תכונות מעכבות של אנזימים נוגדי חמצון ועמילן-הידרוליזה של היברידי תירס צהוב-כתום עמידים לסטריגה

למידע נוסף צרו קשר:tina.xiang@wecistanche.com

תַקצִיר: רוב היתרונות הבריאותיים המופקים מדגנים מיוחסים לתרכובות הביו-אקטיביות שלהם. מחקר זה העריך את רמות התרכובות הביו-אקטיביות וה-נוגד חמצוןוהידרוליזה של עמילןאנזימיםתכונות מעכבות של שש היברידיות תירס צהוב-כתום עמידים בצנרת (מקודדים AS1828-1, 4, 6,8, 9, 11) במבחנה. כלאי התירס גודלו במכון הבינלאומי לחקלאות טרופית (ITA), ניגריה. התרכובות הביו-אקטיביות (סה"כ פנולים, טאנינים,פלבנואידיםרמות פיטאטים, נוגדי חמצון (DPPH" ו-ABTS יכולת ניקוי והפחתת כוח), והידרוליזה של עמילןאנזימים(-עמילאז ו-x-glucosidase) פעילויות מעכבות של הכלאיים של תירס נקבעו באמצעות ספקטרופוטומטריה. במקביל, קרוטנואידים כומתו באמצעות מערכת HPLC הפוכה. הטווחים של התרכובות הביו-אקטיביות היו: 11.25-14.14 מ"ג GAE/g (סה"כ פנולים), 3.62-4.67 מ"ג QE/g (סה"כ פלבנואידים), 3.{{1{ {34}}}}.29 מ"ג/ג'(טאנינים),3.66-4.31 אחוז (פיטאט),8.92-12.11מ"ג/ג'(סה"כ קסנטופיילים),2.{{19 }}.89 ug/g (סה"כ -קרוטן), ו-3.17-3.77ug/g(סה"כ קרוטנואידים של פרווויטמין A). תמציות של הכלאיים של תירס אספו DPPH"(SC50: 9. 07-26.35 מ"ג/מ"ל)ו-ABTS*(2.{{30}}.68 TEACmmol/g), הפחיתו את Fe3 פלוס ל-Fe2 פלוס (0.25±0.64-0 .43±0.01 מ"ג GAE/g), ו-עמילאז ו-glucosidase מעוכבים, עם טווחי IC50 של 26.28-52.55 mg/mL ו-47.72-63.98 mg/mL, בהתאמה. מבין ששת השיבוטים של הכלאיים של תירס, ל-AS1828-9 היה הגבוה ביותר (עמ'<0.05)levels of="" tannins="" and="" phytate="" and="" the="" strongest="">נוגד חמצוןופעילות מעכבת של אנזימים הידרוליזה של עמילן. נצפו מתאמים מובהקים בין כלל הפנולים לבין המאפיינים הבאים: ABTS*(עמ<0.01, r="0.757)," dpph"sc50=""><0.01,r=-0.867), reducing=""><0.05,r=0.633), α-amylase=""><0.01,r=-0.836) and="" α-glucosidase=""><0.05, r="-0.582).Hence," the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids(especially="" as1828-9)="" may="" be="" beneficial="" for="" alleviating="" oxidative="" stress="" and="" postprandial="">

מילות מפתח: סך הפנולים; סך פלבנואידים; טאנינים; קרוטנואידים; חומצה פיטית; בדיקת עיכוב אלפא גלוקוזידאז; בדיקת עיכוב אלפא-עמילאז

1. הקדמה

אספקת גידולי מזון בעלי תשואה גבוהה, מזינים ובריאים חיונית על מנת להתמודד עם האתגרים שמציבה תת-תזונה והמחלות הקשורות בה. לפיכך, גישות שיטתיות שונות, כגון גידול יסודות עמידים למחלות עם איכות תזונתית משופרת, הופעלו בתוכניות מחקר לגידול צמחים כדי לענות על הצרכים התזונתיים של האוכלוסייה העולמית הגדלה במהירות. זה הפך הכרחי יותר בהתחשב בירידה הדרסטית בכמות ובאיכות של אספקת המזון העולמית כתוצאה מזיהום סביבתי, התחממות כדור הארץ ופיתוח של

מקורות ביולוגיים חדשים [1]. באפריקה שמדרום לסהרה, תירס (Zea mays L.) הוכח כתורם לביטחון תזונתי ולהפחתת העוני בקרב משפחות בעלות הכנסה נמוכה [2].

גנוטיפים של תירס צהוב-כתום ידועים בסגולותיהם התזונתיות והמעודדות הבריאות המצוינות בשל התרכובות הביו-אקטיביות שהם מכילים, כולל קרוטנואידים, תרכובות פוליפנוליות, חומצה פיטית [3-5] וטוקופרולים [6]. עם זאת, הסיכוי לביטחון תזונתי ותזונה משופרת באמצעות ייצור תירס מוגבר באפריקה שמדרום לסהרה מאוים על ידי הצמח ההמיטפילי השורש, Striga hermonthica(Del.)Benth גורם לאובדן יבול של עד 100 אחוז תחת נגיעות חמורות עקב אובדן מים וחומרי הזנה דרך טפילות [7,8]. כתוצאה מכך, S. hermonthica מהווה מגבלה אביוטית לייצור תירס באפריקה שמדרום לסהרה, הנובעת משינוי פרדיגמה מהמערכת המסורתית של חקלאות דגנים שכללה תקופות ברזל ממושכות. מערכת מסורתית כזו של גידול דגנים הבטיחה שרמת בנק הזרעים של סטריגה באדמה תהיה נסבלת לצמחים9]. כדי להפחית את ההפסדים בתפוקה ובאיכות של תירס כתוצאה מהידבקות ב-S.hermonthica, שיטת ההדברה הטובה ביותר היא לשתול גנוטיפים של תירס עמידים לסטריגה. אסטרטגיה זו ניתנת להתאמה בקלות, במיוחד בשילוב עם שיטות ניהול אחרות [10].

המחקר האחרון שלנו גילה שהכלאיים תירס צהוב-כתום עמידים לסטריגה מכילים קרוטנואידים, פוליפנולים וחומצה פיטית [3]. ידוע כי תרכובות ביו-אקטיביות אלו פועלות כנוגדי חמצון ומדכאות היפרגליקמיה לאחר ארוחה, בין יתר היתרונות הבריאותיים [4,5,11,12]. בין התרכובות הביו-אקטיביות בדגן תירס כתום, דווח כי נוגד החמצון [13,14] ופעילות מעכבת אנזימי העיכול [15] תלויים בתרכובות הפנוליות, הקיימות בעיקר בצורה הקשורה. בנוסף, ידוע כי תרכובות פנוליות בעלות מספר פעילויות ביולוגיות אחרות כגון עיכוב של קסנטין אוקסידאז ואנזימים הממירים אנגיוטנסין 1-, המעורבים בפתוגנזה של גאוט ויתר לחץ דם תלוי-רנין, בהתאמה [11], ואנטי- תכונות דלקתיות, אנטי-מיקרוביאליות, אנטי-סרטניות, אנטי-אלצהיימר ואנטי-אלרגיות בין פעילויות ביולוגיות אחרות[16]. לפיכך, תרכובות פנוליות ממקורות תזונתיים מושכות תשומת לב רבה הן מצד מדענים והן מצד צרכנים בשל היתרונות שלהן לבריאות האדם [16].

מטרת מחקר זה הייתה להעריך את רמות התרכובות הביו-אקטיביות, ואת התכונות המעכבות של אנזימים נוגדי חמצון ואנזימי עמילן של שישה היברידיות תירס צהוב-כתום עמידים בצינור Striga במבחנה. המחקר בדק גם את הקשרים בין המרכיבים הביו-אקטיביים, ואתנוגד חמצוןופעילות מעכבת של אנזימים הידרוליזה של עמילן של שש היברידיות תירס צהוב-כתום עמידים בצנרת.

2. תוצאות ודיון

2.1. רכיבים ביולוגיים בשש היברידיות תירס צהוב-כתום עמידים לסטריגה

הרכיבים הביו-אקטיביים שנקבעו בששת הצינורות היברידיות תירס צהוב-כתום עמידים לסטריגה(AS1828-1(AS1), AS1828-4(AS4), AS1828-6(AS6), AS{{ 8}} (AS8), AS1828-9(AS9), AS1828-11(AS11))במחקר זה כלל פנולים בסך הכל,פלבנואידים, טאנינים, קרוטנואידים וחומצה פיטית. הרמות של סך הפנולים, סך הפלבנואידים, הטאנינים והחומצה הפיטית מוצגות בטבלה 1. סך הפנולים נע בין 11.25 ל-14.14 מ"ג GAE/g ב-AS4 ו-AS9, בהתאמה; סך הפלבנואידים נע בין 3.62 ל-4.67 מ"ג QE/g ב-AS11 ו-AS6, בהתאמה; תכולת הטאנין נעה בין 3.64 ל-6.29 מ"ג/ג ב-AS1 ו-AS9, בהתאמה; ותכולת החומצה הפיטית נעה בין 3.66 אחוז ב-AS6 ל-4.47 אחוז ב-AS1.

לפיכך, AS9 הכיל את הגבוה ביותר (עמ'<0.05)total phenolics="" and="" tannin="" levels,="" while="" as6="" had="" the="" highest="" total="" flavonoids="" content.="" the="" total="" phenolic="" concentrations="" detected="" in="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" are="" higher="" than="" the="" values="" previously="" reported="" in="" yellow="" maize="" hybrids,="" including="" 2.15="" mg="" gae/g[15]and="" 2.08="" mg="" gae/g[17].="" similarly,="" the="" levels="" of="" total="" flavonoids="" detected="" in="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" in="" this="" study="" are="" higher="" than="" the="" 0.93±="" 0.03="" mg="" oqe/g="" recently="" reported="" in="" provitamin="" a="" yellow="" maize="" flour="" [17].="" although="" the="" tannin="" levels="" are="" within="" the="" range(2.1-7.3="" mg/g)previously="" reported="" in="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" [3],="" the="" values="">

גבוה יחסית מטווח הטאנינים המעובה (33.70 עד 158.55 מ"ג/100 גרם, שווה ערך ל-0.34 עד 1.59 מ"ג/ג) שדווח בגנוטיפים של תירס עם פיגמנטים [13].

הרמות הגבוהות יותר של סך הפנולים, סך הפלבנואידים והטאנינים שנצפו בששת הצינורות היברידיות תירס צהוב-כתום עמידים לסטריגה, ביחס לערכים בספרות הקיימת עבור פוליפנולים אלו בגנוטיפים תירס צהוב שאינם עמידים לסטריגה עשויות להיות קשורות לאפשרות. הבדלים במבנה הגנטי שלהם [3]. ידוע היטב שהביוסינתזה של פוליפנולים ושל מטבוליטים משניים אחרים של הצמח עולה בנוכחות גורמי לחץ כהגנה תאית ו/או מנגנון הסתגלותי של הצמח כדי לעמוד בתנאים לא נוחים [16,18]. יתרה מכך, נביטת זרעי סטריגה מעוררת על ידי ייצור של סטריגולקטונים (הורמונים צמחיים) בשורשי צמח התירס, אותם משחרר הצמח בלחץ [19]. לפיכך, ייתכן שהתכונה של עמידות ל-S. hermonthica הסדירה את הביוסינתזה של תרכובות פוליפנוליות בתירס כדי לעמוד בפני הטפיל. הדבר נתמך על ידי דיווח קודם לפיו עמידות לאחר ההתקשרות ל-S. hermonthica כללה עיבוי של דופן תא הצמח והצטברות של ואקוולים קטנים רבים ומשקעים פנוליים שנצבעים בצפיפות בתוך תא הצמח [20].

תרכובות פנוליות בולטות בפעילות נוגדת החמצון שלהן בשל תכונות החיזור שלהן, המאפשרות להן לפעול כמרווה חמצן בודד, תורמי מימן וחומרים מפחיתים [21]. בנוסף, דווח גם כי תרכובות פנוליות משביתות את אנזימי העיכול, כולל ליפאז לבלב, עמילאז ו-a-glucosidase באמצעות קישור לא ספציפי לאנזימים בודדים [22]. כפי שדווח בעבר על ידי Villiger et al.[23]תרכובות פנוליות בעלות זיקה גבוהה לחלבונים באמצעות מימן וקשירה הידרופוביה, מה שמשפר את יכולתן לעכב אנזימים כגון -עמילאז ו-glucosidase על ידי דנטורציה של חלבון.

The phytic acid contents were comparable (p>0.05)בין ששת הצינורות היברידיות תירס צהוב-כתום עמידים לסטריגה. טווח זה תואם את הדו"ח הקודם שלנו על תכולת החומצה הפיטית של כלאי תירס צהוב-כתום עמידים לסטריגה [3]. לחומצה פיטית יש פעילות נוגדת חמצון, בנוסף להשפעתה המעכבת נגד התפתחות אבנים בכליות [24], כמו גם תכונות אנטי-סרטניות [25]. התכונות נוגדות החמצון של הרכיבים הביו-אקטיביים, במיוחד המרכיבים הפנוליים (פלבונואידים וטאנינים) בהכלאיים של תירס צהוב-כתום עמידים לסטריגה, עשויות גם למנוע ו/או להאט את הפירוק החמצוני של כמה רכיבים תזונתיים אנדוגניים בתירס המועדים מאוד חמצון, כגון חומצות שומן בלתי רוויות וויטמינים [16]. יתרה מזאת, הרכיבים הביו-אקטיביים בהכלאות תירס צהוב-כתום העמידים לסטריגה עשויים להפחית את קצב היווצרות חלק מהמוצרים החמצוניים הרעילים, ובכך לשמור על האיכות התזונתית ולהאריך את חיי המדף של מוצרי מזון [26] המיוצרים מהם.

The carotenoid content in the Striga-resistant yellow-orange maize hybrids is presented in Table 2. Total β-carotene (9-cis-β-carotene + 13-cis-β-carotene + all-trans-β-carotene) ranged from 2.42 to 2.89ug/g; total xanthophylls (lutein+zeaxanthin) ranged from8.92 to 12.11l ug/g; and total provitamin A carotenoids(β-cryptoxanthin+β-carotene+α-carotene） ranged from 3.17 to 3.77 μg/g,in AS6 and AS9,respectively. There were no significant differences(p>0.05) בתכולת הקרטנואידים של הצהוב-כתום העמיד לסטריגה

כלאי תירס. טווחי הקרוטנואידים שהושגו במחקר זה מאששים את אלו שדווחו בעבר על ידי Alamu וחב' עבור הכלאיים של תירס צהוב ביו-מועשר פרווויטמין A [27]. יתרה מזאת, סך כל הקסנטופיילים היה גבוה יותר בערכם מסך הקרטנואידים של פרו-ויטמין A בהיברידיות תירס צהוב-כתום העמידים ל-Striga, דבר המאשש את הממצאים של Ortiz et al. [28].

ייתכן שהקרוטנואידים השלימו את פעילות מעכבת האנזימים נוגדי החמצון וההידרוליזה של עמילן של התרכובות הפנוליות בהכלאיים של תירס צהוב-כתום עמידים לסטריגה, בהתאם לפעילות הביולוגית המדווחת שלהם. לדוגמה, קרוטנואידים דווחו כבעלי פעילות נוגדת חמצון כמנגנון העיקרי העומד בבסיס היתרונות הבריאותיים שלהם [29]. הם גם מעניקים השפעות הגנה מפני מחלות כרוניות שאינן מדבקות כמו סרטן [30] ומחלות לב וכלי דם [31]. כמו כן, דווח ש-cryptoxanthin מפחית באופן משמעותי את הסיכון לסוכרת מסוג 2 (T2D) ומפחית עמידות לאינסולין [32,33].

2.2. פעילות נוגדת חמצון של שש היברידי תירס צהוב-כתום עמידים בצינור סטריגה

הפעילות נוגדת החמצון של היברידיות תירס צהוב-כתום עמידים לסטריגה (טבלה 3) חשפה כי ששת שיבוטי הצינור הציגו כולם פעילות נוגדת חמצון על ידי ניקוי רדיקלים חופשיים (ABTS degree plus ו-DPPH*) והפחתת יוני ברזל (Fe3 פלוס) ליונים ברזליים. (Fe2 פלוס). פעילות נוגדת החמצון השתנתה באופן משמעותי (עמ'<0.05) among="" the="" hybrids,="" with="" as9="" having="" the="" strongest=""><0.05) free="" radicals="" scavenging="" abilities(7.28="" teac="" mmol/g="" and="" sc50,="" 9.07±="" 0.27="" mg/ml="" for="" abts+="" and="" dpph,="" respectively)and="" ferric-reducing="" power="" (0.43="" mg="" gae/g).="" it="" is="" pertinent="" to="" recall="" that="" as9-9="" also="" had="" the="" highest="" level="" of="" total="" phenolics="" and="" tannins,="" as="" presented="" earlier="" in="" table="" 1.="" the="" dpph°scavenging="" abilities="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" obtained="" in="" this="" study="" (sc50:="" 9.07="" to="" 26.35="" mg/ml)="" are="" more="" potent="" than="" those="" reported="" by="" rodriguez-salinas="" et="" al.="" [13]="" for="" pigmented="" maize="" genotypes(ic50:="" 31="" to="" 52="" mg/ml)="" since="" a="" lower="" sc50="" or="" ic50="" is="" indicative="" of="" a="" stronger="" activity="" [34].="" however,="" vitamin="" c,="" a="" standard="" antioxidant="" with="" a="" lower="" sc50(4.63±0.28="" mg/ml),="" had="" a="" stronger="" dpph*scavenging="" activity="" than="" all="" of="" the="" six="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids.="" similarly,="" the="" abts·+="" scavenging="" activity="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" (2.65-7.68="" teac="" mmol/g)is="" higher="" than="" the="" value="" (294.81±="" 2.23="" umol="" teac/g)reported="" by="" irondi="" et="" al.[17]="" for="" provitamin="" a="" yellow="" maize="" flour.="" the="" stronger="" antioxidant="" activity="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" over="" the="" non-striga-resistant="" pigmented="" maize="" genotypes="" may="" be="" attributed="" to="" the="" increased="" deposition="" of="" polyphenolic="" compounds="" in="" their="" defense="" against="" s.="" hermonthica="" [20],="" which="" may="" have,="" consequently,="" enhanced="" the="" antioxidant="" capacity="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="">

יכולת ניקוי הרדיקלים החופשיים וכוח הפחתת הברזל של היברידיות תירס צהוב-כתום עמידים לסטריגה מצביעים על כך שהם עשויים להיות מועילים בהגנה על הגוף מפני התקפות החמצון הנגרמות על ידי רדיקלים חופשיים ומיני חמצן תגובתיים. לפיכך, להיברידי תירס צהוב-כתום עמידים לסטריגה עשויה להיות השפעה מגנה מפני נזקי החמצון של ביומולקולות בגוף, כולל חומצות גרעין, חלבונים, שומנים ופחמימות [35] והמחלות הכרוניות הקשורות ללחץ חמצוני [36] .

2.3. פעילויות מעכבות של אנזימים הידרופיים של עמילן של ששת הצינורות עמידים ביולוגיים עמידים לסטריגה תירס צהוב-כתום היברידי תירס צהוב-כתום

פעילות מעכבת האנזימים המידרוליזים של עמילן (-עמילאז ו-גלוקוזידאז) של ששת צינורות היברידית תירס צהוב-כתום עמידים לסטריגה, המתבטאת כ-IC50 (ריכוז מיצוי שעיכב את פעילות האנזים ב-50 אחוז), מוצגת בטבלה 4. ה-IC50 הערכים של היברידיות תירס צהוב-כתום עמידים ל-Striga על-עמילאז ו-glucosidase נעו בין 26.28 ל-52.55 מ"ג/מ"ל ו-47.72 ל-63.98 מ"ג/מ"ל ב-AS9 ו-AS4, בהתאמה. לפיכך, מבין ששת היברידיות תירס צהוב-כתום עמידים ל-Striga, AS9 עם ערכי ה-IC50 הנמוכים ביותר עבור עמילאז ו-glucosidase כאחד, הציג את החזק ביותר (p<0.05)inhibitory activity="" on="" these="" two="" enzymes.="" interestingly,="" there="" was="" no="" significant="" (p="">0.05) הבדל בערכי ה-IC50 של AS9 ו-acarbose (תרופה סטנדרטית נגד סוכרת) על-עמילאז, מה שמצביע על כך שיכולות מעכבי-עמילאז של AS9 ושל acarbose היו דומות. עם זאת, פרט ליכולת מעכבת -עמילאז של AS9 שהייתה דומה לזו של acarbose, הפעילויות מעכבות -עמילאז ו-glucosidase של ה-acarbose היו חזקות יותר מאלו של הכלאיים של תירס צהוב-כתום עמידים ל-Striga. היכולת של גנוטיפים תירס בעלי פיגמנטים שונים (צהוב, סגול, אדום ושחור) לעכב פעילות האנזים (-glucosidase) המיידר עמילן דווחה על ידי Fabila-Garcia et al. [15]. הממצאים שלהם גילו שלתמצית תירס צהוב יש את הפעילות המעכבת גלוקוזידאז הגבוהה ביותר, מבוטאת באחוזים (69.8 אחוזים), מבין הגנוטיפים של התירס. בנוסף, Irondi et al. [17] לאחרונה דיווחו על ערכי o-amylase ו-glucosidase IC50 של 237.12± 2.60 ו-157.18±1.05 ug/mL, בהתאמה, עבור קמח תירס צהוב של פרו-ויטמין A. יחסית לתמצית משי תירס, שדווחה [37]כמעכבת a-עמילאז ו-glucosidase עם ערכי IC50 ממוצעים של 218.4 ו-221.4 ug/mL, בהתאמה, לששת היברידיות תירס צהוב-כתום עמידים בצינור Striga הייתה השפעה מעכבת חלשה יותר. על c-עמילאז ו-x-glucosidase.

גם c-עמילאז וגם o-glucosidase מעורבים בעיכול פחמימות בתזונה. בעוד שעמילאז במעי הדק יוצר הידרוליזה של עמילן -1,4 קשור לשחרור אוליגוסכרידים ודו-סוכרים, -גלוקוזידאז בגבול המברשת של המעי הדק משלים את העיכול על ידי הידרוליזה נוספת של האוליגוסכרידים והדו-סוכרים כדי להניב חד-סוכרים הנספגים, כולל חד-סוכרים. ופרוקטוז [38]. לפיכך, העיכוב של שני אנזימי העיכול הללו הוא גישה טיפולית מבוססת היטב להקלה על היפרגליקמיה לאחר ארוחה בניהול T2D ומנגנון פעולה מרכזי.

של תרופות רבות נגד סוכרת [39], כולל תרופות, מוצרים טבעיים ומזונות פונקציונליים. יתר על כן, להכלאיים של תירס צהוב-כתום עמידים לסטריגה הייתה השפעה מעכבת משמעותית יותר על עמילאז מאשר על גלוקוזידאז. לדפוס זה של עיכוב אנזימים מימי עמילן יש השלכות טיפוליות מועילות והוא מתאים לדפוס שדווח במחקרים קודמים [17,A0]. לפיכך, לששת הכלאיים של תירס צהוב-כתום עמידים ל-Striga, במיוחד AS9, עשויים להיות יתרונות מסוימים בשליטה בהיפרגליקמיה לאחר ארוחה.

2.4. מתאמים בין הרכיבים הביו-אקטיביים, נוגדי החמצון ופעילות מעכבת האנזימים המיידים בעמילן של שש כלאיות תירס צהוב-כתום עמידים בצנרת.

בין הרכיבים הביו-אקטיביים, סך הפנולים נמצא בקורלציה מובהקת עם ABTS· plus (עמ'<><0.01,r=-0.867), reducing=""><0.05,r=0.633), α-amylase="" ic50=""><0.01,r=-0.836)and α-glucosidase="" ic50=""><0.05,r=-0.582) (table="" 5).="" as="" earlier="" stated,="" lower="" dpph"="" scs0="" and="" enzyme="" ics0="" values="" are="" indicative="" of="" stronger="" scavenging="" and="" inhibitory="" activities="" of="" a="" given="" sample="" on="" dpph*="" and="" enzymes,="" respectively="" [34].="" thus,="" when="" taken="" together,="" the="" negative="" correlations="" between="" total="" phenolics="" and="" dpph·sc50,="" α-amylase="" ic50="" and="" α-glucosidase="" ic50,="" as="" well="" as="" the="" positive="" correlations="" between="" total="" phenolics="" and="" abts="" scavenging="" ability="" and="" reducing="" power,="" suggest="" that="" phenolic="" compounds="" may="" have="" contributed="" majorly="" to="" the="" observed="" antioxidant="" and="" starch-hydrolyzing="" enzymes="" inhibitory="" activities="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="">

3. חומרים ושיטות

3.1. כימיקלים וריאגנטים

טרולוקס, קוורצטין, חומצה L-אסקורבית, חומצה גאלית, ABTS (2,2'-אזינו-ביס-(3-אתיל-בנטיאזולין-6-חומצה סולפונית)), DPPH(2,2-דיפניל -2-picrylhydrazyl), -glucosidase מ-Bacillus stearothermophilus, p-nitrophenylglucopyranoside (PNPG), -עמילאז, עמילן מסיס ואקרבוז נרכשו מסיגמא (סנט לואיס). נעשה שימוש בדרגות אנליטיות של כל שאר הכימיקלים והממסים.

3.2. אוסף דוגמאות

דגימות זרעים יבשות של שש היברידיות תירס צהוב-כתום עמידים בצנרת (מקודדים AS1828-1,4,6,8,9,11) שגודלו כולם בסמינקה (8 מעלות 39'E, 10 מעלה 34' N; גובה של 760 מ'; גשם שנתי של 1149 מ"מ; הטמפרטורה של 18.1-37.3 מעלות ; סוג קרקע, ניטוסולים דיסטריים) וזריה (7 מעלות 45'E, 11 מעלות 8'N ; גובה של 622 מ'; גשם שנתי של 1076 מ"מ; טמפרטורה ממוצעת של 13.9-35.5 מעלות ; סוג קרקע, Ferric Luvisols) נאספו מתוכנית שיפור התירס של המכון הבינלאומי לחקלאות טרופית (IITA), איבאדן, ניגריה. הכלאיים נשתלו בחודש מאי למשך שתי עונות, בעיצוב בלוקים שלם אקראי בשלוש שכפולים, במהלך העונה הגשומה. הדגימות נטחנו לתוך קמח (גודל מסננת 0.50 מ"מ) עם Perten Laboratory Hammer Mill (3102, ארה"ב) ונארזו הרמטית בשקיות דגימה אטומות לניתוחים מעבדתיים נוספים.

3.3. הכנה1 של תמצית דגימות

כדי להכין תמצית מקמח היברידי תירס צהוב-כתום עמיד ל-Striga, 1 גרם מהקמח הושרה ב-10 מ"ל מתנול בצינור צנטריפוגה מכוסה של 50 מ"ל למשך הלילה (12 שעות) עם ניעור לסירוגין. לאחר מכן, התערובת עברה צנטריפוגה ב-3000 סל"ד למשך 10 דקות, ולאחר מכן נאסף הסופרנטנט (תמצית מתנולית) ואוחסן ב--4 מעלות C עד לניתוח [41].

3.4. קביעת תכולת הפנולים הכוללת

שיטת Folin-Ciocalteu שתוארה על ידי Singleton et al. [42] אומצה כדי לקבוע את תכולת הפנולים הכוללת של תמצית קמח תירס צהוב-כתום עמיד לסטריגה, חלק (300 ul) מהתמצית הועבר למבחנה (בשלוש עותקים). לאחר מכן, נוספו 1.5 מ"ל של ריאגנט Folin-Ciocalteu (ראגנט מלאי Folin-Ciocalteu מדולל 10 פעמים עם מים מזוקקים) ו-1.2 מ"ל של תמיסת Na2CO3 (7.5 אחוזים w/v), והתערובת הודגרה בחושך למשך 30 דקות בשעה טמפרטורת חדר. לאחר מכן, הספיגה נקראה ב-765 ננומטר מול ריק. התכולה הפנולית הכוללת חושבה באמצעות עקומת כיול חומצה גאלית והובאה כשווי חומצה גאלית (GAE) בדגימה של מ"ג/גרם.

3.5. קביעת תכולת הפלבנואידים הכוללת

הפרוטוקול המתואר על ידי Kale et al. [43] נעשה שימוש כדי לקבוע את תכולת הפלבנואידים הכוללת של תמצית קמח תירס צהוב-כתום עמיד לסטריגה. בקצרה, 0.5 מ"ל מהתמצית חולקו למבחנות; לאחר מכן הוסף 1.5 מ"ל מתנול, 0.1 מ"ל של אלומיניום כלוריד (10 אחוז), 0.1 מ"ל של 1 M אשלגן אצטט ו-2.8 מ"ל מים מזוקקים. תערובת התגובה עברה מערבולת והודגרה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ולאחר מכן הקראת הספיגה ב-514 ננומטר. תכולת הפלבנואידים הכוללת של התמציות באה לידי ביטוי כשווה ערך לקוורצטין (QE) בדגימה של מ"ג/גרם.

3.6. קביעת תוכן Tan1nin

תכולת הטאנינים בתמציות הקמח של כלאי תירס צהוב-כתום עמיד לסטריגה הוכמתה בשיטה הקולורימטרית שתוארה קודם לכן על ידי ג'וסלין [44], עם שינוי קל. חלק מהדגימה (0.5 גרם) התפזר ב-5 מ"ל של 1 אחוז HCl במתנול והושאר למשך 15 דקות. לאחר מכן, התערובת עברה צנטריפוגה ב-3{{10}}00 סל"ד למשך 10 דקות. חלק של 0.1 מ"ל מהסופרנטנט הוצא למבחנה המכילה 7.5 מ"ל מים מזוקקים, ולאחר מכן נוספו 0.5 מ"ל מגיב פולין-דניס ו-1 מ"ל תמיסת Na2CO3 (35 אחוז), והנפח הועמד לעד. 10 מ"ל עם 0.9 מ"ל מים מזוקקים לאחר הערבוב, תערובת התגובה הודגרה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, והספיגה נקראה ב-760 ננומטר. תכולת הטאנין, מבוטאת כשווה ערך לחומצה טאנית (TAE) בדגימה של מ"ג/גרם, חושבה על פי עקומה סטנדרטית של חומצה טאנית.

3.7. כימות של תוכן הקרוטנואידים של המדגם

תכולת הקרטנואידים של קמח כלאי תירס צהוב-כתום עמיד לסטריגה נקבעה על ידי אימוץ השיטה שתוארה על ידי Howe and Tanumihardjo [45]. קרוטנואידים הופצו מהקמחים על ידי ערבוב 0.6 גרם מהדגימה עם 6 מ"ל של אתנול (המכיל 0.1 אחוז טולואן הידרוקסיל בוטיל). התערובת הוכנסה לאמבט מים ב-85 מעלות למשך 5 דקות. לאחר מכן, השמן המפריע בתערובת סובן עם אשלגן הידרוקסיד (80 אחוזים w/v) ב-85 מעלות באמבט מים למשך 5 דקות. לאחר מכן ערבבו את התרחיף באמצעות מכונת מערבולת והוחזרו לאמבט המים למשך 5 דקות נוספות. הוא הועבר מיד לאמבט של קרח, ונוספו 3 מ"ל מים קרים דה-יונים. תכולת הקרוטנואידים מהתערובת הופרדו שלוש פעמים רצופות עם 3 מ"ל של n-הקסאן על ידי צנטריפוגה ב-1000 סל"ד למשך 10 שניות. השכבה העליונה של התערובת חולקה לתוך צינור ריכוז של 50 מ"ל. חלק ההקסאן המשולב נשטף שלוש פעמים במים מפושטים, סוחרר, וצנטריפוגה במשך 10 שניות ב-1000 סל"ד. חלק ה-n-hexane יובש באמצעות רכז TurboVap (LIV) תחת גז חנקן למשך 25 דקות. התמצית המיובשת שוחזרה עם מתנול/דיכלורומתאן (1 מ"ל, 50:50 v/v), ומנה של 100 μL הוזרק למערכת HPLC כדי לכמת את הקרוטנואידים. מערכת HPLC (Water Corporation, Milford, MA, ארה"ב) כללה עמוד שמירה, עמודת קרוטנואידים C30 YMC (4.6×250 מ"מ, 3 מיקרומטר), משאבת HPLC בינארית (Waters 626), דוגמית אוטומטית (Waters 717), ו גלאי מערך פוטודיודות (Waters 2996). המערכת פעלה עם תוכנת Empower 1 (Waters Corporation). הפאזה הניידת כללה ממס A, המכיל מתנול: מים (92:8 v/v) עם 10 mmol/L אמוניום אצטט, וממס B, המכיל 100 אחוז מתיל שלישוני-בוטיל אתר. פליטת שיפוע בוצעה בקצב זרימה של 1 מ"ל לדקה בתנאים הבאים: 29 דקות של שיפוע ליניארי מ-83 אחוז ל-59 אחוז A; 6 דקות של שיפוע ליניארי מ-59 אחוז ל-30 אחוז A; 1 דקות של החזקה ב-30 אחוז A;4 דקות של שיפוע ליניארי מ-30 אחוז ל-83 אחוז A והחזקה של 4-דקות ב-83 אחוזים. כרומטוגרמות של הקרטנואידים נוצרו ב-450 ננומטר, והקרוטנואידים הספציפיים זוהו וכומתו בשיטת התקנים החיצוניים על בסיס עקומת הכיול מתקנים טהורים והשוואה של ספקטרום הספיגה ואלוציה משותפת עם קרוטנואידים סטנדרטיים.

3.8. קביעת תכולת חומצה פיטית

השיטה של ​​וילר ופרל [46] הופעלה כדי לקבוע את תכולת החומצה הפיטית של הקמחים. המיצוי נעשה על ידי ניעור מכני של תערובת של 1 גרם קמח ו-25 מ"ל של חומצה טריכלורואצטית 3 אחוז (TCA) למשך שעה אחת והתרחיף עבר צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-3500 סל"ד. מנה של 10 מ"ל מהסופרנטנט עורבבו עם תמיסה של 4 מ"ל כלוריד ברזל, והתערובת חוממה באמבט מים רותחים למשך 45 דקות. ההשעיה שהתקבלה בוצעה בצנטריפוגה ב-3500 סל"ד למשך 15 דקות והסופרנטנט הוסר בזהירות. לאחר מכן, המשקע נשטף פעמיים על ידי פיזור ב-25 מ"ל של 3 אחוז TCA, חימום באמבט מים רותחים למשך 10 דקות, וצנטריפוגה ב-3500 סל"ד למשך 10 דקות. נפח המשקעים הועלה ל-30 מ"ל עם מים מזוקקים, והתערובת חוממה באמבט מים רותחים למשך 30 דקות. התרחיף החם סונן בעזרת נייר פילטר Whatman (מס' 2), והמשקעים נשטפו עם 60 מ"ל מים מזוקקים חמים כדי להבטיח סינון מלא. לאחר מכן, המשקע שנשמר על נייר הסינון הומס עם 40 מ"ל של 3.2 M HNO3 חם לתוך בקבוק נפח של 100 מ"ל. מנה של 0.5 מ"ל הועברה לצינור צנטריפוגה ודולל ב-7 מ"ל מים מזוקקים, לאחר מכן נוספו 2 מ"ל של 1.5 מ"ל KSCN, והנפח הועלה ל-10 מ"ל עם 0.5 מ"ל מים מזוקקים. הספיגה נקראה (בתוך דקה אחת) ב-480 ננומטר. תכולת החומצה הפיטית של הקמחים חושבה באמצעות יחס אטומי Fe/P של 4:6.

3.9. 2,2-אזינוביס(3-אתיל-בנזותיאזולין-6-חומצה סולפונית) רדיקלי קטיון(ABTS· plus )ScaOenging Assay/

היכולת של תמציות קמח תירס צהוב-כתום עמידים לסטריגה לסלק ABTS" נחקרה על ידי אימוץ ההליך שדווח על ידי Reet al. [47]. ABTS* בתוספת ריאגנט עבודה הוכן על ידי ערבוב יסודי של נפח שווה של תמיסות מימיות של ABTS plus (7 מילימול/ליטר) ו-K2S2Os (2.45 מילימול/ליטר) ודגירה של התערובת

בארון חשוך בטמפרטורת החדר למשך 16 שעות. לאחר מכן, ספיגת המגיב הותאמה ל-0.70±0.02 עם אתנול (95 אחוז) ב-734 ננומטר. לאחר מכן 0.2 מ"ל מהתמצית ו-2.0 מ"ל מגיב ABTS* הוזרקו למבחנה, ערבבו היטב והודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות במצב חשוך. לבסוף, הספיגה נקראה בספקטרופוטומטר UV-Visible (חברת מילטון רוי, ארה"ב) ב-734 ננומטר. יכולת ההסרה של ABTSe ​​פלוס של תמציות הקמח חושבה מאוחר יותר מתוך עקומת תקן של Trolox ובאה לידי ביטוי כיכולת נוגדת החמצון המקבילה של Trolox (TEAC).

3.10. 2,2-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl Radical (DPPH") מבחן ניקוי

הפרוטוקול שדווח על ידי Cervato et al. [48] ​​נעשה שימוש כדי לקבוע את היכולת של תמציות הקמח לנקות DPPH", תוך שימוש בוויטמין C (חומצה אסקורבית) כנוגד חמצון ייחוס. בקצרה, תערובת תגובה המכילה 1.0 מ"ל של ריכוזים שונים (8, 16) , 24, 32 מ"ג/מ"ל) מהתמצית (או ויטמין C) ו-3.0 מ"ל של תמיסה בדרגת DPPH (60 מיקרומטר) הודגרה בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות. לאחר מכן, הספיגה נקראה ב-517 ננומטר, ויכולת הניקוי של DPPH ( אחוזים ) של התמציות חושבה ובוטאה כריכוז התמצית שסלק 50 אחוז מה-DPPH (SC50).

3.11. מבחן הפחתת כוח

היכולת של תמציות הקמח להפחית את Fe3 plus ל- Fe2 plus נבדקה על ידי אימוץ הפרוטוקול המתואר על ידי Oyaizu [49]. בקצרה, תערובת של התמצית (2.5 מ"ל), 200 מ"מ חיץ נתרן פוספט (pH 6.6) (2.5 מ"ל), ו-1 אחוז אשלגן פריציאניד (2.5 מ"ל) הודגרה ב-50 מעלות למשך 20 דקות לאחר מכן נוספו 2.5 מ"ל של חומצה טריכלורואצטית 10 אחוז. לאחר מכן, התערובת עברה צנטריפוגה ב-650×g למשך 10 דקות. חלק של 2.5 מ"ל מהסופרנטנט הוצא במבחנה, ו-2.5 מ"ל של מים מזוקקים ו-1 מ"ל של 0.1 אחוז פרריקכלוריד נוספו וערבבו היטב, והספיגה נקראה ב-700 ננומטר. לבסוף, כוח ההפחתה של התמציות חושב והובע במיליגרם שווה ערך לחומצה גאלית לגרם דגימה.

3.12. בדיקת עיכוב אלפא-עמילאז

בדיקת עיכוב אלפא-עמילאז בוצעה על ידי אימוץ ההליך המתואר על ידי Kwon et al. [50]. בבדיקה זו נעשה שימוש בלבלב חזירי-עמילאז (EC3.2.1.1) ועמילן מסיס (מצע). דילולים שונים של תמציות הקמח, בסך הכל 500μL ו-500μL של 0.02 M חיץ נתרן פוספט (pH6.9 עם 0.006 M NaCl) המכילה 0.5 מ"ג/מ"ל תמיסה של עמילאז, עורבבו והודגרו ב-37 מעלות למשך 10 דקות. לאחר מכן, נוספו 500 μL של תמיסת עמילן 1 אחוז במאגר נתרן פוספט של 0.02 M, ותערובת התגובה הודגרה ב-37 מעלות למשך 15 דקות. לאחר מכן, ההידרוליזה המזרזת-עמילאז של עמילן הופסקה על ידי הוספת 1.0 מ"ל של מגיב צבע DNSA (1 אחוז 35- חומצה דיניטרו סליצילית, ו-12 אחוז נתרן אשלגן טרטרט ב-0.4 M NaOH). מאוחר יותר הודגרה תערובת התגובה למשך 5 דקות באמבט מים רותחים, מקוררה לטמפרטורת החדר ומדוללה ב-10 מ"ל מים מזוקקים. הספיגה של התערובת נקראה ב-540 ננומטר. בדיקת התייחסות שלא כללה את תמצית הקמחים נכללה בניסוי. לאחר מכן, אחוז עיכוב העמילאז חושב באופן הבא:

(A540R - A540S)× 100 אחוז עיכוב =A540R

כאשר A540R הוא קריאת הספיגה של הפניה; A540S הוא קריאת הספיגה של המדגם.

3.13. בדיקת עיכוב אלפא גלוקוזידאז

Alpha-glucosidase inhibitory activity of the flours extracts was conducted by adopting the procedure reported by Kim et al. [39], using Bacillus stearothermophillus α-glucosidase (EC3.2.1.20) and para-nitrophenylglucopyranoside (PNPG) as the substrate. Five (5)units of an aliquot of α-glucosidase were incubated with 20 μg/mL of the extract for 15 min. The hydrolytic reaction was initiated by adding 3 mM PNPG prepared in 20 mM phosphate buffer, pH6.9, which served as a substrate. The hydrolytic reaction was allowed to proceed for 20 min at37°C, after which 2 mL of 0.1 M Na>CO: נוסף כדי לסיים את התגובה. בדיקת התייחסות ללא תמצית הקמח נכללה בניסוי. הספיגה של ה-p-nitrophenol הצהוב ששוחרר מההידרוליזה המזוזרת של PNPG של PNPG נקראה ב-400 ננומטר ואחוז עיכוב ה-o-glucosidase חושב כך:

(A400R - A400S)× 100 אחוז עיכוב =A400R

כאשר A400R הוא קריאת הספיגה של הפניה; A400S היא קריאת הספיגה של המדגם.

3.14. ניתוח נתונים

הנתונים שהתקבלו במחקר זה (מקביעות משולשות) הובעו כערכים ממוצעים ± סטיית תקן (SD). באמצעות חבילת התוכנה הסטטיסטית SPSS (גרסה 16), בוצע ניתוח שונות (ANOVA) בכיוון אחד על הנתונים, והערכים הממוצעים הושוו באמצעות מבחן הפוסט-הוק של Tukey ב-p<0.05. the="" associations="" between="" the="" bioactive="" components,="" the="" antioxidant,="" and="" the="" starch-hydrolyzing="" enzymes="" inhibitory="" activities="" were="" calculated="" using="" the="" pearson="" correlation="" test.="" column="" representations="" of="" the="" mean="" values="" were="" done="" using="" graphpad="" prism="" (5th="">

4. מסקנות

שש הכלאיים של תירס צהוב-כתום עמידים ל-Striga הכילו מרכיבים ביו-אקטיביים חשובים (סה"כ פנולים, סך פלבנואידים, טאנינים, חומצה פיטית וקרוטנואידים). התמציות שלהם הפגינו פעילות נוגדת חמצון חזקה ועיכבו אנזימים הידרוליזים של עמילן (-עמילאז ו-glucosidase). מבין כלאי תירס צהוב-כתום עמידים ל-Striga, ל-AS1828-9 הייתה הפעילות המעכבת ביותר של נוגדי החמצון וההידרוליזה של האנזים. נצפו מתאמים מובהקים בין התוכן הפנולי הכולל לבין ABTS* פלוס , יכולת ניקוי דרגת DPPH, הפחתת הכוח, פעילות מעכבת -עמילאז ו-glucosidase של הכלאיים של תירס צהוב-כתום עמידים ל-Striga. פעילותם המעכבת של האנזימים נוגדי החמצון והעמילן מרמזים שהכלאיים של תירס צהוב-כתום עמידים ל-Striga (במיוחד AS1828-9) עשויים להועיל במניעה ו/או בהקלה של עקה חמצונית והיפרגליקמיה לאחר ארוחה.