מסלולים תלויים ועצמאיים בקולטן פחמימנים של אריל מתווכים השפעות אנטי-אייג'ינג של כורכומין

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

תַקצִיר:הקולטן לפחמימנים אריל (AhR) הוא גורם שעתוק המופעל על ידי ליגנד, אשר ניתן לווסת את פעילותו על ידי פוליפנולים, כגון כורכומין. ל-AHR ולכורכומין יש השפעות אבולוציוניות שמורות על ההזדקנות. כאן, חקרנו האם וכיצד ה- AhR מתווך את ההשפעות האנטי-אייג'ינג של כורכומין על פני מינים. באמצעות שילוב של ניתוחים in vivo, in vitro וסיליקו, הוכחנו שלכורכומין יש השפעות תלויות AhR או בלתי תלויות באופן ספציפי להקשר. מצאנו שב-Caenorhabditis elegans, AhR מתווך הארכת תוחלת חיים הנגרמת על ידי כורכומין, ככל הנראה באמצעות מנגנון מעכב בלתי תלוי בליגנד הקשור לפעילות נוגדת החמצון שלו. כורכומין גם הראה פעילויות אנטי-אייג'ינג עצמאיות של AhR, כגון הגנה מפני חלבונים המועדים לצבירה ולחץ חמצוני ב-C.elegans וקידום יכולת הנדידה של תאי אנדותל ראשוניים אנושיים. השפעות אלה שאינן תלויות AhR מתווך במידה רבה על ידי מסלול Nrf2/SKN-1.

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

מילות מפתח:קולטן פחמימנים אריל; כורכומין; מתח חמצוני; Caenorhabditis elegans; עכברים; תאי אנדותל; in vivo; בַּמַבחֵנָה; בסיליקו

1. הקדמה

קולטן הפחמימנים של אריל (AhR) הוא פקטור שעתוק המופעל על ידי ליגנד בכל מקום המזוהה כגורם הקובע לתגובה הטוקסיקולוגית ל-23,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin(TCDD) ביונקים [1]. מסלולי איתות AhR תוארו היטב בתאי יונקים. בקצרה, AhR לא-liganded ממוקם בציטופלזמה ומיוצב על ידי גורמים מגוונים, כגון 90-kDa heat shock protein (Hsp90), חלבון AHR-אינטראקציה (AIP) והצ'פרון p23. קשירה לליגנדים אקסוגניים (למשל, TCDD) או אנדוגניים (למשל, kynurenine) מקדמת את הטרנסלוקציה של קומפלקס זה לגרעין, שבו AhR מתנתק מהקו-גורמים שלו ומתכנס בהטרודימר עם ה-AHR nuclear translocator (ARNT). קומפלקס AHR/ARNT המתקבל נקשר לאלמנטים מגיבים לקסנוביוטיים (XRE) של סוללת גנים מגיבים לניקוי רעלים משלב I ו-II, מה שמוביל בסופו של דבר לפירוק הליגנדים [2]. מלבד תפקידו בתגובה קסנוביוטית, מתפקד עבור AhR במגוון תהליכים פתופיזיולוגיים, החל מחסינות [3,4], דלקת [5,6], מטבוליזם של שומנים וגלוקוז [7,8] ועד לב וכלי דם, כבד, ו מחלות איברים אחרות [9-12], התגלו בעשורים האחרונים. עדויות הולכות וגדלות מצביעות גם על תפקידים שונים ולכאורה סותרים של AhR בתהליך ההזדקנות, אשר בכל זאת ניתן ליישב, תוך התחשבות בהשפעות ספציפיות לרקמות, למינון ולמין [13].cistanche genghis khanתפקיד שלילי עבור AhR בהזדקנות ותכונות הקשורות לגיל תואר על פני מינים [14,15]. בהשוואה לסוג הבר Caenorhabditis elegans, לזן המוטנטי AhR,ahr-1(ju145), יש תוחלת חיים ובריאות ממושכת; בעכברים, מחסור ב-AHR משפר את תפקוד כלי הדם ומגביר את פעילות החנקן תחמוצת סינתאז, ולכן, את הזמינות הביולוגית של NO; ולבסוף, נמצא מתאם חיובי בין ביטוי AhR ונוקשות כלי דם בנבדקים בני אדם בגיל העמידה ובגילאי [14]. יתר על כן, במחקר אפידמיולוגי על אוכלוסייה סינית, ביטוי AhR היה קשור לשכיחות של מחלת עורקים כליליים [16].

Cistanche יכול אנטי אייג'ינג

יש לציין, תרכובות רבות המשפיעות על הזדקנות או מחלות הקשורות לגיל [17-19] יכולות לווסת את פעילות AhR [20-22]. בעוד שהפעלת AhR על ידי קסנוביוטיקה מובילה לסוגי סרטן שונים ביונקים [23,24], הוכחו לגורמים תזונתיים וסביבתיים השפעות הפוכות תלויות AhR על תוחלת הבריאות של C.elegans [25]. בין מאפננים תזונתיים של AhR, פוליפנולים כגון כורכומין נחקרו במידה רבה על ההשפעות הפרו-בריאותיות שלהם. כורכומין הוא פיגמנט צהוב מ-Curcuma longa, בעל תכונות מועילות רבות שנשמרו מבחינה אבולוציונית, כולל פעילויות נוגדות חמצון, אנטי דלקתיות ואנטי-אייג'ינג [26]. כורכומין מונע הצטברות חלבון ומגדיל את אורך החיים ב-C.elegans וב-Drosophila באמצעות אפנון של הומאוסטזיס חלבוני [27-29].הארכת חיי cistancheיתרה מכך, כאשר ניתנה למודל עכבר מהונדס של מחלת אלצהיימר, הוא הפחית באופן משמעותי את עומס העמילואיד-בטא(A) הכולל [30]. בעכברים ישנים, הכורכומין החזיר את הזמינות הביולוגית של NO, ובכך הפחית את הלחץ החמצוני ושיפור תפקוד לקוי של האנדותל וקשיחות העורקים המוערכת על ידי מהירות גלי דופק אבי העורקים (PWV) - אחת המדידות הקליניות החשובות ביותר או הסמנים של נוקשות עורק אלסטי גדול [31]. מספר מחקרים בבני אדם הראו גם השפעה מגנה של כורכומין על בריאות הלב וכלי הדם [32]. עם זאת, אופן הפעולה של כורכומין עדיין לא ברור במידה רבה, וחשוב מכך, האם ההשפעות הבריאותיות המועילות שלו מתווכות על ידי AhR לא נחקרה [33.34]

מודלים של אורגניזמים, כמו הנמטודה C.elegans, סייעו בזיהוי הגורמים הגנטיים והסביבתיים של ההזדקנות. זה נובע מתכונותיו הרבות והיתרונות, לרבות טיפול קל במעבדה, תוחלת חיים קצרה וייצור של מספר רב של צאצאים על ידי הפריה עצמית. הגנום של C.elegans הוא ברצף מלא, ורוב הגנים והמסלולים שלו נשמרים מבחינה אבולוציונית. רצף החלבון של AhR נשמר במהלך האבולוציה וב-C.elegans, האורתולוגים של AhR ו-ARNT מקודדים על ידי ה-Ahr-קשורים (ahr-1) ו-ahr-1 הקשורים (aha{{4) }}) גנים, בהתאמה [35]. החלבונים התואמים, AHR-1 ו-AHA-1, חולקים כ-40 אחוז מזהות הרצף שלהם עם היונקים ויוצרים הטרודימר (גם עם מקביליו ליונקים), שיכול לקשור את ה-XREs של המטרה. גנים במבחנה [36].cistanche nzAHR-1 מתבטא בעיקר בסוגי תאים עצביים, כגון נוירונים GABAergic [37l, והוא ממלא תפקיד מפתח בשליטה בהתפתחות הנוירונית [38]. בניגוד ל-AhR של בעלי חוליות, AHR-1 אינו קושר TCDD וקסנוביוטיקה קשורה אחרת [35,39], אך הוא חולק עם AhR של יונקים מאפיינים משותפים בוויסות תהליכים עצביים, התפתחות ופוריות [37,38,{ {8}}], מה שבסופו של דבר מציע שה-AhR הקדמוני לא היה מעורב ישירות בשליטה בגנים לפירוק של ליגנדים רעילים [44,45]. לכן זיהינו את C.elegans כמערכת מודל ייחודית וחזקה לזיהוי וללמוד את הפונקציות הקדומות של ה-AhR, שאולי לא קשורות לתגובת הקסנוביוטיקה שלו.

במחקר זה, חקרנו את התפקיד של AhR בהשפעות האנטי-אייג'ינג של כורכומין על פני מינים. באמצעות שילוב של ניתוחים in vivo, in vitro ו-siliko, מצאנו שכורכומין מציג השפעות אנטי-אייג'ינג מועילות שונות באמצעות מנגנונים בלתי-תלויים ב-ahr-1-ובלתי תלויים. מצאנו שבעלי חיים מדולדלים של C.elegans ahr-1- הם ארוכים אך רגישים יותר ללחץ חמצוני. בעוד שהכורכומין לא האריך עוד יותר את תוחלת החיים של המוטנטים של C.elegans ahr-1, הוא קידם את העמידות שלהם ללחץ חמצוני. כורכומין גם קידם את התגובה נוגדת החמצון ואת יכולת הנדידה של תאי אנדותל ראשוניים אנושיים (EC) ללא תלות ב-AhR, השפעה שהסתמכה בעיקר על Nrf2/SKN-1 על פני מינים. SKN-1 הוא האורתולוגי C.elegans של גורם שעתוק חיזור של גורם שעתוק החיזור Nrt2(גרעיני גורם גרעיני 2-related factor 2), אשר ממלא תפקיד משומר מבחינה אבולוציונית בהומאוסטזיס של תאים ואורגניזמים ותגובה ללחץ חמצוני [ 46,47]תוצאות צימוד ממבחן מדווח סלולרי ובמודל סיליקו של תחום AHR-1 ליגנד מחייב (LBD), אז הראינו שככל הנראה כורכומין דיכא את פעילות AHR-1 בליגנד- באופן עצמאי-מחייב. יש לציין, ובהתאם לנתונים ב-C.elegans ו-EC, כורכומין ופרו-אוקסידנטים הציגו השפעות הפוכות על פעילות AHR-1, מה שמרמז שכורכומין עשוי לווסת את פעילות AHR-1 באמצעות יכולת נוגדת החמצון שלו באופן ישיר או בעקיפין באמצעות הרגולציה של Nrf2/SKN-1 או חלבונים מווסתים חיזור אחרים.

2. חומרים ושיטות

2.1. C.elegan1s

2.1.1. C. elegans זנים וטיפוח

השתמשנו בזנים הבאים של C.elegans: N2 [wild-type], CZ2485 [ahr-1(jul45)], NV38b [alhr-1(ju145);unc-54p:Q40 :YFP], NV38wt [unc-54p::Q40:YFP] (הזן המקורי AM141 [48]), NV42a [unc-54p::alphasymuclein::YFP, ahr-1 (jul45)], NV42wt [unc-54p::alphasynuclein::YFPI (הזן המקורי NL5901 [49]), NV35a [ahr-1(ju145);(pAF15)gst-4 p::GFP::NLS], NV35wt (pAF15)st-4p::GFP::NLS](הזן המקורי CL2166). לצורך תחזוקה, התולעים נשמרו מסונכרנות על ידי הטלת ביצים ב-20 מעלות על מדיית גידול נמטודות לוחות (NGM) והוזנו ב-E.coli OP50, לפי השיטות המתוארות ב-[25]. לצורך הניסויים, תולעים סונכרנו על צלחות בתוספת E.coli HT115(DE3) על צלחות בתוספת 1 mM IPTG (Fisher Scientific, Geel, בלגיה).

2.1.2. השתקת גנים על ידי הפרעה בתיווך RNA (RNAi)

השתקת גנים הושגה באמצעות הזנת E.coli HT115(DE3) המבטאים פלסמידים עם dsRNA כנגד גנים ספציפיים [50]. האכלת RNAi בוצעה ברציפות מלידה ועד מוות. עבור בדיקת עמידות ל-juglone עם חיידקי HT115(skn-1), האכלה RNAi הוחלה מתולעי L4 למשך 24 שעות לפני העברתם לצלחות ג'גלון טריות.

2.1.3. E.coli זנים וצמיחה

חיידקים גודלו במדיום LB ב-37 מעלות למשך הלילה. בעת שימוש בוקטורים נושאי E.coli, למדיום LB נוספו 0.01 אחוז של אמפיצילין ו-0.0005 אחוז של tetracycline.E.coli HT115(L4440), HT115(ugt{{8} }),HT115(skn-1), ו-OP50 התקבלו מספריית RNAi של Ahringer C. elegans [51].

2.1.4. תוחלת חיים

ניתוח תוחלת החיים התחיל מאוכלוסיה מסונכרנת של תולעים, שהועברה לצלחות NGM טריות מדי יום במהלך תקופת הפוריות. לאחר שלב הפוריות, החיות הועברו כל יום לסירוגין. בעלי חיים מתים, חיים ומצונזרים קיבלו ניקוד במהלך תהליך ההעברה. בעלי חיים נספרו כמתים כאשר הם לא הראו תנועה, או תגובה לגירוי ידני עם חוט פלטינה, ולא פעילות שאיבה של הלוע. צונזרו בעלי חיים עם בקיעה פנימית (שקיות), ופות התפוצצות, או שמתו מיובשות על הקיר. מספר החיות המתות והמצונזרות שימש לניתוח הישרדות ב-OASIS[52] או OASIS 2[53]. לחישוב תוחלת החיים הממוצעת ועקומת ההישרדות ב-OASIS וב-OASIS 2, נעשה שימוש באומדן קפלן-מאייר, וערכי ה-p חושבו באמצעות מבחן ה-log-rank בין אוכלוסיות מאוחדות של בעלי חיים.

2.1.5. טווח תנועה/בריאות

התנועה נקבעה כפרמטר להזדקנות בריאה, והשלב של התנועה הפעילה מכונה טווח הבריאות. זה הוערך באוכלוסיות ששימשו לבדיקת תוחלת החיים. בעלי חיים, שזחלו באופן ספונטני או לאחר גירוי ידני, נחשבו כזזים, בעוד שבעלי חיים מתים או בעלי חיים ללא התנהגות זחילה נחשבו כלא זזים. ניתוח סטטיסטי נעשה כמתואר עבור תוחלת החיים.

2.1.6. טיפול בכורכומין של C. elegans

כורכומין (Sigma Aldrich, Taufkirchen, גרמניה) הומס ב-DMSO (Carl Roth, Karlsruhe, גרמניה) בריכוז של 100 mM וסופק ל-NGM לאחר חיטוי. הריכוז הסופי של כורכומין בתקשורת היה 100 מיקרומטר (0.1 אחוז DMSO). לוחות הבקרה הכילו 0.1 אחוז DMSO. תולעים טופלו ברציפות החל מביצים.

2.1.7. כימות של אגרגטים של PolyQ

אגרגטים של PolyQ40 הוצגו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (הגדלה של 100×) בתולעים בנות יום 10- שהורדמו עם 15 מ"מ נתרן אזיד (Sigma Aldrich, Taufkirchen, גרמניה). כדי להעריך את מספר האגרגטים, תמונות נתפרו באמצעות תוסף התפירה בזוגיות של פיג'י [54] כדי ליצור תולעים שלמות, ומספר האגרגטים כמת בפיג'י [55] באמצעות התוסף "Analyze Particles".

2.1.8. כימות של אגרגטים של x-Synuclein

צבירי סינקלאין בשרירי הראש של 7-תולעים בנות יום הוצגו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (400× הגדלה) בתולעים שהורדמו עם 15 mM נתרן אזיד (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany, S2002 ). התמונות פוצלו באמצעות Plastik (גרסה 1.3.0)(מעבדה של אנה קרשוק במעבדה האירופית לביולוגיה מולקולרית, היידלברג, גרמניה) (זמינה ב-https://www.ilastik.org/, נגישה ב-10 באפריל 2018)[56] . התמונות המפולחות שימשו לניתוח מספר האגרגטים בפיג'י [55] באמצעות התוסף "Analyze Particles".

2.1.9. ניתוח מונחי מיקרו-מערך ו-GO

נאספו דגימות מחמישה עותקים עצמאיים עם כ-{0}} תולעים בנות יום לכל מצב, וה-RNA חולץ ונטען לשבב Affymetrix. הנתונים הגולמיים של המיקרו-מערך בפורמט של CEL נותחו באמצעות התוכנה R (גרסה 3.4.2)(R Foundation, Vienna, Austria) ו-Bioconductor (The Bioconductor Project, Bioconductor הוא קוד פתוח ופיתוח פתוח) [57]. תיקון רקע, נורמליזציה וחישוב ביטוי בוצעו ב-oligo package58] ובשיטת RMA. עבור בקרת איכות של המערך, נעשה שימוש בחבילה arrayQualityMetrics 3.34.0 [59]. בגלל מדדי האיכות, מדגם ahr-1C5 לא נכלל בניתוח נוסף. הגנים המבוטאים בצורה דיפרנציאלית זוהו באמצעות חבילת Limma ומודל ליניארי וסטטיסטיקת t מתונה עם FDR כדי לבדוק השוואות מרובות [6{{20}}]. הוחל ערך p של 0.1. הגנים המובעים בצורה דיפרנציאלית נותחו להעשרת מונחים Gene Ontology באמצעות Cytoscape (גרסה 3.6.0) (The Cytoscape Consortium, ארגון עצמאי ללא מטרות רווח)[61] עם הפלאגין ClueGo (גרסה 2.5.0) (Laboratory of Integrative אימונולוגיה של סרטן, פריז, צרפת)[62]. ניתן לגשת לנתוני המיקרו-מערך דרך מספר ההצטרפות לביטוי Gene Expression Omnibus. GSE195769.

2.1.10.ROS כימות

MtROS זוהו בתולעי מוטציות חיות wt ו-ahr-1 באמצעות MitoSOX Red (Ther-moFisher Scientific, Dreieich, גרמניה). נמטודות סונכרנו על ידי הטלת ביצים על גבי לוחות IPTG תוך שימוש בחיידקי HT115(L4440) כמזון. לאחר מכן, 48 שעות מאוחר יותר, 50 בעלי חיים בשלב L4 הועברו לצלחות 10μM MitoSOX אדומות שהוכנו טריות עם זרעים עם HT115 (L4440) נהרג UV. התולעים הודגרו בחושך ב-20 מעלות. לאחר דגירה של 16 שעות, הם הועברו לצלחות NGM חדשות שנפרשו ב-HT115(L4440) חי למשך שעה אחת כדי להסיר שאריות צבע מהמעיים. לצורך הדמיה, נמטודות הותקנו על גבי שקופיות של 2 אחוז אגרוז, הורדמו על ידי הוספת 10 mM levamisole וקובעו על ידי ProLongTM Glass Antifade Mountant (ThermoFisher Scientific, Dreieich, גרמניה). התמונות נרכשו מיד עם מיקרוסקופ Zeiss Axio Imager M1 (Carl Zeiss, Inc., קלן, גרמניה) באמצעות אובייקטיבי 40× ומסנן DsRed. לאחר מכן, אזור ראש התולעת נבחר באופן ידני, והעוצמה המשולבת חושבה באמצעות תוכנת ההדמיה Fij 55.

2.1.11. בדיקת טטרמתילרודמין אתיל אסטר (TMRE).

כדי להעריך את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, נמטודות סונכרנו על ידי הטלת ביצים על צלחות IPTG זרעו עם חיידקי HT115(L4440). ביום הניסוי, TMRE(Invitrogen, Eugene, OR, ארה"ב) הומס ב-DMSO לריכוז של 5 מ"מ ולאחר מכן דילל ל-30 מיקרומטר עם HT115 (L4440) מושבת בחום (30 דקות, 65 מעלות). סך של 150 μL של תמיסה זו נוספו לכל צלחת והושארו לייבוש בחושך למשך כ-30 דקות. שישים תולעים סינכרוניות בוגרות בגיל 1, 3 או 5 ימים של בגרות נאספו על צלחות ה-TMRE שהוכנו והושארו לכתם להיספג במשך שעתיים בחושך ב-20 מעלות. לאחר הצביעה, תולעים הועברו לצלחות IPTG שנזרעו ב-HT115(L4440) מושבת בחום והודגרו במשך שעה אחת בחושך ב-20 מעלות, כדי להסיר שאריות צבע מהמעיים.גודל הפין cistancheלצורך הדמיה, 10 נמטודות הותקנו על גבי שקופיות של 2 אחוזים של כרית agarose, הורדמו על ידי הוספת 10 mM levamisole וקובעו על ידי ProLongM Glass Antifade Mountant (ThermoFisher Scientific, Dreieich, גרמניה). עבור כל ריצה ניסיונית, 5 שקופיות הוכנו לכל קבוצה. התמונות נרכשו מיד עם מיקרוסקופ Zeiss Axio Imager M1 (Carl Zeiss, קלן, גרמניה) באמצעות אובייקטיבי 2.5× ומסנן DsRed. עוצמת הקרינה חושבה באמצעות פיג'י [55].

2.1.12. בדיקת קצב שאיבה בלוע ותנועתיות

נמטודות N2 ו-CZ2485 סונכרנו על ידי הלבנה [63] והביצים הושארו למאגר ביצי הבקיעה (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl, 2mM MgCl2,25 mM Hepes, pH 7.3) למשך הלילה, בתנועות מסלוליות. זחלי L1 זוהו על גבי NGM בתוספת 1 mM IPTG ומכילים 0.1 אחוז DMSO או 100 מיקרומטר כורכומין. HT115 (L4440) חיידקים שימשו כמזון. תולעים בוגרות צעירות נאספו עם חיץ M9, עברו צנטריפוגה (300 גרם × 3 דקות), ונשטפו פעמיים כדי להסיר חיידקים. תולעים הודגרו עם 0-1 mM H, O, (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany) (100 תולעים/100 μL), למשך 2 שעות על ניעור מסלול. תולעי בקרה הודגרו עם חיץ M9 בלבד. לאחר שעתיים, תולעים הועברו ל-NGM בתוספת 1 mM IPTG ומכילה 0.1 אחוז DMSO או 100 מיקרומטר כורכומין והוזרעו בחיידקי HT115(L4440) כמזון. קצב שאיבת הלוע, ניקוד על ידי ספירת הפעמים שהבולה הסופית של הלוע התכווצה במרווח של 1 דקה (שאיבות/דקה), ובדיקת התנועתיות, הניקוד על ידי ספירת מספר הטראש בגוף (כיפופי גוף/דקה) ב חיץ M9 על פני מרווח של דקה 1, קיבל ניקוד מ-2 עד 20 שעות מאוחר יותר.

2.1.13.בדיקת רגישות ג'גלון חריפה

נמטודות N2 ו-CZ2485 סונכרנו על ידי הטלת ביצים על צלחות NGM עם DMSO או 100 מיקרומטר של כורכומין. לצלחות נוספו 1 mM IPTG ונזרעו בחיידקי HT115(L4440) או HT115(ugt-45) ​​כמזון. כדי להעריך את ההשפעה של העור -1 RNAi, התולעים סונכרנו על ידי הטלת ביצים על גבי לוחות DMSO או כורכומין עם זרע בחיידקי HT115(L4440). כאשר הנמטודות הגיעו לשלב הזחל L4, הן הועברו למשך 24 שעות לצלחות DMSO או כורכומין עם זרע בחיידקי HT115(עור-1). תולעים בוגרות ביום הראשון (25 תולעים) הועברו לצלחות NGM טריות המכילות 200 מיקרומטר Juglone (Merck, Darmstadt, גרמניה) ונזרעו עם 25 μL של 10× תרבית חיידקים מרוכזת למשך לילה. הישרדות התולעים תחת לחץ חמצוני המושרה על ידי ג'גלון נבדקה על ידי תנועה מעוררת מגע מדי שעה, במשך 6 שעות. בעלי חיים קיבלו ניקוד כמתים כאשר הם לא הגיבו למגע עם פיק חוט פלטינה. נמטודות שיובשו על הקיר צונזרו. מספר החיות המתות והמצונזרות נמדד והיישום המקוון לניתוח הישרדות OASIS2 הופעל לניתוח הישרדות [53].

2.1.14. כימות של GST-4:GFP Intensity

NV35wt ו-NV35a סונכרנו על ידי הטלת ביצים על צלחות NGM בתוספת של 1 mM IPTG ומכילות 0.1 אחוז DMSO או 100 μMcurcumin. חיידקי HT115（L4440）,HT115(ugt-45) ו-HT115(עור-7) שימשו כמזון. כדי לדמיין את הקרינה של GFP, תולעים בוגרות יום 1 הורדמו בתמיסת 10 מ"מ Levmisole הידרוכלוריד והותקנו על רפידות אגרוז של 2 אחוזים. התמונות נרכשו מיד עם מיקרוסקופ Zeiss Axio Imager M1 (Carl Zeiss, קלן, גרמניה), הגדלה של 2.5×) ולאחר מכן נותחו באמצעות התוכנה CellProfiler (צוות הפרויקט של CellProfiler, Cimini Lab ב-Broad Institute of MIT והרווארד, MA, ארה"ב). בקצרה, תמונות עובדו באמצעות צינור כדי לפלח תולעים בכל תמונה ממיקרוסקופיה של שדה בהיר ולהפריד אותן מהרקע. לאחר מכן, עוצמת ה-GFP המשולבת נמדדה לכל תולעת.

2.1.15.PCR בזמן אמת למחצה (qPCR) ב-C. elegans

נאספו דגימות מ-3 שכפולים עצמאיים עם תולעים בנות יום 1000 3-בערך לכל מצב ו-RNA חולץ. לאחר כביסה ואלוציה, תכולת ה-RNA כונתה באמצעות ספקטרופוטומטריה, ו-1-2 ug של RNA שימש לסינתזת cDNA (Omniscript RT Kit (Qiagen, Hilden, גרמניה).אבקת cistancheזוגות פריימר מפורטים בטבלה S1. עבור qPCR בזמן אמת, ה-cDNA דולל ב-1:2 0 ב-10 mM TRIS (pH8.0). לצורך התגובה, נעשה שימוש בערכת qPCR Green Core (Jena Biosciences, Jena, גרמניה)) או בערכת GoTaq⑧ qPCR (Promega, Walldorf, גרמניה). הדגימות הופעלו ב-MyiQ2 cycler (BioRad, Feldkirchen, גרמניה), והביטוי של כל דגימה נמדד בשני עותקים על אותה צלחת מרובת בארות. הביטוי חושב ביחס לגנים הייחוס לפעול-1 ול-CDC-42 באמצעות תוכנת iO5. כל הנתונים שנאספו הופעלו למחקר גנים לפי הוראות המשתמש של BioRad, והביטוי חושב באמצעות הביטוי המנורמל (ddCr). היעילות של כל תגובה של זוג פריימר נוספה לכימות נכונה של הביטוי המנורמל. היעילות הוערכה עם דילולים של 1:20, 1:100, 1:500 ו-1:2500 של ה-cDNA. מערכי ביטוי מנורמלים, השינוי בקיפול בהשוואה לסוג פראי חושב עבור כל שכפול.

2.2. תאים יונקים

2.2.1.טיפוח תאי Cos7

תאי Cos7 (ATTC, #CRL-1651) טופחו ב-37 מעלות ו-5% CO, ב-Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Gibco/ThermoScientific, Dreieich, גרמניה) עם 1 אחוז פירובט, 1 אחוז גלוטמקס ו-1 0 אחוז סרום בקר עוברי (FBS)(Gibco/ThermoScientific, Dreier-ich, Germany) ופניצילין נוספים (10.000 יחידות/מ"ל)/סטרפטומיצין (10.000 ug/ מ"ל) ברגע שהתאים בנו מדשאה של תאים משולבים, הם נותקו מהבסיס באמצעות 0.05 אחוז טריפסין/EDTA (Thermo Scientific, Dreieich, גרמניה).

2.2.2. טרנספקציה פלסמידים

השתמשנו בפלסמידים הבאים להעברה של תאי Cos7: pcDNA3, pcDNA3-Ahr-1-VP16,pcDNA3-AhA-1-VP16,pcDNA3-AhR -1(jul45)-VP16, p1A1-FL, Perl-TK. הפלסמידים מתוארים על ידי Larigot et al. (הוגש יחד עם מחקר זה). הפלסמיד p1A1-FL נושא לוציפראז הניתן ל-XRE, Perl-TK נושא לוציפראז רנילה, וה-pcDNA3-Ahr-1-VP16 ו-pcDNA3-AhA{{24 }}VP16 נושאים רצפים לביטוי של C.elegans AHR-1 ו-AHA-1, בהתאמה. עבור מחקר זה, יצרנו pcDNA3-AhR-1(LBD)-VP16 על ידי מוטגנזה מכוונת אתר של הפלסמיד pcDNA3-Ahr-1-VP16 עם QuikChange II Site-Directed ערכת Mutagenesis (Agilent, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב). צמד הפריימר הבא שימש ליצירת החלפה L ל-A ב-L363, ו-H ל-Qsubstitution ב-H365 של AHR-1:LBD-F5'-GAGAGCATCGGCGCGACCCAACGGCTGCTGAACGAG 3'andLBD-R5'-CTCGTTCAGCAGCCGTTGGCTCTCGCC{49} '.Super-competent XL1-תאים כחולים עברו טרנספורמציה עם הפלסמיד שהתקבל לצורך הגברה. רצף הפלסמיד אומת על ידי רצף Sanger.

2.2.3.טרנספקציה חולפת של תאי Cos7

ב-24 שעות לפני ההעברה,20,000 תאים/באר נזרעו בצלחת 48-באר ב-400 ul DMEM (בתוספת 10 אחוז FBS בתוספת אנטיביוטיקה) והודגרו ב-37 מעלות. לאחר מכן הועברו תאים עם ריכוזי הפלסמיד הבאים באמצעות lipofectamine 200 (Invitrogen, Eugene, OR, USA): p1A1-FL(244ng/well), Phil-TK(36ng/well),pcDNA3- AhA-1-VP16(5ng/well), או pcDNA3-VP16(10 ng/well), pcDNA3-Ahr-1-VP16(5ng/well) או pcDNA 3-AhR-1(ju145)-VP16(5 ng/well) כפי שתואר על ידי Larigot et al. (הוגש יחד עם מחקר זה). Lipofectamine 2000 שימש בריכוז של 1 ul/באר והודגרה מראש עם הפלסמידים המתאימים ב-DMEM למשך 20 דקות לפני השימוש. עבור ההעברה החולפת, תאי Cos7 הודגרו עם תערובת ליפופקטמין/פלסמיד for3hin DMEM (בתוספת 10 אחוז FBS) ללא אנטיביוטיקה כדי למנוע רעילות הנגרמת על ידי אנטיביוטיקה. לאחר מכן, מדיום ההעברה הוסר והוחלף ב-400 μL/באר DMEM (בתוספת 10 אחוז FBS בתוספת אנטיביוטיקה). התאים שהועברו הודגרו ב-37 מעלות. בכל צלחת לא הועברו 2 בארות של תאים ובכך נעשה שימוש למטרות נורמליזציה. 2.2.4.טיפול בתאי Cos7

פתרונות מלאי בריכוזים הגבוהים פי 1000- מריכוז הטיפול הרצוי הוכנו עבור כל התרכובות. כורכומין (Sigma Aldrich, Taufkirchen, גרמניה), Benzo(a)pyrene (Sigma Aldrich, Taufkirchen, גרמניה), Leflunomide (Sigma Aldrich, Taufkirchen, גרמניה)ולוטאין (Sigma Aldrich, Taufkirchen, גרמניה), הומסו ב-DMSO ( קרל רוט, קרלסרוהה, גרמניה), בעוד רזברטרול (סיגמה אולדריך, טאופקירכן, גרמניה) ורוטנון (סיגמה אולדריך, טאופקירכן, גרמניה) הומסו באתנול (קארל רוט, קרלסרוהה, גרמניה). ב-24 שעות לאחר ההעברה, מצע תרבית התאים של התאים הוחלף במדיום תרבית תאים המכיל דילול 1:100 של התרכובת המתאימה. התאים טופלו במשך 24 שעות לפני הערכת פעילות הלוציפראז.

2.2.5. Assay Luciferase (AhR Activity)

פעילות התעתיק של AhR הוערכה על ידי מדידת הפעילות של לוציפראז מונע XRE [64]. לשם כך, נעשה שימוש במערכת Assay Dual-Luciferase Reporter (Promega, Wall Dorf, גרמניה). לאחר טיפול של 24 שעות, תאי Cos7 נשטפו פעמיים עם PBS ולאחר מכן עברו ליטוש למשך 15 דקות ב-RT באמצעות חיץ תמוגה פסיבי הכלול בערכת Dual-Luciferase Reporter Assay. סה"כ 20 μL מהתאים המוארים הונחו בצלחת לבנה 96- ושימשו למדידות זוהר. מצעי הלוציפרין (LARII) והוניל (Stop&cGlo) הוכנו לפי תיאור היצרן. הדגימות הועמסו על luminometer (EG&G Berthold microplate Luminometer LB 96V Microluminomat plus (Berthold Technologies, Bad Wildbad, גרמניה), והמצעים הוצמדו למערכת הצינורות של luminometer. ראשית, נוספו 65 uL של LARII לכל באר. של המדגם, ונמדדה הארה שהופקה ע"י לוציפראז הגחלילית, לאחר מכן נוספו 65 μL של מגיב Stop&clo ונמדדה הזוהר שהופק ע"י ה-Renilla luciferase. כדי להעריך את פעילות AhR ממדידות הזוהר, ביצענו את הפוסט-עיבוד הבא שלבים: ראשית, הארה של תאים לא שעברו טרנספקציה הופחתה מהזוהר של כל דגימה לצורך תיקון רקע. בשלב הבא, נרמלנו את זוהר הלוציפראז לזוהר הרנילה של אותה דגימה כדי לבטל הבדלים בקצב ההעברה ובתא שלב נורמליזציה נוסף לתאים שעברו העברת pcDNA-VP16 בוצע עבור כל קבוצת טיפול כדי להסיר AhR-indep השפעות סופיות על הלוציפראז המונע על ידי XRE.

מאמר זה מופק מ- Antioxidants 2022, 11, 613. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants