השפעות נוירו-הגנה חריפות תלויות מינון של פולי(פרו-17 אסטרדיול) בדגם של עכבר של פגיעת חבלה בעמוד השדרה

תַקצִיר

17 -אסטרדיול (E2) מעניק הגנה עצבית במודלים פרה-קליניים של פגיעה בחוט השדרה כאשר הם ניתנים באופן מערכתי. מטרת מחקר זה הייתה ליישם E2 באופן מקומי על חוט השדרה הפגוע למשך זמן ממושך באמצעות חומרים ביו-סרטים פולי(פרו-E2).

ככל שאנשים לומדים יותר על פציעות חוט שדרה, אנו מתחילים להבין את ההשפעה שיש לה על הבריאות הפיזית והנפשית של אנשים. למרות שפציעות חוט השדרה יכולות לגרום לתופעות שליליות רבות, למרבה המזל, ניתן לשלוט בהשפעתן על הזיכרון.

ראשית, עלינו להבהיר מהי פגיעה בחוט השדרה. חוט השדרה הוא עצב מוגן בעמוד השדרה שאחראי על העברת הוראות מהמוח לחלקים שונים בגוף. אם חוט השדרה נפגע, חלקים מסוימים בגוף יאבדו קשר טוב עם המוח, וכתוצאה מכך פגיעה בתנועת הגפיים, התחושה והשליטה האוטונומית.

לפציעות חוט שדרה עשויה להיות השפעה מסוימת על הזיכרון של אנשים, במיוחד בשלבי השיקום המוקדמים של חולים עם פציעות חוט שדרה. פציעות חוט השדרה עלולות לגרום להתדרדרות תשומת הלב, זיכרון העבודה ויכולת העיבוד הרגשי של האדם, מה שישפיע על יכולת הזיכרון של האדם.

עם זאת, השפעות שליליות אלו יפחתו בהדרגה ככל שהמטופלים יעברו טיפול שיקומי. מטופלים יכולים לשפר את הזיכרון שלהם על ידי השתתפות במשחקי זיכרון ואימונים קוגניטיביים אחרים. יחד עם זאת, שיקום גופני תורם גם לשיקום התפקודים המוטוריים והחושיים של הגוף, ובכך לשפר את התפקודים הרגשיים והקוגניטיביים.

עלינו לעודד חולים עם פציעות חוט שדרה להשתתף באופן פעיל בטיפול שיקומי ולהתמיד באימוני שיקום לשיפור הבריאות הגופנית והנפשית. אנא האמינו שבעזרת קוגניציה נכונה וטיפול לאחר הניתוח, המטופלים יכולים להתגבר על השפעת הפגיעה בחוט השדרה על הזיכרון ולהמשיך לחיות חיים פעילים. ניתן לראות שאנו צריכים לשפר את הזיכרון, ו-Cistanche יכולה לשפר משמעותית את הזיכרון מכיוון ש-Cistanche יכולה לווסת גם את איזון הנוירוטרנסמיטורים, כמו הגברת רמות האצטילכולין וגורמי גדילה, החשובים מאוד לזיכרון וללמידה. בנוסף, Cistanche יכול גם לשפר את זרימת הדם ולקדם אספקת חמצן, מה שיכול להבטיח שהמוח יקבל מספיק תזונה ואנרגיה, ובכך לשפר את החיוניות והסיבולת של המוח.

לחץ על יודע תוספי מזון כדי לשפר את הזיכרון

בעקבות פגיעה בחוט השדרה בעכברים זכרים בוגרים, סרטי פולי(פרו-E2) הושתלו תת-דורית, וההגנה העצבית הוערכה באמצעות אימונוהיסטוכימיה 7 ימים לאחר הפציעה וההשתלה. במחקרים אלה, סרטי פולי(פרו-E2) שיפרו באופן מתון את ההגנה הנוירובית מבלי להשפיע על התגובה הדלקתית. בהשוואה לבקרות הפצועים.

כדי להגדיל את מינון ה-E2 ששוחרר, יוצרו סרטי פולי(pro-E2) משחררי בולוס על ידי שילוב של E2 לא קשור בסרטי הפולי(proE2).

עם זאת, בהשוואה לבקרות הפצועות, סרטי פולי(פרו-E2) משחררי בולוס לא שיפרו באופן משמעותי את ההגנה העצבית או הגבילו דלקת ב-7 או 21 ימים לאחר הפציעה. עבודה עתידית תתמקד בפיתוח חומרים ביו-פולי(פרו-E2) המסוגלים ליתר דיוק שחרור מינונים טיפוליים של E2.

מָבוֹא

פציעת חוט שדרה טראומטית (SCI) היא מצב מתיש המשפיע על מעל 18,000 אנשים מדי שנה בארצות הברית,1 בעוד השכיחות העולמית של SCI מוערכת בין 236 ל-1009 למיליון.2

חולים המושפעים מ-SCI סובלים מליקויים נוירולוגיים חמורים, כולל אובדן תחושה, פגיעה בתפקוד המעי/שלפוחית ​​השתן ושיתוק.3,4 ההשפעה העיקרית על חוט השדרה גורמת למוות נוירוני באתר הפציעה, אשר מוחמר עוד יותר על ידי מספר מפלי פציעה משניים הכוללים אסטרוציטים ומקרופאגים. .

עם הזמן, אסטרוציטים אלו יוצרים צלקת גליאלית אשר מונעת את הרחבת האקסונים מעבר לקצה הנגע.5 אין עד כה תרופות נוירו-פרוטקטיביות מאושרות על ידי ה-FDA לטיפול ב-SCI.

מחקר שנמשך כמה עשורים התמקד במתן מערכתי של ביומולקולות כדי למנוע אובדן עצבי עקב פציעה משנית ו/או לקדם התחדשות אקסונלית, מה שמוביל בסופו של דבר לשיקום של תפקוד שאבד.6 ביומולקולה אחת שהוכיחה הבטחה משמעותית במודלים פרה-קליניים של SCI היא הנקבה. הורמון המין, 17 -אסטרדיול(E2).

מתן E2 מועיל באופן כללי למערכת העצבים המרכזית על ידי הפחתת דלקת, 7-9 הקלה על תגובתיות תאי גליה, 10 הגבלת מתח חמצוני, 11-14 והפחתת מוות נוירוני אקציטוטוקסי הנגרם על ידי גלוטמט.15 E2 משפר את ההתאוששות התפקודית בדגמי מכרסמים שונים של SCI.10, 16,17 מעניין, מתן מערכתי במינון מרובות של E2 גורם להחלמה תפקודית מהירה יותר18,19 בהשוואה לבעלי חיים המקבלים מנה בודדת בלבד.17

מכיוון ש-E2 מקדם התאוששות תפקודית בצורה יעילה יותר באמצעות משטרי מינונים מרובים, המטרה שלנו הייתה לשחרר E2 באופן יציב במקום הפציעה (כדי למנוע השפעות מחוץ למטרה) כדי לעקוף בעיות הנובעות ממינונים מרובים/הזרקות מערכתיות של E2.

לשם כך, השתמשנו באסטרטגיית ביו-חומר פולי(פרו-תרופתי) שבה התרופה המקורית (E2) הופעלה תחילה עם קבוצות אליל תגובתיות ולאחר מכן פולימרה באמצעות תוספת פוטו-יזית תיול-אן רדיקלית עם דיתיול גמיש אוליגו-(אתילן גליקול), כפי שתואר קודם לכן. .20 השגנו שרשראות פולימר במשקל מולקולרי גבוה, המורכבות מ-E2prodrug כיחידה החוזרת בתוך הפולימר.

עם פירוק הידרוליטי, הפולימר משחרר בהדרגה E2 לתוך המדיה שמסביב. תוצרי הלוואי האחרים היחידים מהשחרור הם פחמן דו חמצני ואוליגו (אתילן גליקול) (oEG) (איור 1). שרשראות פולי(פרו-E2) המיוצרות לסרטים או מיקרופייבר יכולות לשחרר E2 בריכוזי ננומולרים במבחנה בסולם זמן של חודשים עד שנים .20

ה-E2 המשתחרר מפיגומי הפולי(פרו-E2) הללו הוא ביו-אקטיבי, והפיגומים הללו מקדמים נוירוטרופיזם והגנה עצבית במבחנה על ידי הגנה על נוירונים מלחץ חמצוני המושרה על ידי מי חמצן. כאן, יישמנו את סרטי הפולי(פרו-E2) במודל עכברי של חבלה SCI, מיד לאחר הפציעה, והערכנו את יכולת ההגנה העצבית שלהם in vivo.

עיצוב הסרט הפולי(פרו-E2) הראשוני שלנו הגביר את ההגנה הנוירובית בצורה חריפה (7 ימים לאחר הפציעה) באתר הפציעה מבלי להשפיע על התגובה הדלקתית. מכיוון שסרטי poly(pro-E2) משחררים ננוגרמים של E2 ליום, פיתחנו אסטרטגיית שחרור נוספת שבה unboundE2 שולב במטריצת הפולי(pro-E2). שיערנו ששחרור בולוס של E2 לא קשור עשוי לספק יתרונות נוירו-הגנה נוספים.

סרטי פולי(פרו-E2) שוחררו E2 באופן פרץ ואחריו שחרור מתמשך של E2 מהפולימר בריכוזים נמוכים יותר. צביעה אימונוהיסטולוגית העריכה נוירונים, אסטרוציטים ומקרופאגים/מיקרוגליות הנמצאים באתר הפציעה בצורה חריפה (7 ימים לאחר הפציעה) וכרונית (21 ימים לאחר הפציעה) לאחר SCI בנוכחות סרטי פולי (פרו-E2) משחררי בולוס אלה.

תוצאות ודיון

סרטי פולי(פרו-E2) משחררים E2 בריכוזים ננומולריים, מקדמים צמיחה נוירונית מגנגליון שורש הגב, ומגנים על נוירונים מלחץ חמצוני המושרה על ידי מי חמצן במבחנה.20 המחקר המוצג כאן מבקש לקבוע את יכולתו של פולי(פרו-E2) סרטים כדי לספק הגנה עצבית in vivo באמצעות מודל עכברים של SCI חבלה.

חבלה בינונית SCI הושרה בעכברים זכרים בוגרים, ומיד לאחר הפציעה, סרטי פולי(פרו-E2) הונחו ישירות מעל הפציעה (איור 2A). כדי להבטיח שסרטי הפולי(פרו-E2) יישארו במקומם לאחר ההשתלה, הושתלו סרטי פולי(פרו-E2) הטעונים ברודמין B בחוטי השדרה של בעלי חיים פצועים. שבעה ימים לאחר ההשתלה, חוטי השדרה נאספו והצטלמו באמצעות מיקרוסקופ אור (איור 2B). בכל החיות, סרטי הפולי(pro-E2) שהושתלו עם רודמין B נותרו במקום המאמתים את פרוטוקול ההשתלה.

כדי לבדוק את יכולתם של סרטי פולי(פרו-E2) לספק הגנה עצבית ולהקל על דלקת, הושתלו סרטי פולי(פרו-E2) (ללא rhodamine B) בעקבות פציעת עמוד השדרה, וחוטי השדרה נאספו 7 ימים לאחר הפציעה וההשתלה. חתכים אורכיים (עובי 10 מיקרומטר) נחתכו, במרכזם סביב מוקד הפציעה, וסומנו על מנת לדמיין נוירונים ומקרופאגים בחוט השדרה (איור 3).

קטעים סומנו עבור NeuN כדי להעריך את הנוכחות הנוירונית, וניתוח כמותי של הצביעה גילה שסרטי הפולי(pro-E2) הגדילו באופן משמעותי את האזור החיובי NeuN סביב מוקד הפציעה בהשוואה לבקרות הפצועים שלא קיבלו שתלי סרט (איור 3A; p=0.0002). צביעה נוספת עבור אקסונים באמצעות NFH (שרשרת כבדה של נוירופילמנטים) חשפה גם את ההשפעה הנוירו-פרוטקטיבית החריפה של סרטי הפולי(pro-E2) המושתלים (איור 3B; p=0.0017).

ראינו ששינוי זה בהגנה עצבית לא נבע משינוי באפופטוזיס (קספסה 3) באתר הפציעה (תומך באיור S1; p=0.9966). צביעה עבור מקרופאגים פעילים (CD68) גם לא גילתה כל הבדלים משמעותיים בין החיות שטופלו בסרט פולי(פרו-E2) לבין החיות הלא מטופלות (איור 3C; p= 0.7207).

ביחד, סרטי פולי(פרו-E2) מגבירים באופן צנוע את ההגנה העצבית בצורה חריפה מבלי לשנות את התגובה הדלקתית. סרטי פולי(פרו-E2) הגדילו את הצפיפות הנוירונים בצורה חריפה בכמעט 20%, אך לסרטים לא היו השפעות אנטי דלקתיות ברורות (בהתבסס על כימות של האזור שנכבש על ידי המקרופאגים המופעלים) (איור 3).

חוסר זה של הפחתה בדלקת עשוי להצביע על כך שהמינונים האנטי-דלקתיים והנוירו-פרוטקטיביים של E2 שונים וששניהם לא הושגו בניסוח הסרט הנוכחי.20 שיערנו שהגברת שחרור E2 מהסרטים הפולי(פרו-E2) עשויה להפחית את הדלקת. ולאפשר תגובה נוירו-הגנה חזקה יותר.

כדי להגדיל את המינון של E2 ששוחרר בצורה חריפה, סרטי הפולי(פרו-E2) שונו כך ששחרור בולוס E2 יתרחש מיד לאחר ההשתלה. לאחר שחרור הבולוס של E2, פירוק פולימר יגיע לשחרור E2 באותו ריכוז כמו קודם. הניסוי שתואר לעיל חזר על עצמו תוך שימוש בסרטי פולי(פרו-E2) משחררי בולוס, וההגנה העצבית והדלקת הוערכו ב-7 ימים לאחר הפציעה (dpi).

עם זאת, במקום יתרון נוסף, סרטי הפולי(pro-E2) המשחררים בולוס לא הגדילו באופן משמעותי את האזור החיובי NeuN בהשוואה לבקרות הפגועים, הלא מטופלים (איור 4A; p=0.6770). סרטי הפולי(proE2) משחררי בולוס הגבירו את ביטוי CD68, אך העלייה לא הייתה שונה סטטיסטית (p= 0.1780).

מגמות עלייה בתגובתיות גליה ודלקת מיקרוגליה נצפו גם בנוכחות סרטי פולי(פרו-E2) משחררי בולוס עקב העלייה בביטוי GFAP (אסטרוציטים) ו-Iba1 (מיקרוגליה); עם זאת, העליות הללו לא היו גדולות מבחינה סטטיסטית ממה שנצפה בקבוצת הביקורת הפגועה, הלא מטופלת (p=0.3233ו-p=0.3053, בהתאמה). ביחד, סרטי פולי(פרו-E2) משחררי בולוס לא שיפרו את ההגנה העצבית, ותגובתיות אסטרוציטים ונוכחות מקרופאגים/מיקרוגליות לא הופחתו כפי שהשערו תחילה.

מאחר שלא נצפו הבדלים בין בעלי חיים פצועים, לא מטופלים לבין בעלי חיים מטופלים בסרט פולי(proE2) משחררי בולוס, לא נצפו בנקודת הזמן החריפה של 7 dpi, נבחרה נקודת זמן כרונית לחקירה נוספת מאז סרטי הפולי(pro-E2). יכול לשחרר E2 לטווח ארוך.20 הניסוי המתואר לעיל חזר על עצמו עם סרטי ה-bolus-releasingpoly(pro-E2), אך החיות הוערכו באופן כרוני ב-21 dpi (איור 5).

חוטי השדרה סומנו עבור אותם סוגי תאים שצוינו קודם לכן. לאחר ניתוח, הייתה נטייה לעלייה בחלק השטח של NeuN בחיות המושתלות בסרט פולי(פרו-E2) משחרר בולוס בהשוואה לבעלי החיים הפצועים, הלא מטופלים (איור 5A; עמ'=0.0897) בנוסף, נצפו מגמות שבהן סרטי פולי(פרו-E2) משחררי בולוס הפחיתו את חלק השטח של ביטוי CD68 ו-GFAP בהשוואה לנתונים מבקרים לא מטופלים של בעלי חיים פצועים (איור 5B, C; p=0.0859 ו-p=0.2780).

עם זאת, אף אחת מהמגמות לא הייתה שונה סטטיסטית. מצד שני, קטעי רקמה המסומנים ב-Iba1 מבעלי חיים שטופלו בפולי(pro-E2) משחררים בולוס הציגו ביטוי מוגבר בהשוואה לנתונים מבקרות לא מטופלות, פצועים (p < 0.0001). העבודה הקודמת שלנו מראה כי poly(pro) -E2) סרטים יצוקים על 15 מ"מ × 15 מ"מ משחררים כ-266 ננוגרם של E2 ליום,20 מה שמתורגם לכ-2 ננוגרם של E2 ליום מהסרטים (1 מ"מ × 1.8 מ"מ) המשמשים כאן. סרטי הפולי(פרו-E2) משחררי בולוס משחררים 40 אג' נוספים של E2 לא קשור באופן חריף לאחר ההשתלה.

מחקר המתמקד בשימוש ב-E2 במודלים של SCI של מכרסמים מראה כי מינון נמוך של אסטרוגן (10 ug/ק"ג) במתן תוך ורידי מחליש גליוזיס תגובתי ומספק הגנה עצבית תוך הפחתה של אירועים דלקתיים, עיכוב אפופטוזיס והגברת אנגיוגנזה. 21 לעומת זאת, מינונים גבוהים וסיסטמיים של אסטרוגנים השפעות שליליות הכוללות שיעור מוגבר של תרומבוזיס עמוק של ורידים וסרטן22,23 והתפתחות של תכונות גופניות נשיות אצל גברים. זה ראוי לציון מכיוון שרוב המחקר של E2 התמקד במתן E2 באופן מערכתי, תוך ורידי או תוך צפק.

בהתחשב בדאגות הבטיחות בשימוש במינונים גבוהים של E2 באופן מערכתי, חשוב לייעל את ריכוז ה-E2 למסירה מקומית לחוט השדרה הפגוע כדי למנוע תופעות לוואי. עד כה, רק מחקר אחד סיפק E2 מחומר ביולוגי באמצעות ננו-חלקיקים כדי לספק E2 באופן מוקדי (2.5 ug או 25 ug). שחרור מננו-חלקיקים הפחית במהירות את הדלקת בצורה חריפה במודל חולדה של חבלה SCI.9היעדר תגובה מובהקת סטטיסטית בנתונים שלנו (איורים 4 ו-5) עשוי לנבוע מחוסר איזון בכמות ה-E2 שאנו מעבירים באופן מקומי לחוט השדרה עם toomuch E2 (40 ug) משתחרר בצורה חריפה בעוד שמעט מאוד (2 ננוגרם) משתחרר באופן כרוני.

למרות שמה שאנו רואים מנתונים אלה הם מגמות צנועות, מחקר זה מדגיש את החשיבות של מינון E2 כדי לקדם הגנה עצבית in vivo. הפחתת המינון הראשוני של E2 והתאמת קינטיקה של הפירוק של החומר הביולוגי הפולי(פרו-E2) יכולים לעזור להקל על בעיה זו ולספק תוצאות טובות יותר להגנת העצבים.

למרות שמחקר זה בוצע אך ורק בגברים, חיוני להעריך את ההשפעה של סרטי פולי (פרו-E2) אלה בשני המינים כדי לבסס פוטנציאל תרגום חוקי עבור החומר הביולוגי הזה. מחקרים הראו שבעקבות SCI, רמות אסטרוגן מוגברות אצל נשים עשויות להיות אחראיות חלקית לשיפור התוצאות התפקודיות שלהן בהשוואה לגברים. 24מאחר שיש נוכחות מוגברת של אסטרוגן אצל נשים, כל אסטרטגיה ביו-חומרית המשתמשת באסטרוגן צריכה לקחת בחשבון רמה מוגברת זו ולשנות את החומר. שחרר את הקינטיקה בהתאם כדי להבטיח שהמינון הנמסר יישאר זהה עבור זכרים ונקבות.

שיטות

ייצור סרטי פולי(פרו-E2).

הפולימר הפולי(פרו-E2) P1 סונתז ואופיין כפי שתואר בפירוט קודם.20 לפולימר משקל מולקולרי ממוצע של MW ~ 80 kDa ופיזור של Đ ~ 3, על פי כרומטוגרפיה של ג'ל חדירה (GPC). סרטי פולי(פרו-E2) יוצרו על ידי המסת הפולימר בכלורופורם (5% משקל/משקל; פולימר/כלורופורם), יציקת התמיסה על גבי כיסויי זכוכית בגודל 15 מ"מ × 15 מ"מ (פתרון 100 μL לכל כיסוי), והשארתם לייבוש לילה תחת ואקום (<100 mTorr) at room temperature (RT). In a subset of experiments, the polymer solution was supplemented with rhodamine B (0.005 wt %/wt; rhodamine B/chloroform) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) to verify the presence of the poly(pro-E2) films in animals post-implantation.
כדי ליצור סרטי פולי(פרו-E2) עם E2 לא קשור, הסרטים יוצרו על ידי הוספת E2 (Abcam, Cambridge, MA) לא קשור לתמיסת הפולימר (0.0625 wt %/wt; E2/chloroform) לפני יציקה טיפה. הפתרון על גבי כיסויי הכיסוי. לפני ההשתלה, כיסויי הכיסוי עם הסרטים עוקרו באמצעות קרינה אולטרה סגולה (UV) למשך 30 דקות והסרטים סולפו מהכיסויים בארון בטיחות ביולוגי סטרילי. סרטי הפולי(pro-E2) נחתכו לאחר מכן לחתיכות בגודל 1 מ"מ × 1.8 מ"מ, המתאימים להשתלה בעכבר מבוגר כמתואר להלן.

חבלה בעמוד השדרה והשתלת סרטי פולי(פרו-E2).

כל הליכי הטיפול הניתוחיים והפוסט-ניתוחיים אושרו על ידי Rensselaer PolytechnicInstitute והוועדות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אוהיו סטייט (IACUC). כדי לעורר חבלה SCI, עכברי זכר C57BL/6 בוגרים (בני 10- עד 12-שבוע), שנרכשו ממעבדת ג'קסון (מספר מלאי 000664; בר הארבור, ME), הורדמו בזריקה תוך צפקית של קטמין (80 מ"ג/ק"ג) וקסילאזין (10 מ"ג/ק"ג). החלק האחורי של החיות היה מגולח והוכן באופן אספטי באמצעות 70% אתנול ובטאדין.

לאחר הנחת החיה על כרית חימום שנשמרה ב-37 מעלות, נפתחו שכבות העור והשרירים כדי לחשוף את עמוד השדרה, ובוצעה כריתת למינקטומית הגב על החוליה התשיעית (T9) החזה כדי לחשוף את חוט השדרה. חבלה בינונית (75 קילו-דין) נגרמה ברמה זו באמצעות אימפטור Infinite Horizons (Precision Systems andInstrumentation, Lexington, KY).

לאחר שהושג הדימום, הדורה נפתחה (איור 2) וסרט פולי(פרו-E2) או סרט פולי(פרו-E2) משחרר בולוס (1 מ"מ × 1.8 מ"מ) הונח מתחת לדורה ומעל לחוט השדרה, מכסה אתר הפציעה. בחיות בקרה, הדורה נפתחה אך סרטי הפולי(פרו-E2) לא הושתלו. שכבות השרירים נסגרו לאחר מכן באמצעות תפרים סטריליים, והעור נסגר באמצעות אטבי פצע מתכת סטריליים.

העכברים קיבלו 2 מ"ל של מי מלח סטרילי שהוזרקו תת עורית והוחזרו לכלובים שלהם והונחו על מחמם שקופיות שהוגדר ל-37 מעלות למשך הלילה. כדי להבטיח הידרציה נכונה וכדי למנוע זיהומים, העכברים הוזרקו תת עורית עם 1-2 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית וגנטוצין (1 מ"ג/ק"ג) מדי יום במשך 5 הימים הראשונים שלאחר הפציעה (dpi). שלפוחית ​​השתן הובעה ידנית פעמיים ביום למשך הניסויים. כל החיות אוכסנו בתנאים קונבנציונליים במחזור אור-חושך של 12-שעה עם גישה חופשית למזון ומים.

קצירת רקמות.

בנקודות הזמן הסופיות המיועדות של 7 או 21 dpi, העכברים הוזרקו לטאלדוזה של קטמין/קסילזין (1.5× מינון כירורגי) וחולפו טרנסלבבי עם 0.1 Mphosphate-buffered saltine (PBS; pH 7.4) ואחריו 4% פרפורמלדהיד (PFA; pH 7.4). חוטי השדרה הוסרו, קיבועו לאחר 2 שעות ב-4% PFA, ולאחר מכן הועברו למאגר פוספט 0.2M (PB; pH 7.4) למשך הלילה.

חוטי השדרה הוגנו בהקפאה ב-30% סוכרוז למשך 48 שעות ב-4 מעלות ולאחר מכן נחסמו למקטעים של 10 מ"מ שמרוכזים סביב מקום הפציעה כשהעמודים הגביים כלפי מעלה. קטעים אלה הוטמעו במדיום טמפרטורה חיתוך אופטימלית של Tissue-Tek (VWR International, Radnor, PA) והוקפאו במהירות על קרח יבש. כל חוטי השדרה נחתכו ב-10 מיקרומטר בקרויוסטט Microm HM505E, שהונח על שקופיות ColorFrost Plus (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), ולאחר מכן מאוחסן ב-20 מעלות עד לשימוש לצביעה חיסונית.

אימונוהיסטוכימיה וכימות.

השקופיות הופשרו על מחמם שקופיות למשך שעה אחת ולאחר מכן נשטפו 3 פעמים ב-0.1 MPBS. פעילות פרוקסידאז אנדוגנית נכבתה על ידי דגירה של השקופיות ב-6% H2O2 מדולל במתנול למשך 15 דקות ב-RT. לאחר כביסה 3 פעמים ב-0.1 M PBS, החתכים הודגרו עם 4% BSA ו-0.1% Triton X-100 ב-0.1 M PBS למשך 1 שעה ואחריה דגירה למשך לילה של הנוגדנים העיקריים ב-4 מעלות או RT (טבלה 1).

השקופיות הודגרו עם נוגדנים משניים מתאימים (1:1000; Vector Laboratories, Burlingame, CA) ב-RT למשך שעה. כדי להמחיש את הנוגדן הקשור, השקופיות הודגרו עם Vectatain Elite-ABC (Vector Laboratories) למשך שעה אחת ופותחו עם ImmPACT3,3'-diaminobenzidine (DAB) או מצע Vector SG (Vector Laboratories) למשך 10 דקות.

קטעים אלה התייבשו באמצעות דגירה רציפה של 2 × 2 דקות ב-70% ו-90% אתנול, 2 × 3 דקות ב-100% אתנול, ולאחר מכן 3 × 3 דקות ב-Histoclear, ולבסוף כוסו ב-Permount (ThermoFisher Scientific). לניתוח הכימות נעשה שימוש בשישה קטעים לכל חיה, במרווחים של 100 מיקרומטר זה מזה בחוט השדרה הפגוע.

החתכים המסומנים באימונו צולמו באמצעות מיקרוסקופ הדמיה Axioplan 2 המצויד במצלמת AxioCamdigital ובתוכנת AxioVision גרסה 4.8.2 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, גרמניה) ואובייקטיבי 5×.

מספר הפיקסלים החיוביים בכל אחד מהקטעים נספר באמצעות תוכנת ניתוח תמונה MIPAR (MIPAR, Worthington, OH) כדי לחשב את אחוז שבר השטח החיובי לכל מקטע. אחוז השטח החיובי הממוצע של ששת החתכים לכל חיה חושב עבור כל אחד מהכתמים ודווח.

ניתוח סטטיסטי.

כל הנתונים מדווחים כממוצע ± סטיית התקן. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות תוכנת GraphPad Prism 9 סטטיסטית (GraphPad Software, San Diego, CA). בכל הניסויים, נעשה שימוש ב-5-6 בעלי חיים בכל קבוצה, שמקורם לפחות בשתי קבוצות שונות של בעלי חיים. כדי לבדוק את ההבדלים בין קבוצת הסרטים הבקרה לפולי(פרו-E2), נעשה שימוש במבחן ה-t של התלמיד (איורים 3, 4 ו-5). המשמעות נקבעה ב-p פחות או שווה ל-0.05.

חומר משלים

עיין בגרסת האינטרנט ב-PubMed Central לחומר משלים.

תודות

המחברים מודים לוונמין לאי על סיועה בניתוחי העכברים.

מימון

עבודה זו קיבלה תמיכה ממלגת קרן קרייג ה. ניילסן (מענק 468116) וממלגת קרן מחקר משותקים של אמריקה (מענק 3171) ל-MKG ומ-NIH R01 (מענק NS092754) ומוענק תמיכה מוסדית של מדינת ניו יורק במדינת ניו יורק ל-R3224G כל עבודת החיות בוצעה בסיוע ממחלקת מדעי המוח של אוניברסיטת אוהיו סטייט כירורגית בתמיכת NINDS Grant P30NS104177.

הפניות

(1). המרכז הלאומי לסטטיסטיקה של פגיעות חוט שדרה. (2020) עובדות ונתונים על פציעת חוט שדרה במבט אחד, אוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם, ברמינגהאם, אל.

(2). Cripps RA, Lee BB, Wing P, Weerts E, MacKay J, and Brown D (2011) מפה גלובלית לאפידמיולוגיה של פגיעות טראומטיות בעמוד השדרה: לקראת מאגר נתונים חי למניעת פציעות. חוּט הַשִׁדרָה. 49, 493–501. [PubMed: 21102572]

(3). דונובן WH (2007) פגיעה בחוט השדרה - עבר, הווה ועתיד. Journal of Spinal CordMedicine 30, 85–100.

(4). Pickelsimer E, Shiroma EJ, and Wilson DA (2010) חקירה כלל-מדינתית של מצבים בריאותיים שליליים של אנשים עם פגיעה בחוט השדרה. J. Spinal Cord Med. 33 (3),221–231. [PubMed: 20737795]

(5). Silver J, and Miller JH (2004) התחדשות מעבר לצלקת גליה. נאט. הכומר נוירוסקי. 5 (2), 146–156. [PubMed: 14735117]

(6). Varma AK, Das A, Wallace G, Barry J, Vertegel AA, Ray SK, and Banik NL (2013) SpinalCord Injury: A Review of Current Therapy, Future Treatments, and Basic Science Frontiers.Neurochem. מילון 38, 895–905. [PubMed: 23462880]

(7). Zendedel A, Mönnink F, Hassanzadeh G, Zaminy A, Ansar MM, Habib P, Slowik A, Kipp M, andBeyer C (2018) אסטרוגן מחליש ביטוי והפעלה מקומית של דלקת לאחר פגיעה בחוט השדרה. מול. נוירוביול. 55 (2), 1364–1375. [PubMed: 28127698]

(8). Lee JY, Choi HY, Ju BG ו-Yune TY (2018) אסטרוגן מקל על כאב נוירופתי שנגרם לאחר פגיעה בחוט השדרה על ידי עיכוב מיקרוגליה והפעלת אסטרוציטים. ביוכים. ביופיס. אקטה, מול. בסיס דיס. 1864 (7), 2472–2480. [PubMed: 29653184]

(9). Cox A, Varma A, Barry J, Vertegel A, and Banik N (2015) ננו-חלקיקים אסטרוגן בפגיעת חוט שדרה של חולדה מעורר השפעות אנטי דלקתיות מהירות בפלזמה, נוזל מוחי ורקמות.J. נוירוטראומה 32 (18), 1413–1421. [PubMed: 25845398]

(10). Sribnick EA, Samantaray S, Das A, Smith J, Matzelle DD, Ray SK, and Banik NL (2010) טיפול באסטרוגן לאחר פגיעה בפציעה כרונית בחוט השדרה משפר את תפקוד התנועה בחולדות. J. Neurosci. מילון 88 (8), 1738–1750. [PubMed: 20091771]

(11). Honda K, Shimohama S, Sawada H, Kihara T, Nakamizo T, Shibasaki H, ו-Akaike A (2001) העברת אותות אנטי-אפופטוטיים לא נוגנומיים על ידי אסטרוגן בנוירונים קליפת המוח מתורבתים. J.Neurosci. מילון 64 (5), 466–475. [PubMed: 11391701]

(12). Sribnick EA, Wingrave JM, Matzelle DD, Ray SK, and Banik NL (2003) אסטרוגן כסוכן נוירו-מגן בטיפול בפגיעות בעמוד השדרה. אן. NY Acad. Sci. 993,125–133. [PubMed: 12853305]

For more information:1950477648nn@gmail.com