חלבון 4B שאינו מבני של וירוס זיקה מקיים אינטראקציה עם DHCR7 כדי להקל על זיהום ויראלי

תַקצִיר

וירוס זיקה (ZIKV) מפתח חלבונים לא מבניים כדי להתחמק מתגובה חיסונית ולהבטיח שכפול יעיל בתאי המארחים. לאחרונה דווח כי האנזים המטבולי של כולסטרול 7-דהידרוכולסטרול רדוקטאז (DHCR7) משפיע על תגובות חיסון מולדות בזיהום ZIKV. עם זאת, החלבון החיוני הלא מבני והמנגנונים המעורבים בהתחמקות נגיפית בתיווך DHCR7- אינם מובהרים היטב. במחקר זה, הדגמנו כי זיהום ZIKV הקל על ביטוי DHCR7. יש לציין, שה-DHCR7 המווסת בתורו הקל על זיהום ZIKV, וחסימת DHCR7 דיכא זיהום ZIKV. מבחינה מכנית, חלבון ZIKV לא מבני 4B (NS4B) קיים אינטראקציה עם DHCR7 כדי לגרום לביטוי DHCR7. יתרה מכך, DHCR7 עיכב זרחון של TANK-binder kinase 1 (TBK1) ושל אינטרפרון גורם רגולטורי 3 (IRF3), מה שהביא להפחתה של ייצור אינטרפרון-בטא (IFN-) וגנים מעוררי אינטרפרון (ISGs). לכן, אנו מציעים ש-ZIKV NS4B נקשר ל-DHCR7 כדי לדכא את הפעלת TBK1 ו-IRF3, אשר בתורה מעכבת IFN-ו-ISGs, ובכך להקל על התחמקות ZIKV. מחקר זה מרחיב את התובנות לגבי האופן שבו חלבונים נגיפיים שאינם מבניים נוגדים חסינות מולדת כדי להקל על זיהום ויראלי באמצעות אנזימים מטבוליים של כולסטרול וחומרי ביניים.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

1. הקדמה

כנגיף פלווי הנישא יתושים, נגיף Zika (ZIKV) זוהה בתחילה מ-rhesus macaque באוגנדה בשנת 1947. מגיפת ה-ZIKV עברה מספר התפרצויות ברחבי העולם, הפכה לאיום בריאותי עולמי מצטבר עקב ההתפשטות הנפיצה דרך נתיבי יתושים, מסעות ברחבי העולם של טרנספורטרים אסימפטומטיים, והעברה מינית. רוב זיהומי ה-ZIKV במגיפות העבר היו אסימפטומטיות או קלות (Wang et al., 2016), עם זאת, במספר המגיפות האחרונות, זיהום ZIKV הוביל למחלות הרסניות, כולל תופעות נוירולוגיות במהלך ההריון (מיקרוצפליה ופטירת עובר) והפרעה נוירולוגית (תסמונת Guillain-Barre) במבוגרים (Cao-Lormeau et al., 2016; Pierson and Diamond, 2020; Rasmussen et al., 2016). מערכת החיסון המולדת היא הקו הראשון והקריטי של ההגנה החיסונית של המארח מפני זיהום ויראלי. לאחר זיהום ב-ZIKV, RNA ויראלי זוהה על ידי גן I (RIG-I) הניתן להשראת חומצה תוך-תאית (Chazal et al., 2018; Hertzog et al., 2018; Kato et al., 2006), אשר יזם את החיסון המולד במורד הזרם. תגובות, כולל הפעלת TANK binding kinase 1 (TBK1), זרחון אינטרפרון גורם 3 (IRF3) ולאחר מכן מוביל לייצור אינטרפרונים מסוג I (IFN-I) (Fitzgerald et al., 2003; Grant et al., 2016; Xia et al., 2018) וביטוי של עשרות גנים מעוררי אינטרפרון (ISGs) עם השפעות אנטי-ויראליות שונות (Savidis et al., 2016; Schneider et al., 2014). מערכת החיסון המארחת מייצרת IFNs ו-ISGs כדי להגביל זיהום ויראלי, אולם, ZIKV עצמו פיתח מגוון מנגנוני בריחה כדי להבטיח הישרדות ושכפול מוצלחים בתא המארח, כגון קידוד חלבונים ספציפיים שאינם מבניים (NS). RNA גנומי ZIKV מייצר שבעה חלבונים לא מבניים, כולל NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B ו-NS5 (Berhoux, 2020). ZIKV NS1 מגייס מארח deubiquitinase USP8 לייצוב caspase-1 ומחליש איתות IFN מסוג I לטובת זיהום ZIKV (Zheng et al., 2018). דווח כי מוטנט NS1 נקשר ל-TBK1 ומפחית את הזרחון של TBK1, מה שמוביל לייצור IFN- מופחת (Xia et al., 2018). ZIKV NS3 נקשר ורודף חלבוני פיגום אנושיים (14-3-3ε ו-14-3-3η) (Riedl et al., 2019), בעוד NS4A יוצר אינטראקציה עם MAVS כדי להחליש RIG-I- ו-MDA{{50} }תגובות חיסוניות מולדות מתווך (Ma et al., 2018). יש לציין, ZIKV NS5 קושר ומדרדר את מתמר האותות והמפעיל של תעתיק 2 (STAT2) כדי להחליש איתות IFN מסוג I (Grant et al., 2016; Kumar et al., 2016). יתרה מכך, הוכח כי NS5 יוצר אינטראקציה עם RIG-I ומדכא את ה-K63-polyubiquitination המקושר של RIG-I, ובכך מדכא ייצור IFN- (Li et al., 2020). בנוסף, הוכחו כי ZIKV NS2A, NS2B, NS4A ו-NS4B גוברים על ייצור IFN על ידי מיקוד לאלמנטים נפרדים במסלול RIG-I (Xia et al., 2018). כדי להשיג שכפול יעיל בתאי יונקים, ה-ZIKV מסתמך גם על הרכיבים המטבוליים של השומנים התאיים המארח כדי ליצור מעטפת ומכלול חלקיקים נגיפיים שלם (Chen et al., 2020; Leier et al., 2020). כולסטרול הוא אחד ממרכיבי השומנים של ממברנות התא ומשתתף בתפקודים ביולוגיים מרובים (איקונן, 2008). הומאוסטזיס של כולסטרול תאי מווסת באופן הדוק על ידי סינתזת כולסטרול, כולל הספיגה מחלקיקי ליפופרוטאינים ושחרור למקבלים חוץ-תאיים. כמעט כל תאי היונקים תלויים במטבוליזם של כולסטרול (Luo et al., 2020). עדויות מצטברות הצביעו על כך שמטבוליזם של כולסטרול משתתף בתגובה חיסונית מולדת נגד זיהום ויראלי (Blanc et al., 2013; Petersen et al., 2014; York et al., 2015). לאחר זיהום ויראלי, סינתזת הכולסטרול השתנתה באופן ניכר ומלווה בביטוי משופר של IFN-I ו-ISGs במקרופאגים (Li et al., 2017; Liu et al., 2008; York et al., 2015). כאנזים המפתח בחילוף החומרים של כולסטרול, כולסטרול-25-הידרוקסילאז (CH25H) הופך כולסטרול ל25-הידרוקסיכולסטרול (25HC), שזוהה כמוצר הביולוגי שתורם לתגובה חיסונית מולדת נגד רוב גדול של וירוסים, כולל וירוס כשל חיסוני אנושי 1 (HIV-1), וירוס סטומטיטיס שלפוחית ​​(VSV), וירוס הרפס סימפלקס 1 (HSV-1), וירוס אבולה (EBOV), ZIKV, וירוס גמא הרפס של עכברים ( MHV68), וירוס קדחת עמק השבר (RVFV), וירוס האביב-קיץ הרוסי אנצפליטיס (RSSEV) (Blanc et al., 2013; Li et al., 2017; Liu et al., 2013). המחקרים הנוכחיים מוגבלים בחקירת האופן שבו מוצרים מטבוליים של כולסטרול (למשל 25HC) יכולים לתמרן את העברת האותות ולהשתתף בחסינות מולדת. עד כה, האנזימים או תוצרי הביניים במעלה הזרם של ביו-סינתזה של כולסטרול עדיין אינם מובהרים היטב. בתור האנזים המטבולי החיוני של כולסטרול, 7-דהידרוגכולסטרול רדוקטאז (DHCR7) יכול למחוק את הקשר הכפול C (7-8) בטבעת B של סטרולים ולזרז את הכולסטרול מ-7-דהידדרוכולסטרול ({{100} }DHC) (Luu et al., 2015). 7-DHC הוא גם מבשר של ויטמין D, ומוטציות DHCR7 מקושרות לוויטמין D גבוה יותר, מה שמצביע על כך ש-DHCR7 מציג השפעות ביולוגיות מסובכות בהמרה של כולסטרול וויטמין D (Kuan et al., 2013; Prabhu et al. , 2016א). מחקר שהוצג היטב הראה ששתיקת DHCR7 יכולה להפעיל את מסלול PI3K-AKT3, להוביל לזרחון IRF3 Ser385 ולקדם ייצור IFN- כדי לעכב זיהום ויראלי מרובה במבחנה ובאינבו (Xiao et al., 2020). עם זאת, ההבנה של מטבוליזם של כולסטרול בתיווך DHCR7- בהתחמקות חיסונית בתיווך חלבון ZIKV NS מוגדרת בצורה גרועה. כאן, אנו מבהירים מנגנון מובהק ש-ZIKV NS4B מתמקד ב-DHCR7, אנזים מפתח בסינתזה של כולסטרול, כדי להחליש את תגובת ה-IFN-I ולהקל על זיהום ZIKV. מצאנו שזיהום ZIKV הגביר את ביטוי DHCR7. מעניין לציין כי DHCR7 משופר מקדם זיהום ב-ZIKV, בעוד שהדיפה או מיקוד של DHCR7 עם מעכבים יכולים לדכא זיהום ב-ZIKV. יתרה מכך, ZIKV NS4B יכול לקשור את DHCR7 ובכך לגרום לביטוי DHCR7, אשר עיכב את הפעלת TBK1 ו-IRF3 והוביל לייצור מופחת של IFN-ו-ISG. לכן, אנו מציעים שקישור ZIKV NS4B ל-DHCR7 מפחית את הפעלת IRF3, אשר בתורו מעכב IFN- ו-ISGs כדי להקל על התחמקות ZIKV. מחקר זה מרחיב תובנות חדשות לגבי האופן שבו חלבון ZIKV לא מבני מבטל חסינות מולדת כדי להקל על זיהום ויראלי באמצעות אינטראקציה עם אנזימים מטבוליים של כולסטרול.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Enhance Immunity

【בקש עוד】 דוא"ל:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. חומרים ושיטות

2.1. קוי טלפון

תאי U251 נרכשו ממרכז סין לאוסף תרבות סוג (CCTCC) (ווהאן, סין). תאי כליות Cercopithecus aethiops (Vero), תאי כליה עוברית אנושית (HEK 293T) ותאי אדנוקרצינומה של הריאות האנושית (A549) נרכשו מאוסף הרקמות האמריקאי (ATCC). התאים נשמרו ב-Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco) בתוספת של 10% סרום בקר עוברי (FBS) (Gibco), פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין סולפט (100 ug/mL) ב-37 C ו-5 % CO2. תאי Aedes albopictus (C6/36) תורבו ב-Minimal Essential Medium (MEM) בתוספת של 10% FBS, פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין סולפט (100 ug/mL) ב-28 C עם 5% CO2.

2.2. הגברה, טיטרציה וזיהום של ZIKV

ה-ZIKV isolate z16006 (מספר גישה ל-GenBank, KU955589.1) תורבת בתאי C6/36, ו-ZIKV הוכנס למנות בבקבוקונים מקפיאים ואוחסן ב-80 C. טיטרים של ZIKV נמדדו על ידי בדיקת פלאק. התאים הודבקו ב-ZIKV בריבוי הזיהום המצוין (MOI) למשך 2 שעות, ולאחר מכן שטיפה עם מי מלח פוספט חוצץ (PBS), ולאחר מכן התרבית, נקצרו ונבדקו.

2.3. פלסמידים וריאגנטים

פלסמיד ביטוי pcDNA3.1(þ)-3 שימש לשבט גנים בודדים של ZIKV ממקטעים תואמים של ZIKV cDNA. כדי לבנות pGEX6p-1-NS4B, ה-ZIKV NS4B שוכפל משנה לתוך וקטור pGEX6p-1 באמצעות ClonExpress II One Step Cloning Kit (Vazyme Biotech, נאנג'ינג, סין). ה-cDNA המקודדים ל-DHCR7, RIG-I, TBK1 ו-IRF3 אנושיים ששובטו לתוך וקטור pCAGGS-HA או pcDNA3.1 (þ)-3 וקטור דגל נבנה בשיטת שיבוט מולקולרית סטנדרטית. מוטציית ה-missense G410S של DHCR7 נבנתה בשיטת מוטגנזה מכוונת אתר. מעטפת אנטי-ZIKV של ארנב חד-שבטי (GTX133314) נרכשה מ- GeneTex (אירווין, קליפורניה, ארה"ב). ארנב פוליקלונלי אנטי-DHCR7 (A8049), ארנב חד שבטי אנטי-ISG15 (A2416), ארנב חד שבטי אנטי-TBK1 (A3458), ארנב חד שבטי אנטי-P-TBK1 ב-Ser172 (AP1026), ארנב פוליקלונלי אנטי-1118 אנטי-11F18A -ארנב IgG (ac005), ו-IgG נגד עכבר (ac011) נרכשו מ-ABclonal Technology (Wuhan, סין). נוגדנים משניים נגד עכבר FITC ונוגדנים Cy3 נגד ארנב נרכשו מ-Abbkine (Wuhan, סין). ארנב חד שבטי אנטי-P-IRF3 ב-Ser396 (29047S) ואנטי-ISG56 חד שבטי ארנב (14769S) נרכשו מ- Cell Signaling Technology (CST, Boston, MA, ארה"ב). אנטי-דגל חד שבטי עכברים (F3165), אנטי-HA חד שבטי ארנבת (H6908) ואנטי-GAPDH חד שבטי עכברים (G9295) נרכשו מסיגמא (סנט לואיס, MO, ארה"ב). אנטיגן-נוגדנים מקבוצת אנטי-פלווי-וירוס חד שבטיים של עכברים (MAB10216) נרכש מ-Millipore (Mass, ארה"ב). Lipofectamine 2000 (11668-027) ו-Trizol (15596018) נרכשו מחברת Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, ארה"ב). Poly(I: C) נרכש מ-InvivoGen (סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב).

2.4. בדיקת פלאק

סופרנטנט המכיל ZIKV מדולל ב-DMEM נטול סרום ותאי Vero נגועים בצלחת של 12-באר למשך 2 שעות, ולאחר מכן שטיפה עם 1 מ"ל PBS פעמיים. DMEM המכיל 2% FBS ו-2% אגרוז בנקודת התכה נמוכה עורבבו היטב לפי יחס נפח של 1:1, ולכל באר נוספה תערובת של 1 מ"ל. התאים הנגועים תורבו ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 5-7 ימים. התאים נקבעו עם 4% פרפורמלדהיד למשך שעה אחת ונצבעו עם 0.5% סגול קריסטל למשך 30 דקות. 12-צלחת הבאר נשטפה במים והלוחות חושבו.

2.5. ייצור וזיהום לנטיוירוס

רצפי המיקוד של shRNAs עבור DHCR7 האנושי היו כדלקמן: sh-DHCR7-1: 50 -ATTGCCAGCACAGACGGATTT-30, sh-DHCR7-2: 50 -CGTGATTGACTTCTTCTGGAA{ {8}}. וקטור pLKO.1 הנושא shRNA מקושקש לבקרה שלילית (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב) או רצף היעד הספציפי הועבר לתאי HEK293T יחד עם psPAX2 ו-pMD2.G עם Lipofectamine 2{{19} }00. חלקיקים ויראליים המכילים supernatants נקצרו ב-36 שעות לאחר ההעברה ולאחר מכן עברו צנטריפוגה ב-210 גרם למשך 10 דקות. שלב הסופרנטנט נטול התאים סונן דרך מסנן 0.45 מיקרומטר כדי להסיר את פסולת התא. תאי U251 הודבקו בחלקיקי lentiviral בנוכחות 8 ug/mL polybrene. לאחר 48 שעות של תרבית, תאי U251 נבחרו עם puromycin (2 ug/mL, Sigma). יעילות הפגיעה של sh-DHCR7 נקבעה על ידי RT-PCR וניתוח Western blot.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

2.6. כתם מערבי

תאים חולקו ע"י חיץ RIPA בתוספת מעכבי פרוטאז ומעכבי פוספטאז על קרח למשך שעה אחת, ולאחר מכן עברו צנטריפוגה ב-4 C, 13, 000 גרם למשך {{10}} דקה אחת כדי לאסוף את התא lysate. ריכוז החלבון בליזט התא נמדד על ידי בדיקת חלבון ביצינצ'ונינית (BCA). החלבון הופרד על ידי SDS-PAGE ולאחר מכן הועבר על גבי ממברנת פוליוויניל דיפלואוריד (PVDF). קרום ה-PVDF נחסם עם חיץ חוסם אימונובלוטינג TBST (10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 mol/L NaCl, ו-0.05% Tween-20) המכיל 5% BSA למשך שעה. לאחר שטיפה עם TBST, הממברנה הודגרה עם נוגדנים ראשוניים ונוגדנים שניים ולאחר מכן זוהתה באמצעות מערכת הדמיה Chemiluminescence (Bio-Rad).

2.7. בדיקת כולסטרול כולל

הכולסטרול הכולל בתאים זוהה באמצעות ערכת בדיקת כולסטרול רקמות מבית Applygen Technologies Inc. (בייג'ינג, סין). התקן של 5 mmol/L כולסטרול היה נתון לדילול סדרתי עם אתנול נטול מים כדי לצייר את העקומה הסטנדרטית, וכמויות הכולסטרול הכולל הסלולרי חושבו על פי העקומות הסטנדרטיות. הניסוי נערך לפי הנוהל שסיפק היצרן.

2.8. מבחני אימוניות משולבים

תאי HEK293T הועברו עם הפלסמידים המצוינים. תאים נקצרו והוסרו עם חיץ תמוגה RIPA בתוספת מעכבי פרוטאז. לאחר צנטריפוגה ב-18, 000 גרם למשך 15 דקות ב-4 C, נאספו תאי תאים והופצו אימונו על ידי Flag-Trap ProteinG Sepharose (GE Healthcare, Milwaukee, WI, ארה"ב) למשך 4 שעות ב-4 C. החלבונים הקשורים נפלטו עם 2 חיץ טעינה ונותחו על ידי אימונובלוטינג.

2.9. PCR בזמן אמת

סך RNAs הופקו מתאי באמצעות ריאגנט TRIzol (Invitrogen Life Technologies), ו-cDNA הופק עם ערכת M-MLV transcriptase הפוכה (Promega, Madison, WI, ארה"ב). RT-PCR בוצע באמצעות ערכות SYBR RT-PCR (DBI Bio-science) ב- Roche LC480. ה-mRNA של גליצרלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) נקבע כהתייחסות האנדוגנית לנרמל את ה-mRNA ורמות ביטוי הגנים חושבו בשיטת 2 ΔΔCT. הרצפים של פריימרים RT-PCR מוצגים בטבלה משלימה S1. 2.10. מיקרוסקופיה

תאי U251 הועברו טרנסfected עם פלסמיד והורבו במשך 3 0 שעות, ולאחר מכן נשטפו שלוש פעמים עם PBS. תאים נקבעו עם 4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות וחלחלו עם PBS המכיל 0.1% TritonX-100 למשך 5 דקות. לאחר שטיפה עם PBS, התאים נאטמו עם PBS המכיל 5% BSA למשך 30 דקות. תאים נשטפו שלוש פעמים עם PBS והודגרו עם אנטי-HA, אנטי-FLAG ואנטי-flavivirus, ולאחר מכן הודגרו עם נוגדנים משניים נגד עכבר ו- Cy3 נגד ארנב. תאים נצבעו ב-40,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) ובוצעו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי אולימפוס.

2.11. מבחני GST pull-down

הפלסמיד pGEX6p-1-NS4B הועבר לזן Escherichia coli (E. coli) BL21. ה-GST וה-GST-NS4B הוזרו על ידי IPTG בריכוז סופי של 0.5 mmol/L, והתרבויות גודלו במשך 6-8 שעות נוספות ב-37 C. ולאחר מכן החלבון GST ו-GST- חלבון NS4B טוהר מחיידקי E. coli. החלבון GST או GST-NS4B הודגר עם חרוזי גלוטתיון Sepharose (Novagen) ונשטף שלוש פעמים עם PBS. חלבון GST וחלבון GST-NS4B הודגרו עם חלבון ההיתוך האיקריוטי HA-DHCR7, שמקורו בפלסמידים המקודדים ל-HA-DHCR7-ליזטים של תאי HEK293T למשך 4 שעות ב-4 C. המשקעים נשטפו חמש פעמים, רתחו ב חיץ טעינה של 2 SDS, וזוהה על ידי ווסטרן כתם עם נוגדנים אנטי-GST ואנטי-HA.

2.12. מוטגנזה מכוונת אתר HA-DHCR7

זוגות מתאימים של פריימרים מוטגניים (טבלה משלימה S1) סונתזו ושימשו ליצירת המבנה המוטגני על ידי PCR. HA-DHCR7 שימש כתבנית עבור PrimeSTAR® HS Premix (Takara). לאחר PCR, הפלסמיד מסוג הבר שנותר במוצר ה-PCR עוכל באופן סלקטיבי על ידי DpnI (New England Biolabs). תוצר ה-PCR המעוכל הועבר לזן E. coli DH5. המוטנט הרצוי אושר על ידי ניתוח רצף Sanger.

מערכת חיסון מגבירה צמח cistanche

2.13. ניתוח סטטיסטי

כל הניסויים חזרו על עצמם לפחות שלוש פעמים עם תוצאות דומות. הנתונים מבוטאים כסטיית תקן ממוצעת (SD). המשמעות של השונות נקבעה על ידי מבחן t-דו-זיוותי של הסטודנט עבור ANOVA דו-קבוצתי או חד-כיווני עם מבחן ההשוואות המרובות של דאנט או ANOVA דו-כיווני עם מבחן ההשוואות המרובות של Sidak עבור השוואות מרובות קבוצות באמצעות תוכנת GraphPad Prism (גרסה 8.0.1). ערך של P < 0.{{10}}5 נחשב למובהק סטטיסטית, ו-P > 0.05 זוהה כלא מובהק סטטיסטית. עבור כל הנתונים, המובהקות הוצגה כ-*P <0.05, **P <0.01 ו-***P <0.001.

3. תוצאות

3.1. זיהום ZIKV גורם לביטוי DHCR7

עדויות מצטברות הוכיחו שחילוף החומרים של כולסטרול משפיע על תגובות חיסוניות מולדות של המארח נגד זיהום ב-flavivirus, כגון נגיף ZIKV ו-Denge (DENV) (Leier et al., 2020; Randall, 2018). DHCR7 מקודד לאנזים שהופך את 7-DHC לכולסטרול, השלב האחרון בביוסינתזה של כולסטרול (Moebius et al., 1998). זיהינו לראשונה ביטוי DHCR7 לאחר זיהום ZIKV. אסטרוציט אנושי U251 היה נגוע ב-ZIKV, אשר הגדיל באופן תלוי מינון את ביטוי DHCR7 הן ב-mRNA והן בחלבון (איור 1A-C). כדי לאשר את התופעה, בשלב הבא בדקנו את ביטוי DHCR7 בתאי Vero ומצאנו שזיהום ZIKV גרם באופן משמעותי לביטוי DHCR7 (איור 1D-F), מה שעולה בקנה אחד עם התוצאות בתאי U251.

יתרונות cistanche-מחזק את המערכת החיסונית

3.2. מיקוד ל-DHCR7 מעורר פעילות אנטי-ZIKV קריטית

כדי להעריך את ההשפעות של DHCR7 נגד זיהום ZIKV, תאי U251 ו-A549 הועברו עם פלסמיד מקודד HA-DHCR7 ולאחר מכן הודבקו ב-ZIKV (MOI ¼ 1). התוצאות הראו כי ביטוי יתר של DHCR7 הגביר באופן משמעותי את ביטוי ה-ZIKV mRNA (איור 2A ו-B). יש לציין, עם הצטברות חלבון DHCR7, הביטוי של חלבון מבני ZIKV E גדל גם הוא (איור 2C ו-D). בנוסף, ערכנו עוד בדיקת פלאק תוך שימוש בסופרנטנט מתמונה 2C ומצאנו שביטוי יתר של DHCR7 עלה באופן משמעותי ביחידות יוצרות הפלאק, בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 2E ו-F). דווח כי מוטציית ה-missense G410S של DHCR7 מבטלת את פעילות האנזים (Fitzky et al., 1998; Shim et al., 2004; Witsch-Baumgartner et al., 2000). כדי לקבוע עוד יותר את ההשפעות של DHCR7 על זיהום ZIKV, בנינו בשלב הבא מוטנט לא פעיל של DHCR7 (G410S). בהשוואה לסוג הבר של DHCR7, המוטנט G410S יכול לעכב באופן משמעותי זיהום ZIKV (איור 2G). ביצענו גם בדיקת מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לאשר את התצפית. כפי שמוצג באיור 2H, ביטוי יתר של DHCR7 הגביר זיהום ZIKV. כדי לקבוע אם פעילות אנזימים אנדוגנית DHCR7 היא קריטית לזיהום ב-ZIKV, תכננו שני RNAs סיכת ראש קצרים (shDHCR7-1 ו-sh-DHCR7-2) המכוונים ספציפית ל-DHCR7 ויצרו תא U251 מושתק של DHCR7- קווים עם מערכת shRNA (איור 3A). לבסוף, בחרנו ב-sh-DHCR7-1 בגלל יעילות ההשתקה הגבוהה יותר שלו. בהשוואה ל-shRNA של קו תאים בקרה, תאי נוק-דאון אלו של DHCR7 הראו רגישות נמוכה יותר לזיהום ZIKV (איור 3B ו-C). לאחר מכן השתמשנו במעכב DHCR7 הסלקטיבי AY9944 שמונע את התקשרות של 7-DHC לכולסטרול (Xu et al., 2011), אשר הוכח כמעכב פעילות אנזימית של DHCR7 (Horlick, 1966; Moebius et al., 1998). בהשוואה לבקרה, מתן AY9944 עיכב באופן תלוי מינון זיהום ZIKV בתאי U251 (איור 3D-F). בדיקת פלאק בוצעה גם בתאי Vero כדי להעריך עוד יותר את ההשפעות של DHCR7, והראתה ש-AY9944 יכול לדכא באופן משמעותי זיהום ZIKV (איור 3G ו-H). יש לציין, מיקרוסקופיה קונפוקלית הראתה שחלבון ZIKV E הצטמצם באופן משמעותי בנוכחות AY9944 (איור 3I). ממצאים אלה הצביעו על כך שהכוונה ל-DHCR7 יכולה לעכב זיהום ZIKV.

איור 1. זיהום ZIKV משרה ביטוי DHCR7. תאי A–F U251 ו-Vero הודבקו ב-ZIKV (MOI ¼ 0, 1 ו-2) במשך 24 שעות, ורמות ה-RNA התוך-תאי של ZIKV (A, D) ו-DHCR7 (B, E) נקבעו על ידי RT-PCR עם GAPDH כבקרה פנימית. רמות החלבון היחסיות של מעטפות DHCR7 ו-ZIKV זוהו על ידי כתם מערבי (C, F). הנתונים הם משלושה ניסויים עצמאיים לפחות (ממוצע SD) או נתונים מייצגים (C, F). מובהקות סטטיסטית חושבה באמצעות ANOVA חד כיווני עם מבחן ההשוואות המרובות של דנט (A, B, D, E). **P < 0.01, ***P < 0.001. SD, סטיית תקן.

3.3. DHCR7 מעכב את הפעלת TBK1 ו-IRF3 כדי להפחית את ייצור IFN ו-ISGs

מכיוון ש-DHCR7 הוא האנזים החיוני להמרת 7-DHC לכולסטרול (Moebius et al., 1998) וזיהום ZIKV יכול להגביר את ביטוי DHCR7, כך מדדנו את רמת הכולסטרול לאחר זיהום ZIKV. גילינו שלזיהום ZIKV יש השפעה מועטה על סינתזת כולסטרול בתאי U251 ו-Vero (איור 4A ו-B), אם כי DHCR7 גדל (איור 1A-D). בהתחשב ב-DHCR7 המוגבר על זיהום ZIKV ותפקידי המפתח של IFNs בהתמודדות עם זיהום ZIKV, בשלב הבא קבענו את ההשפעה של DHCR7 על מסלול האיתות IFN-I. בקרה והשתקת DHCR7-תאי U251 הודבקו ב-ZIKV או הועברו ב-poly(I:C), וביטוי IFN- נחקר. בהשוואה לקבוצת הביקורת, זיהום ב-ZIKV או טיפול בפולי(I:C) הגבירו באופן ניכר את ביטוי ה-IFN בתאי DHCR7-השתקת U251 (איור 4C ו-D). ISGs הם המשפיעים של פעולות אינטרפרון וממלאים תפקידים מרכזיים בהגנה חיסונית מולדת מפני זיהום ZIKV. הדגמנו גם חסימת DHCR7 יכולה לחזק משמעותית את ביטוי ISG15 ו-ISG56 ברמות mRNA וחלבון כאחד (איור 4E-J). באופן עקבי, טיפול מעכב DHCR7 AY9944 יכול לגרום לביטוי IFN-, ISG15 ו-ISG56 (איור 4K, L). חשוב לציין, המוטנט הבלתי פעיל G410S יכול להפוך חלקית את ההשפעות המעכבות של DHCR7 על ביטוי IFN ו-ISG (איור 4M, N). הפעלת TBK1 ו-IRF3 חיונית להשראת IFNs-ISGs, ולכן, בשלב הבא בחנו את ההשפעה של DHCR7 על ביטוי והפעלה של TBK1 ו-IRF3. הדגמנו ש-DHCR7 לא רק עיכב באופן תלוי מינון את רמת החלבון, אלא גם דיכא את רמת הזרחון של TBK1 ו-IRF3 (איור 5A-C). יתר על כן, המוטנט הבלתי פעיל G410S הפך באופן חלקי את ההשפעות המעכבות של DHCR7 על זרחון IRF3 ו-TBK1 (איור 5D). בניגוד לממצאים של ביטוי יתר של DHCR7, טיפול ב-AY9944 יכול לגרום להפעלת IRF3 ו-TBK1 בתא U251 (איור 5E).

3.4. ZIKV NS4B יוצר אינטראקציה עם DHCR7 כדי לעכב זרחון TBK1 ו-IRF3

עדויות מצטברות גילו ש-ZIKV פיתח חלבוני NS ספציפיים כדי להקל על שכפול יעיל בתאי מארח על ידי התחמקות ישירה מחסינות מולדת ומסתגלת של המארח באמצעות שפע של מנגנונים נפרדים. ביצענו בדיקת IP משותפת כדי לסנן את החלבון הפרטני ZIKV NS שיכול לקיים אינטראקציה עם DHCR7. תאי HEK293T הועברו יחד עם pCMV-DHCR7-HA ופלסמיד המבטאים חלבון NS אינדיבידואלי שהתמזגו עם Flag-tag. כפי שמוצג באיור 6A, DHCR7 נקשר רק ל-NS4B אך אינו מצליח ליצור אינטראקציה עם חלבוני NS אחרים. מבחני IP-שיתוף הדדיים נערכו עוד יותר והראו שחלבון NS4B קיים אינטראקציה עם DHCR7 בתאי HEK293T (איור 6B ו-C). כדי לאשר את האינטראקציה של NS4B ו-DHCR7, לאחר מכן ביצענו מיקרוסקופ קונפוקאלי ומצאנו שחלבון NS4B וחלבון DHCR7 עברו קולקאליזציה בציטופלזמה (איור 6D). בדיקת GST pull-down הדגימה עוד יותר את האינטראקציה של NS4B ו-DHCR7 (איור 6E). יתר על כן, טרנספקציה חולפת של NS4B בתאי U251 יכולה לגרום באופן דרמטי לביטוי DHCR7 (איור 6F). חשוב לציין, NS4B יכול לחסום באופן תלוי מינון זרחון של TBK1 וגם של IRF3, שהיה מתאם חיובי עם ההפעלה המשופרת של TBK1 ו-IRF3 בתגובה ל-DHCR7 (איור 6G ו-H). עם זאת, ביטוי יתר של NS4B בתאי HEK293T הפחית באופן משמעותי את רמת החלבון של TBK1, אך השפיע מעט על חלבון IRF3 (איור 6G ו-H). כדי לאשר עוד תצפיות אלה, NS4B הועבר לתאי DHCR7 נוק-דאון U251 והראה השפעות מעכבות על רמות חלבון אנדוגני וזרחון של TBK1 ו-IRF3 (איור 6I). ביחד, תוצאות אלו הוכיחו ש-ZIKV NS4B קיים אינטראקציה עם DHCR7 והגביר את ביטוי DHCR7 כדי לחסום את הפעלת TBK1 ו-IRF3 ולאחר מכן להקל על זיהום ZIKV.

איור 2. ביטוי יתר של DHCR7 מקדם שכפול ZIKV. תאי A-D U251 ו-A549 הועברו ב-HA-vector או HA-DHCR7 בריכוזים המצוינים במשך 12 שעות ולאחר מכן הודבקו ב-ZIKV למשך 36 שעות נוספות. רמות ה-ZIKV RNA זוהו על ידי RT-PCR עם GAPDH כבקרה פנימית (A, B), ורמות החלבון של מעטפת ZIKV, HA-DHCR7 ו- GAPDH זוהו על ידי Western blot (C, D). תאי E, F Vero הודבקו בסופרנטנט המכיל ZIKV מאיור 2C למשך 48 שעות כדי לקבוע עותקי ZIKV על ידי מבחן פלאק. תאי G U251 הועברו ב-HA-vector, HA-DHCR7 או HA-DHCR7 (G410S) למשך 12 שעות והודבקו ב-ZIKV למשך 36 שעות, ורמות החלבון של מעטפת ZIKV, HA-DHCR7 ו GAPDH זוהו על ידי Western blot. תאי H U251 הועברו טרנסfected עם HA-vector או HA-DHCR7 (1 ug) במשך 12 שעות נגועים ב-ZIKV במשך 36 שעות, ולאחר מכן הודגרו עם נוגדנים אנטי-flavivirus עכברים וארנבים נגד HA, בעקבות צביעה באנטי-עכבר מצומד FITC Cy3-נוגדנים משניים נגד ארנב מצומדים. גרעינים נצבעו ב-DAPI. התמונות הוצגו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. סרגל קנה מידה ¼ 100 מיקרומטר. הנתונים הם משלושה ניסויים עצמאיים לפחות (ממוצע SD) או נתונים מייצגים (C, D, E, G, H). המובהקות הסטטיסטית חושבה באמצעות מבחן t-דו-זנב של Student (F) או ANOVA חד כיווני עם מבחן ההשוואות המרובות של דנט (A, B). *P < 0.05, ***P < 0.001. SD, סטיית תקן.

4. דיון

IFNs מסוג I ו-ISGs במורד הזרם שלהם מתמודדים עם סדרה גדולה של פתוגנים וממלאים תפקיד מכריע בהגנה החיסונית של המארח נגד ZIKV (Lazear et al., 2016). כדי להתחמק מהמעקב בתיווך IFN ולהשיג שכפול מספק, ZIKV מפתחת חלבוני NS המכוונים לנקודות שונות של מסלול האיתות של IFN כדי לברוח ממערכת החיסון המולדת התאית (Lee et al., 2021). מחקרי הרכבה הראו ש-ZIKV NS1, NS3, NS4A ו-NS5 מעכבים מודולים שונים של מסלול RIG-I/IFN-I ומאפשרים זיהום ויראלי תוך שימוש במנגנונים עצמאיים ומגוונים (Grant et al., 2016; Kumar et al., 2016 ; Ma et al., 2018; Riedl et al., 2019; Xia et al., 2018; Zheng et al., 2018). עם זאת, המנגנון הספציפי של ZIKV NS4B נגד הגבלה חיסונית מוגדר בצורה גרועה. ZIKV NS4B הוא חלבון הידרופובי במיוחד המורכב מ-251 חומצות אמינו וממוקם בממברנת הרשת האנדופלזמית עם N-טרמינל (Zou et al., 2014). עיכוב NS4B של מסלול האיתות IFN-I זוהה בנגיפי flavivirus שונים (Ding et al., 2013; Munoz-Jordan et al., 2003, 2005; Shan et al., 2021; Yi et al., 2016; Zhang et al. אל., 2021). מחקר שנערך לאחרונה דיווח כי זן ZIKV INMI1 מבודד בברזיל משתמש ב-NS4B כדי לסתור את מורד הזרם של מסלול האיתות IFN-I על ידי ריסוק זרחון STAT1 וכתוצאה מכך הפרעה לתחבורה גרעינית STAT1 (Fanunza et al., 2021). במחקר זה, מצאנו מנגנון מובהק שבו ZIKV NS4B ביטל את ייצור IFN- על ידי דיכוי זרחון TBK1 ו-IRF3, המרכיב במעלה הזרם של מסלול האיתות IFN-I. יש לציין כי החלפת חומצות אמינו (G18R) התגלתה ב-ZIKV NS4B, אשר תרמה לירידה בייצור IFN- ולהחלשת ביטוי ISG, וכתוצאה מכך הקלה על זיהום ויראלי בעכברים, מה שמעיד על המשמעות של NS4B כגורם הקובע לפתוגנזה (Gorman et al. ., 2018). עדויות מתפתחות הצביעו על החשיבות הקריטית של חילוף החומרים של כולסטרול המשתתף בתגובה חיסונית מולדת (Akula et al., 2016; Dang et al., 2017; Reboldi et al., 2014; York et al., 2015). למרות שתועדו כמה תוצרי ביניים במטבוליזם של כולסטרול כבעלי השפעות אנטי-ויראליות רחבות (Blanc et al., 2013; Li et al., 2017; Liu et al., 2013; Xiao et al., 2020), המחקר שלנו המחיש מנגנון חדשני כי האנזים המטבולי של כולסטרול DHCR7 היה מעורב בזיהום ב-ZIKV על ידי החלשת הפעלת TBK1 ו-IRF3 כדי להקל על זיהום ויראלי. כאנזים מפתח המעורב במטבוליזם של דסמסטרול וכולסטרול, DHCR7 מייצג מעבר של המרת 7-DHC לוויטמין D בתאי עור שנחשפו ל-UVB (Prabhu et al., 2016b). יתר על כן, DHCR7 ממוקם לא רק בשער של מסלול בלוך אלא גם בקצה מסלול Kandutsch-Russell (Prabhu et al., 2016a, 2016b), אשר ממלא תפקיד חיוני בשליטה בסינתזה של כולסטרול. ההצלבה של DHCR7 והאינטראקציה שלו עם אנזימים אחרים במספר מסלולים עשויים להעצים פונקציות מרובות בסוגי תאים או איברים שונים. מחקר קודם גילה שחסימת DHCR7 עלולה להפחית את הדסמסטרול, המבשר המיידי של ביוסינתזה של כולסטרול, ובכך להציע הגנה מספקת מפני זיהום HCV (Luu et al., 2015; Rodgers et al., 2012). חשוב לציין, Xiao et al. הראו שזיהום VSV מפחית את ביטוי DHCR7, מה שמוביל להפחתת כולסטרול, אך הרבה יותר 7-הצטברות DHC במקרופאגים ובכבד (Xiao et al., 2020). מקרופאגים שטופלו ב-7-DHC העניקו תגובה אנטי-ויראלית מוגברת; בעוד שתוספת הכולסטרול הראתה הגנה מינורית. מעכבי DHCR7 ומתן של 7-DHC עשויים להיות גישות שימושיות להילחם בזיהומים ויראליים כגון HIN1, HSV ו-VSV. במחקר זה, מצאנו כי מעכב DHCR7 AY9944 יכול לדכא זיהום ZIKV. עם זאת, המחקר שלנו גילה שזיהום ZIKV גרם לביטוי DHCR7, אך השפיע מעט על הביוסינתזה של כולסטרול בתאי גליה. לא בדקנו את רמת 7-ביטוי DHC לאחר זיהום ב-ZIKV, עם זאת, כדאי להמשיך ולחקור האם ל-7-DHC ו-AY9944 יש יעילות טיפולית סינרגית לטיפול בחולים שנדבקו ב-ZIKV זיהום במוח. ביטוי יתר של DHCR7 קידם זיהום ב-ZIKV, בעוד שהטיפול במעכבי סלקטיבי DHCR7 (AY9944) הגביר מאוד את ייצור IFN- נגד זיהום ב-ZIKV. הפעלת TBK1 ו-IRF3 היא חיונית להפעלת איתות IFN-I. מחקר קודם הראה שהשתקת DHCR7 או 7-טיפול DHC הפעילו את מסלול PI3K-AKT3 לזרחון IRF3, אך לא TBK1 במקרופאגים (Xiao et al., 2020). עם זאת, הממצאים שלנו הראו כי DHCR7 הפחית באופן תלוי מינון הן את ביטוי IRF3 והן TBK1, כמו גם את זרחון IRF3 ו-TBK1. חקירות אלו העלו כי DHCR7 עשוי לתרום לזיהום ZIKV במנגנון בלתי תלוי בחילוף החומרים של כולסטרול במוח. הובהר היטב כי ZIKV השתמש בחלבוני NS כדי ליצור אינטראקציה ישירה עם רכיבים שונים של מסלול RIG-I/IFN-I כדי להתחמק מתגובה חיסונית ולהקל על שכפול ויראלי. דיווחנו בעבר על האינטראקציה של ZIKV NS5 עם RIG-I כדי להחליש את ייצור IFN (Li et al., 2020). אחרים הוכיחו ש-ZIKV NS1 ו-NS2B כוונו ל-TBK1, NS3 כוונו ל-RIG-I ו-MDA5 כדי להפחית את ייצור IFN-I ו-ISGs (Lee et al., 2021; Riedl et al., 2019). עם זאת, התפקוד של חלבוני ZIKV NS המכוונים למטבוליזם של כולסטרול נותר חמקמק במידה רבה. במחקר זה, הדגמנו גם אינטראקציה לא מדווחת בין האנזים המטבולי של כולסטרול DHCR7 וחלבוני ZIKV NS. הראינו DHCR7 קשור ספציפית ל-NS4B, לא לחלבוני NS אחרים. סיפקנו את הראיות הקריטיות לכך ש-ZIKV NS4B קיים אינטראקציה עם DHCR7, וגרם לביטוי שלו באופן מהותי, דבר שעולה בקנה אחד עם התוצאות בתאי U251 לאחר זיהום ZIKV. חשוב לציין, מלבד הדגמה ישירה של המעורבות של DHCR7 ו-ZIKV NS4B, מצאנו גם ש-ZIKV NS4B הגביר את ביטוי DHCR7 כדי לעכב זרחון TBK1 ו-IRF3 ולהקל על זיהום ZIKV. בהסכמה לתוצאות שלנו, מחקר שנערך לאחרונה גילה שמחסור ב-DHCR7 יכול להפעיל איתות IRF3 ו-IFN כדי לעכב VSV ונגיפים אחרים במקרופאגים.

איור 3. נוק-דאון של DHCR7 מפחית זיהום ZIKV בתאי U251. תאי U251 הועברו עם החלקיקים ה-lentiviral המכילים shRNA נגד DHCR7 (shDHCR7-1 ו-sh-DHCR7-2) או רצף לא יעד (sh-NTC), ואחריו בחירת פורומיצין למשך 14 ימים. יעילות ההפקה נקבעה על ידי RT-PCR. B, C DHCR7-השתקה תאי U251 (sh-DHCR7) ו-sh-NTC U251 היו נגועים מדומה או נגועים ב-ZIKV (MOI ¼ 1) למשך 36 שעות. רמת ה-ZIKV RNA התוך תאית זוהתה על ידי RT-PCR עם GAPDH כבקרה פנימית (B) ורמות החלבון של מעטפת ZIKV, DHCR7 ו- GAPDH זוהו על ידי Western blot (C). תאי D, E U251 טופלו עם מעכב DHCR7 AY9944 בריכוז המצוין למשך שעתיים, ולאחר מכן זיהום ב-ZIKV (MOI ¼ 1) למשך 48 שעות. התאים עברו RT-PCR כדי לזהות ZIKV RNA (D). רמות החלבון של מעטפת ה-ZIKV, DHCR7 ו-GAPDH זוהו באמצעות Western blot (E). תאי F U251 טופלו עם מעכב DHCR7 AY9944 בריכוז המצוין במשך 36 שעות, ו-DHCR7 ו-GAPDH זוהו על ידי Western blot. תאי G, H Vero הודבקו בסופרנטנט המכיל ZIKV מאיור 3E למשך 48 שעות כדי לקבוע עותקי ZIKV על ידי מבחן פלאק. תאי I U251 טופלו ב-AY9944 בריכוז המצוין במשך שעתיים, ולאחר מכן זיהום ב-ZIKV ב-MOI ¼ 1 למשך 36 שעות. התמונות הוצגו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. סרגל קנה מידה ¼ 100 מיקרומטר. הנתונים הם משלושה ניסויים עצמאיים לפחות (ממוצע SD) או נתונים מייצגים (C, E, F, G ו-I). מובהקות סטטיסטית מחושבת באמצעות ANOVA חד כיווני עם מבחן ההשוואות המרובות של דנט (A, D, H) או ANOVA דו כיווני עם מבחן ההשוואות המרובות של Sidak (B). ***P < 0.001. SD, סטיית תקן.

איור 4. DHCR7 מעכב ייצור IFN ו-ISG. תאי A, B U251 ו-Vero הודבקו ב-ZIKV (MOI ¼ 0, 0.5, ו-1) במשך 24 שעות וכולסטרול תאי נמדד על ידי ערכת בדיקת כולסטרול כולל של רקמות. תאי C–H DHCR7-השתקה U251 (sh-DHCR7) ו-sh-NTC U251 הודבקו ב-ZIKV (MOI ¼ 1) או טופלו ב-Poly(I:C) (1 ug/mL) למשך 6 שעות. RNA תאי כולל הוצא והועבר ל-RT-PCR עבור ביטוי ה-mRNA עם GAPDH כבקרה פנימית. הביטויים היחסיים של IFN-ו-ISGs היו מנורמלים לזה של דגימות sh-NTC בקבוצת המדומה, ושינויי קיפול הראו מופרזים. IFN- (C, D), ISG15 (E, F) ו-ISG56 (G, H). תאי I, J DHCR7-השתקת U251 (sh-DHCR7) ו-sh-NTC U251 הודבקו ב-ZIKV (MOI ¼ 1) או הועברו ב-Poly(I:C) (1 ug/mL) למשך 24 שעות, ורמות החלבון של ISG15, ISG56 ו-GAPDH זוהו באמצעות Western blot. תאי K U251 טופלו במינון המצוין של AY9944 למשך 2 שעות, ולאחר מכן הודבקו ב-ZIKV (MOI ¼ 1) למשך 6 שעות. רמת ה-IFN-RNA זוהתה על ידי RT-PCR עם GAPDH כבקרה פנימית. תאי L U251 טופלו במינון המצוין של AY9944 למשך שעתיים ולאחר מכן הודבקו ב-ZIKV (MOI ¼ 1) למשך 24 שעות. רמות החלבון של ISG15, ISG56 ו-GAPDH זוהו באמצעות Western blot. תאי M U251 הועברו ב-HA-vector, HA-DHCR7, או HA-DHCR7 (G410S) למשך 24 שעות והודבקו ב-ZIKV (MOI ¼ 1) למשך 6 שעות. רמות ה-IFN-RNA זוהו על ידי RT-PCR עם GAPDH כבקרה פנימית. תאי N U251 הועברו ב-HA-vector, HA-DHCR7, או HA-DHCR7 (G410S) למשך 24 שעות, ולאחר מכן הודבקו ב-ZIKV (MOI ¼ 1) למשך 24 שעות. רמות החלבון של ISG15, ISG56 ו-GAPDH זוהו באמצעות Western blot. הנתונים הם משלושה ניסויים עצמאיים לפחות (ממוצע SD) או נתונים מייצגים (I, J, L, N). מובהקות סטטיסטית מחושבת באמצעות ANOVA חד כיווני עם מבחן ההשוואות המרובות של דנט (A, B, K, M) או ANOVA דו כיווני עם מבחן ההשוואות המרובות של Sidak (C–H). ns, P > 0.05, ***P < 0.001. SD, סטיית תקן.

איור 5. DHCR7 מעכב את הפעלת TBK1 ו-IRF3. תאי A, B HEK293T הועברו יחד עם פלסמיד מקודד TBK1- יחד עם פלסמיד המבטא DHCR7- או וקטור ריק (A). תאי HEK293T הועברו יחד עם פלסמיד המקודד IRF3-, פלסמיד מקודד RIG-I, יחד עם DHCR7- המבטא פלסמיד או וקטור ריק (B). תאים נקצרו 24 שעות לאחר ההעברה והועברו ל-Western blot עם נוגדנים מסומנים [אנטי-TBK1, אנטי-P-TBK1(S172), אנטי-IRF3, אנטי-PIRF3(S396), אנטי-HA ואנטי-GAPDH ]. תאי C U251 הועברו במינון המצוין של פלסמיד המבטא DHCR7 או וקטור ריק למשך 24 שעות. לאחר מכן התאים הודבקו ב-ZIKV (MOI ¼ 1) שנקטפו ב-6 שעות לאחר ההדבקה והועברו ל-Western blot עם נוגדנים מסומנים [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3( S396), אנטי-HA ואנטי-GAPDH]. תאי D U251 הועברו עם HA-vector, HA-DHCR7 או HA-DHCR7 (G410S) למשך 24 שעות. לאחר מכן התאים הודבקו ב-ZIKV (MOI ¼ 1) שנקטפו ב-6 שעות לאחר ההדבקה והועברו ל-Western blot עם נוגדנים מסומנים [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-PIRF3(S396) , אנטי-HA ואנטי-GAPDH]. תאי E U251 טופלו במינון המצוין של AY9944 למשך 2 שעות והודבקו ב-ZIKV (MOI ¼ 1) למשך 6 שעות, ולאחר מכן הועברו לכתם Western עם נוגדנים מסומנים [אנטי-TBK1, אנטי-P-TBK1(S172), אנטי. -IRF3, אנטי-P-IRF3(S396), ואנטי-GAPDH]. הנתונים הם משלושה ניסויים עצמאיים לפחות ומוצגים כנתונים מייצגים (A-E).

איור 6. ZIKV NS4B מקיים אינטראקציה עם DHCR7 כדי לעכב זרחון TBK1 ו-IRF3. תאי HEK293T הועברו יחד עם פלסמידים המקודדים ל-HA-DHCR7, ופלסמידים המקודדים לחלבונים לא מבניים של ZIKV (FLAG-NS1, FLAG-NS3, FLAG-NS4A, FLAG-NS4B ו-FLAG-NS5) או פלסמיד בקרה ריק עבור 3 0 ש. הליסאטים של התא טופלו עם נוגדנים נגד דגל ולאחר מכן נותחו על ידי אימונובלוטינג עם נוגדנים מסומנים. תאי B, C HEK293T הועברו יחד עם פלסמידים המקודדים HA-DHCR7, פלסמידים המקודדים FLAG-NS4B, או פלסמיד בקרה ריק למשך 30 שעות. הליסאטים של התא טופלו עם נוגדן אנטי-HA (B) או נוגדן אנטי-FLAG (C) ולאחר מכן נותחו על ידי אימונובלוטינג עם נוגדנים מסומנים. תאי D U251 הועברו עם פלסמיד FLAG-NS4B יחד עם פלסמידים המקודדים ל-HA-DHCR7. הלוקליזציה של FLAG-NS4B (ירוק), HA-DHCR7 (אדום), סמן הגרעין DAPI (כחול) והמיזוג נותחו במיקרוסקופיה קונפוקלית. סרגל קנה מידה ¼ 10 מיקרומטר. E lysates של תאים מתאי HEK293T שהועברו עם HA-DHCR7 הודגרו עם חלבון GST או חלבון GST-NS4B אשר הודגר עם חרוזי גלוטתיון-Sepharose. תערובות זוהו על ידי ווסטרן כתם עם נוגדנים אנטי-HA ואנטי-GST (למעלה). ליזטים מתאי HEK293T שעברו מעבר והחלבונים המטוהרים זוהו באמצעות Western blot עם נוגדנים אנטי-HA ואנטי-GST (למטה). תאי F U251 הועברו טרנסfected עם פלסמיד המקודד FLAG-NS4B (0, 1, 2 ug). רמות החלבון היחסיות של DHCR7, FLAG-NS4B ו-GAPDH זוהו באמצעות Western blot. תאי G, H HEK293T הועברו יחד עם פלסמיד המביע NS4B או וקטור ריק, יחד עם פלסמיד מקודד TBK1-(F), פלסמיד המביע IRF3- ופלסמידים המקודדים RIG-I (G) . תאים נקצרו 24 שעות לאחר ההעברה והועברו ל-Western blot עם נוגדנים מסומנים [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3(S396), anti-FLAG ו-antiGAPDH ]. I DHCR7-השתקת תאי U251 (sh-DHCR7) ו-sh-NTC U251 הועברו טרנסfected עם פלסמיד המביע NS4B או וקטור ריק. תאים נקצרו 6 שעות לאחר ההעברה ועברו כתם ווסטרן עם נוגדנים מסומנים [אנטי-TBK1, אנטי-P-TBK1(S172), אנטי-IRF3, אנטי-P-IRF3(S396), אנטי-FLAG ואנטי-GAPDH ]. הנתונים מייצגים שלושה ניסויים עצמאיים.

5. מסקנות

לסיכום, מחקר קודם גילה כי האנזים DHCR7 של חילוף החומרים של כולסטרול מעורב בתגובה חיסונית מולדת נגד זיהומים ויראליים שונים. המחקר שלנו הציג ש-ZIKV NS4B קיים אינטראקציה עם DHCR7 וגרם לביטוי DHCR7. ה-DHCR7 המוגבר מעכב מאוד את הפעלת TBK1 ו-IRF3 וגורם לייצור מופחת של IFN ו-ISG, מה שמקל על זיהום ZIKV בתאי גליה. ממצאים אלו חשפו מנגנון בריחה חיסוני ויראלי חדש ש-ZIKV מתגבר על תגובה חיסונית על ידי מיקוד ישיר ל-DHCR7 עם NS4B.

הפניות

Akula, MK, Shi, M., Jiang, Z., Foster, CE, Miao, D., Li, AS, Zhang, X., Gavin, RM, Forde, SD, Germain, G., Carpenter, S., Rosadini, CV, Gritsman, K., Chae, JJ, Hampton, R., Silverman, N., Gravallese, EM, Kagan, JC, Fitzgerald, KA, Kastner, DL, Golenbock, DT, Bergo, MO, Wang, D ., 2016. שליטה על התגובה החיסונית המולדת על ידי מסלול המבלונאט. נאט. אימונול. 17, 922–929.

Berthoud, L., 2020. ההגבלה של flaviviruses. וירול. חטא. 35, 363–377.

Blanc, M., Hsieh, WY, Robertson, KA, Krop, KA, Forster, T., Shui, G., Lacaze, P., Watterson, S., Griffiths, SJ, Spann, NJ, Meljon, A., Talbot, S., Krishnan, K., Covey, DF, Wenk, MR, Craigon, M., Ruzsics, Z., Haas, J., Angulo, A., Griffiths, WJ, Glass, CK, Wang, Y. , Ghazal, P., 2013. גורם השעתוק STAT-1 מצמד סינתזה מקרופאגים של 25-hydroxycholesterol לתגובה האנטי-ויראלית של אינטרפרון. חסינות 38, 106–118.

Cao-Lormeau, V.-M., Blake, A., Mons, S., Lastere, S., Roche, C., Vanhomwegen, J., Dub, T., Baudouin, L., Teissier, A., Larre, P., Vial, A.-L., Decam, C., Choumet, V., Halstead, SK, Willison, HJ, Musset, L., Manuguerra, J.-C., Despres, P., Fournier , E., Mallet, H.-P., Musso, D., Fontanet, A., Neil, J., Ghawche, F., 2016. התפרצות תסמונת Guillain-Barre הקשורה לזיהום בנגיף זיקה בפולינזיה הצרפתית: מקרה -מחקר בקרה. Lancet 387, 1531–1539.

Chazal, M., Beauclair, G., Gracias, S., Najburg, V., Simon-Loriere, E., Tangy, F., Komarova, AV, Jouvenet, N., 2018. RIG-I מזהה את ה-5' אזור של גנומים של דנגי וזיקה. נציג תא 24, 320–328.

Chen, Q., Gouilly, J., Ferrat, YJ, Espino, A., Glaziou, Q., Cartron, G., El Costa, H., AlDaccak, R., Jabrane-Ferrat, N., 2020. Metabolic תכנות מחדש על ידי נגיף הזיקה מעורר דלקת בשליה האנושית. נאט. Commun. 11, 2967. Dang, EV, McDonald, JG, Russell, DW, Cyster, JG, 2017. ריסון אוקסיסטרול של סינתזת כולסטרול מונע הפעלת AIM2 inflammasome. תא 171, 1057–1071 e1011.

Ding, Q., Cao, X., Lu, J., Huang, B., Liu, YJ, Kato, N., Shu, HB, Zhong, J., 2013. וירוס הפטיטיס C NS4B חוסם את האינטראקציה של STING ו TBK1 כדי להתחמק מחסינות מולדת של המארח. J. Hepatol. 59, 52–58.

Fanunza, E., Grandi, N., Quartu, M., Carletti, F., Ermellino, L., Milia, J., Corona, A., Capobianchi, MR, Ippolito, G., Tramontano, E., 2021 נגיף INMI1 Zika NS4B נוגד את איתות האינטרפרון על ידי דיכוי זרחון STAT1. וירוסים 13, 2448.

Fitzgerald, KA, McWhirter, SM, Faia, KL, Rowe, DC, Latz, E., Golenbock, DT, Coyle, AJ, Liao, SM, Maniatis, T., 2003. IKKε ו-TBK1 הם מרכיבים חיוניים של איתות IRF3 נָתִיב. נאט. אימונול. 4, 491–496.

Fitzky, BU, Witsch-Baumgartner, M., Erdel, M., Lee, JN, Paik, Y.-K., Glossmann, H., Utermann, G., Moebius, FF, 1998. Mutations in the Δ{{ 3}}גן סטרול רדוקטאז בחולים עם תסמונת Smith-Lemli-Opitz. פרוק. נאטל. Acad. Sci. ארה"ב 95, 8181–8186.

Gorman, MJ, Caine, EA, Zaitsev, K., Begley, MC, Weger-Lucarelli, J., Uccellini, MB, Tripathi, S., Morrison, J., Yount, BL, Dinnon 3rd, KH, Ruckert, C. ., יאנג, MC, Zhu, Z., Robertson, SJ, McNally, KL, Ye, J., Cao, B., Mysorekar, IU, Ebel, GD, Baric, RS, Best, SM, Artyomov, MN, Garcia -Sastre, A., Diamond, MS, 2018. מודל עכבר בעל יכולת חיסונית של זיהום בנגיף זיקה. Cell Host Microbe 23, 672–685.e6.

Grant, A., Ponia, SS, Tripathi, S., Balasubramaniam, V., Miorin, L., Sourisseau, M., Schwarz, MC, Sanchez-Seco, MP, Evans, MJ, Best, SM, Garcia-Sastre , A., 2016. וירוס Zika מכוון ל-STAT2 האנושי כדי לעכב איתות אינטרפרון מסוג I. Cell Host Microbe 19, 882–890.

Hertzog, J., Dias Junior, AG, Rigby, RE, Donald, CL, Mayer, A., Sezgin, E., Song, C., Jin, B., Hublitz, P., Eggling, C., Kohl, A., Rehwinkel, J., 2018. זיהום עם בידוד ברזילאי של וירוס Zika מייצר RNA מגרה RIG-I והחלבון NS5 הנגיפי חוסם אינדוקציה ואיתות IFN מסוג I. יורו J. Immunol. 48, 1120–1136.

Horlick, L., 1966. השפעת מעכב חדש של ביוסינתזה של כולסטרול (AY 9944) על סטרולים בסרום ורקמות בחולדה. J. Lipid Res. 7, 116–121.

Ikonen, E., 2008. סחר בכולסטרול סלולרי ומידור. נאט. כומר מול. Cell Biol. 9, 125–138.

Kato, H., Takeuchi, O., Sato, S., Yoneyama, M., Yamamoto, M., Matsui, K., Uematsu, S., Jung, A., Kawai, T., Ishii, KJ, Yamaguchi , O., Otsu, K., Tsujimura, T., Koh, CS, Reis e Sousa, C., Matsuura, Y., Fujita, T., Akira, S., 2006. תפקידים דיפרנציאליים של MDA5 ו- RIG-I הליקאזות בזיהוי נגיפי RNA. טבע 441, 101–105.

Kuan, V., Martineau, AR, Griffiths, CJ, Hypp€onen, E., Walton, R., 2013. מוטציות DHCR7 הקשורות למצב גבוה יותר של ויטמין D אפשרו הגירה מוקדמת של בני אדם לקווי הרוחב הצפוניים. BMC Evol. ביול. 13, 144.

Kumar, A., Hou, S., Airo, AM, Limonta, D., Mancinelli, V., Branton, W., Power, C., Hobman, TC, 2016. וירוס Zika מעכב ייצור אינטרפרון מסוג I ומורד הזרם איתות. EMBO Rep. 17, 1766–1775.

Lazear, HM, Govero, J., Smith, AM, Platt, DJ, Fernandez, E., Miner, JJ, Diamond, MS, 2016. מודל עכבר של פתוגנזה של וירוס Zika. Cell Host Microbe 19, 720–730. Lee, LJ, Komarasamy, TV, Adnan, NAA, James, W., Rmt Balasubramaniam, V., 2021. מחבואים: משחק הגומלין בין וירוס Zika לבין התגובה החיסונית המארח. חֲזִית. אימונול. 12, 750365.

Leier, HC, Weinstein, JB, Kyle, JE, Lee, JY, Bramer, LM, Stratton, KG, Kempthorne, D., Navratil, AR, Tafesse, EG, Hornemann, T., Messer, WB, Dennis, EA, Metz, TO, Barklis, E., Tafesse, FG, 2020. מפת שומנים גלובלית מגדירה רשת חיונית לשכפול וירוס Zika. נאט. Commun. 11, 3652.

Li, A., Wang, W., Wang, Y., Chen, K., Xiao, F., Hu, D., Hui, L., Liu, W., Feng, Y., Li, G., Tan, Q., Liu, Y., Wu, K., Wu, J., 2020. אתר שמרני NS5 נדרש לנגיף Zika כדי להגביל את איתות RIG-I. חֲזִית. אימונול. 11, 51.

Li, C., Deng, YQ, Wang, S., Ma, F., Aliyari, R., Huang, XY, Zhang, NN, Watanabe, M., Dong, HL, Liu, P., Li, XF, Ye, Q., Tian, ​​M., Hong, S., Fan, J., Zhao, H., Li, L., Vishlaghi, N., Buth, JE, Au, C., Liu, Y., Lu , N., Du, P., Qin, FX, Zhang, B., Gong, D., Dai, X., Sun, R., Novitch, BG, Xu, Z., Qin, CF, Cheng, G. , 2017. 25- Hydroxycholesterol מגן על המארח מפני זיהום בנגיף זיקה והמיקרוצפליה הקשורה אליו במודל של עכבר. חסינות 46, 446–456.

Liu, CI, Liu, GY, Song, Y., Yin, F., Hensler, ME, Jeng, WY, Nizet, V., Wang, AH, Oldfield, E., 2008. מעכב ביוסינתזה של כולסטרול חוסם את מחלת ה-Staphylococcus aureus . מדע 319, 1391–1394.

Liu, SY, Aliari, R., Chikere, K., Li, G., Marsden, MD, Smith, JK, Pernet, O., Guo, H., Nusbaum, R., Zack, JA, Freiberg, AN, Su, L., Lee, B., Cheng, G., 2013. כולסטרול המושרה על ידי אינטרפרון-25- הידרוקסילאז מעכב באופן נרחב כניסה ויראלית על ידי ייצור של 25- 25-הידרוקסיכולסטרול. חסינות 38, 92–105.

Luo, J., Yang, H., Song, BL, 2020. מנגנונים וויסות של הומאוסטזיס של כולסטרול. נאט. כומר מול. Cell Biol. 21, 225–245.

Luu, W., Hart-Smith, G., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2015. האנזימים הסופיים של סינתזת כולסטרול, DHCR24 ו-DHCR7, מקיימים אינטראקציה פיזית ותפקודית. J. Lipid Res. 56, 888–897.

Ma, J., Ketkar, H., Geng, T., Lo, E., Wang, L., Xi, J., Sun, Q., Zhu, Z., Cui, Y., Yang, L., Wang, P., 2018. חלבון לא מבני 4A של וירוס זיקה חוסם את איתות RLR-MAVS. חֲזִית. מיקרוביול. 9, 1350. Moebius, FF, Fitzky, BU, Lee, JN, Paik, YK, Glossmann, H., 1998.

שיבוט מולקולרי וביטוי של הדלתא האנושית 7-סטרול רדוקטאז. פרוק. נאטל. Acad. Sci. ארה"ב 95, 1899–1902.

Munoz-Jordan, JL, Laurent-Rolle, M., Ashour, J., Martinez-Sobrido, L., Ashok, M., Lipkin, WI, Garcia-Sastre, A., 2005. עיכוב של איתות אינטרפרון אלפא/ביתא על ידי חלבון NS4B של flaviviruses. J. Virol. 79, 8004–8013.

Munoz-Jordan, JL, Sanchez-Burgos, GG, Laurent-Rolle, M., Garcia-Sastre, A., 2003. עיכוב של איתות אינטרפרון על ידי וירוס דנגי. פרוק. נאטל. Acad. Sci. ארה"ב 100, 14333–14338.

Petersen, J., Drake, MJ, Bruce, EA, Riblett, AM, Didigu, CA, Wilen, CB, Malani, N., Male, F., Lee, FH, Bushman, FD, Cherry, S., Doms, RW, Bates, P., Briley Jr., K., 2014. המסלול הרגולטורי העיקרי של סטרול תאי נדרש לזיהום בנגיף האנדים. PLoS Pathog. 10, e1003911.

Pierson, TC, Diamond, MS, 2020. האיום המתמשך של flaviviruses המתעוררים. נאט. מיקרוביול. 5, 796–812. Prabhu, AV, Luu, W., Li, D., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2016a. DHCR7: אנזים חיוני עובר בין ייצור כולסטרול וויטמין D. פרוג. Lipid Res. 64, 138–151.

Prabhu, AV, Luu, W., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2016b. פירוק בתיווך כולסטרול של 7-דהידרוכולסטרול רדוקטאז משנה את האיזון מכולסטרול לסינתזה של ויטמין D. ג'יי ביול. Chem. 291, 8363–8373. Randall, G., 2018. מטבוליזם של טיפות שומנים במהלך זיהום בנגיף דנגי. טרנדים מיקרוביול. 26, 640–642.

Rasmussen, SA, Jamieson, DJ, Honein, MA, Petersen, LR, 2016. וירוס זיקה ומומים מולדים - סקירת הראיות לסיבתיות. N. Engl. J. Med. 374, 1981–1987.

Reboldi, A., Dang, EV, McDonald, JG, Liang, G., Russell, DW, Cyster, JG, 2014. דלקת. 25-Hydroxycholesterol מדכא דלקת המונעת על ידי אינטרלוקין-1- במורד הזרם של אינטרפרון מסוג I. מדע 345, 679–684.

Riedl, W., Acharya, D., Lee, JH, Liu, G., Sherman, T., Chiang, C., Chan, YK, Diamond, MS, Gack, MU, 2019. Zika virus NS3 מחקה תאי { {2}}מוטיב מחייב כדי לנטרל חסינות מולדת בתיווך RIG-I ו-MDA5-. Cell Host Microbe 26, 493–503 e496.

Rodgers, MA, Villareal, VA, Schaefer, EA, Peng, LF, Corey, KE, Chung, RT, Yang, PL, 2012. פרופיל מטבוליטים ליפידים מזהה את חילוף החומרים של דסמסטרול כמטרה אנטי-ויראלית חדשה לנגיף הפטיטיס C. ריבה. Chem. Soc. 134, 6896–6899. Savidis, G., Perreira, JM, Portmann, JM, Meraner, P., Guo, Z., Green, S., Brass, AL, 2016. ה-IFITMs מעכבים שכפול וירוס Zika. נציג תא 15, 2323–2330.

שניידר, WM, Chevillotte, MD, Rice, CM, 2014. גנים מעוררי אינטרפרון: רשת מורכבת של הגנות מארח. אננו. כומר אימונול. 32, 513–545.