רצף הגנום השלם לאבחון הפרעות התרחבות נוירולוגיות חוזרות בבריטניה: דיוק אבחוני רטרוספקטיבי ומחקר אימות קליני פרוספקטיבי

למידע נוסף:ali.ma@wecistanche.com

סיכום

רקע כללי

הפרעות התרחבות חוזרות משפיעות על כ-1 מתוך 3000 אנשים והן מחלות הטרוגניות קלינית הנגרמות על ידי הרחבות של חזרות קצרות של DNA טנדם. בדיקה גנטית היא לרוב ספציפית למיקום, וכתוצאה מכך תת-אבחון של אנשים שיש להם מצגים קליניים לא טיפוסיים, במיוחד בחולים ילדים ללא היסטוריה משפחתית חיובית קודמת. רצף גנום שלם משמש יותר ויותר כבדיקת קו ראשון להפרעות גנטיות נדירות אחרות, ושואפנו להעריך את ביצועיו באבחון של חולים עםנוירולוגיהפרעות התרחבות חוזרות.

שיטות

הערכנו בדיעבד את הדיוק האבחוני של רצף גנום שלם כדי לזהות את מוקדי ההתרחבות החוזרים הנפוצים ביותר הקשורים לנוירולוגיתוצאות (AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT ו-TBP) באמצעות דגימות שהתקבלו בשירות הבריאות הלאומי באנגליה ממטופלים שעל פי החשדנוירולוגיהפרעות; תוצאות בדיקת PCR קודמות שימשו כתקן הייחוס. הדיוק הקליני של רצף גנום שלם לזיהוי הרחבות חוזרות נבדק באופן פרוספקטיבי בחולים שנבדקו גנטית ולא אובחנו בעבר, שגויסו בשנים 2013-17 לפרויקט הגנום 100 000 בבריטניה, אשר נחשדו כבעלי מחלה גנטית.נוירולוגיהפרעה (צורות משפחתיות או מוקדמות של אטקסיה, נוירופתיה, פרפלגיה ספסטית, דמנציה, מחלת נוירונים מוטוריים,פרקינסוןתְנוּעָההפרעות, מוגבלות אינטלקטואלית או הפרעות נוירו-שריריות). אם בוצעה קריאת הרחבה חוזרת באמצעות רצף גנום שלם, נעשה שימוש ב-PCR כדי לאשר את התוצאה.

ממצאים

הדיוק האבחוני של רצף גנום שלם לזיהוי הרחבות חוזרות הוערך מול 793 בדיקות PCR שבוצעו בעבר ב-NHS מ-404 מטופלים. ריצוף גנום שלם סיווג נכון 215 מתוך 221 אללים מורחבים ו-1316 מתוך 1321 אללים לא מורחבים, והראה רגישות של 97·3 אחוזים (95% CI 94·2-99·0) ו-99·6% ספציפיות (99·1-99 ·9) על פני 13 הלוקוסים הקשורים למחלה בהשוואה לתוצאות בדיקת PCR. בדגימות של 11 631 חולים בפרויקט הגנום 100 000, ריצוף גנום שלם זיהה 81 הרחבות חוזרות, שנבדקו גם על ידי PCR: 68 אושרו כהרחבות חוזרות בטווח הפתוגני המלא, 11 לא היו. -הרחבות או תמורות ביניים פתוגניות, ושתיים היו חזרות לא מורחבות (שיעור גילוי שגוי של 16 אחוז).

פרשנות

במחקר שלנו, רצף גנום שלם לזיהוי של הרחבות חוזרות הראה רגישות וסגוליות גבוהות, וזה הוביל לזיהוי שלנוירולוגיהפרעות התרחבות חוזרות בחולים שלא אובחנו בעבר. ממצאים אלו תומכים ביישום של רצף גנום שלם במעבדות קליניות לאבחון של חולים שיש להםנוירולוגימצגת עקבית עם הפרעת התרחבות חוזרת.

מימון

מועצת המחקר הרפואי, המחלקה לבריאות ושירותים חברתיים, שירות הבריאות הלאומי באנגליה, המכון הלאומי לחקר הבריאות, ואילומינה.

מבוא

למרות ההתקדמות האחרונה בהבנתנו את הבסיס הגנטי של נדירנוירולוגיהפרעות, עד 70 אחוז מהחולים עם הפרעות כאלה נותרים לא מאובחנים גנטית.1–3 בחלקו, זה נובע מהאתגרים הטכניים של בדיקת וריאנטים גנטיים מורכבים וחוזרים על עצמם, כולל הרחבות חוזרות; לפי הערכות, הרחבות כאלה משפיעות על כ-1 מתוך 3000 אנשים (נספח עמ' 1) והן הגורם המוביל ליותר מ-40 הפרעות נוירוגנטיות,4 כולל מחלת הנטינגטון ותסמונת X שביר. הפרעות התרחבות חוזרות הן הטרוגניות מבחינה קלינית וגנטית, והתרחבות חוזרת יכולה להיות קשורה למחלות שונות. לדוגמה, הרחבות ב-C9orf72 יכולות להופיע כטרשת צדדית אמיוטרופית או דמנציה פרונטו-טמפורלית.5 הרחבות חוזרות בלוקוסים שונים יכולות גם להניב מאפיינים פנוטיפיים דומים, מה שמקשה על הבחנה קלינית: הרחבות חוזרות לפחות בעשרה גנים לאטקסיה ספינו-צרבלורית הנוכחים לעתים קרובות כמבוגרים אטקסיה מתחילה,6 ואלו ב-C9orf72 ו-AR יכולים שניהם לגרום למחלת נוירונים מוטוריים.7,8

הפרעות התרחבות חוזרות נגרמות על ידי עלייה במספר רצפי DNA טנדם קצרים שחוזרים על עצמם, וספי הפתוגניות לכל הפרעה הם ספציפיים ללוקוס. גודל ההרחבה משתנה מפחות מ-30 חזרות (למשל, ב-CACNA1A) לכמה אלפי יחידות חוזרות (למשל, ב-FMR1, DMPK, C9orf72 ו-FXN, שיכולות להרחיב עד 5 kb בגודל). הרחבות חוזרות מפגינות חוסר יציבות מולקולרית, מה שעלול להוביל לשינויים בגודל החוזר (בדרך כלל עולה באורך) על פני דורות ורקמות.4 במצבים אלה, עלייה במספר החזרות מובילה לעתים קרובות להתפרצות מוקדמת יותר ולמחלה חמורה יותר ברציפות. דורות.4 הופעה בילדים של הפרעות התרחבות חוזרות עלולה להופיע כתסמונות רב-מערכתיות ללא חתימות פנוטיפיות ספציפיות,9 ולפיכך יש סיכוי גבוה יותר שילדים עם הפרעות אלו יהיו חסרי אבחון כאשר היסטוריה משפחתית של הפרעת התרחבות חוזרת נעדרת מאשר כאשר היא קיימת.10– 12

הערכת מעבדה של הרחבות חוזרות מוגבלת בדרך כלל להערכה מולקולרית ממוקדת של לוקוס אינדיבידואלי המונחה על ידי האבחנה הקלינית החשודה באמצעות שיטות מבוססות PCR או Southern blot,13 שעלולות להיות יקרות וגוזלות זמן. בנוסף, בשל המאפיינים הפנוטיפיים המגוונים והחופפים של הפרעות אלו, מוקדי התרחבות חוזרים הקשורים למחלה יכולים להישאר ללא בדיקה.14

רצף גנום שלם מופיע ככלי אבחון קו ראשון בחולים עם מחלה נדירה15, אך עד לאחרונה חשבו שיש להם יכולת מוגבלת להעריך לוקוסים המכילים הרחבות חוזרות.16 לעומת זאת, התקדמות בביואינפורמטיקה אפשרה את זיהוי המחלה. -גרימת הרחבות חוזרות מנתוני רצף הדור הבא.17–22 כאן, אנו מדווחים על הערכה אבחנתית של גישת ריצוף גנום שלם לזיהוי הרחבות חוזרות באמצעות נתוני PCR רטרוספקטיביים, ואימות הקליני שלה בחולים בפרויקט 100000 גנומים אשר היה חשד להפרעה נוירולוגית, שלא אובחנה בבדיקות גנטיות קודמות.

שיטות

עיצוב לימודים ומשתתפים

הערכה זו של רצף גנום שלם לזיהוי הרחבות חוזרות כללה הן דיוק אבחון והן הערכות דיוק קליניות. הדיוק האבחוני הוערך באמצעות נתונים של מטופלים שנבדקו בעבר על ידי PCR עבור הרחבות חוזרות, הידוע כגורם למחלה נוירולוגית. קיימברידג', בריטניה). עבור שני קבוצות החולים, בדיקות PCR בוצעו על דגימות חולים על ידי מעבדות בשירות הבריאות הלאומי (NHS) כחלק מהערכה קלינית שגרתית: עבור דגימות בפרויקט 100000 גנומים, בדיקות PCR נעשו לפני הגיוס לפרויקט על ידי University College London Hospital Neurogenetics Laboratory (לונדון, בריטניה); דגימות עם הרחבות חוזרות שאושרו על ידי PCR התקבלו מחולים שנבדקו על ידי המעבדה הגנומית שבסיסה בקיימברידג'. חולים עם תוצאות בדיקות PCR חיוביות ו-PCR שליליות עבור הפרעות התרחבות חוזרות זוהו להכללה במחקר שלנו באמצעות מערכות תיעוד מעבדה; כל המטופלים נתנו הסכמה מדעת בכתב לשימוש בדגימה שלהם למטרות הבטחת איכות ומחקר והדרכה, כחלק מאופטימיזציה ואימות שירות קליני.

ריצוף גנום שלם של כל דגימה נעשה באחת משתי מעבדות: Genomics England (Hinxton, בריטניה) עבור דגימות 100000 Genome Project (n=254) ו- Illumina Clinical Services Laboratory (ICSL; San Diego, CA, ארה"ב) עבור דגימות שהושגו על ידי המעבדה הגנומית שבסיסה בקיימברידג' (n=150). בסך הכל, מערך נתונים זה שימש לחלק הדיוק האבחוני של המחקר, והורכב מנתוני PCR ורצף גנום שלם מ-404 חולים, המכסים 13 לוקוסים המייצגים את הפרעות ההתרחבות החוזרות הנוירולוגיות הנפוצות ביותר: 11 לוקוסים הקשורים לאטקסיה ומאוחר. הפרעות נוירודגנרטיביות מתחילות (HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72 ו-FXN), לוקוס אחד הקשור למוגבלות אינטלקטואלית (FMR1), ולוקוס אחד הקשור לניוון מיוטוני (DMPK). עבור כל לוקוס, נתוני בדיקת PCR היו זמינים עבור אלל מורחב אחד לפחות (נספח עמ' 24).

הדיוק הקליני הוערך על ידי בחינת הקונקורדנציה של הרחבות חוזרות, כפי שזוהו עם רצף גנום שלם, עם חשד לאבחון קליני לאחר אישור PCR בחולים עם חשד להפרעות נוירולוגיות גנטיות (צורות משפחתיות או מוקדמות של אטקסיה, נוירופתיה, פרפלגיה ספסטית, דמנציה , מחלת נוירונים מוטוריים,פרקינסוןהפרעות תנועה, מוגבלות אינטלקטואלית או הפרעות נוירו-שריריות) שגויסו לפרויקט 100000 גנומים בשנים 2013-17. פרויקט 100,000 גנומים הוא תוכנית בבריטניה להערכת הערך של רצף גנום שלם בחולים עם צרכים אבחוניים לא מסופקים במחלות נדירות ובסרטן. לאחר אישור אתי לפרויקט 100000 גנומים על ידי ועדת האתיקה של קיימברידג' דרום במזרח אנגליה (עיון 14/EE/1112), כולל לניתוח נתונים והחזרה של ממצאי אבחון לחולים, חולים אלה גויסו על ידי אנשי מקצוע בתחום הבריאות וחוקרים מטעם 13 מרכזי רפואה גנומית באנגליה ונרשמו לפרויקט אם הם או האפוטרופוס שלהם סיפקו הסכמה בכתב לכך שהדגימות והנתונים שלהם ישמשו במחקר, כולל מחקר זה. פרובנדים, ובמידת האפשר, בני משפחה אחרים, נרשמו על פי קריטריוני התאמה שנקבעו למצבי מחלה נדירים ספציפיים (נספח עמ' 5-11). מטופלים גויסו לפרויקט 100000 גנומים לאחר בדיקות גנטיות סטנדרטיות ב-NHS, כפי שצוין בקריטריונים לזכאות. נתונים קליניים סטנדרטיים נרשמו באמצעות Human Phenotyping Ontology (HPO)23 כנגד מודלים של נתונים ספציפיים למחלה.24 גם מצב המחלה של בני המשפחה, ביחס להתוויה הקלינית של הפרובנד לבדיקה, נאסף.

כדי לזהות הרחבות חוזרות סיבתיות בחולים עם מחלה לא מאובחנת גנטית, בדקנו חולים עם חשד להפרעות גנטיות המתאימות למחלת התרחבות חוזרת. החולים נבחרו על בסיס התאמה של תנאי המחלה וה-HPO שלהם עם הפרעות חוזרות הקשורות להתרחבות. נתוני רצף הגנום המלא של המטופלים נחקרו כדי לחפש הרחבות בקבוצות מסוימות של חזרות באמצעות ארבעה לוחות הרחבה חוזרים שונים בהתאם למאפיינים הקליניים שלהם (נספח עמ' 5). ההרחבות החוזרות שנבחרו להכללה בלוחות אלו הן מוקדי ההתרחבות החוזרים הנפוצים ביותר הגורמים למחלה נוירולוגית. מטופלים עם מאפיינים קליניים שעשויים להיות תואמים ליותר מהפרעת התרחבות חוזרת אחת נבדקו במספר פאנלים. אם בוצעה קריאת הרחבה חוזרת באמצעות רצף גנום שלם, בוצעה בדיקת אישור באמצעות PCR.

עבור כל חולה עם התרחבות חוזרת מאושרת, נמסר לרופא המקומי על תוצאת האבחון הפוטנציאלית, ותרומת ההתרחבות החוזרת למאפיינים הקליניים של החולה הוערכה. עבור הרחבות חוזרות שהסבירו באופן מלא או חלקי את המאפיינים הקליניים של המטופל, הוצא דו"ח אבחון על פי נהלים סטנדרטיים מקומיים.

נהלים

עבור הדגימות ההיסטוריות של NHS המשמשות בחלק הדיוק האבחוני של המחקר שלנו, הרחבות חוזרות נבדקו בעבר באמצעות הגברה של PCR וניתוח מקטעים. סריקה דרומית בוצעה עבור הרחבות גדולות של C9orf72. בחלק הדיוק הקליני של המחקר שלנו, הרחבות חוזרות שזוהו על ידי רצף גנום שלם בחולים מפרויקט הגנומים 100 000 נבדקו על ידי PCR בדגימות המאוחסנות במעבדות גנטיות של NHS. פרטים נוספים, לרבות רצפי פריימר, מובאים בנספח (עמ' 2-3, 25-26).

ה-DNA הוכן לרצף גנום שלם באמצעות הכנת ספריית TruSeq DNA PCR-Free, ורצף קצה זוגי של 150 bp או 125 bp בוצע בפלטפורמות HiSeq 2000 או HiSeq X במתקן הגנום הגבוה של Genomics England, וב-ICSL . גנומים רוצו לעומק ממוצע של 35× (31× עד 37×; נספח עמ' 27). גנוטיפ קצר-טנדם חוזר בוצע באמצעות חבילת התוכנה ExpansionHunter גרסה 3.1.2.25,26 בקצרה, ExpansionHunter מיישרת מחדש קריאות רצף על פני קבוצה מוגדרת מראש של חזרות טנדם קצרות כדי להעריך את גודל שני האללים מאדם (נספח עמ' 3).

פלט ExpansionHunter כולל הערכה של מספר האלמנטים החוזרים, הגודל הכולל ומגבלת הביטחון עבור כל לוקוס שהוערך. הנחיות מהאגודה לפתולוגיה רפואית והמכללה של פתולוגים אמריקאים ממליצות על בדיקה חזותית של קריאות וריאנטים במהלך ההערכה השגרתית של וריאנטים של רצף תפוקה גבוהה.27

עם זאת, לא ניתן להמחיש כראוי גרסאות חוזרות טנדם קצרות על ידי כלי הדמיה נפוצים כגון Integrative Genomics Viewer.28 כדי לבחון את נתוני רצף הגנום השלם העומדים בבסיס כל קריאת גנוטיפ, נעשה שימוש בכלי להדמיה של גרפים, המאפשר הדמיה ישירה של הפלוטיפים ואת ערימת הקריאה המתאימה. של הגנוטיפים של ExpansionHunter (נספח עמ' 3, 15). בדיקה חזותית של גרף ה-pileup בוצעה בכל קריאות טנדם חוזרות קצרות של ריצוף גנום שלם כדי לאשר שחיזוי ExpansionHunter עבור אללים נכלל כולו בכל קריאה (כלומר, רצף החוזר היה קטן יותר מאורך הקריאה ברצף); כדי לאשר נוכחות של התפשטות מונואללית או ביאללית; לזהות קריאות חיוביות-שווא משוערות; וכדי לזהות אללים שליליים כוזבים בהרחבות חוזרות ביאלליות, כגון FXN (נספח עמ' 4, 16).

ExpansionHunter מעריך גודל חוזר מנתוני רצף גנום שלם על ידי ניתוח קריאות רצף המכילות באופן מלא או חלקי חזרה טנדם קצרה. אם אלל חוזר טנדם קצר קצר מאורך הקריאה, ExpansionHunter חוזה את הגודל המדויק; אם אלל חוזר טנדם קצר ארוך מאורך הקריאה, ExpansionHunter מעריך את גודל החזרה בתוך CI, בהתאם להרכב רצף הלוקוס, עומק הרצף ואיכות הרצף.

ניתוח סטטיסטי

סיווגנו חזרות כמורחבות על ידי רצף גנום שלם אם הגודל שנחזה על ידי ExpansionHunter היה מעל לחיתוך הקדם-מוטציה, או לא מורחבת אם הגודל החזוי היה מתחת לחיתוך (נספח עמ' 28).

רגישות ו-CIs לזיהוי התרחבות חוזרת של רצף שלם של הגנום חושבו כשיעור האללים עם חזרות מורחבות בין אללים שאושרו בעבר על ידי PCR עם חזרות מורחבות. הספציפיות נאמדה כשיעור האללים הלא מורחבים בין חזרות לא מורחבות שנבדקו בעבר על ידי PCR. תיאור מלא של הנוסחאות הסטטיסטיות ניתן בנספח (עמ' 1).

כדי להשוות גדלים חוזרים על ידי PCR עם הערכות גודל חוזרות על ידי ריצוף גנום שלם, אללים בכימות PCR הושוו לגדלים חוזרים שנחזה על ידי ExpansionHunter עבור אללים קצרים מאורך הקריאה בכל 13 לוקוסים חוזרים בטנדם קצרים. הקונקורדנציה חושבה על פי אחוז הגדלים החוזרים שנחזה על ידי ExpansionHunter שהיו בהתאמה לגודל מכמת PCR, תוך התחשבות בשגיאת PCR של פלוס או מינוס חזרה אחת. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות תוכנה סטטיסטית R גרסה 3.6.3.

תפקיד מקור המימון

תכנון המחקר, רישום מטופלים, איסוף הנתונים והרצף הובלו על ידי עובדי Genomics England וחוקרים אקדמיים. עובדי Illumina ביצעו רצף של 150 דגימות מטופלים כמרכיב מתוכנן במחקר דיוק אבחון רצף הגנום כולו ופיתחו את ExpansionHunter. עובדים של Genomics England, חוקרים אקדמיים ומחברים משותפים RTH, ED ו-MAE ביצעו את הניתוח והפירוש של הרחבות חוזרות בחולים שגויסו לפרויקט הגנום 100 000. למקורות המימון לא היה תפקיד בפרשנות הנתונים או בכתיבת הדו"ח.

תוצאות

הדיוק האבחוני של רצף גנום שלם לאיתור הרחבות חוזרות הוערך מול 793 בדיקות PCR שבוצעו בעבר במסגרת ה-NHS מ-404 חולים (64 חולים נבדקו ליותר מחזרה אחת; איור 1). מתוך בדיקות אלו, 183 סווגו כבעלי חזרה מורחבת ו-610 כבעלי התרחבות חוזרת על ידי PCR, והניבו בסך הכל 221 אללים בודדים מורחבים ו-1321 לא מורחבים על פני 13 לוקוסים של מחלה (נספח עמ' 24, 28). ריצוף גנום שלם סיווג נכון 215 מתוך 221 אללים מורחבים ו-1316 מתוך 1321 אללים לא מורחבים בהשוואה לתוצאות בדיקת PCR (נספח עמ' 27, 29), המראה רגישות ראשונית של 97·3 אחוז (95 אחוז CI 94·2–99 ·0) וספציפיות של 99·6 אחוזים (99·1–99·9; טבלה 1). בעקבות התיקון החזותי של כל השיחות על סמך איכות הקריאה, הרגישות עלתה ל-99·1 אחוז (96·8–99·9) והספציפיות ל-100 אחוז (99·7–100; איור 2א, טבלה 1). הדמיה של האללים המורחבים אפשרה זיהוי של תוצאות חיוביות שגויות וסיווג מחדש של כל האללים השליליים השגויים ב-FXN, מתוכם רק אלל אחד סווג נכון כמורחב בדגימות עם הרחבות ביאלליות (נספח עמ' 17, 18).

אורך החזרה הוכמת על ידי PCR ב-509 בדיקות PCR שחקרו 945 אללים על פני 13 לוקוסי התרחבות חוזרים. מתאמים בין ExpansionHunter ו-PCR עבור גדלים חוזרים קצרים וגדולים מאורך הקריאה ברצף (כלומר, 150 bp) מוצגים בנספח (נספח עמ' 19). נצפתה התאמה גבוהה עבור חזרות קצרות מאורך הקריאה, עם הסכמה של 92·7 אחוזים (836 מתוך 902) בין PCR ו- ExpansionHunter. נצפתה שונות לוקוס, עם התאמה גבוהה בין ExpansionHunter ו-PCR עבור ATXN2, ATXN7, CACNA1A ו-HTT, וקונקורדנציה נמוכה עבור DMPK או TBP (נספח עמ' 30). אורכי האללים הגדולים מאורך הקריאה הוערכו בחסר על ידי ExpansionHunter, אשר השפיע על דיוק הקריאה ב-DMPK, FMR1 ו-FXN (איור 2B, נספח עמ' 19, 31).

למרות שה- ExpansionHunter הצליח לזהות נכון אללים גדולים מורחבים ב-FMR1, DMPK, C9orf72 ו-FXN (נספח עמ' 29), אומדני הגודל החזויים נטו להיות נמוכים מאלה שהתקבלו ב-PCR כאשר הגודל החוזר גדל בטווח הפתוגני, מה שהשפיע על היכולת להבחין בין הרחבות גדולות לקטנות ב-DMPK, C9orf72 ו-FXN, או בין הרחבות ותמורות מלאות ב-FMR1 (נספח עמ' 31). לדוגמה, ללוקוסים עם אורך חוזר שהוערך על ידי PCR גדול מ-200 חזרות ב-FMR1 ומסווגים כמוטציה מלאה היה גודל חוזר ממוצע שהוערך על ידי ExpansionHunter של 92·6 (SD 17·8; נספח עמ' 31).

כדי לבדוק את היכולת של זיהוי התרחבות חוזרת על ידי רצף גנום שלם כדי לפתור את האבחנה של חולים שנבדקו בעבר ולא אובחנו גנטית, בדקנו 11 631 חולים עם חשד להפרעה נוירולוגית גנטית שגויסו לפרויקט 100000 גנומים (איור 1). נתוני רצף גנום שלם הוערכו באמצעות ארבעה לוחות הרחבה חוזרים שונים בהתאם למאפיינים הקליניים של המטופל. מספרי המטופלים שנבדקו בכל אחד מארבעת הפאנלים מוצגים בטבלה 2.

בסך הכל, זיהינו ואישרנו חזותית הרחבות חוזרות בדגימות מ-105 מטופלים (טבלה 2, נספח עמ' 20, 33). מתוכם, 81 דגימות היו זמינות לבדיקת אישור באמצעות PCR, ו-68 אושרו כבעלי הרחבה חוזרת (0·6 אחוז תשואה): 45 (1·2 אחוז) מתוך 3692 בפאנל A, שמונה ({ {18}}·3 אחוזים ) מתוך 2743 בפאנל B, חמישה (0·6 אחוזים ) מתוך 860 בפאנל C, ועשרה (0·1 אחוז ) מתוך 6731 בפאנל D. 13 מתוך 81 קריאות הרחבה לא אושרו כהרחבות חוזרות פתוגניות (שיעור גילוי שגוי של 16 אחוז). מתוכם, שניים היו אללים לא מורחבים ב-ATXN1 ו-ATXN2, ארבעה היו קריאות בגודל בינוני FMR1 (נספח עמ' 21), ושבעה היו תמורות FMR1.

פרטים קליניים של 68 החולים עם הרחבות חוזרות שאושרו על ידי PCR, כולל המצגים הקליניים שלהם, ההרחבה החוזרת שזוהתה ותרומת ההתרחבות החוזרת למאפיינים הקליניים של המטופל מסופקים בטבלה 3; תנאי HPO, גודל חוזר המוערך על ידי ExpansionHunter והאם הוצא דוח אבחון מפורטים בנספח (עמ' 33).

הרחבות נצפו בחולים שהציגו מגוון רחב של מצגות קליניות חופפות שנבדקו עם פאנל A (טבלה 3, נספח עמ' 22), כולל התרחבות חוזרת של ATXN2 בחולה עם מחלת פרקינסון המגיבה ללבודופה והיסטוריה של אטקסיה מוחית מתקדמת. , והרחבות AR בארבעה חולים שאובחנו קלינית עם מחלת Charcot-Marie-Tooth, כולל אחד עם נוירופתיה demyelinating neuropathy שאושרה גנטית (כלומר, Charcot-Marie-Tooth סוג 1, חולה 42; נספח עמ' 33). מגוון רחב של אבחנות קליניות קודמות נצפה בחולים עם הרחבות חוזרות פתוגניות.

לדוגמה, בשבעה חולים עם טרשת צדדית אמיוטרופית או מחלת נוירונים מוטוריים אחרים, זוהו הרחבות ב-AR (n=4) וב-C9orf72 (n=3). בחולים עם חשד לאטקסיה תורשתית, זיהינו הרחבות בלוקוסים שלא הוערכו כחלק מטיפול אבחוני שגרתי במסגרת ה-NHS בזמן הגיוס, כולל ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP ו-HTT ( שולחן 3). כמו כן, זיהינו הרחבות חוזרות בחולים עם מאפיינים קליניים התואמים להפרעות התרחבות חוזרות חלופיות, כולל התרחבות C9orf72 במחלת פרקינסון מוקדמת ומשפחתית (חולה 24, טבלה 3) והתרחבות חוזרת בטווח החדירה המופחת ב-HTT (38 חזרות) בשתי אחיות עם הפרעת תנועה, דמנציה, דיכאון וקשיי דיבור (מטופלים 44 ו-45), מה שמדגיש את האתגר האבחוני שמציג הפרעות ההתרחבות החוזרות הללו.

שמונה ילדים שנבדקו עם פאנל B נמצאו עם הרחבות חוזרות גדולות של CAG (איור 3), שבעה מהם הסבירו במלואם את המאפיינים הקליניים של המטופל. לשישה חולים לא היה היסטוריה משפחתית אינפורמטיבית ולא הוצעו להם בדיקות הרחבה חוזרות כחלק מההערכה הקלינית שלהם בזמן הגיוס (מטופלים 48-53; טבלה 3, נספח עמ' 33). שניים מהילדים הללו נשאו הרחבות HTT גדולות (90-100 חזרות CAG). יש לציין, ילד אחד ירש את החזרה מהורה לא מושפע ללא היסטוריה משפחתית של מחלת הנטינגטון. בדיקות משפחתיות נמשכות, אך זוהה אלל חדירות מופחת במשפחה המורחבת, מה שמצביע על כך שהחזרה התרחבה ביותר מ-60 יחידות חוזרות בדור בודד (מטופל 52). בזמן כתיבת שורות אלה, איש במשפחה לא הראה סימנים למחלת הנטינגטון, וייעוץ ובדיקות גנטיות נמשכות להורים. שני ילדים מתחת לגיל 5 נשאו הרחבות חוזרות גדולות ב-ATXN7 והציגו מחלה רב-מערכתית מורכבת. עבור אחד מהילדים הללו (מטופל 50), הוריהם הראו בעיות בהליכה שנתיים לאחר ההרשמה לפרויקט 100000 גנומים. באופן דומה, נמצאה אצל ילדה בת 10 עם מוגבלות שכלית 99-התרחבות חוזרת ב-ATXN2, למרות העובדה ששני ההורים מוגדרים כלא מושפעים, וילדה בת 18 עם דמנציה נמצאה נושאת {{101} {19}}חזור על הרחבה ב-ATN1 (נספח עמ' 33).

התגלו חמש הרחבות ב-DMPK (פאנל C), כולל בילד ואם עם אבחנה קלינית של ניוון שרירים, בשני אחים עם חשד למיופתיה דיסטלית ובמתבגר עם מיאופתיה מולדת (מטופלים 54-58). הרחבות FMR1 (פאנל D) זוהו בתשעה בנים וילדה אחת, ואבחון של תסמונת X שביר הסבירה באופן מלא או חלקי את המאפיינים הקליניים המציגים (מטופלים 59-68).

דִיוּן

האבחנה של הפרעות התרחבות חוזרות היא מאתגרת בתחום הבריאות בשל מאפיינים קליניים הטרוגניים וחופפים וממצאים קליניים לא ספציפיים, שעלולים לעלות בחומרתם עם הגיל ובכל דור שלאחר מכן. הפרעות התרחבות חוזרות הן בין הגורמים השכיחים ביותר למחלות נוירולוגיות תורשתיות.4 אף על פי כן, חולים עלולים להיות מאובחנים בתת-אבחון, בין אם בגלל שבדיקות גנטיות לא מספיקות בוצעו ובין אם בגלל שהווריאציות הגנטיות הסיבתיות טרם התגלו. גישות הבדיקה הן כיום מקוטעות, וייתכן שהחולים יבדקו את נקודת ההתפשטות החוזרת השגויה29 או יקבלו בדיקה מולקולרית לסוג שונה של וריאנטים עקב חפיפה של מאפיינים קליניים עם הפרעות גנטיות נוירולוגיות אחרות.30

ריצוף גנום שלם שימש במספר הגדרות כבדיקת קו אבחון להפרעות נוירולוגיות נדירות, אך בעבר נחשב כבעל יכולת נמוכה לזהות הרחבות חוזרות.16 פותחו מספר כלים לזיהוי הרחבות חוזרות מגנום שלם. רצף במסגרת המחקר,31 אך אף אחת מהגישות הללו לא יושמה על נתוני רצף גנום שלם שנאספו ממספר רב של מטופלים בשירות בריאות יחיד. אנו מציגים ראיות לכך שאלגוריתם שנועד לזהות הרחבות חוזרות מרצף גנום שלם יכול להעריך באופן מהימן את ההרחבות החוזרות הגורמות למחלה הנפוצות ביותר ולפתור מקרים שלא אובחנו בעבר גנטית בקבוצה גדולה של חולים עם הפרעות נוירולוגיות. התוצאות שלנו מצביעות על כך שרצף גנום שלם יכול להבחין בין אללים לא מורחבים ומורחבים עם רגישות וסגוליות גבוהות על פני 13 לוקוסים של התפשטות חוזרת (שניתן לשפר עוד יותר על ידי בדיקה ויזואלית), יכול לחשב במדויק את גודלם של אללים הקטן מאורך הקריאה , ועלול להמעיט בגודלן של הרחבות גדולות ב-FMR1, DMPK, FXN ו-C9orf72.

כאשר זיהוי של הרחבות חוזרות על ידי ריצוף גנום שלם הוערך מול תוצאות חיוביות ושליליות שהושגו בעבר במעבדות גנומיות אבחנתיות קליניות בשיטות סטנדרט זהב, מצאנו מינימום של 97·3 אחוזי רגישות ו-99·6 אחוזי ספציפיות. יתרה מזאת, הראינו שניתן לשפר גם את הספציפיות וגם את הרגישות על ידי איסוף ידני של ערימת הקריאה, מה שמאפשר זיהוי של תוצאות חיוביות שגויות וסיווג מחדש של אללים שליליים כוזבים בדגימות עם הרחבות ביאלליות. מתוך 6731 מטופלים שנבדקו עבור FMR1 (פאנל D), 124 שיחות צפויות להיות מורחבות. הצלחנו להחריג 97 באמצעות בדיקה חזותית כתוצאות שווא. זה מצביע על כך של-1 מתוך 54 בדיקות רצף גנום שלם תהיה קריאת FMR1 שתצטרך להיבדק ויזואלית כדי להשליך שיחה חיובית-שגויה פוטנציאלית. נמשכת עבודה לשיפור שיטת הגנוטיפים של ExpansionHunter כדי להפחית את מספר הקריאות החיוביות-שגויות עבור FMR1.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 חזרות) גורמות למחלה חמורה יותר, ואטקסיה ספינו-צרבלורית מסוג 36 (NOP56), שעבורן הרחבות גדולות מ-650 חזרות נחשבות לפתוגניות וגדלים חוזרים של 15-650 נחשבים ביניים וגרסאות בעלות משמעות לא ברורה.

יותר מ-40 מוקדי התפשטות חוזרים זוהו; רבים מהלוקוסים הללו זוהו רק לאחרונה וכעת הם קשורים למצבים בלתי מוסברים בעבר, כולל אטקסיה מוחית עם נוירופתיה ותסמונת ארפלקסיה וסטיבולרית (RFC1) 32 ואפילפסיה מיוקלונית (SAMD12).33 מוקדי ההתרחבות החוזרים הנפוצים ביותר היו גורמים למחלה נוירולוגית. נבחר למחקר שלנו על סמך הזמינות של דגימות ביקורת חיוביות ושליליות.

הממצאים המוצגים כאן מצביעים על כך ש- ExpansionHunter אמור להיות מסוגל לסווג אללים לא מורחבים ומורחבים במדויק בכל מוקד התרחבות חוזר אם האללים הלא מורחבים קטנים מאורך הקריאה (כלומר, 150 bp). למרות שלרוב מוקדי ההתפשטות החוזרים יש אללים קטנים מ-150 bp כאשר הם אינם מורחבים, לוקוסים מסוימים שגודל האלל הלא-מורחב עבורם קרוב ל-150 bp (למשל, NOTCH2NLC)34 עשוי להיות קשה יותר לגנוטייפ באמצעות גישה זו. עבור לוקוסים שבהם החזרה המורחבת גדולה משמעותית מאורך הקריאה, רצף גנום שלם יכול לזהות הרחבות פתוגניות (למשל, NOP56,35 RFC120,32). טכנולוגיות רצף ארוכות קריאה מתפתחות עשויות להציע גישות משלימות בעת ביצוע גנוטיפ של הרחבות גדולות.36

הערכה של הרחבות חוזרות באמצעות רצף גנום שלם ב-11 631 חולים לא מאובחנים שגויסו לפרויקט הגנום 100 000 הניבה 68 חולים עם ממצאים מסבירים. מטופלים גויסו לפרויקט הגנום 100 000 לאחר בדיקות גנטיות סטנדרטיות; לפיכך, שיעור ההרחבות החוזרות שזוהו בקבוצה זו מייצג עלייה של התשואה האבחנתית מבדיקות NHS סטנדרטיות, הכוללות בדיקה ספציפית ללוקוס עבור הפרעות התרחבות חוזרות כגון FXN או DMPK. יש לציין שחלק מהאבחנות לא נחשדו על סמך המאפיינים הקליניים של המטופל, כולל שישה מטופלים ילדים שלא היה להם היסטוריה משפחתית ידועה של הפרעת התרחבות חוזרת. גדלי ההתרחבות החוזרים הממוצעים החזויים על ידי רצף הגנום השלם בחולים ילדים המתוארים במחקר זה גדולים משמעותית מהממוצע במבוגרים, בהתאם לציפייה שהרחבות גדולות יותר קשורות להופעה מוקדמת וחמורה יותר, אפילו בילדים. נדרשת עבודה נוספת, אך ממצא זה מצביע על כך שהערכה תלוית גיל וחוזרת תלויה בגודל של פתוגניות עשויה לתמוך באבחון ילדים על ידי הפחתת הסיכון הפוטנציאלי של זיהוי אללים בסיכון למבוגרים, מה שמוביל לבדיקות ניבוי בלתי רצויות בילדים.

הממצאים שלנו מאפשרים הקמת זרימת עבודה אבחנתית קלינית לרצף גנום שלם (נספח עמ' 23). אנו מציעים שבדיקה ויזואלית תיעשה עבור כל השיחות המסווגות כמורחבות כדי לזהות תוצאות חיוביות שגויות, ועבור הרחבות ביאלליות שעבורן זוהה רק אלל מורחב אחד (למשל, FXN). אנו ממליצים למעבדות להשתמש ב-ExpansionHunter כדי להעריך את קיומה של הרחבה ללא עמידה בהערכת הגודל ולבצע בדיקת PCR מאשרת כרכיב סטנדרטי של זרימת העבודה של הבדיקה.

מחלות תורשתיות נדירות כוללות מגוון רחב של מאפיינים קליניים, מה שהופך את הבדיקה הגנומית הספציפית ללוקוס ללא יעילה, מפרכת ויקרה. אנו מציגים ראיות לכך שרצף גנום שלם בדרגה קלינית עם פוטנציאל לאבחן מגוון מחלות נוירולוגיות נדירות המוצגות בדרך כלל עם וריאנטים של מספר בסיס, אינדל או עותק בודד יכול כעת להתרחב להרחבות חוזרות. מכיוון שרצף גנום שלם מספק בדיקה יחידה שיכולה לזהות את ההרחבות החוזרות הנפוצות ביותר, כמו גם מאפשרת בדיקה של מוטציות נקודתיות וריאנטים של מספר העתקות בגנים הקשורים למצבים אלה בו זמנית, היא מציעה את ההזדמנות לזהות את רוב החולים עם הפרעות הטרוגניות אלו. שלא אובחנו באמצעות בדיקה ספציפית לוקוס. בעידן של טיפולים מתפתחים להפרעות אלו, גילוי מוקדם עשוי להיות חיוני.37 תוצאות אלו תומכות ביישום של רצף גנום שלם לזיהוי של הרחבות חוזרות במעבדות אבחון קליני, גישה שכבר נכללה ב-NHS England National Genomic מדריך בדיקות,38 לחקירה של מחלה נוירולוגית נדירה שלא אובחנה.

הפניות

1 Ngo KJ, Rexach JE, Lee H, et al. תקרת אבחון לרצף אקסומים באטקסיה מוחית והפרעות נוירולוגיות קשורות. Hum Mutat 2020; 41: 487–501.

2 Lynch DS, Koutsis G, Tucci A, et al. פרפלגיה ספסטית תורשתית ביוון: אפיון של אוכלוסייה שלא נחקרה בעבר באמצעות רצף הדור הבא. Eur J Hum Genet 2016; 24: 857–63.

3 Graziola F, Garone G, Stregapede F, et al. תשואה אבחנתית של פאנל גנים ממוקד של הדור הבא של רצף להפרעות תנועה בילדים: מחקר עוקבה שנתי 3-. פרונט ג'נט 2019; 10: 1026.

4 Paulson H. מחלות התרחבות חוזרות. Handb Clin Neurol 2018; 147: 105–23.

5 Gossye H, Engelborghs S, Van Broeckhoven C, van der Zee J. C9orf72 דמנציה פרונטומפורלית ו/או טרשת צדדית אמיוטרופית. סיאטל, וושינגטון: אוניברסיטת וושינגטון, 2015.

6 Klockgether T, Mariotti C, Paulson HL. אטקסיה Spinocerebellar. Nat Rev Dis Primers 2019; 5:24.

7 שקוטאי VG, פוגל BL. נוירוגנטיקה קלינית: אטקסיה ספינו-מוחית דומיננטית אוטוזומלית. Neurol Clin 2013; 31: 987–1007.

8 La Spada A. ניוון שרירים בעמוד השדרה והבולברי. בתוך: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, eds. GeneReviews. סיאטל, וושינגטון: אוניברסיטת וושינגטון, 1999.

9 Gousse G, Natural H, Touraine R, et al. צורה קטלנית של אטקסיה spinocerebellar סוג 7 עם התחלה מוקדמת בילדות. Arch Pediatr 2018; 25: 42–44.

10 Ansorge O, Giunti P, Michalik A, et al. צבירה של Ataxin-7 ו-ubiquitination ב-SCA7 אינפנטילי עם 180 חזרות של CAG. אן נוירול 2004; 56: 448-52.

11 Ramocki MB, Chapieski L, McDonald RO, Fernandez F, Malphrus AD. אטקסיה Spinocerebellar Type 2 מציגה רגרסיה קוגניטיבית בילדות. J Child Neurol 2008; 23: 999–1001.

12 Mitchell N, LaTouche GA, Nelson B, Figueroa KP, Walker RH, Sobering AK. אטקסיה ספינו-צרבלורית 3 של הילדות: דיסטוניה בלשון כביטוי מוקדם. Tremor Other Hyperkinetic Mov 2019; פורסם באינטרנט ב-13 בספטמבר.

13 בירד TD. ניוון מיוטוני סוג 1. בתוך: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, eds. GeneReviews. סיאטל, וושינגטון: אוניברסיטת וושינגטון, 2019.

14 Aydin G, Dekomien G, Hoffman S, Gerding WM, Epplen JT, Arning L. תדירות של הרחבות חוזרות של SCA8, SCA10, SCA12, SCA36, FXTAS ו-C9orf72 בחולי SCA שליליות עבור תת-הסוגים הנפוצים ביותר של SCA. BMC Neurol 2018; 18:3.

15 Turro E, Astle WJ, Megy K, et al. רצף גנום שלם של חולים עם מחלות נדירות במערכת בריאות לאומית. טבע 2020; 583: 96–102.

16 אשלי EA. לקראת רפואה מדויקת. נת ר ג'נט 2016; 17: 507–22.

17 Liu HY, Zhou L, Zheng MY, ועוד. תועלת אבחנתית וקלינית של רצף גנום שלם בקבוצה של משפחות סיניות לא מאובחנות עם מחלות נדירות. Sci Rep 2019; 9: 19365.

18 Mousavi N, Shleizer-Burko S, Yanicky R, Gymrek M. פרופיל הגנום של הרחבות חוזרות טנדם. Nucleic Acids Res 2019; 47: e90.

19 Tankard RM, Bennett MF, Degorski P, Delatycki MB, Lockhart PJ, Bahlo M. זיהוי הרחבות של חזרות טנדם בקבוצות ברצף עם נתוני רצף בקריאה קצרה. Am J Hum Genet 2018; 103: 858–73.

20 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Bennett MF, et al. זיהוי מבוסס ביואינפורמטיקה של חזרות מורחבות: הרחבת פנטמר אינטרונית שאינה רפרנסית ב-RFC1 גורמת ל-CANVAS. Am J Hum Genet 2019; 105: 151–65.

21 Gross AM, Ajay SS, Rajan V, et al. וריאנטים של מספר העתקים בריצוף גנום קליני: פריסה ופרשנות למחלה נדירה ולא מאובחנת. Genet Med 2019; 21: 1121–30.

22 Trost B, Engchuan W, Nguyen CM, et al. זיהוי כלל הגנום של חזרות DNA טנדם המורחבות באוטיזם. טבע 2020; 586: 80–86.

23 Robinson PN, Kohler S, Bauer S, Seelow D, Horn D, Mundlos S. The Human Phenotype Ontology: כלי לביאור וניתוח מחלה תורשתית אנושית. Am J Hum Genet 2008; 83: 610–15.

24 Genomics אנגליה. מודלים קליניים של מצבי מחלה נדירים. 2018. https://www.genomicsengland.co.uk/?wpdmdl=5500 (נגישה ב-4 באוגוסט 2021).

25 Dolzhenko E, van Vugt JJFA, Shaw RJ, et al. זיהוי של הרחבות חוזרות ארוכות מנתוני רצף שלם ללא PCR. Genome Res 2017; 27: 1895-903.

26 Dolzhenko E, Deshpande V, Schlesinger F, et al. ExpansionHunter: כלי המבוסס על רצף גרף לניתוח וריאציות באזורי חוזר טנדם קצרים. ביואינפורמטיקה 2019; 35: 4754–56.

27 Roy S, Coldren C, Karunamurthy A, et al. תקנים והנחיות לאימות צינורות ביואינפורמטיקה של רצף הדור הבא: המלצה משותפת של האגודה לפתולוגיה מולקולרית והמכללה לפתולוגים אמריקאים. J Mol Diagn 2018; 20: 4–27.

28 Robinson JT, Thorvaldsdottir H, Winckler W, et al. צופה גנומיקה אינטגרטיבית. Nat Biotechnol 2011; 29: 24–26.

29 Schneider SA, van de Warrenburg BPC, Hughes TD, et al. הומוגניות פנוטיפית של המצג דמוי מחלת הנטינגטון במשפחת SCA17. נוירולוגיה 2006; 67: 1701–03.

30 שניידר SA, מחלת Bird T. Huntington, דומה למחלת הנטינגטון וכוריאה תורשתית שפירה: מה חדש? Mov Disord Clin Practice 2016; 3: 342–54.

31 Bahlo M, Bennett MF, Degorski P, Tankard RM, Delatycki MB, Lockhart PJ. התקדמות אחרונה בזיהוי הרחבות חוזרות עם רצף של הדור הבא בקריאה קצרה. F1000Res 2018; 7: 736.

32 Cortese A, Simone R, Sullivan R, et al. התרחבות ביאללית של חזרה אינטרונית ב-RFC1 היא סיבה שכיחה לאטקסיה מאוחרת. Nat Genet 2019; 51: 649–58.

33 Ishiura H, Doi K, Mitsui J, et al. הרחבות של TTTCA ו-TTTA אינטרוני באפילפסיה משפחתית שפירה של מבוגרים. Nat Genet 2018; 50: 581–90.

34 ישיורה H, Shibata S, Yoshimura J, et al. הרחבות חוזרות ללא קידוד של CGG במחלת הכללה תוך גרעינית עצבית, מיופתיה אוקולופרינגודיסטית ומחלה חופפת. Nat Genet 2019; 51: 1222–32.

35 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Pope K, et al. אבחון מהיר של אטקסיה spinocerebellar 36 במשפחה בת שלושה דורות באמצעות נתוני רצף גנום שלם בקריאה קצרה. Mov Disord 2020; 35: 1675–79.

36 Mantere T, Kersten S, Hoischen A. רצף קריאה ארוך המתעורר בגנטיקה רפואית. פרונט ג'נט 2019; 10: 426.

37 אלרבי LM. הפרעות התרחבות חוזרות: מנגנונים וטיפולים. נוירו-תרפיה 2019; 16: 924–27.

38 מערכת הבריאות הלאומית. ספריית הבדיקות הלאומית הגנומית: קריטריוני בדיקה למחלה נדירה ותורשתית. אוקטובר, 2021.