היעדר לכאורה של BMAL1-הצלבת שריר שלד-כליות תלות בעכברים Ⅱ

3. תוצאות

3.1. אימות של דגם iMS-BMAL1 KO

הנוקאאוט עבור העכברהמודל במחקר זה הושרה על ידי טמוקסיפן; לכן, היעילות של זריקה זו הוערכה עבור כל העכברים. רקומבינציה PCR עבור BMAL1 על רקמת שריר השלד הזכרי מ-iMS-BMAL1 KO הניב שתי פסים לאישור רקומבינציה על ידי הזרקת טמוקסיפן, פס אחד של 431 bp המייצג את האלל Bmal1 floxed ופס של 572 bp המייצג את תוצר הרקומבינציה [11] (איור ). פס בודד של 431 bp מצביע על חוסר רקומבינציה כפי שניתן לראות בעכברים שטופלו ברכב. נוק-אאוט אומת בכל העכברים באמצעות PCR רקומבינציה לאחר המתת חסד. במודל עכבר זה, BMAL1 צריך להיות דפוק רק בתוך שרירי השלד. ביטוי חלבון BMAL1 הוערך בקטעי כליות כדי לוודא שאין השפעה. ניתוח של BMAL1 המסומן על ידי מערכת החיסון (כתם חום) הוכיח שביטוי BMAL1 ב-הכליה אינה מושפעתבעכברי iMS-BMAL1 KO (איור 1B). צביעה גרעינית חומה BMAL1 נמצאה בכל תאי הכליה בשתי הקבוצות.

איור 1. ביטוי BMAL1 אינו משתנה בכליות של iMS-BMAL1 KO. (א) בדיקת PCR רקומבינציה ברקמת שריר השלד. הפריימרים קדימה ואחורה עבור אלל Bmal1 הפלוקס הניבו פס של 431 bp, אשר נראתה בעכברי iMS-BMAL1 KO ועכברי בקרה. פריימר שני קדימה זיהה את המוצר המשולב עם פס של 572 bp, שנראה רק ב-iMS-BMAL1 KO. ArroWindices להקה שנמצאה בעכברי נוקאאוט. (ב) תמונות מייצגות של קטעי כליות המדגימים ביטוי חלבון BMAL1 בעכברי בקרה ו-iMS-BMAL1 KO. האיור מציג את קליפת הכליה. סמנים מצביעים על תאי BMAL1-חיוביים. סרגל קנה המידה מייצג 0.05 מ"מ. העכברים המוצגים באיור הם מקבוצת התקדמות השלב. S=סולם סטנדרטים, עכברי CL=בקרה, עכברי KO=iMS-BMAL1KO.

3.2. נוזל ומומס

טיפול בתנאים בסיסיים ובעקבות דלדול אשלגן מכיוון שהכליה כל כך עמידה בפני הפרעות פיזיולוגיות, במיוחד בעכברי C57Bl/6 [15], אתגרנו קבוצה של עכברים באמצעות מניעת אשלגן בתזונה. הראינו בעבר כי עכברי KO זכרים BMAL1 ספציפיים לכליה מציגים פנוטיפ לטיפול בנתרן בתגובה לדיאטת K אפס [10]. גם עכברי הבקרה וגם עכברי iMS-BMAL1 KO הפרישו 34% פחות נתרן בעקבות דיאטה דלת אשלגן בהשוואה לקו הבסיס; עם זאת, לא היה הבדל בהפרשת הנתרן בין שתי הקבוצות מהשתן שנאסף במהלך התקופות הפעילות או הלא פעילה (איור 2A, B). כצפוי, הפרשת אשלגן ירדה לרמות מינימליות תוך 24 שעות לאחר דלדול האשלגן במהלך התקופות הפעילה והלא פעילה (איור 2C, D). לא היה הבדל בין עכברי ביקורת ו-iMS-BMAL1 KO בהפרשת אשלגן. סך המים בגוף עלה ב-6% בעקבות דלדול האשלגן בשתי הקבוצות (איור 2E). בנוסף, הייתה מגמה שלעכברי iMS-BMAL1 KO יש יותר מים בגוף מאשר לבקרה עם עכברי iMS-BMAL1 KO עם רמות גבוהות ב-2-3% מהביקורת, אם כי זה לא היה משמעותי (p=0.06 ).

איור 2. לא היה הבדל בטיפול בנתרן בין קבוצות בעקבות דלדול אשלגן הפרשת נתרן במהלך (A) בשעות הלילה ו-(B) בשעות היום מביקורת גברית ו-iMS-BMAL1 KOMice שטופלו בדיאטה רגילה וחמישה ימים של דיאטה דלת אשלגן. הפרשת אשלגן במהלך (C) בשעות הלילה ו-(D) בשעות היום באותם עכברים. איסוף שתן בוצע כל 12 שעות (E) סך כל המים בגוף נורמלו למשקל הגוף מעכברים לפני ואחרי הטיפול בן חמישה ימים עם דיאטה דלת אשלגן. (ו) ניתוח סטטיסטי עבור כל פאנל באיור 2. n=4-5. הערכים הם ממוצע + SEM. ANOVA דו כיווני שימש להשוואת קבוצות. מבחן ההשוואות המרובות של Sidak שימש להשוואה בין ביקורת ל-KO בתוך קבוצות טיפול. *=p < 0.05, **=p < 0.001UNaV=הפרשת נתרן בשתן; UKV= הפרשת אשלגן בשתן; תזונה רגילה=רגילה; LowK= יום של טיפול דיאטה דל אשלגן.

3.3. הערכת תפקוד מיטוכונדריאלי

בעבר, חוסר יעילות מטבולית קשורה למחיקת BMAL1 [7,12,16,17. כדי לקבוע אם השפעה של נוק-אאוט BMAL1 בשריר השלד השפיעה על המיטוכונדריה הכלייתית, הערכנו תחילה את הביטוי של חלבון ניתוק המיטוכונדריאלי 1 (UCP1) בקליפת הכליה של עכברי iMS-BMAL1 KO בהשוואה לביקורת. ביטוי חלבון UCP1 בקליפת המוח הכלייתית הבסיסית נטה להיות גבוה יותר בעכברי iMS-BMAL1 KO בהשוואה לבקרות אך לא הגיע למשמעות (איור 3A, B; p=0.058). בשל ההבדלים העדינים ב-UCP1 קליפת המוח, גישה קפדנית יותר להערכת ההשפעה של iMS-BMAL1 KO על תפקוד המיטוכונדריה הכלייתי בוצעה על ידי ביצוע מבחני נשימה ברזולוציה גבוהה על מיטוכונדריה מבודדות מ-אזורי קליפת המוח של הכליות. תפקוד נשימתי מיטוכונדריאלי בקליפת המוח הכלייתית בכל מצב נשימה שנמדד (L, PCI, PCI+II, ECI+II, ECII, ECIV) וכן יחסי בקרת השטף היו דומים בין הקבוצות (איור 3C, D). יחס בקרת הנשימה, אינדיקטור של נשימה מצמדת (PCI/L), היה ממוצע של 3.4 ו-3.3 עבור עכברי בקרה ו-iMS-BMAL1 KO, בהתאמה. קיבולת חילוף (או רזרבה), ההבדל בין קיבולת OXPHOS מקסימלית (PCI+II) לקיבולת ETS מקסימלית (ECI+II), היה 22% ו-19% מ-ECI+II עבור עכברי בקרה ו-iMS-BMAL1 KO, בהתאמה, ועשה זאת. לא שונה משמעותית.

3.4. סמנים דלקתיים בכליה

שרירי השלד הוכחו בעבר כגורמים לעלייה בדלקת בכליה על ידי שחרור פסולת מטבולית. פאנלים של סמני דלקת ופציעה נמדדו בקליפת הכליה ובמדולה של iMS-BMAL1 KO ועכברי ביקורת. רמות אינטרלוקין קורטיקלי (lL) 6 היו גבוהות יותר פי 7 בעכברי iMS-BMAL1 KO בהשוואה לבקרות (טבלה 1). באופן דומה, הייתה מגמה של רמות IL-6 להיות גבוהות יותר ברקמה המדולרית של עכברי iMS-BMAL1 KO בהשוואה לבקרות, אבל זה לא הגיע למשמעות (p= 0.07). מעכב הרקמות המדולרי של רמות metalloproteinase 1 (TlMP-1) נמצא גם גבוה יותר בעכברי iMS-BMAL1 KO, כמעט פי 2 מזה של הביקורת (טבלה 1). לא היה הבדל ברמות מולקולות גדילה פיברובלסט 23, IL-10, רנין או פגיעה בכליות ברקמת קליפת המוח או המדולרית מ-iMS-BMAL1 KO לעומת עכברי ביקורת. בנוסף, לא נמצא הבדל ברמות IL-5, IL-17 או TIMP-1 בין שתי הקבוצות (טבלה 1).

3.5. פגיעה ותפקוד כלייתי

לחץ צירקדי התנהגותי, כגון ג'ט לג, מוביל להשפעות מזיקות על הבריאות הכללית [18,19]. מכיוון שנראה שחוסר האשלגן בתזונה לא משפיע באופן דיפרנציאלי על עכברי iMS-BMAL1 KO במונחים של תפקוד הפרשת הכליה, שיערנו שהפרעה צירקדית התנהגותית עשויה לשנות את תפקוד הכליות ב-iMS-BMAL1 KO בהשוואה לעכברי ביקורת. התקדמות שלב היא שיטה נפוצה לגרימת הפרעה צירקדית [20,21]. עכברים עברו פרוטוקול של 2-שבוע, 14-שעות להקדמת שלב כדי לשנות את פרקי הזמן שלהם בלילה/יום. GFR היה דומה בין iMS-BMAL1 KO ועכברי בקרה לפני ואחרי התקדמות השלב (איור 4A). נצפתה פגיעה צינורית מינימלית בעכברי iMS-BMAL1 KO ובבקרות בעקבות הערכה היסטולוגית של קטעי כליות שנאספו לאחר התקדמות השלב (איור 4B).

3.6. השפעות חוץ-כליות של iMS-BMAL1 KO

בהתחשב בחוסר פנוטיפ בכליה של עכברי iMS-BMAL1 KO, בדקנו את הריאה כדי לקבוע אם אובדן ספציפי לשריר השלד של BMAL1 משפיע לרעה על רקמות אחרות. ריאות נאספו מעכברים בעקבות פרוטוקול קדמת השלב עבור ציטומטריית זרימה כדי להעריך סמנים דלקתיים [14]. מצאנו שפרופיל ההתאמה של תאים שמקורם במח עצם של חדירת תאים מדכאים מונוציטיים ונויטרופיליים (Mo-MDSC ו-PMN-MDSC, בהתאמה) אימונומודולטוריים מונוציטיים ונויטרופיליים (Mo-MDSC ו-PMN-MDSC, בהתאמה) גדל בריאות של עכברי iMS-BMAL1 KO לעומת ביקורת (איור 5) ). ממצאים אלה מצביעים על תכנות מחדש פוטנציאלי של אוכלוסיית תאי החיסון עם הפרעה באיתות BMAL1 בשרירי השלד.

איור 4. שיבוש שעון בשרירי השלד אינו משפיע על תפקוד הכליות או גורם לפציעה צינורית. (א) קצב סינון גלומרולרי נמדד באמצעות מוניטור תת עורי לפני ואחרי התקדמות השלב בעכברי בקרה ו-iMS-BMAL1 KO. n=5. (ב) תמונות מייצגות של קטעי כליות מוכתמים בהמטוקסילין ואאוזין מעכברי בקרה ו-iMS-BMAL1 KO בעקבות התקדמות השלב. אזור קליפת המוח מוצג. סרגל קנה המידה מייצג 0.05 מ"מ. (ג) אחוז הצינוריות המציגות סימני פציעה הנראים בחלקי כליה מוכתמים משתי קבוצות העכברים. n=4–5. כל הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. ANOVA דו-כיווני שימש להשוואת נתוני קצב הסינון הגלומרולרי של הקבוצות. מבחן t של התלמיד שימש להשוואת קבוצות מנתוני הערכת פגיעה בצינורית. GFR=קצב סינון גלומרולרי; NS=לא משמעותי

ממוצע ± SEM. מבחן t של הסטודנט שימש להשוואות בין קבוצות. Mo-MDSC=תאי מדכא מונוציטי מיאלואיד; PMN-MDSC=פולימורפו-גרעיני

4. דיון

הממצא העיקרי ממחקר זה הוא שמחיקת BMAL1 בשרירי השלד לא תרמה לשינויים בתפקוד הכליות או הובילה לפגיעה כלייתית גלויה בתנאים שנבדקו. ישנן דרכים שונות שבהן שרירי השלד יכולים להשפיע לרעה על תפקוד הכליות, כולל שחרור פסולת מטבולית ותרומה לתנגודת לאינסולין [22,23]. יתר על כן, שיבוש השעון בשרירי השלד מייצר פנוטיפ הזדקנות בעכברים (מאפיין נוסף להתפתחות מחלת כליות) [6,16]. למרות עכברי iMS-BMAL1 KO שהפגינו מאפיינים של הזדקנות וסימנים של דלקת כלייתית מוגברת, לא זוהתה פגיעה כלייתית או ירידה בתפקוד הכלייתי.

שינויים פתולוגיים בכליות הנגרמים על ידי גיל כוללים התפתחות גלומרולוסקל. רוזיס, פיברוזיס אינטרסטיציאלי ואובדן צינורי [24,. התקדמות אלו בפגיעה בכליות מובילות לירידה ב-GFR ולחוסר תפקוד בטיפול במומסים ובמים. במחקר זה, GFR וטיפול במומסים הוערכו כדי לקבוע את תפקוד הכליות. עכברים היו מאותגרים עם (1) שינוי באשלגן בתזונה כדי לשנות את הטיפול במומסים או (2) שינוי בלוח הזמנים של הלילה/יום כדי לחשוף כל חריגות פוטנציאליות בתפקוד הכליות. מחקרים בעכברים ובבני אדם מראים באופן עקבי שדלדול אשלגן בתזונה מוביל לעלייה באחזקת נתרן [25-28]. שתי קבוצות העכברים במחקר זה הדגימו שימור נתרן בעקבות דיאטה דלת אשלגן, כצפוי, אך לא היה הבדל בטיפול במומסים בין הקבוצות לפני או אחרי מניפולציה תזונתית. GFR היה דומה גם בין הקבוצות לפני ואחרי התקדמות השלב. לא ראינו שום סימנים של פגיעה כלייתית, לא דווח על הבדל בהאכלה או בפעילות בין קבוצות עכברים אלו ממחקרים קודמים [7,12]. בסך הכל, לא היו שינויים בתפקוד הכליות הדומים למה שרואים בפנוטיפ מיושן.

יש שפע גבוה של מיטוכונדריה בקשור לכליהעם צריכת חמצן גבוהה, שהיא שנייה רק ​​ללב [29]. אספקת ATP חשובה ביותר לתפקוד הכלייתי, ופגיעה במיטוכונדריה נקשרה להתקדמות של מחלת כליות [22,30]. בהתבסס על דיווחים קודמים על חוסר יעילות מטבולית בעכברי BMAL1-KO ספציפיים לשלד-שריר וגלובליים [7,12,16,17], הערכנו את תפקוד המיטוכונדריאלי הכלייתי. היעדר BMAL1 בשרירי השלד והשינויים הנלווים במודל עכבר זה לא השפיעו על תפקוד נשימתי המיטוכונדריאלי בכליה.

הומאוסטזיס אלקטרוליט מושפע מאוד מה-פעולות של שרירי השלד, במיוחד בתגובה למחסור באשלגן [31]. התפקיד הפוטנציאלי של שריר השלד BMAL1 בשינוי התוך תאי של איזון האשלגן בתגובה לדלדול האשלגן לא הוערך כאן. מחקר זה התמקד בכליה, שהיא הרגולטור הסופי של איזון האלקטרוליטים. מעניין לציין כי עכברי iMS-BMAL1 KO הפגינו הפרשת אשלגן נמוכה יותר במהלך שלב המנוחה בתזונה רגילה בהשוואה לעכברי ביקורת. יש לציין כי לא נראה הבדל בשלב הפעיל, כלומר כאשר רוב ההפרשה מתרחשת. בנוסף, כאשר משולבים נתוני השלב הפעיל והלא פעיל, אין הבדל בהפרשת 24-שעות. מגבלה של מחקר זה היא שלא הצלחנו להעריך אשלגן בסרום בתום מחקר דלדול האשלגן בתזונה. זהו פרמטר חשוב שיש לקחת בחשבון בעת ​​הערכת דיבור צולב בין שרירי השלד והכליות.

עכברי iMS-BMAL1 KO הפגינו מאפיינים רבים של פנוטיפ לא בריא ומיושן, כולל הליכה שונה, ניידות מופחתת, חולשת שרירים ופגיעה בספיגת גלוקוז [6,7,12,16]. ניכרו אינדיקטורים להשפעה שלילית של מחיקת BMAL1 בשרירי השלד על איברים אחרים. מחקר זה בדק את ההשפעה על הכליה. למרות שרמות גבוהות של TIMP-1 ו-IL-6 נקשרו להתפתחות שלמחלת כליות[32,33], נתונים במחקר זה מצביעים על כך שתפקוד הכליות אינו מושפע למרות עלייה משמעותית בסמנים אלו. כפי שהוכח על ידי עלייה בחדירת מונוציטים ונויטרופילים לרקמת הריאה מעכברי iMS-BMAL1 KO, איברים נוספים כולל הריאות עשויים להפגין תפקוד שונה.

מתן טמוקסיפן הוכח כגורם לתופעות לוואי שליליות. הוכח כי טמוקסיפן מעורר התפתחות בקע בעכברים זכרים [34]. מצד שני, טמוקסיפן הוכיח מאפיינים אנטי-פיברוטיים ב-aמחלת כליותדגם [35]. במחקר זה, היה צורך בטיפול בטמוקסיפן במינון נמוך למשך חמישה ימים בלבד כדי לגרום לנוק-אאוט של BMAL1 משריר השלד. העכברים לא נשמרו על טמוקסיפן במשך תקופה ארוכה. בנוסף, ניסויים לא נערכו בעכברים עד חמישה שבועות לאחר טיפול בטמוקסיפן. אין זה סביר שטמוקסיפן השפיע על תוצאות המחקר הזה.

5. מסקנות

לסיכום, עכברים זכרים עם מחיקת BMAL1 בשריר השלד לא הראו שינוי בתפקוד הכליות אופגיעה בכליותבתנאים שנבדקו. הממצא של דלקת בריאות מצביע על כך שאיברים חוץ-כליים עשויים להיות מושפעים מהפרעה בשעון בשרירי השלד, ללא תלות בשינויים בכליה. בסך הכל, הכליה מפגינה עמידות לפנוטיפ ההזדקנות שמציגים עכברי iMS-BMAL1 KO.

תרומות מחבר:

המשגה, GRC, SEW, AJB, KAE ו-MLG; אצור נתונים, SEW, CAW, MAG-M., CMD, EE, K.-YC, SHM ו-DB; ניתוח פורמלי, GRC, CMD, EE, K.-YC, SHM, DB, AJB, KAE ו-MLG; רכישת מימון, KAE ו-MLG; חקירה, GRC; מתודולוגיה, GRC, CAW, AJB ו-MLG; ניהול פרויקטים, MLG; משאבים, MLG; טיוטה מקורית בכתיבה, GRC, KAE ו-MLG; כתיבה-סקירה ועריכה, GRC, SEW, CAW, MAG-M., CMD, EE, K.-YC, AJB, KAE ו-MLG כל המחברים קראו והסכימו לגרסה שפורסמה של כתב היד.

הפניות

1. Yoo, SH; ימאזאקי, ש.; Lowrey, PL; שימומורה, ק.; קו, CH; Buhr, ED; Siepka, SM; הונג, HK; אה, WJ; יואו, OJ; et al. תקופה 2: דיווח של לוציפראז בזמן אמת על דינמיקה יממה חושף תנודות מחזוריות מתמשכות ברקמות היקפיות של עכברים. פרוק. נאטל. אקד. Sci. ארה"ב 2004, 101, 5339–5346. [CrossRef] [PubMed]

2. Partch, CL; גרין, CB; Takahashi, JS ארכיטקטורה מולקולרית של השעון הצירקדי של היונקים. טרנדים Cell Biol. 2014, 24, 90–99. [CrossRef] [PubMed]

3. Gumz, ML בסיס מולקולרי של קצב יממה בפיזיולוגיה של הכליות ובפתופיזיולוגיה. Exp. פיזיול. 2016, 101, 1025–1029. [CrossRef]

4. ריצ'רדס, ג'יי; Gumz, ML מנגנון של השעון הצירקדי בפיזיולוגיה. אמ. J. Physiol. רגיל. אינטגר. Comp. פיזיול. 2013, 304, R1053–R1064. [CrossRef] [PubMed]

5. Egstrand, S.; מייס, ML; אולגורד, ק.; לוין, E. השעון הצירקדי של כלי הדם במחלת כליות כרונית. Cells 2021, 10, 1769. [CrossRef] [PubMed]

6. שרדר, EA; Harfmann, BD; ג'אנג, X.; סריקואה, ר.; אנגליה, JH; Hodge, BA; וון, י.; ריילי, לוס אנג'לס; יו, ש; כריסטי, א.; et al. שעון שריר פנימי הכרחי לבריאות השרירים והשלד. J. Physiol. 2015, 593, 5387–5404. [CrossRef]

7. הרפמן, בי"ד; שרדר, EA; קכמן, מ"ט; Hodge, BA; ג'אנג, X.; Esser, KA אובדן ספציפי לשריר של bmal1 מוביל לשיבושים בחילוף החומרים של גלוקוז ברקמות ולהומאוסטזיס סיסטמי של גלוקוז. שלד. Muscle 2016, 6, 12. [CrossRef]

8. אוסאליבן, ED; יוז, ג'יי; Ferenbach, DA הזדקנות הכליות: גורמים והשלכות. J. Am. Soc. נפרול. 2017, 28, 407–420. [CrossRef]

9. שי, ז.; סו, ו.; ליו, ס.; ז'או, ג'; איסר, ק.; שרדר, EA; Lefta, M.; סטאוס, ח"מ; גואו, ז.; Gong, MC Bmal1 עם שרירים חלקים משתתף בוויסות הקצב הצירקדי של לחץ הדם. ג'יי קלין. תחקור. 2015, 125, 324–336. [CrossRef] 10. Crislip, GR; דומה, LG; מאסטן, ש; צ'נג, KY; לינץ', IJ; ג'ונסטון, JG; בראל, ד.; Glasford, KB; Holzworth, MR; Verlander, JW; et al. הבדלים בתרומת bmal1 הכלייתית ל-na. אמ. J. Physiol. רן. פיזיול. 2020, 318, F1463–F1477. [CrossRef]

11. מורלה, ל. שור, או.; לינץ', IJ; מריט, אני; Wingo, CS שיטה לא פולשנית לחקר התפתחות נפח הנוזל החוץ-תאי בעכברים באמצעות תהודה מגנטית גרעינית של תחום הזמן. אמ. J. Physiol. רן. פיזיול. 2020, 319, F115–F124. [CrossRef] [PubMed]

12. Hodge, BA; וון, י.; ריילי, לוס אנג'לס; ג'אנג, X.; אנגליה, JH; Harfmann, BD; שרדר, EA; Esser, KA השעון המולקולרי האנדוגני מתזמר את ההפרדה הזמנית של חילוף החומרים המצע בשרירי השלד. שלד. Muscle 2015, 5, 17. [CrossRef] [PubMed]

13. הריסון, DK; פאשינג, מ.; פונטנה-איוב, מ.; Gnaiger, E. מצבי חיזור ציטוכרום ובקרת נשימה במיטוכונדריה של לב עכברים ובשר ברמות יציב של היפוקסיה. J. Appl. פיזיול. (1985) 2015, 119, 1210–1218. [CrossRef] [PubMed]

14. אוליביירה, AC; פו, ג; לו, י.; וויליאמס, MA; פי, ל.; ברנטלי, ML; Ventetuolo, CE; רייזאדה, חבר הכנסת; מהראד, ב.; סקוט, EW; et al. ציר האיתות הכימוקין בין תאי האנדותל והמיאלואידים מסדיר את התפתחות יתר לחץ דם ריאתי הקשור לפיברוזיס ריאתי והיפוקסיה. אמ. J. Physiol. תא ריאות מול. פיזיול. 2019, 317, L434–L444. [CrossRef]

15. ראב, מ.; Schaefer, F. מודלים לא מהונדסים של עכברים של מחלת כליות. Nephron 2016, 133, 53–61. [CrossRef]