבודד שפעת לזיהום הבא שמדביק ומשתכפל באופן בלעדי ב-AECs, ניתן להניח כי מדובר באפקט אנטי-ויראלי פרקריני שמקורו ב-AMs ומועבר ל-AECs. בהתבסס על הנתונים שהתקבלו כאן, אנו מציעים את המודל הבא (איור 8E): OMVs מחיידקים גרם שליליים יכולים להפעיל מקרופאגים אנושיים בצורה פרו-דלקתית קלאסית ולקדם אותם אנטי-ויראלית באמצעות TLR4 ו-TRIF לאחר אנדוציטוזיס מוצלח של שלפוחיות. IFN I release יכול בתורו להפוך מקרופאגים ו/או AECs לאנטי-ויראליים באמצעות איתות IFNAR ו-JAK/STAT. הדבקה של תאים אלה לאחר מכן גורמת לירידה 1-מתווכת של Mx בעומס הנגיפי. מכיוון שלא הייתה לנו גישה ל-AMs אנושיים ראשוניים, הניסויים בוצעו באמצעות BDMs אנושיים כמודל. בהתחשב במקורות ההתפתחותיים השונים ובפרימינג של מקרופאגים אלו, ניתן להעלות על הדעת כי AMs היו מראים תגובה פרו-דלקתית חלשה יותר בניגוד ל-BDMs. שלפוחיות חיידקים כבר נמצאות בשימוש באסטרטגיות חיסון נגד פתוגנים שונים הגורמים לדלקת ריאות (נסקרו ב-[42]). לפיכך, OMVs לא רק מייצגים כלי לאסטרטגיות חיסון סיסטמיות פוטנציאליות נגד חיידקי המארח שלהם, אלא יכולים לשמש גם באופן מקומי כדי להילחם בזיהומים ויראליים על ידי הפעלת תאי חיסון מולדים. דרושים מחקרים עתידיים in vivo כדי לבדוק אם ממצאים אלו במבחנה ישימים לפתוגנים ויראליים אחרים. בנוסף, יש לציין כי יש לנטר באופן ביקורתי תגובה אנדוטוקסית שעלולה להתרחש כדי למנוע תגובות חיסוניות מוגזמות in vivo. יש צורך בפיקוח הדוק על השראת IFN מסוג I, שכן הוכח אצל אנשים בריאים כי שאיפה של אגוניסט TLR7 נסבלת היטב בתחילה לאחר המנה הראשונה, אך הובילה לתגובת TNF ו-IFN I מוגברת ולתסמינים דמויי שפעת , לאחר מנה שנייה [43]. כדי להילחם בתופעות שליליות, ייתכן שיהיה צורך בגרסאות מהונדסות גנטית של OMVs, שיגרמו לתגובה חיסונית מאוזנת והשגת יישום טוב. ביחד, אנו מציגים כאן מודל של האופן שבו OMVs יכולים לעורר איתות אנטי-ויראלי במקרופאגים אנושיים וכיצד ניתן להשתמש בכך כדי למנוע שכפול IAV.

איור 8 KpOMV מפחית את שכפול נגיף השפעת A בפרוסות ריאות חתוכות מדויקות של בני אדם. PCLS אנושי הודגרה עם 1 מיקרוגרם/מ"ל OMVs (Lp/Kp) למשך 20 שעות ולאחר מכן הודבקו בנוסף בשפעת A/California/04/2009 (H1N1pdm) למשך 48 שעות. השבתת UV של הנגיף שימשה בקרה. ציטוטוקסיות נקבעה על ידי כימות של LDH משוחרר מ-PCLS ומתוארת באחוזים בהשוואה לתמוגה הכוללת. ביטוי B Mx1 הוכמת על ידי qPCR והוא מוצג ביחס ל-RPS18 ול-PCLS בקרה לא מטופל. שחרור CXCL10 נקבע על ידי ELISA והוא מתואר ב-ng/mL. D שכפול ויראלי נקבע על ידי בדיקת פלאק והוא מתואר ב-pfu/mL. עמודות מציגות ערכים ממוצעים של שלושה עד חמישה שכפולים ביולוגיים + SEM. E מוצע מודל להשראת חסינות אנטי-ויראלית של OMVs בריאה. סטטיסטיקה: 1-דרך ANOVA (AC), פרידמן-מבחן (D); *עמ'<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001; * compared to IAV infected, but not pre-treated PCLS, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=5

הפניות

1. Kulp A, Kuehn MJ. פונקציות ביולוגיות וביוגנזה של שלפוחיות קרום חיצוני של חיידקים מופרשים. Annu Rev Microbiol. 2010;64:163–84.

2. אליס TN, Kuehn MJ. ארסיות ותפקידים אימונומודולטורים של שלפוחית ​​ממברנה חיצונית של חיידקים. Microbiol Mol Biol Rev. 2010;74(1):81–94.

3. Giordano NP, Cian MB, Dalebroux ZD. הפרשת שומנים בקרום החיצוני והתגובה החיסונית המולדת לחיידקים גרם שליליים. להדביק את אימוון. 2020. https://doi.org/10.1128/IAI.00920-19.

4. Mancini F, et al. חיסוני OMV ותפקידם של אגוניסטים של TLR בתגובה חיסונית. Int J Mol Sci. 2020. https://doi.org/10.3390/ijms21124416.

5. Hu G, Christman JW. מאמר עריכה: מקרופאגים מכתשית בדלקת ריאות ורזולוציה. אימונול קדמי. 2019;10:2275.

6. Grassin-Delyle S, et al. תפקידם של קולטנים דמויי אגרה בייצור ציטוקינים על ידי מקרופאגים ריאות אנושיים. J Inate Immun. 2020;12(1):63–73.

7. גיליון מידע על שפעת (עונתית). 2018; https://www.who.int/news-room/ fact-sheets/detail/influenza-(עונתית)

8. Crotta S, et al. אינטרפרונים מסוג I ו-Typ III מניעים לולאות הגברה מיותרות כדי לעורר חתימה שעתוק באפיתליה של דרכי הנשימה הנגועים בשפעת. PLoS Pathog. 2013;9(11): e1003773.

9. Bals R, Hiemstra PS. חסינות מולדת בריאה: כיצד תאי אפיתל נלחמים בפתוגנים נשימתיים. Eur Respir J. 2004;23(2):327–33.

10. Helft J, et al. תאים דנדריטים של CD103+ מוגנים מפני זיהום בנגיף השפעת. J Clin Invest. 2012;122(11):4037–47.

11. Ghoneim HE, Thomas PG, McCullers JA. דלדול של מקרופאגים alveolar במהלך זיהום שפעת מקל על זיהומים חיידקיים. J Immunol. 2013;191(3):1250–9.

12. יונג אל, ואח'. שלפוחיות ממברנות חיצוניות שמקורן ב- Legionella pneumophila מעודדות שכפול חיידקים במקרופאגים. PLoS Pathog. 2016;12(4): e1005592.

13. Lindhauer NS, et al. פעילות אנטיבקטריאלית של הגנת Tribolium castaneum במודל של זיהום במבחנה של Streptococcus pneumoniae. אַרסִיוּת. 2019;10(1):902–9.

14. דנוב O, et al. עשן סיגריות משפיע על אוכלוסיות תאים דנדריטים, תפקוד מחסום אפיתל והתגובה החיסונית לזיהום ויראלי עם H1N1. Front Med. 2020. https://doi.org/10.3389/fmed.2020.571003.

15. Matrosovich M, et al. מדיום שכבה חדש בעל צמיגות נמוכה עבור מבחני פלאק ויראלי. Virol J. 2006;3:63. 16. Neuhaus V, et al. הערכה של ההשפעות הציטוטוקסיות והאימונומודולטוריות של חומרים בפרוסות ריאות חתוכות מדויקות של בני אדם. J Vis Exp. 2018. https://doi.org/10.3791/57042. 17. Niehof M, et al. בידוד RNA מפרוסות ריאה חתוכות מדויקות (PCLS) ממינים שונים. הערות BMC Res. 2017;10(1):121.

18. Schulz C, et al. מקרופאגים שמקורם ב-THP-1- הופכים את תאי האפיתל של הריאות להגיב נמוך ל-Legionella pneumophila - מחקר ביולוגי מערכות. Sci Rep. 2017;7(1):11988.

19. Livak KJ, Schmittgen TD. ניתוח נתוני ביטוי גנים יחסיים תוך שימוש ב-PCR כמותי בזמן אמת ובשיטת 2(-Delta Delta C(T)). שיטות. 2001;25(4):402–8. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262.

20. Haller O, et al. Mx GTPases: מכונות אנטי-ויראליות דמויות דינמין של חסינות מולדת. טרנדים מיקרוביול. 2015;23(3):154–63. 21. Anastasia M, et al. קצה ה-C של חלבון NS1 של נגיף שפעת A/WSN/1933(H1N1) מווסת תגובות אנטי-ויראליות במקרופאגים ועכברים אנושיים נגועים. J Gen Virol. 2015;96(8):2086–91.

22. Jager J, et al. היתוך של שלפוחית ​​ממברנה חיצונית Legionella pneumophila עם מערכות ממברנות אוקריוטיות הוא מנגנון להעברת גורמי פתוגן לממברנות התא המארח. Cell Microbiol. 2015;17(5):607–20.

23. Lammers AJ, et al. תפקידו של TLR2 בתגובת המארח לדלקת ריאות פנאומוקוקלית בהיעדר הטחול. BMC Infect Dis. 2012. https://doi. org/10.1186/1471-2334-12-139.

24. Mamat U, et al. ייצור חלבון ללא אנדוטוקסין - טכנולוגיית ClearColi™. שיטות נאט. 2013;10:916.

25. Théry C, et al. מידע מינימלי למחקרים של שלפוחיות חוץ-תאיות 2018 (MISEV2018): הצהרת עמדה של האגודה הבינלאומית לשלפוחיות חוץ-תאיות ועדכון של הנחיות MISEV2014. J Extracell שלפוחיות. 2018;7(1):1535750. https://doi.org/10.1080/20013078.2018. 1535750. 26. Bonnington KE, Kuehn MJ. ייצור שלפוחית ​​ממברנה חיצונית מקל על שיפוץ lps ותחזוקת ממברנה חיצונית בסלמונלה במהלך מעברים סביבתיים. MBio. 2016. https://doi.org/10.1128/mBio. 01532-16.

27. Jasim R, et al. אנליזה ליפידומית של שלפוחיות הממברנה החיצוניות ממבודדים קליניים מסוג Klebsiella pneumoniae רגישים ועמידים לפולימיקסין. Int J Mol Sci. 2018. https://doi.org/10.3390/ijms19082356.

28. Olaya-Abril A, et al. אפיון שלפוחיות הגנה חוץ-תאיות שמקורן בממברנה המיוצרות על ידי Streptococcus pneumoniae. J Proteomics. 2014;106:46–60.

29. Kuhn T, Koch M, Fuhrmann G. Probiomimetics-לקטובצילוס המחקים מיקרו-חלקיקים חדשים מראים השפעות אנטי דלקתיות ומגנות מחסום במודלים של מערכת העיכול. קָטָן. 2020;16(40): e2003158.

30. מהני מ, ואח'. שלפוחית ​​ממברנה חוץ-תאית סטרפטוקוקלית מופנמת במהירות על ידי תאי מערכת החיסון ומשנה את שחרור הציטוקינים שלהם. אימונול קדמי. 2020;11:80.

31. Volgers C, et al. תפקיד אימונומודולטורי עבור שלפוחיות ממברנות המשתחררות על ידי מקרופאגים THP-1 ופתוגנים נשימתיים במהלך זיהום מקרופאג. BMC Microbiol. 2017;17(1):216.

32. אליס TN, ליימן SA, Kuehn MJ. שלפוחיות ממברנות חיצוניות המיוצרות באופן טבעי מ-Pseudomonas aeruginosa מעוררות תגובה חיסונית מולדת חזקה באמצעות חישה משולבת של רכיבי ליפופוליסכריד וחלבון כאחד. להדביק את אימוון. 2010;78(9):3822–31.

33. Alaniz RC, et al. שלפוחיות ממברנה הן פקסימיליות אימונוגניות של Salmonella typhimurium המפעילות בעוצמה תאים דנדריטים, תגובות ראשונות של תאי B ו-T ומעוררות חסינות מגן in vivo. J Immunol. 2007;179(11):7692–701.

34. Watanabe S, Kumazawa Y, Inoue J. Liposomal lipopolysaccharide יוזם מסלול איתות תלוי-TRIF בלתי תלוי ב-CD14. PLoS ONE. 2013;8(4): e60078.

35. Fransen F, et al. השפעה דיפרנציאלית של TLR2 ו-TLR4 על התגובה החיסונית לאחר חיסון עם חיסון נגד Neisseria menin-gitidis או Bordetella pertussis. PLoS ONE. 2010;5(12): e15692.

36. Travanty E, et al. רגישות דיפרנציאלית של תאי ריאה ראשוניים אנושיים לנגיפי שפעת H1N1. J Virol. 2015;89(23):11935–44.

37. מובארק RA, et al. השוואה של תגובות פרו ואנטי דלקתיות בתאי אפיתל ראשוניים של דרכי אוויר אנושיות ומקרופאגים מכתשיים. Respir Res. 2018;19(1):126.

38. Wu W, et al. תגובה חיסונית מולדת לזיהום בנגיף אינפו-אנזה H3N2 ו-H1N1 במודל של תרבות איברי ריאות אנושיים. וירולוגיה. 2010;396(2):178–88.

39. Wu W, et al. נגיף שפעת A(H1N1)pdm09 מדכא תגובות אנטי-ויראליות מולדות יזומות של RIG-I בריאה האנושית. PLoS ONE. 2012;7(11): e49856.

40. Delgado-Ortega M, et al. תגובה חיסונית מולדת לתת-סוג H3N2 וירוס שפעת חזירים בתאי קנה הנשימה של חזירים שזה עתה נולדו, מקרופאגים מכתשית ופרוסות ריאות חתוכות במדויק. Vet Res. 2014;45:42.

41. Kolbe U, et al. השראת ציטוקינים מוקדמת לאחר זיהום Pseudomonas aeruginosa בפרוסות ריאה חתוכות במדויק של עכברים תלויה בחישת כדאיות חיידקים. אימונול קדמי. 2020. https://doi.org/10.3389/fmmu. 2020.598636.

42. יונג אל, ואח'. התפקיד הקליני של שלפוחיות חוץ-תאיות מארח ושל חיידקים בדלקת ריאות. Adv Drug Deliv Rev. 2021. https://doi.org/10. 1016/j.addr.2021.05.021.

43. Delaney S, et al. סבילות באדם בעקבות מינון שאיפה של האגוניסט הסלקטיבי TLR7, AZD8848. BMJ Open Respir Res. 2016;3(1): e000113.