אקטאוזיד כאופציה טיפולית פוטנציאלית עבור קרצינומה כבדית ראשונית: מחקר פרה-קליני

איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

די מא, חואן וואנג, לו ליו, מייקי צ'ן וז'יונג וואנג

תַקצִיר

רקע: קרצינומה של הכבד (HCC) הוא גידול ממאיר שכיח עם מאפיינים של פרוגנוזה גרועה, תחלואה גבוהה ותמותה ברחבי העולם. בפרט, רק מספר אפשרויות טיפול מערכתיות זמינות עבור חולי HCC מתקדמים וכוללות סוראפניב ומשטר atezolizumab פלוס bevacizumab שתואר לאחרונה כטיפולי קו ראשון אפשריים. אנו מציעים כאן אקטאוזיד, גליקוזיד פנילתנואיד המופץ באופן נרחב בצמחי מרפא רבים כמועמד פוטנציאלי נגד HCC מתקדם.

שיטות: שגשוג תאים, היווצרות מושבות והגירה נותחו בשלוש שורות התאים HCC האנושיות BEL7404, HLF ו-JHH-7. בדיקת אנגיוגנזה בוצעה באמצעות HUVESs. מודל העכברים העירומים של BEL7404 או JHH-7 xenograft הוקם כדי לנתח את ההשפעות האנטי-גידוליות האפשריות של אקטאוזיד. qRT-PCR ו-Western blotting שימשו כדי לחשוף את המנגנונים האנטי-גידוליים הפוטנציאליים של אקטאוזיד.

תוצאות:אקטאוזיד מ-cistancheעיכבו את התפשטות התאים, היווצרות המושבות והנדידה בכל שלוש שורות התאים HCC האנושיות BEL7404, HLF ו-JHH-7. האיסור על אנגיוגנזה על ידי אקטאוזיד התגלה על ידי עיכוב היווצרות צינורות ונדירת תאים של HUVECs. השילוב של אקטאוזיד וסורפניב יצר עיכוב חזק יותר של יצירת מושבת תאים והגירה של תאי HCC וכן של אנגיוגנזה של HUVECs. היעילות האנטי-גידולית של אקטאוזיד הוכחה עוד יותר במודל העכברים העירומים של BEL7404 או JHH-7 xenograft, עם שיפור בשילוב עם sorafenib בעיכוב הצמיחה של JHH-7 xenograft. טיפול נוסף בתאי JHH-7 עם אקטאוזיד גילה עלייה ברמת חלבון מדכא הגידולים p53 וכן ירידה ברמת הגנים הקשורים לקליקריין (KLK1, 2, 4, 9 ו-10) ללא מובהק שינויים בשאר הגנים KLK1-15.

מסקנות:אקטאוזיד מ-cistancheמפעיל אפקט אנטי-גידולי אולי באמצעות ויסות-על של רמות p53 וכן עיכוב של ביטוי KLK ואנגיוגנזה. Acteoside יכול להיות שימושי כתוספת בטיפול ב-HCC מתקדם במרפאה.

מילות מפתח: Acteoside, Hepatocellular Carcinoma, Sorafenib, Xenograft, p53, Kallikrein

רקע כללי

קרצינומה כבדית (HCC) היא גידול ממאיר שכיח עם מאפיינים של פרוגנוזה גרועה ותחלואה ותמותה גבוהים ברחבי העולם [1, 2]. גורמים שונים זוהו כתורמים להתרחשות ולהתקדמות של HCC, כולל זיהום על ידי נגיף הפטיטיס B או C, השבתת גנים מדכאי גידולים כגון p53, הפעלה לא תקינה של אונקוגנים כגון K-ras, וכמה מולקולות איתות. כגון PI3K, ERK/MAPK ו-Wnt/-catenin וכן התחמקות של מערכת החיסון המארחת [3, 4]. לניהול HCC, כריתה, השתלת כבד ואבלציה בתדר רדיו הן אפשרויות עבור חולי HCC בשלב מוקדם, אך עם שיעורים גבוהים של הישנות וגרורות [3, 5, 6]. בנוסף, רק מספר אפשרויות טיפול מערכתיות זמינות עבור חולי HCC מתקדמים וכוללות סוראפניב ומשטר atezolizumab פלוס bevacizumab שתואר לאחרונה כטיפולי קו ראשון אפשריים [7]. בהקשר זה, יש חשיבות ועניין לפתח חומרים חדשים המכוונים למטרות מולקולריות מרובות או לקבוע אסטרטגיה חדשה כגון יישום טיפול משולב בטיפול ב-HCC מתקדם.

אקטאוזיד מ-cistancheהוא גליקוזיד פנילתנואיד המופץ באופן נרחב בצמחי מרפא רבים, כולל Ligustrum purpurascens [8], Rehmannia glutinosa [9] ו- Ligustrum purpurascens [10]. עדויות מצטברות הראו כי אקטאוזיד יכול להפעיל פעילויות ביולוגיות שונות, כולל הפעילות האנטי-גידולית שלו. לדוגמה, אקטאוזיד הראה השפעות אנטי-פרוליפרטיביות חזקות על תאי סרטן הערמונית [11]. מסירה תוך-צפקית של אקטאוזיד דיכאה את צמיחת הגידול במודל עכבר מלנומה, אולי באמצעות עיכוב חלבון קינאז C [12]. בנוסף, אקטאוזיד העצים את הרגישות של תאי סרטן המעי הגס ל-5- Fluorouracil באמצעות מיקוד איתות PI3K/Akt [13]. הנתונים הקודמים שלנו הראו גם עיכוב של מלנוגנזה על ידי אקטאוזיד בתאי מלנומה B16 [14]. למרות זאת, מידע מועט זמין לגבי היעילות האפשרית של אקטאוזיד בטיפול ב-HCC והמנגנונים הפוטנציאליים הבסיסיים.

במחקר הנוכחי הראינו זאתאקטאוזיד מ-cistancheמעכב את התפשטות התאים, היווצרות המושבות והנדידה בכל שלוש שורות התאים HCC האנושיות BEL7404, HLF ו-JHH7. האנגיוגנזה מעוכבת גם בעקבות טיפול באקטאוזיד, כפי שמוצג על ידי עיכוב היווצרות צינורות ונדירת תאים של HUVECs. היעילות האנטי-גידולית in vivo של אקטאוזיד מודגמת עוד במודל העכברים העירומים של BEL7404 או JHH-7 xenograft, עם שיפור בשילוב עם sorafenib בעיכוב הצמיחה של JHH-7 xenograft. ניתן לייחס את ההשפעות האנטי-גידוליות של אקטאוזיד לוויסות העל של p53 וכן לדיכוי של KLK ואנגיוגנזה.

שיטות

תרבית תאים

שורות התאים BEL7404, HLF ו-JHH7 הושגו מ-American Type Culture Collection ותורבתו באופן שגרתי במדיום DMEM המכיל 10 אחוזים סרום בקר עוברי בתוספת 100 יחידות/מ"ל פניצילין G ו-100 ug/ml סטרפטומיצין. באינקובטור לח ב-37 מעלות עם 5 אחוז פחמן דו חמצני. תאי אנדותל ורידי טבור אנושיים (HUVECs) בודדו מוורידי חבל הטבור האנושיים (שסופקו על ידי מעבדות המחקר של ScienCell, סן דייגו, ארה"ב) ונשמרו במדיום תאי אנדותל כמתואר קודם [15].

ריאגנטיםאקטאוזיד מ-cistanche (A01) נרכש מ-Jiangsu Yongjian Medicine Technology Co., Ltd. (Taizhou, סין; פריט מס' 100581; טוהר גדול מ-99 אחוזים או שווה ל-99% על ידי HPLC). Sorafenib הושג מ-Selleck Chemicals (יוסטון, ארה"ב). המסנו אקטאוזיד ב-0.9 אחוז מלוחים. תמיסת המניות של sorafenib הוכנה ב-dimethyl sulfoxide (DMSO; 10 mM), מנותקת, ואוחסנה ב-20 מעלות.

חיות

עכברי BALB/c (Nu/Nu) זכרים (18-20 גרם, 6-8 שבועות בזמן הקבלה) שימשו במחקר (Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd., שנחאי, סין). בעלי חיים שוכנו בכלובי פוליסולפון מאווררים בנפרד בחדר מבוקר טמפרטורה ואור (12 שעות אור - 12 שעות מחזור כהה, האורות דולקים ב-7:00 בבוקר) עם גישה חופשית למזון ומים . כל פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים ובוצעו בהתאם להנחיות האגודה הבינלאומית לחקר כאב בנוגע לשימוש בחיות מעבדה.

בדיקת שגשוג תאים הפעילות האנטי-שגשוגית בוצעה באמצעות בדיקת MTT. בקצרה, תאים צופו בצפיפות של 4-5 × 103 תאים לבאר בצלחות 96-באר. לאחר שהוצמדו למשך הלילה, טופלו תאים בסדרה של ריכוזים של אקטאוזיד. לאחר הטיפולים התרופתיים בנקודת הזמן המצוינת, התאים הודגרו עם 3-(4,5- Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT ; Roche Diagnostic Corporation, Indianapolis, IN, ארה"ב. ריכוז סופי: 5 ug/ml) למשך 3-4 שעות ב-37 מעלות. מוצר הפורמזן הומס ב-DMSO לכימות באורך גל של 570 ננומטר.

Colony formation assay Cells were seeded in 24-well plates at a density of 200 cells per well and allowed to attach to the bottom of the well overnight. Cells were then treated with indicated drugs at the given concentration. The culture medium was replaced every 3 days until colonies were visible on day 12 post-culturing. For colonies counting, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with 0.1% crystal violet. Colonies>10 תאים נספרו תחת מיקרוסקופ אור (× הגדלה של 100; אולימפוס, טוקיו, יפן).

בדיקת ריפוי פצעים התאים נזרעו בצלחות של {{0}} צלחות באר (1 × 105 תאים לבאר) ותופחו ל-90 אחוזי ריכוז. שכבת התאים נשרטה עם קצה פיפטה סטרילי של 200 ul כדי לייצר פער פצע. נדידת תאים לאזור הפצוע הוצגה בנקודות הזמן המצוינות (0, 10 ו-24 שעות) תחת מיקרוסקופ אור הפוך בהגדלה של × 100. כל ניסוי בוצע בשלושה עותקים.

מבחן היווצרות צינורות ה-HUVEC תורבו כמתואר קודם [15]. בקצרה, צלחות הבאר 96- צפו ב- Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, ארה"ב) לפי הוראות היצרן ולאחר מכן הוחזרו לחממה לפולימר למשך 30-40 דקות. לאחר מכן ה-HUVECs נזרעו בצפיפות של 2 × 105 תאים/מ"ל וטופלו בתרופות נתונות שונות במשך 8 שעות. היווצרות הצינור צולמה במיקרוסקופ הפוך בנקודות הזמן המצוינות ונותחה באמצעות תוכנת ImageJ.

ניתוח סופג מערבי

סה"כ ליזטים של תאים הוכנו עם חיץ מבחן רדיואימוניות (RIPA) (50 mM Tris HCl ב-pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 אחוז NP40, 1 אחוז נתרן דיאוקסיכולאט, 0.1 אחוז SDS, 10 ug/ml leupeptin, 10 ug/ml aprotinin ו-2 mM PMSF). דגימות חלבון עם כמויות שוות (20 ug/מסלול) הופרדו על ג'ל SDS-PAGE והועברו לממברנות PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA). הממברנות הודגרו למשך הלילה עם נוגדן p53 (Cell Signaling Technology, בוסטון, MA). עבור בקרות טעינה, הממברנות נשטפו עם חיץ הפשטה ונבדקו מחדש עם נוגדן -אקטין (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). חלבונים זוהו באמצעות מערכת זיהוי ECL (Perkin Elmer Life Sciences, בוסטון, ארה"ב).

qRT-PCR

RNA כולל הוצא מקווי תאים באמצעות ריאגנט Trizol (Invitrogen, ארה"ב) ועבר תגובת שרשרת של תעתיק-פולימראז הפוכה (RT-PCR) לסנתז cDNA באמצעות ערכה זמינה מסחרית. qRT-PCR בזמן אמת באמצעות 2xSYBR ירוק qPCR Supermix נערך במכונת Stratagene Mx3000P PRC (Agilent Technologies, ארה"ב). רצפי ה-primer הוצגו להלן: sense 5'-CACCATGTGG TTCCTGGTTC-3' ו-anti-sense 5'- CAAACAAGTT GTGGCGACCC-3' עבור KLK1; sense 5'-GTGTACAGTC ATGGATGGGC-3' ו-anti-sense 5'-CCCAGAATCA CCCCCACAAG-3' עבור KLK2; sense 5′- CCACACCC GCTCTACGATATGA-3′ ו-anti-sense 5'-CCC AGA ATCACCCGAGCAG-3′ עבור KLK3; sense 5'-CGCACA CTGTTTCCAGAACTC-3' ו-anti-sense 5'- GTTG CAGGAGTCCTTCTGGT-3' עבור KLK4; sense 5'-CCTG CACCCACATCTTTCTCT-3' ו-anti-sense 5'- GGTAAGCATCCTCGCACCTT-3' עבור KLK5; sense 5′- CTCTCTCCTGGGGACACAGA-3′ ואנטי-חוש 5'- TCCGCCATGCACCAACTTAT-3′ עבור KLK6; sense 5′- TTTTGGAGCCCAGCTGTGTG-3′ ואנטי-חוש 5'- GTCACCATTGCAGGCGTTTT-3' עבור KLK7; sense 5′- CTGGGCAGGACACTCCAG-3′ ואנטי-חוש 5′- ACACCGCCACAGAGTAGTTG-3′ עבור KLK8; sense 5′- GTAGGGGGTTCTCGTAGGGT-3′ ואנטי-חוש 5'- CGGTGACGTCATAGAGACGG-3′ עבור KLK9; sense 5'-CAGGAGTGCCAGCCTCAC-3' ו-anti-sense 5'- CTGGGGAGGAAGAGGATGGA-3' עבור KLK10; sense 5'-CCCACCCCTTGGATTCTGTCT-3' ו-anti-sense 5'-GTGAACTATGTAGCGGGGCT-3' עבור KLK11; sense 5'-TGTTCTTGGTGAGTTCTCCCG-3' ו-anti-sense 5'-GGATCCAGTCCACATACTTGC-3' עבור KLK12; sense 5'-CCTGAACCACGACCATGACA-3' ו-anti-sense 5'-GCAGGGTTTGGATGTAGCCT-3' עבור KLK13; sense 5'-CCCAACTACAACTCCCGGAC-3' ו-anti-sense 5'-CCTGAAGCAACTGCTCGTGA-3' עבור KLK14; sense 5'-AGTTGCTGGAAGGTGACGAG- 3′ ו-anti-sense 5'-TGGCTAACATCTGGGCCTTG- 3' עבור KLK15; sense 5'-GACAGTCAGCCGCATCTT CT-3′ ואנטי-חוש 5'- GCGCCCAATACGACCAAA TC-3' עבור GAPDH. ערכי סף המחזור (Ct) של כל גן KLK נורמלו לזה של GAPDH ונותחו עם תוכנת MxPro.

פעילות אנטי-גידולית in vivo של A01 לבד או בשילוב עם סוראפניב. תרחפי BEL7404 תאים הוכנו (3 × 106 תאים) והוזרקו תת עורית לאגף הימני של עכברים עירומים אתיים. עשרה ימים לאחר החיסון, עכברים נושאי גידול (משקל גוף (ג):22-26; ממוצע ± SEM:23.8 ± 0.14) נבדקו ונבחרו לאקראי ל-7 קבוצות טיפול בעקבות נפח הגידול ({ {12}} מ"מ). סך של 38 עכברים הוקצו לקבוצות טיפול שונות (n=5 לקבוצה מלבד קבוצת המודל (n=8)). לאחר מכן טופלו בעלי חיים באמצעות מתן דרך הפה עם אקטאוזיד (A01; 12.5, 25 ו-50 מ"ג/ק"ג), סוראפניב בלבד (50 מ"ג/ק"ג) או בשילוב עם A01 (50 מ"ג/ק"ג) פעם ביום למשך 14 ימים. יתרה מכך, מינון של 20 מ"ג/ק"ג A01 ניתנה גם לווריד. המינונים נבחרו על סמך מחקרים קודמים ונתונים ראשוניים שלנו [15]. צמיחת הגידול נוטרה כל 3 או 4 ימים באמצעות קליפר אלקטרוני, כאשר הנפח מחושב כ-0.5xlengthxwidth (mm3). בנוסף, נכלל ניסוי מקביל באמצעות חיסון JHH-7. שבעה ימים לאחר החיסון, עכברים נושאי גידול (משקל גוף (ג):20-26; ממוצע ± SEM:24.0 ± 0.20) נבדקו ונבחרו לחלוקה אקראית לקבוצות טיפול בהתאם לנפח הגידול (80-130 mm3 ). סך של 23 עכברים הוקצו ל-4 קבוצות טיפול (n=5 לכל קבוצה למעט קבוצת המודל (n=8)). לאחר מכן, בעלי חיים קיבלו A01 (20 מ"ג/ק"ג, iv), סורפניב לבד (50 מ"ג/ק"ג, ig) או בשילוב עם A01 (20 מ"ג/ק"ג, iv) פעם ביום במשך 14 ימים רצופים. כל העכברים הורדמו עם כלורלי הידרט (350 מ"ג/ק"ג) והוקרבו על ידי פריקת צוואר בסוף תקופת התצפית. ומסת הגידול הוסרה והצטלמה במצלמה דיגיטלית.

ניתוח סטטיסטי

כל הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן (SD). אלא אם צוין אחרת, ניתוחים סטטיסטיים בוצעו תוך שימוש בניתוח שונות (ANOVA) ואחריו מבחן Tukey פוסט-הוק. ערכי נפח הגידול מוצגים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). ANOVA דו-כיווני ואחריו בדיקות Tukey שימשו לניתוח נתוני נפח הגידול. תוכנת GraphPad Prism שימשה לניתוחים סטטיסטיים. ערך של p < 0.05="" נחשב="" מובהק="">

תוצאות

השפעות של A01 על התפשטות ויצירת מושבות של HCCs במבחנה

שלוש שורות התאים של HCC (BEL7404, HLF ו-JHH7) שימשו למבחן התפשטות התאים. כפי שמוצג באיור 1, בדיקת MTT גילתה ש-A01 עיכב את התפשטות כל שלושת תאי ה-HCC. כדי לשאול עוד האם הפעילות האנטי-פרוליפרטיבית של A01 נבעה מהיכולת שלו לעכב clonogenicity של תאים, בוצע בדיקת יצירת המושבה. A01 ב-100 מיקרומטר הראה עיכוב חזק של היווצרות מושבה בתאי BEL7404 (איור 2a ו-b). בשילוב עם סורפניב (2 מיקרומטר), עוצמת העיכוב הייתה חזקה יותר מזו של A01 או סורפניב בלבד. תוצאות דומות נראו גם בשני תאי HCC האחרים, HLF ו-JHH-7 (איור 2c ו-d).

השפעות של A01 לבד או בשילוב עם sorafenib על נדידת תאים של HCCs in vitro

לאחר מכן הערכנו את נדידת התאים על ידי שימוש במבחן פצע השריטה. כפי שמוצג באיור 3, השילוב של A01 (100 או 500 מיקרומטר) וסוראפניב (10 מיקרומטר) מנע באופן משמעותי ריפוי פצעים בכל שלושת תאי HCC, בהשוואה לקבוצת הביקורת. עבור תאי BEL7404, הן A01 (100 או 500 מיקרומטר) והן סוראפניב (10 מיקרומטר) יצרו רק נטייה של מניעה של ריפוי פצעים ללא מובהקות סטטיסטית (איור 3א ו-ד). עבור תאי HLF, A01 ב-500 מיקרומטר וסוראפניב ב-10 מיקרומטר עיכבו ריפוי פצעים. בפרט, A01 (500 מיקרומטר) בשילוב עם סורפניב (10 מיקרומטר) יצר עיכוב חזק יותר של ריפוי פצעים מאשר סורפניב בלבד (איור 3b ו-e). עבור תאי JHH, ריפוי פצעים נמנע על ידי A01 (500 מיקרומטר) וסורפניב (10 מיקרומטר). השילוב של A01 (100 מיקרומטר) וסורפניב (10 מיקרומטר) יצר עיכוב חזק יותר של ריפוי פצעים מאשר A01 (100 מיקרומטר) או סורפניב (10 מיקרומטר) בלבד. יתרה מכך, A01 ב-500 מיקרומטר בשילוב עם סורפניב (10 מיקרומטר) הראה עיכוב חזק יותר של ריפוי פצעים מאשר A01 (500 מיקרומטר) או סורפניב (10 מיקרומטר) בלבד (איור 3c ו-f).

השפעות של A01 לבד או בשילוב עם sorafenib על אנגיוגנזה במבחנה

אנגיוגנזה קשורה קשר הדוק לגידול, התקדמות וגרורות של הגידול [16], ולכן נחשבת כאחת ממטרות ההתערבות לטיפול בסרטן. תחילה ביצענו בדיקת יצירת צינורות כדי לנתח את האנגיוגנזה הפוטנציאלית במבחנה. כפי שמוצג באיור 4, טיפול למשך 3 שעות עם סורפניב בלבד (10 מיקרומטר) או השילוב של A01 (100 ו-500 מיקרומטר) וסורפניב (10 מיקרומטר) החל להראות השפעות מעכבות על היווצרות מבנים דמויי כלי דם, כלומר ההתארכות והיישור של ה-HUVECs (איור 4a ו-c). לאחר טיפול במשך 8 שעות, A01 (100 ו-500 מיקרומטר), סורפניב (10 מיקרומטר) וכן השילוב של A01 וסורפניב, כולם עיכבו באופן משמעותי את היווצרותם של מבנים דמויי כלי דם, עם עיכוב חזק יותר על ידי השילוב של A01 וסורפניב מאשר A01 או sorafenib לבד (איור 4a ו-c). בנוסף, נדידת התאים של HUVECs היא צעד מפתח ליצירת כלי דם חדשים במהלך אנגיוגנזה ובכך נחקרת. כפי שמוצג באיור 4b ו-d, A01 (500 מיקרומטר), סוראפניב (10 מיקרומטר) וכן השילוב של A01 (100 ו-500 מיקרומטר) וסורפניב (10 מיקרומטר) כולם עיכבו באופן משמעותי נדידת תאים של HUVECs. A01 (500 מיקרומטר) בשילוב עם סורפניב (10 מיקרומטר) יצר עיכוב חזק יותר מאשר A01 (500 מיקרומטר) או סורפניב (10 מיקרומטר) בלבד.

השפעות של A01 לבד או בשילוב עם סורפניב על צמיחת גידולים in vivo של BEL7404 ו-JHH-7 HCC xenografts

כדי להעריך עוד יותר את היעילות של A01 לבד או בשילוב עם סורפניב על צמיחת הגידול in vivo של HCC, הקמנו מודל עכבר עירום קסנוגרט תת עורי באמצעות BEL7404 או JHH-7 תאים. כפי שמוצג באיור 5, נפח הגידול ירד מאוד בעקבות טיפול ב-A01 (25 ו-50 מ"ג/ק"ג, דרך מתן דרך הפה; 20 מ"ג/ק"ג, דרך וריד הזנב; כל p < 0.01="" לעומת="" קבוצת="" המודל)="" או="" סורפניב="" (50="" מ"ג/ק"ג,="" דרך="" מתן="" דרך="" הפה;="" p="">< 0.01="" לעומת="" קבוצת="" המודל)="" לבד="" (איור="" 5a="" ו-b).="" השילוב="" של="" a01="" (50="" מ"ג/ק"ג)="" וסורפניב="" (50="" מ"ג/ק"ג)="" הראה="" עיכוב="" חזק="" יותר="" של="" צמיחת="" הגידול="" בהשוואה="" לסורפניב="" בלבד="" (p="">< 0.01),="" אך="" הפיק="" אפקט="" דומה="" לזה="" של="" a01="" בלבד="" (איור="" 5a="" ו-c="" ).="" לאחר="" מכן="" השתמשנו="" במודל="" העכברים="" העירומים="" של="" jhh-7="" xenograft="" כדי="" להמשיך="" ולבחון="" את="" היעילות="" האנטי-גידולית="" האפשרית="" של="" a01.="" כפי="" שמוצג="" באיור="" 6,="" טיפול="" ב-a01="" (20="" מ"ג/ק"ג,="" iv)="" או="" בסוראפניב="" (50="" מ"ג/ק"ג,="" ig)="" יצר="" עיכוב="" משמעותי="" של="" צמיחת="" הגידול="" של="" jhh-7="" xenograft="" (p="">< 0.01="" לעומת="" קבוצת="" המודל="" ),="" עם="" עיכוב="" גדול="" יותר,="" בשילוב="" יחד="" (איור="" 6a="" ו-b;="" p=""><0.01 לעומת="" a01="" או="" קבוצת="" סוראפניב="">

אפנון אפשרי של פפטידאז הקשור לקליקריין ו-p53 על ידיאקטאוזיד מ-cistanche

ה-Kallikrein-related peptidase (KLK) הוצע כסמן ביולוגי לסרטן באבחון ובפרוגנוזה של סוגי סרטן שונים, כולל קרצינומה כבדית עקב ביטוי לא מווסת שלו [17-19]. בתרחיש זה, זיהינו ביטוי גנים של KLK1-15 בקו התא HCC JHH-7. כפי שמוצג באיור 7, טיפול באקטאוזיד יצר עיכוב משמעותי של רמות ה-KLK1, 2, 4, 9 ו-10 mRNA (איור 7a-e), ללא שינויים משמעותיים בשאר ה-KLK1-15 (לא הוצגו נתונים ). בנוסף, זיהינו גם את רמת החלבון p53 מדכא הגידול וחשפנו עלייה בטיפול באקטאוזיד (איור 7f).

דִיוּן

הטיפול ב-HCC מתקדם כבר מזמן בלתי ניתן לפתרון עקב חוסר היכולת לאבחן בשלבים מוקדמים יותר והעמידות הכימית של הגידול [5, 6]. Sorafenib, מעכב המולטיקינאז שדווח כמעכב שגשוג תאים ואנגיוגנזה, יחד עם מעכב מולטי-קינאז פומי נוסף, lenvatinib הפך לטיפול הסטנדרטי של HCC מתקדם [3, 5, 20, 21]. עם זאת, שיעורי ההישרדות הכוללים צנועים לאור שיעורי התגובה הנמוכים וחוסר ההתאמה במסגרות הקליניות [3, 22]. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי atezolizumab יחד עם bevacizumab הניבו תוצאות קליניות טובות יותר מאשר sorafenib בחולים עם HCC בלתי ניתן לניתוח, מה שהופך את השילוב הזה לאפשרות טיפול קו ראשון חדש עבור HCC מתקדם [7]. בהקשר זה, זיהינו שהפנילתנואיד גליקוזיד,אקטאוזיד מ-cistancheעיכבו את התפשטות התאים, היווצרות המושבות והנדידה בשלוש שורות התאים האנושיות HCC BEL7404, HLF ו-JHH-7 וכן אסרו אנגיוגנזה של HUVECs. השילוב של אקטאוזיד וסורפניב יצר עיכוב חזק יותר של יצירת מושבת תאים והגירה של תאי HCC וכן של אנגיוגנזה של HUVECs. Acteoside הציג את היעילות האנטי-גידולית במודל העכברים העירומים של BEL7404 או JHH-7 xenograft, עם שיפור בשילוב עם sorafenib בעיכוב הצמיחה של JHH-7 xenograft. ניתוחים נוספים גילו עלייה ב-p53 וכן ירידה של כמה גנים של KLK. בהתאם, יש לשקול שימוש אפשרי באקטאוזיד כתוספת בטיפול ב-HCC מתקדם במרפאה.

עדויות מתגברות הראו את ההשפעות האנטי-גידוליות שלאקטאוזיד מ-cistancheבתאי גידול שונים כגון תאי מלנומה B16, תאי גליובלסטומה, תאי סרטן המעי הגס, תאי קרצינומה של תאי קשקש בפה, תאי סרטן הערמונית ותאי אדנוקרצינומה של השד [11-13, 23-25] או בבעלי חיים הנושאים גידולים [12]. למרות זאת, מעט מחקרים התמקדו בהשפעות של אקטאוזיד על HCC in vitro או in vivo למעט מחקר אחד שמשתמש ב-diethylnitrosamine כמסרטן כדי לגרום להפטו-קרצינוגנזה בחולדות וחשף את מניעת הכימיקלים על-ידי אקטאוזיד [26]. במחקר הנוכחי, הראינו את העיכוב על ידי אקטאוזיד של שגשוג תאים, יצירת מושבות והגירה בשורות תאים HCC וכן צמיחת גידול בעכברים הנושאים קסנושתלים של קו תאים HCC, ובכך הדגימו ישירות את ההשפעות האנטי-גידוליות של אקטאוזיד ב-HCC. יתרה מזאת, השילוב של אקטאוזיד וסורפניב יצר השפעות אנטי-גידול חזקות עוד יותר. בשילוב עם העדויות שאקטאוזיד מגן מפני פציעות כבד [27–29] ללא השפעות רעילות בבעלי חיים וללא מוטגניות [30], נראה כי ניתן ליישום עתידי של הטיפול המשולב של אקטאוזיד וסורפניב בחולים עם מתקדם HCC במרפאה.

משפחת הקליקריינים האנושית כוללת 15 פרוטאזות סרין דמויות טריפסין או כימוטריפסין (KLK1-15) הומולוגיות, חד-שרשרתיות, והיא הייתה מעורבת בוויסות צמיחת הגידול, התקדמות ניאופלסטית, אנגיוגנזה וגרורות [18, 31]. בפרט, ה-KLKs הוצעו כסמן ביולוגי לסרטן באבחון ובפרוגנוזה של סוגי סרטן שונים, כולל קרצינומה כבדית עקב ביטוי לא מווסת [17-19]. לדוגמה, KLK1 מוצע כסמן הביולוגי של סרטן הקיבה עקב עליית רמות KLK1 בניאופלזמה בקיבה ומניעת צמיחת גידול בסרטן קיבה על ידי עיכוב פעילות KLK1 עם חלבון מקשר Kallikrein (KBP) [32]. בתרחיש זה, ראינו עיכוב משמעותי של רמות ה-KLK mRNA על ידי אקטאוזיד (KLK1, 2, 4, 9 ו-10). דיווח של יישום של KBP, שנקשר ספציפית לקליקריין רקמות ומעכב את פעילות הקליקריין, דווח כדי לדכא את הצמיחה של HCC בעכברים, אולי באמצעות הפעילות האנטי-אנגיוגנית שלו [33], מה שמרמז על מעורבות אפשרית של KLK בהתקדמות של HCC. בנוסף, חלבון מדכא הגידול p53 מסוגל לגרום להזדקנות, אפופטוזיס וכן לעצור מחזור התא. ביטוי מוגבר של p53 מעניק רגישות מוגברת לכימותרפיה בתאים סרטניים [34]. בהקשר זה, התוצאות המערביות שלנו הראו עלייה ברמות p53 בעקבות טיפול באקטאוזיד. בסיכומו של דבר, סביר להסיק כי אקטאוזיד מפעיל את ההשפעות האנטי-גידוליות על HCC, אולי דרך הוויסות העליונה שלו של p53 וכן עיכוב של KLK ואנגיוגנזה.

יש לציין כי היעד המולקולרי הישיר אליואקטאוזיד מ-cistancheיכול לקשור ישירות עדיין לא ברור. הנתונים הראשוניים שלנו באמצעות עגינה מולקולרית חשפו קישור ישיר של אקטאוזיד עם קליקריין (נתונים לא מוצגים). יהיה צורך בניסויים נוספים כדי להבהיר הנחה זו. בנוסף, באשר למינוני האקטאוזיד המשמשים לבדיקת תאים במחקר הגבוהים פי 10–50 מזו של סורפניב (10 מיקרומטר), ראשית בחרנו את המינונים האלה של אקטאוזיד בהתאם ל- קשר מינון-תגובה במבחן MTT. שנית, המינונים שבהם השתמשנו (100, 500 מיקרומטר) היו דומים למחקרים קודמים [35], שבהם אקטאוזיד (100 מיקרומטר) עיכב את התפשטות התאים של תאי סרטן המעי הגס. לבסוף, למרות המינון הגבוה יותר בבדיקת התא, אקטאוזיד יצר עיכוב בולט של צמיחת הגידול במודל העכברים העירומים של HCC xenograft במחקר שלנו (25 ו-50 מ"ג/ק"ג), ההשפעות דומות לסוראפניב (50 מ"ג/ק"ג). עבור sorafenib, הוא שימש במחקר שלנו במינון של 10 מיקרומטר ברמה התאית. מינון זה דומה למחקרים קודמים שבהם נמצא כי סורפניב מעכב את כדאיות התא עם IC50 של 4.0-6.5 מיקרומטר בשורות התאים HCC של תאי PLC/PRF/5 ו-HepG2. לעומת זאת, המינון של סורפניב ששימש לדיכוי הצמיחה של שתל קסנו-HCC בעכברי נקבות SCID היה 30 מ"ג/ק"ג (פו לפי נתח) [36]. במרפאה המינון המומלץ של סורפניב למטופל הוא 400 מ"ג לפעם (2*0.2 גרם), פעמיים ביום (800 מ"ג ליום בסך הכל). מינון זה של סורפניב בשימוש במרפאה הוא בניגוד למינון המשמש בבדיקת תאים (ערך IC50 ברמת מיקרומטר), אולי בשל יכולת הספיגה הירודה שלו בתנאי in vivo. עבור אקטאוזיד, בהתבסס על המינון שלו בעכברים (50 מ"ג/ק"ג, ig), המינון המקביל לבני אדם (60 ק"ג BW) הוא כ-250 מ"ג. מינון זה דומה לזה של סורפניב בשימוש במרפאה וצריך להיות מקובל על המטופלים.

מסקנות לסיכום,אקטאוזיד מ-cistancheמסוגל להפעיל אפקט אנטי-גידולי בשורות תאים HCC ובעכברים עירומים הנושאים קסנושתלים של קו תאים HCC, השפעות אולי באמצעות הגדלת רמות p53 וכן איסור על KLK ואנגיוגנזה. Acteoside יכול להיות שימושי כתוספת בטיפול ב-HCC מתקדם במרפאה.

הפניות

1 Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. סטטיסטיקת סרטן עולמית 2018: הערכות GLOBOCAN של שכיחות ותמותה ברחבי העולם עבור 36 סוגי סרטן ב-185 מדינות. CA Cancer J Clin. 2018;68(6):394–424..

2. Llovet JM, Zucman-Rossi J, Pikarsky E, Sangro B, Schwartz M, Sherman M, Gores G. Hepatocellular carcinoma. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16018.

3. Sim HW, Knox J. Hepatocellular carcinoma בעידן של אימונותרפיה. קור פרובל סרטן. 2018;42(1):40–8. 4. Jiang Y, Han QJ, Zhang J. Carcinoma Hepatocellular: מנגנוני התקדמות ואימונותרפיה. World J Gastroenterol. 2019;25(25):3151– 67.

5. Forner A, Da Fonseca LG, Diaz-Gonzalez A, Sanduzzi-Zamparelli M, Reig M, Bruix J. מחלוקות בניהול קרצינומה הפטוצלולרית. נציג JHEP 2019;1(1):17–29.

6. Hartke J, Johnson M, Ghabril M. האבחון והטיפול בקרצינומה הפטוצלולרית. סמינריון פאתול. 2017;34(2):153–9.

7. Finn RS, Qin S, Ikeda M, Galle PR, Ducreux M, Kim TY, Kudo M, Breder V, Merle P, Kaseb AO, et al. Atezolizumab בתוספת Bevacizumab בקרצינומה כבדית בלתי ניתנת לניתוח. N Engl J Med. 2020;382(20):1894–905.

8. He ZD, Ueda S, Akaji M, Fujita T, Inoue K, Yang CR. גלוקוזידים מונוטרפנואידים ופנילאתנואידים מ- Ligustrum peduncular. פיטוכימיה. 1994;36(3):709–16.

9. Li H, Chou GX, Wang ZT, Hu ZB. קביעת HPLC שלאקטאוזידב- Radix Rehmanniae. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2006;31(10):822–4.

10. Wong IY, He ZD, Huang Y, Chen ZY. פעילות נוגדת חמצון של גליקוזידים פנילתנואידים מ- Ligustrum purpurascens. J Agric Food Chem. 2001;49(6):3113–9.

11. Mulani SK, Guh JH, Mong KK. אסטרטגיה סינתטית כללית ותכונות אנטי-התפשטות על קווי תאי סרטן הערמונית עבור גליקוזידים טבעיים של פנילאתנואידים. Org Biomol Chem. 2014;12(18):2926–37.

12. Cheimonidi C, Samara P, Polychronopoulos P, Tsakiri EN, Nikou T, Myrianthopoulos V, Sakellaropoulos T, Zoumpourlis V, Mikros E, Papassideri I, et al. ציטוטוקסיות סלקטיבית של החומר הצמחי אקטאוזיד כנגד תאי גידול והתובנות המכניסטיות שלו. חיזור ביול. 2018;16:169–78.

13. עטיה י"מ, אל-כרש ד"מ, וואדי ה"א, אלמזר מ"מ. Verbascoside: זיהוי, כימות ורגישות פוטנציאלית של תאי סרטן המעי הגס ל-5-FU על ידי מיקוד למסלול PI3K/AKT. Sci Rep. 2018;8(1):16939.

14. Liu S, Zhao Z, Huo Z, Xu Z, Zhong Y, Wang X, Yang Y, Wang Z. Osmanthus fragrans תמצית פרחים מימית והאקטאוזיד המועשר שלו מעכבים מלנוגנזה ופיגמנטציה הנגרמת על-ידי אולטרה סגול. Nat Prod Commun. 2018;13(5):575–80.

15. Wang J, Ma S, Chen X, Zhang S, Wang Z, Mei Q. מעכב PI3K החדשני S1 מתחזק עם סוראפניב בתאי סרטן ריאות לא קטנים הכוללים את האיתות Akt-S6. חקור סמים חדשים. 2019;37(5):828–36.

16. חנן ד, וינברג ר"ע. סימני ההיכר של הסרטן: הדור הבא. תָא. 2011;144(5):646–74. 17. Emami N, Diamandis EP. תועלת של פפטידאזות הקשורות לקליקריין (KLKs) כסמנים ביולוגיים לסרטן. Clin Chem. 2008;54(10):1600–7.

18. Tailor PD, Kodeboyina SK, Bai S, Patel N, Sharma S, Ratnani A, Copland JA, She JX, Sharma A. פוטנציאל ביולוגי אבחנתי ופרוגנוסטי של גנים ממשפחת Kallikrein בסוגי סרטן שונים. Oncotarget. 2018;9(25): 17876–88.

19. Kontos CK, Mavridis K, Talieri M, Scorilas A. Kallikrein-related peptidases (KLKs) בסרטן מערכת העיכול: היבטים מכניסטיים וקליניים. Thromb Haemost. 2013;110(3):450–7.

20. Cheng AL, Kang YK, Chen Z, Tsao CJ, Qin S, Kim JS, Luo R, Feng J, Ye S, Yang TS, et al. יעילות ובטיחות של sorafenib בחולים באזור אסיה-פסיפיק עם קרצינומה כבדית מתקדמת: ניסוי אקראי שלב III, כפול סמיות, מבוקר פלצבו. לנצט אונקול. 2009;10(1):25–34. 21. Llovet JM, Ricci S, Mazzaferro V, Hilgard P, Gane E, Blanc JF, de Oliveira AC, Santoro A, Raoul JL, Forner A, et al. Sorafenib בקרצינומה כבדית מתקדמת. N Engl J Med. 2008;359(4):378–90.

22. שיר MJ. כימותרפיה עירוי לעורק הכבד עבור קרצינומה כבדית מתקדמת. World J Gastroenterol. 2015;21(13):3843–9.

23. ליאו י"פ, ראו י"ק, צנג י"מ. תמצית מימית של Anisomeles India והתרכובת המטוהרת שלה מפעילה פעילות אנטי-גרורותית באמצעות עיכוב של NF kappaB/AP-1-תלויי MMP-9 בתאי MCF-7 של סרטן השד האנושי. Food Chem Toxicol. 2012;50(8):2930–6.

24. Zhang Y, Yuan Y, Wu H, Xie Z, Wu Y, Song X, Wang J, Shu W, Xu J, Liu B, et al. השפעת verbascoside על אפופטוזיס וגרורות בקרצינומה של תאי קשקש בבני אדם. Int J Cancer. 2018;143(4):980–91.

25. Hwang TW, Kim DH, Kim DB, Jang TW, Kim GH, Moon M, Yoon KA, Choi DE, Park JH, Kim JJ. אפקט אנטי סרטני סינרגטי של כימותרפיה על בסיס גליובלסטומה אקטאוזיד וטמוזולומיד. Int J Mol Med. 2019; 43(3):1478–86.

26. Peerzada KJ, Faridi AH, Sharma L, Bhardwaj SC, Satti NK, Shashi B, Tasduq SA. אקטאוזיד מתווך כימי-מניעת סרטן כבד ניסיוני באמצעות STAT-3 מווסת עקה חמצונית ואפופטוזיס. Environ Toxicol. 2016;31(7):782–98.

27. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. מטבוליטים של אקטאוזיד תזונתי: פרופילים, בידוד, זיהוי ויכולות הגנה על הכבד. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.

28. Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Namba T, Kadota S. Acteoside מעכב אפופטוזיס ב-D-galactosamine ופגיעה בכבד הנגרמת על ידי ליפופוליסכריד. Life Sci. 1999;65(4):421–30.

29. Zhao J, Liu T, Ma L, Yan M, Zhao Y, Gu Z, Huang Y. אפקט מגן של אקטאוזיד על פגיעה אימונולוגית בכבד הנגרמת על ידי Bacillus Calmette Guerin בתוספת ליפופוליסכריד. פלנטה מד. 2009;75(14):1463–9.

30. Lu B, Li M, Zhou F, Huang W, Jiang Y, Mao S, Zhao Y, Lou T. תמצית עשירה ב-phenylethanoid glycoside של פרח Osmanthus: מחקרי רעילות חריפים ותת-כרוניים. J Etnopharmacol. 2016;187:205–12.

31. דיאמנדיס EP, יוסף GM. Kallikreins של רקמה אנושית: משפחה של סמנים ביולוגיים חדשים לסרטן. Clin Chem. 2002;48(8):1198–205.

32. Sawant S, Snyman C, Bhoola K. השוואה של ביטוי רקמה של קליקריין וקולטן קינין בכיב קיבה ובניאופלזמות. Int Immunopharmacol. 2001;1(12):2063–80.

33. Lu L, Yang Z, Zhu B, Fang S, Yang X, Cai W, Li C, Ma JX, Gao G. Kallikreinbinding protein מדכא את הצמיחה של קרצינומה הפטוצלולרית על ידי פעילות אנטי-אנגיוגנית. סרטן Lett. 2007;257(1):97–106.

34. Guntur VP, Waldrep JC, Guo JJ, Selting K, Dhand R. הגדלת חלבון p53 גורם לרגישות לסרטן ריאות של תאים לא קטנים לפקליטקסל ולציספלטין במבחנה. Anticancer Res. 2010;30(9):3557–64.

35. Zhou L, Feng Y, Jin Y, Liu X, Sui H, Chai N, Chen X, Liu N, Ji Q, Wang Y, Li Q. Verbascoside מקדם אפופטוזיס על ידי ויסות איתות HIPK2-p53 באדם סרטן מעי גס. סרטן BMC. 2014;14:747.

36. Liu L, Cao Y, Chen C, Zhang X, McNabola A, Wilkie D, Wilhelm S, Lynch M, Carter C. Sorafenib חוסמת את מסלול RAF/MEK/ERK, מעכבת אנגיוגנזה של הגידול ומעוררת אפופטוזיס של תאי גידול בהפאטו-תאי. קרצינומה דגם PLC/PRF/5. Cancer Res. 2006;66:11851–8.