פוטנציאל נוגד חמצון, אנטי דלקתי ואנטי אייג'ינג של תמצית קלמיה אנגסטיפוליה וזיהוי של כמה תרכובות עיקריות חלק 1

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

תַקצִיר:הזדקנות העור היא המרכיב הגלוי ביותר בתהליך ההזדקנות, מה שמעורר דאגה גדולה עבור אנשים רבים. לצמחים ממשפחת Ericaceae יש בדרך כלל תכונות נוגדות חמצון ואנטי דלקתיות, מה שהופך אותם למרכיבים פעילים פוטנציאליים אנטי אייג'ינג. מחקר זה נועד להעריך את הבטיחות והיעילות האנטי-אייג'ינג של תמצית Kalmia angustifolia באמצעות תחליפי עור משוחזרים. הערכת הבטיחות בוצעה באמצעות מבחן 3-(4,5-dimethyl thiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), בעוד שהיעילות הייתה נקבע על ידי הערכת פעילות נוגדת חמצון ואנטי דלקתית וניתוח תחליפי עור משוחזרים לפי שיטת ההרכבה העצמית על ידי היסטולוגיה וצביעה אימונופלואורסנטית (אלסטין, קולגן-1, קולגן-3, אקוופורין-3) . בדיקת כדאיות התא קבעה את בטיחות התמצית בריכוז של עד 200 ug/mL. בדיקת Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) ומבחן מבוסס תאים באמצעות 2',7'-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) חשפו פעילות נוגדת חמצון חזקה עם ערך ORAC של 16 מיקרומול טרולוקס שווה ערך/מ"ג וחצי- ריכוז מעכב מקסימלי （IC50） של 0.37±0.02 ug/mL, בעוד שנמצאה פעילות אנטי דלקתית מעניינת בעיכוב ייצור NO, עם אחוז עיכוב של ייצור NO של 49±2 אחוז ב-80 ug/mL. הבידוד והאפיון של התמצית אפשרו זיהוי של תרכובות שיכולות להיות אחראיות לפעילויות ביולוגיות אלו, כאשר שתיים מהן זוהו לראשונה ב-K.גזע cistancheAngustifolia: avicularia ו- epicatechin-(2 -O-7, 4 -6)-ent-epicatechin. ניתוחים היסטולוגיים של תחליפי עור שטופלו בתמצית הראו עלייה בעובי העור בהשוואה לביקורות. תמצית K. Angustifolia הגבירה את הביטוי של אלסטין וקולגן-1, אשר בדרך כלל מופחתים עם הזדקנות העור. תוצאות אלו מצביעות על כך שלK. Angustifolia יש יעילות נוגדת חמצון מבטיחה ופוטנציאל אנטי אייג'ינג.

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

מילות מפתח: תחליפי עור; הזדקנות העור; מוצרים טבעיים; רכיבים פעילים; כבשה לורל; פעילות נוגדת חמצון; פעילות אנטי דלקתית; הנדסת רקמות

1. הקדמה

הזדקנות העור היא תהליך פיזיולוגי טבעי המדאיג אנשים רבים. זהו הראשון "סימן גלוי להתקדמות הגיל ולניוון העור. לפיכך, הניסוח של אנטי אייג'ינג: מוצרי קוסמטיקה קיבלו חשיבות בשנים האחרונות בשל הרצון להגביל את הופעת ההזדקנות הזו. הזדקנות העור מאופיינת על ידי שינויים מרובים ברמה ביולוגית, הכוללים ירידה בשגשוג התאים, וכתוצאה מכך ניוון אפידרמיס, וירידה ברכיבי עור כמו פיברובלסטים וסיבי אלסטין וקולגן, ובכך ירידה בעובי העור במבוגרים יותר [1,2] היער הבוראלי מלא במשאבים לא נחקרים עם פוטנציאל רב לפיתוח של חומרים פעילים קוסמטיים.. Kalmia angustifolia, הידוע גם בשם דפנה כבשה, הוא צמח אנגיוספירמי ממשפחת האריקאצ'ים.יתרונות ותופעות לוואי של cistanche tubulosaצמח זה מקורו במזרח צפון אמריקה אך נמצא בעיקר ביער הבוריאלי הקנדי [3]. ברפואה האינדיאנית המסורתית השתמשו ב-K. Angustifolia לטיפול בבעיות בריאות שונות הכרוכות בדלקות, כגון כאבי בטן, נקעים ונפיחות, מה שמצביע על כך שלצמח זה יש תכונות אנטי דלקתיות [4]. לצמחים שונים ממשפחת ה- Ericaceae יש גם תכונות אנטי דלקתיות ונוגדות חמצון, ההופכות אותם לחומרים פעילים קוסמטיים מעניינים. ההרכב הכימי של K.angustifolia עדיין לא מתועד היטב. כמה מחקרים זיהו תרכובות רעילות, כגון גריאנוטוקסינים, שהם רעלנים עצביים רעילים לבני אדם בעת בליעה, אך לעתים נדירות קטלניים, ו-arbutin(4-hydroxyphenyl -D-glucopyranoside), מעכב טירוזינאז שנמצא בעלים של K. Angustifolia ומשמש כגורם לדיפיגמנטציה [5-8]. למרות תרכובות אלה שעלולות להיות רעילות שנמצאו ב-K. Angustifolia, מחקרים אחרים קבעו גם כי ניתן למצוא פלבנואידים, חומצות פנוליות, טאנינים וטרפנים בשפע בצמח [9-15]. לחלק מהתרכובות הללו יש פעילויות ביולוגיות מעניינות ולכן יכולות להעניק ל-K. Angustifolia אפקט אנטי-אייג'ינג מבטיח, כפי שהם עושים לצמחים אחרים.

Cistanche יכול אנטי אייג'ינג

גם אם יש צורך בפיתוח מוצרים דרמו-קוסמטיים חדשים המסייעים במניעת הזדקנות העור, חוקים חדשים האוסרים או מגבילים ניסויים בבעלי חיים בתעשיית הקוסמטיקה מקשים על כך. לכן יש צורך באפשרויות אחרות לבדיקת יעילות המוצר. השימוש בתרביות תאים חוץ גופיות, או תחליפי עור, הוא חלופה טובה לבדיקת מרכיבים קוסמטיים. מספר דגמים מאושרים על ידי המרכז האירופי לאימות שיטות אלטרנטיביות (ECVAM, Ispra, איטליה) ונמכרים מסחרית לחברות קוסמטיקה, על מנת שיבצעו בדיקות בטיחות וימנעו את הסבל המיותר הכרוך בשימוש בבעלי חיים [16,17] . עם זאת, רוב הדגמים הזמינים מסחרית מציגים רק אפידרמיס מובחן וחסרים את האינטראקציה בין קרטינוציטים ופיברובלסטים [16]. מודלים חדשים של עובי מלא הופיעו בשנים האחרונות ואפשרו, בין היתר, לחקור מסלולי הזדקנות ותרכובות אנטי-אייג'ינג, מה שהופך אותם לכלים שימושיים להחלפת השימוש בבעלי חיים בתחום הקוסמטיקה [18,19].תמצית cistanche tubulosaמטרת מחקר זה הייתה תחילה להעריך את הפעילות הביולוגית של תמצית K. Angustifolia על שכבות מונו-שכבות של תאים מתורבתים ולאחר מכן להעריך את פוטנציאל האנטי-אייג'ינג של תמצית זו באמצעות תחליפי עור משוחזרים על פי שיטת ההרכבה העצמית [20,21] . החוזק של מודל תחליף עור זה הוא שהוא נקי מחומרים אקסוגניים ומסתמך על היכולת של חומצה אסקורבית לקדם את ייצור המטריצה ​​החוץ-תאית על ידי פיברובלסטים עוריים, מה שהופך את המודל לאנושי לחלוטין.ביקורות על cistanche tubulosaמחקר זה מציג מרכיב פעיל חדש שיכול לשמש במוצרים דרמו-קוסמטיים ומציע שימוש במודלים במבחנה כחלופה במחקר קוסמטי.

2. חומרים ושיטות

2.1. הכנת חומר צמחי ותמצית

K.angustifolia נקצרה ב-2 במאי015 באזור Lac-St-Jean בקוויבק, קנדה. הצמח זוהה על ידי M. Patrick Nadeau ודגימת שובר (no.QFA0617265) הופקדה בעשבון לואי מארי של אוניברסיטת לאב, אואבק, קנדה. חלקים אוויריים של K.angustifolia (2.1 ק"ג) נטחנו באמצעות מטחנת Fritsch Pulverisette 25 Cutting Mill (Fritsch, Laval, QC, קנדה) וחולצו תחת ריפלוקס עם אתנול נטול מים (1.5 ליטר, שלוש פעמים) ו-EtOH-H2O3:1( 1.5 ליטר, פעמיים). התמציות שהתקבלו לאחר המיצויות הראשונות (ב- EtOH ו- EtOH-H, O) סוננו ואוחדו יחד. לאחר אידוי של EtOH בוואקום, הפאזה המימית חולקה עם דיכלורומתאן (DCM, CHCl; 300 מ"ל, חמש פעמים) ואתיל אצטט (EtOAc; 300 מ"ל, חמש פעמים). שלב ה-EtOAc התאדה בלחץ מופחת עד ליובש כדי להניב תמצית K.angustifolia (222.6 גרם, 10.6 אחוזים). יום לפני הטיפולים, התמצית, בצורת אבקה, הומסה ב-dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma, Oakville, ON, קנדה) לקבלת תמיסת המניות, ולאחר מכן אוחסנה ב--20 מעלות עד לצורך. הריכוזים הרצויים של K.angustifolia הושגו על ידי דילול תמיסת המניות (12.5 או 25 מ"ג/מ"ל) ישירות במצע התרבות ביום הניסוי. הריכוז הסופי של DMSO היה 0.2 אחוז (ofo) על מנת למנוע רעילות ממסים.

2.2.בידוד של תרכובות עיקריות של תמצית K. Angustifolia

מתוך תמצית EtOAc שתוארה קודם לכן, 30 גרם הופרדו על ידי כרומטוגרפיה על גבי עמודת Diaion (Mitsubishi Chemicals, Charlotte, NC, ארה"ב), תוך שימוש ב-MeOH/H2O כמפלט בתנאי שיפוע (40 אחוזים , 50 אחוז , 60 אחוז , 70 אחוז ו- 100 אחוז ), כדי לתת ארבעה שברים מועשרים (AD). שבר B (2 גרם) הועבר לעמודת סיליקה ג'ל (200 גרם) ונשלף עם תנאי גרדיאנט של MeOH-DCM מ-5 אחוזים עד 15 אחוזים כדי לתת ארבעה שברים (B1-B4). שבר C(6 גרם) הוכנס גם לעמודת סיליקה ג'ל (300 גרם) ונשלף עם תנאי גרדיאנט של MeOH-DCM מ-5 אחוזים עד 25 אחוזים כדי לתת שבעה שברים (C1-C7). החלק C3 (500 מ"ג) טוהר על ידי כרומטוגרפיה הפוכה של פאזה על עמודת C18 (120 גרם, FLH-R33230B-IS120 SiliaSepTM C18, Silicycle, קוויבק, QC, קנדה) באמצעות 0.1 אחוז חומצה פורמית ב-H, O-MeOH מ 40 אחוז עד 60 אחוז. התקבלו ארבעה תת-שברים: C3A-C3D, עם C3B, ו-C3C עם טוהר גבוה, המכילים תרכובות עיקריות. חלק C4(2g) טוהר גם על ידי כרומטוגרפיה הפוכה על עמודת C18 באמצעות 0.1 אחוז חומצה פורמית ב-H2O-MeOH מ-30 אחוז ל-45 אחוז. מההפרדה התקבלו שלושה תת-שברים: C4A-C4C, עם C4A ו-C4C בטוהר גבוה, המכילים כל אחד תרכובת בודדת. שבר D (8.7 גרם) הועבר לעמודות סיליקה ג'ל (2×200 גרם) ונשלף עם תנאי גרדיאנט של CHCl3-MeOH (15:1;10:1;5:1) לקבלת שמונה שברים (D 1-D8). כל שברים D1 עד D4 הציגו תרכובת עיקרית.

2.3. ניתוח NMR ו-GC-MS

ספקטרו של תהודה מגנטית גרעינית (NMR) תועדו עם ספקטרומטר Bruker Avance 400 (Bruker, Milton, ON, קנדה) ב-400 מגה-הרץ עבור גרעיני H ו-100 מגה-הרץ עבור גרעיני 13C, תוך שימוש בכלורופורם מפושט (CDCl3) או מתנול מפושט (CH3OD) בתור הממס. שינויים כימיים מדווחים ב-ppm ביחס לשיא שיורי הממס. ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (HRMS) תועדה בספקטרומטר מסה Agilent 6224 MS-TOF (Agilent, Saint-Laurent, QC, קנדה) המצויד במקור ספריי אלקטרו.

2.4.ביופסיות וחילוץ תאים

קרטינוציטים ופיברובלסטים ראשוניים התקבלו מביופסיות של ניתוחי הקטנת חזה. התורמות היו נקבות קווקזיות בנות 18 עד 52 שנים. קרטינוציטים ופיברובלסטים חולצו מהביופסיות בשיטת הבידוד שתוארה קודם לכן [22,23]. ביופסיות הודגרו בתרמוליזין ב-4 מעלות למשך 16 שעות על מנת להפריד את האפידרמיס מהדרמיס. לאחר מכן, קרטינוציטים בודדו מהאפידרמיס באמצעות טריפסין למשך 30 דקות, בעוד שפיברובלסטים בודדו מהדרמיס באמצעות קולגנאז למשך 4 שעות. לאחר מכן התאים תורבו למעבר הרצוי. נעשה שימוש בקרטינוציטים במעבר 1 ובפיברובלסטים במעבר 4.

2.5. תרבית תאים

פיברובלסטים ראשוניים (מעבר 4) נזרעו ב-4×103 תאים/ס"מ ורבית ב-Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) בתוספת של 10 אחוז FB Essence סרום (FBI; Seradigm, Salt Lake City) , UT, ארה"ב), 100 UI/ml פניצילין G (Sigma, Oakville, ON, קנדה), ו-25ug/ml gentamicin (ג'מיני, מערב סקרמנטו, קליפורניה, ארה"ב). קרטינוציטים ראשוניים (מעבר 1) נזרעו בגודל 4×103 תאים/סמ"ר על שכבת הזנה של פיברובלסטים עכברים מוקרנים 3T3 ותופחו בשילוב של DMEM עם F12 של Ham בשיעור של 3:1 (DMEMH), בתוספת 5 אחוז שיבוט עוברי. Ⅱ סרום (Hyclone, Scarborough, ON, קנדה), 5 ug/mL אינסולין (Sigma, St. Louis, MO, ארה"ב), 0.4 ug/mL הידרוקורטיזון (Galen-ova, Saint-Hyacinthe, QC, קנדה), 0.212 ug /mL isoproterenol hydrochloride (Sandoz קנדה, Boucherville, QC, קנדה), 10 ng/mL אנושי גורם גדילה אפידרמיס (EGF; Austral Biological, San Ramon, CA, ארה"ב), 100UI/mL פניצילין G (Sigma, Oakville, ON, קנדה ) ו-25 ug/mL gentamicin (ג'מיני, מערב סקרמנטו, קליפורניה, ארה"ב). תרביות תאים הודגרו ב-37C באטמוספירה של 8% פחמן דו חמצני (CO2). אמצעי תרבית תאים הוחלפו כל יומיים, בסך הכל שלוש פעמים בשבוע.

2.6. בדיקת ציטוטוקסיות

הרעילות של תמצית K.angustifolia הוערכה על קרטינוציטים ראשוניים באמצעות {{0}}(4,5-dimethyl thiazolyl-2)-2,{{5} }בדיקת דיפנילטטרזוליום ברומיד (MTT). בדיקת MTT היא בדיקה קולורימטרית המבוססת על הפחתה אנזימטית של מלח טטרזוליום צהוב (MTT) לגבישי פורמזן סגולים. תגובה אנזימטית זו מזורזת על ידי מיטוכונדריה succinate dehydrogenase בתאים פעילים מבחינה מטבולית. לפיכך, הוא משמש להערכת כדאיות התא בהתבסס על פעילות מטבולית תאית. בקצרה, ביום 0, קרטינוציטים ב-P3 מתורמים בריאים צופו ב-5×103 תאים/באר בצלחת של 96-באר על שכבת הזנה של פיברובלסטים מוריינים 3T3 מוקרנים. ביום השני נוסף הטיפול. ביום 4, צבע MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, Sigma, St. Louis, MO, ארה"ב) נוסף לצלחת בריכוז של 0.5 מ"ג/מ"ל בתמיסת מלח סטרילית (PBS) 1X. לאחר מכן הודגרה הצלחת למשך 3 שעות (37 מעלות, 8 אחוז CO) ופורמאזן חולץ עם תמיסה טריה של איזופרפנול וחומצה הידרוכלורית (HCl). הספיגה נקראה ב-570 ננומטר באמצעות קורא microplate (SpectraMax Plus 384 Microplate Reader, Molecular Devices, San José, CA, ארה"ב). 2.7. בדיקת קיבולת ספיגת רדיקלי חמצן (ORAC).

על מנת להעריך את תכונות נוגדי החמצון של תמצית K.angustifolia, בוצע בדיקת Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) כמתואר על ידי Ou et al. עם כמה שינויים [24]. בקצרה, הבדיקה בוצעה בצלחת 384-באר על קורא צלחות Fluoroskan Ascent FLTM (Labsystems, Milford, MA, ארה"ב). ריכוזים שונים של Trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl chroman-2-חומצה קרבוקסילית; אנלוגי ויטמין E) הוכנו כדי ליצור עקומה סטנדרטית לפי הסדר כדי להשוות דגימות בדיקה עם ביקורת חיובית זו. הניסוי בוצע בטמפרטורה של 37.5 מעלות וחצי 7.4 עם דגימה ריקה במקביל.cistanche בריטניההקרינה של הפלואורסצין תועדה כל 60 שניות עם הפלואורומטר לאחר הוספת 2,2'-אזוביס(2-אמידינו-פרופאן) דיהידרוכלוריד. הקרינה נמדדה באורך גל עירור של 485 ננומטר ואורך גל פליטה של ​​538 ננומטר. התוצאות חושבו על ידי שימוש בהבדלים בין האזורים מתחת לדעיכת הפלואורססין מהריק לעקומת המדגם. התוצאות עבור ערכי ORAC התבטאו במיקרומול של טרולוקס שווה ערך (TE) למיליגרם (μmol TE/mg) או מיקרומול של TE למיקרומול (umol TE/mol).

2.8. פעילות נוגדת חמצון מוערכת באמצעות בדיקה מבוססת תאים

פעילות נוגדת החמצון הוערכה עם בדיקה מבוססת תאים באמצעות 2',7/-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) כפי שתואר על ידי Girard-Lalancette וחב' עם כמה שינויים [25]. בקצרה, פיברובלסטים של עור אנושי WS1 (ATCC⑧ CRL-1502, מנאסס, וירג'יניה, ארה"ב) הודגרו במשך 60 דקות עם 100 μL של 5μM DCFH-DA בתמיסת מלח מאוזנת של Hanks (HBSS, HyClone, Marlborough, MA, ארה"ב) . לאחר מכן, כדי להעריך את הפעילות נוגדת החמצון של התמצית, התאים הודגרו במשך 60 דקות עם ריכוזים גדלים של תמצית K.angustifolia והבקרות החיוביות (קוורצטין וטרולוקס). עבור הלחץ החמצוני, נוספו 100 μL של 400 μM tertbutyl hydroperoxide (t-BuOOH) כדי להשיג ריכוז סופי של 200 μM t-BuOOH בבארות. הקרינה נמדדה מיד ולאחר 90 דקות באמצעות קורא לוחות Fluoroskan Ascent FLTM אוטומטי (Labsystems, Milford, MA, ארה"ב). הקרינה הוערכה באורך גל עירור של 485 ננומטר ואורך גל פליטה של ​​538 ננומטר. פעילות נוגדת חמצון התבטאה כאחוז העיכוב של חמצון DCFH.

2.9. פעילות אנטי דלקתית מוערכת על ידי כימות ניטריט

הפעילות האנטי דלקתית הוערכה על ידי הערכת עיכוב ייצור תחמוצת החנקן (NO) על ידי תמצית K.angustifolia כפי שתואר על ידי Legault וחב'. [26]. בקצרה, המקרופאגים העכברים RAW 264.7(ATCC⑧ TIB-71, Manassas, VA, ארה"ב) הודגרו עם ריכוזים הולכים וגדלים של תמצית K. Angustifolia ולאחר מכן עוררו עם 100 ng/mL lipopolysaccharide (LPS). בקרה חיובית, Nw-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride （L-NAME）, שימשה גם בשני ריכוזים שונים: 250 מיקרומטר (67 ug/mL) ו- 1 mM (270 ug/mL). סופרנטנטים נטולי תאים נאספו 24 שעות לאחר גירוי LPS, וריכוז ה-NO הוערך מיד באמצעות תגובת Griess. הספיגה נקראה ב-540 ננומטר באמצעות קורא לוחות Multiskan (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב). נוכחות ניטריט כמתה באמצעות עקומה סטנדרטית של NaNO. תאים לא פעילים (שנחשפו למדיה בלבד) שימשו כבקרה שלילית ותאים מופעלים כבקרה חיובית.

2.10.ייצור תחליפי עור

תחליפי עור בריא יוצרו לפי שיטת ההרכבה העצמית, ששונו חלקית באמצעות 6-צלחות באר [20,21]. בקצרה, פיברובלסטים ב-P5 מתורמים בריאים נזרעו ב-1.5×105 תאים/באר ותופחו במשך 26 ימים ב-DMEM בתוספת של 50 ug/mL של (פלוס)-נתרן L-ascorbate (Sigma, St. Louis, MO, USA) עד שיצרו יריעות שניתן לטפל בהן. לאחר מכן, שני יריעות פיברובלסט נותקו והונפו על גבי כדי ליצור את המקבילה העורית. שווי ערך עורי הודגרה ב-37 מעלות באווירה של 8 אחוז CO, למשך יומיים נוספים כדי לאפשר איחוי יריעות ובכך ליצור את השכבה העורית החדשה של תחליפי העור. לאחר תקופה זו, קרטינוציטים ב-P2 מתורמים בריאים נזרעו על המקבילה העורית בתאים של 1 × 10 מעלות/שווה ערך ליצירת שכבת האפידרמיס של תחליפי העור ותופחו במשך שבעה ימים ב-DMEMH בתוספת 50 ug/mL של (פלוס) -נתרן L-ascorbate (Sigma, St. Louis, MO, ארה"ב) כדי לאפשר שגשוג קרטינוציטים. לאחר מכן, הועלו תחליפי עור לממשק האוויר-נוזל כדי לקדם התמיינות תאים. בממשק האוויר-נוזל, תורבו תחליפי עור עם מדיום חסר EGF כדי להשיג נציג אפיתל שכבות של עור in vivo. 14 ימים לאחר שהועלו לממשק האוויר-נוזל, טופלו תחליפי העור שלוש פעמים בשבוע במשך שבוע בתמיסת מניות התמצית מדוללת במצע תרבות (עם ריכוז סופי של תמצית K. Angustifolia של 25 ug/mL). לאחר סך של 56 ימי תרבית, נלקחו ביופסיות תחליפי עור ונותחו על ידי היסטולוגיה וצביעה אימונופלואורסצנטית.

2.11. ניתוחים היסטולוגיים

ביופסיות תחליפי עור מכל מצב תוקנו בתמיסת HistoChoice (Amresco, Solon, OH, ארה"ב) והוטמעו בשעווה פרפין. קטעים בעובי 5 מיקרומטר נחתכו והוצבעו ב-Trichrome של מאסון באמצעות צבעי המטוקסילין, פוקסין-פונסאו וכחול אנילין של Weigert. עובי הדרמיס והאפידרמיס החי נמדד עם תוכנת ImageJ (המכון הלאומי לבריאות (NIH), Bethesda, MD, ארה"ב). עבור מדידות העובי, נותחו שלוש אוכלוסיות תאים שונות, ולכל אחת מהן צולמו שתי תמונות מייצגות לכל מצב ובוצעו 10 מדידות לתמונה עבור סך של 60 מדידות לכל מצב.

2.12. צביעת אימונופלואורסצנטי

ביופסיות תחליפי עור מכל מצב הוטבעו בתרכובת Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA, ארה"ב), הוקפאו בחנקן נוזלי, ולאחר מכן נשמרו ב--80 מעלות עד לצורך. חלקים קפואים של עור אנושי רגיל שימשו כביקורות חיוביות. צביעת אימונופלואורסצנטי עקיפה בוצעה על חתכים קריו בעובי 6 אום קבועים באציטון. הנוגדנים העיקריים שבהם נעשה שימוש היו: אנטי-אלסטין פוליקלונאלי ארנב (gG)(דילול 1:800, אבקם, קיימברידג', MA, ארה"ב), אנטי-קולגן פוליקלונאלי ארנבת-1 (IgG)(דילול 1:300, Cedarlane, ברלינגטון, אוניברסיטאות, קנדה), אנטי-קולגן פוליקלוני של ארנבים-3 (IgG)(דילול 1:200, סידרלן, ברלינגטון, אוניברסיטאות, קנדה) ואנטי-אקופורין פוליקלונלי של ארנב-3(IgG)(דילול 1:500, Abcam, Cambridge, MA, ארה"ב). הנוגדן המשני בו נעשה שימוש היה IgG של חמור נגד ארנבת (H פלוס L) Alexa 488 (דילול 1:1600, Life Technologies, Eugene, OR, ארה"ב). גרעיני תאים סומנו לאחר הנוגדן המשני עם המדיום המורכב DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL, ארה"ב). כדי לכמת למחצה את עוצמת הקרינה של כל חלבון, עוצמת הפיקסלים של צביעת החיסון נמדדה באמצעות תוכנת ImageJ (המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), Bethesda, MD, ארה"ב). בקצרה, כל שכבת העור (דרמיס או אפידרמיס חי) של החלבון הנחקר נותחה על ידי מדידת הערך האפור הממוצע של כל אזור. עוצמת הקרינה של תחליפי העור המטופלים הושוותה לעוצמת הקרינה של תחליפי העור הבקרה כדי להעריך את השינוי בביטוי החלבון שנצפה בטיפולים.

2.13. ניתוח סטטיסטי

התוצאות הובעו כממוצע ± סטיית תקן. הניתוח הסטטיסטי של מבחן ה-MTI, המבחן המבוסס על תאים נוגדי חמצון והפעילות האנטי-דלקתית בוצעו בניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן פוסט-הוק של דאנט (p-value)<0.05 compared="" to="" control="" at="" 0="" μg/ml）="" or="" a="" bonferroni's="" post="" hoc="" test=""><0.05 compared="" to="" controls).="" thickness="" measurements="" were="" analyzed="" with="" a="" t-test.="" results="" were="" considered="" significant="" when=""><0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" with="" r="" software="" (v3.5.2,="" rcmdr="" v2.5-1,="" r-core="" team="" 2018,="" r="" foundation,="" vienna,="">

מאמר זה מופק מ- Antioxidants 2021, 10, 1373. https://doi.org/10.3390/antiox10091373 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants