זנים פרוביוטיים ברי קיימא ומומתים בחום משפרים את חסינות הפה על ידי העלאת ריכוז ה-IgA ברירית הפה

תַקצִיר

חסינות רירית הפה-אף ממלאת תפקיד מכריע בהגנה על הגוף מפני פלישת חיידקים וויראליים. נעשה שימוש במוצרים פרוביוטיים בטוחים כדי לשפר את חסינות האדם ובריאות הפה. במחקר זה, אימתנו את ההשפעות המועילות של טבליות פרוביוטיות מעורבות, המורכבות מ-Lactobacillus salivarius subsp. salicinius AP-32, Bifdobacterium animalis subsp. lactis CP-9, ו-Lactobacillus paracasei ET-66, וטבליות פרוביוטיות מומתות בחום, המורכבות מ-L. salivarius subsp. salicinius AP-32 ו-L. paracasei ET-66, על חסינות דרך הפה בקרב 45 משתתפים בריאים. המשתתפים חולקו באופן אקראי לקבוצות פרוביוטיקה קיימא, פרוביוטיקה מומתת בחום ופלסבו. מתן הטיפול נמשך 4 שבועות. דגימות רוק נאספו בשבועות 0, 2, 4 ו-6, ונמדדו אוכלוסיות Lactobacillus, Bifidobacterium ו-Streptococcus mutans וריכוז IgA. ריכוזי ורמות IgA של TGF-beta ו-IL-10 בתאי PBMC כומתו בשיטת ELISA. התוצאות הראו כי רמות ה-IgA ברוק עלו באופן משמעותי במתן שני התרופות הקיימות (119.30±12.63%, ***P<0.001) and heat-killed (116.78±12.28%, ***P<0.001) probiotics for 4 weeks. Among three probiotic strains, AP-32 would effectively increase the levels of TGF-beta and IL-10 in PBMCs. The oral pathogen Streptococcus mutans was significantly reduced on viable probiotic tablet administration (49.60±31.01%, ***P<0.001). The in vitro antibacterial test confirmed that viable probiotics effectively limited the survival rate of oral pathogens. Thus, this clinical pilot study demonstrated that oral probiotic tablets both in viable form or heat-killed form could exert beneficial effects on oral immunity via IL-10, TGB-beta mediated IgA secretion. The effective dosage of viable probiotic content in the oral tablet was 109 CFUs/g and the heat-killed oral tablet was 1× 1010 cells/g.

תוסף תוסף cistanche-הגברת חסינות

מבוא

רירית הפה-אף, השער ליצירת קשר עם אנטיגנים בשאיפה, היא ההגנה הקדמית של מערכת החיסון האנושית [1, 2]. בדרך כלל, וירוסים או חיידקים פתוגניים פולשים למשטחי הרירית של חלל הפה-אף על ידי מאבק נגד המערכת החיסונית המקומית והמיקרוביוטה הבריאה [3]. דלקות ותסמינים, כולל שיעול, כאב גרון, נזלת וחום, מתפתחים עקב התגובות החיסוניות נגד וירוסים וחיידקים פתוגניים פולשניים [4]. בנוסף, אימונוגלובולין A (IgA) הוא הגורם החיסוני העיקרי ברוק ומווסת את ההומאוסטזיס של המיקרוביוטה הפה [5]. מספר מחקרים דיווחו על יכולתו של IgA המופרש להגן על הגוף מפני זיהום על ידי פתוגנים ויראליים, כולל וירוס סינציטי נשימתי [6], רוטה וירוס [7], וירוס שפעת [7]. Secretory IgA מתפקד כדי להגן על אפיתליה רירית. ניקולס מילט ואחרים. גילה כי IgA רירית יכול למנוע קנדידה אלביקנס דיסביוזיס קומנסלית בחלל הפה [8]. זה גם מונע הצטברות של הפתוגן דרך הפה Streptococcus mutans, הגורם לפלאק דנטלי [9].

חוץ מזה, חוקרים גילו שהמיקרוביוטה של ​​הפה והמטבוליטים שלה עשויים להשפיע באופן מקומי על חסינות במחסום הפה [10]. מחקרים קודמים הוכיחו את היעילות של פרוביוטיקה בהעלאת ריכוז ה-IgA ברירית הפה [11]. אריקסון וחב'. הוכיח כי מסטיק המכיל Lactobacillus reuteri השתתפה בתגובה חיסונית אדפטיבית של נבדקים בריאים על ידי הגדלת רמות IgA ברוק [12]. בבני אדם, הציטוקינים החיסונים TGF-beta ו-IL-10 נמצאים בקורלציה לייצור של IgA [13].

עם זאת, האם מיקרוביוטה דרך הפה העלתה את רמות הפרשת IgA דרך הציטוקינים TGF-beta ו-IL-10 עדיין לא ברורה. יתר על כן, הפתוגנים דרך הפה כוללים את S. mutans, P. gingivalis ו-F. nucleatum subsp. פולימורפיזם ו-A. actinomycetemcomitans הראו מתאם גבוה עם מחלות חניכיים וריח רע מהפה [14]. מוצרים פרוביוטיים יכולים להיות טיפול אלטרנטיבי פוטנציאלי לדלקת חניכיים על ידי עיכוב פתוגנים דרך הפה Fusobacterium nucleatum, אך Porphyromonas gingivalis ו-Aggregatibacter actinomycetemcomitans לא הראו ירידה משמעותית [15]. תוספת פרוביוטיקה יכולה גם למנוע זיהומים פתוגניים [16]. דווח כי מינים מרכזיים של המיקרוביוטה הגבילו את הצמיחה של דלקת ריאות פתוגנית של סטרפטוקוקוס [17]. לפיכך, שמירה על מערכת אקולוגית מיקרוביאלית מאוזנת באמצעות ספיגה של זנים פרוביוטיים עשויה להיות דרך חלופית לווסת את חסינות הפה ולשפר את בריאות הפה. ממצאים קודמים על עיכוב פתוגנים דרך הפה על ידי זנים פרוביוטיים גילו כי Lactobacillus salivarius subsp. salicinius AP -32, Bifdobacterium animalis subsp. lactis CP-9, ו-Lactobacillus paracasei ET-66 מפעילים השפעות אנטיבקטריאליות מצוינות במבחנה; עם זאת, לא במנגנון של הגדלת רמות H2O2 [18]. האסטרטגיות העיקריות של זנים פרוביוטיים להגבלת צמיחה פתוגנית דרך הפה היו צירוף פתוגנים דרך הפה, ייצור חומרים ביולוגיים, שינוי סביבת הפה ויצירת חומרים אנטי-מיקרוביאליים [19]. בנוסף, מחקר במבחנה הראה ש-L. salicinius AP-32 תיווך ציטוקין דלקתי [אינטרלוקין (IL)-8, IL-10] בתאי אפיתל אנושיים [20]. לכן, במחקר זה, אימתנו אם טבליות פרוביוטיות מעורבות בת קיימא, המורכבות מ-L. salivarius subsp. salicinius AP-32, B. animalis subsp. lactis CP-9, ו-L. paracasei ET-66, וטבליות פרוביוטיות מומתות בחום, המורכבות מ-L. salivarius subsp. Salicinius AP-32 ו-L. paracasei ET-66, שיפרו את התפקוד החיסוני באמצעות TGF-beta, IL-10 או העלו את רמת ריכוז ה-IgA ברוק. נבדק התפקוד האנטי-בקטריאלי של ספיגת מוצרים פרוביוטיים בחלל הפה.

יתרונות תוסף cistanche-איך לחזק את המערכת החיסונית

לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Enhance Immunity

【בקש עוד】 דוא"ל:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

חומר ושיטות

משתתפים

בסך הכל, 45 משתתפים בריאים בגילאי 20-40 שנים גויסו וחולקו באופן אקראי לשלוש תת-קבוצות: הטבליה הפרוביוטית הניתנת לקיום, הטבליה הפרוביוטית הפומית שהומתה בחום וקבוצות פלצבו. כל קבוצה כללה 15 משתתפים. משתתפים עם הרגלי אכילת עישון ואגוזים לא נכללו. טבליות דרך הפה הוקצו באופן עיוור למשתתפים. כל המשתתפים נטלו את הטבליות הפה שלוש פעמים ביום (בוקר, צהריים וערב) במשך 4 שבועות. דגימות רוק (2 מ"ל) נאספו למדידת ריכוז IgA ואוכלוסיות מיקרואורגניזמים בשבועות 0, 2, 4 ו-6. הסכמה מדעת התקבלה מכל המשתתפים שנכללו במחקר זה. הפרוטוקול אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של האוניברסיטה הרפואית של צ'ונג שאן, טייוואן (CS19052).

טבליות פרוביוטיות דרך הפה

הטבליה הפרוביוטית הניתנת דרך הפה (1 גרם) הכילה שלושה זנים פרוביוטיים ברי קיימא, L. salivarius subsp. salicinius AP-32, B. animalis subsp. lactis CP-9, ו-L. paracasei ET-66. ערבבנו 0.01 גרם של 1011 יחידות יצירת מושבות (CFUs) פרוביוטיקה בודדת בטבליה דרך הפה. כל זן פרוביוטי בודד נמדד בסביבות 0.33 * 109CFUs/g. תכולת הפרוביוטיקה הכוללת בטבליה הפאלית הייתה 109 מושבות CFUs/g. המינון הפעיל של הטבליה הפרוביוטית דרך הפה היה בעקבות עבודות שפורסמו בעבר [18]. כל הזנים הפרוביוטיים התקבלו מהמעבדה של Biofag Biotech Co., Ltd. (Tainan, טייוואן). L. salivarius subsp. salicinius AP-32 בודד ממעי אנושי בריא והופקד במכון המחקר והפיתוח של תעשיית המזון, טייוואן (מזהה: BCRC 910437) ובאוניברסיטת ווהאן, סין (מזהה: CCTCC-M2011127); B. animalis subsp. CP לקטי-9 בודד מחלב אם בריא והופקד במכון למחקר ופיתוח של תעשיית המזון, טייוואן (מזהה: BCRC 910645) ובאוניברסיטת ווהאן (מזהה: CCTCC-M2014588); L. paracasei ET-66 בודד מחלב אם בריא והופקד במכון למחקר ופיתוח תעשיית המזון, טייוואן (מזהה: BCRC 910753) ובמרכז איסוף התרבות המיקרוביולוגית הכללית של סין, בייג'ין, סין (מזהה: CGMCC{ {22}}). לקטובצילוס. salivarius subsp. salicinius AP-32 ו-L. paracasei ET-66 תורבו על לוחות אגר דה מאן, רוגוסה ושארפ (MRS) (110,660, Merck, Darmstadt, גרמניה) והודגרו בתנאים אנאירוביים פקולטטיביים ב-37 מעלות למשך 48 שעות. B. animalis subsp. Lactis CP-9 תורבת על אגר MRS בתוספת של 0.05% ציסטאין והודגר אנאירובית ב-37 מעלות למשך 48 שעות. ספירת מושבות בוצעה לכימות CFU של חיידקים לאחר גידול זני פרוביוטיקה [18].

מערכת חיסון מגבירה צמח cistanche

טבליות פרוביוטיות לפה המומתות בחום

הטבליות הפרוביוטיות האוראליות המומתות בחום (1 ​​גרם) היו מורכבות מ-L. salivarius subsp. salicinius AP-32 ו-L. paracasei ET-66. הזנים הברי קיימא תורבו והודגרו, כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, AP-32 ו-ET-66 הושבתו על ידי דגירה של הזנים הקיימאים במדיה MRS ב-100 מעלות למשך שעה. תכולת הפרוביוטיקה בטבליה דרך הפה הייתה 1×1010 תאים/גרם. המינון הפעיל של טבליות פרוביוטיות דרך הפה המומתות בחום היה בעקבות בדיקות חוץ גופיות שפורסמו בעבר [11]. כל ההליכים הניסויים בוצעו במעבדה של Biofag Biotech Co., Ltd (Tainan, טייוואן).

מדידה של אוכלוסיות לקטובצילוס וביפידובקטריה בדגימות רוק

דגימות רוק (2 מ"ל) נאספו מכל משתתף בשבועות 0, 2, 4 ו-6. דגימות הרוק (100 µL) דוללו באופן סדרתי ונוספו ל-MRS צלחות. כדי למדוד אוכלוסיות לקטובצילוס, לקטובצילוס תורבת והודגרה על לוחות האגר של MRS בתנאים אנאירוביים פקולטטיביים ב-37 מעלות למשך 48 שעות. כדי למדוד אוכלוסיות Bifdobacterium, Bifdobacterium תורבת והודגרה בצורה אנאירובית על אגר MRS בתוספת של 0.05% ציסטאין ב-37 מעלות למשך 48 שעות. ספירת מושבות בוצעה לכימות CFU של חיידקים לאחר גידול זני פרוביוטיקה. שיעורי אוכלוסיית הלקטובצילוס והביפידובקטריום נורמלו למספר האוכלוסייה הפרוביוטי בשבוע 0. שיעור האוכלוסייה של לקטובצילוס וביפידובקטריום שנאסף בשבוע 0 נחשב ל-100%. השיטה הניסיונית באה בעקבות עבודות שפורסמו בעבר [18].

מדידת ריכוז IgA ברירית הפה

דגימות רוק (2 מ"ל) נאספו מכל משתתף בשבועות 0, 2, 4 ו-6 ונשמרו ב-20 מעלות. ערכת IgA Human Uncoated ELISA (קטלוג מס' 88-50600-88; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, ארה"ב) שימשה לניתוח ריכוז ה-IgA. ראשית, ציפנו נוגדני IgA אנטי-אנושיים על צלחת באר 96-. IgA רוק הקיים בדגימה או בתקן נוספה למיקרו-באר, ולאחר מכן הוסף נוגדן IgA אנטי-אנושי מצומד HRP בטמפרטורת החדר למשך שעה. הפיפטינג של מצע TMB לכל באר למשך 30 דקות. לבסוף, קונצרט IgA נמדד בספקטרופוטומטר ב-450 ננומטר. כל הליך הניסוי בוצע בשלושה עותקים, בהתאם להוראות היצרן. שיעור הריכוז של IgA שנאסף בשבוע 0 נחשב ל-100%. השיטה הניסיונית באה בעקבות עבודות שפורסמו בעבר [18].

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

מדידת ריכוז TGF-Beta ו-IL-10 ב-PBMC

הבדיקה של עלייה הנגרמת על ידי פרוביוטיקה של רמות TGF-beta ו-IL-10 בעקבות המחקר הקודם [20]. תאי הדם המונו-גרעיניים ההיקפיים (PBMCs) התקבלו מדגימות דם של תורמים בריאים (מרכז הדם Tainan, Taiwan Blood Services Foundation). צנטריפוגה של דם מלא דרך שיפוע Ficoll-Hypaque (Pharmacia, שוודיה), ושבר צפיפות האור מהממשק של 42.5%-50% נפלטה. זריעה של תאי PBMC שחולצו 4*105 תאים ב-100 µl RPMI-1640 עם 1% FBS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, ארה"ב) לכל באר של צלחות 96 בארות. לאחר מכן הוסף טיפול פרוביוטי של 5*105 cfu/20 µl לכל PBMC שנזרעה היטב (תאים: זנים פרוביוטיים=1:10). הביקורות החיוביות היו הוספת 10 מיקרוגרם/מ"ל Phytohaemagglutinin (PHA) (Sigma-Aldrich, מינכן, גרמניה) לבארות זרעי PBMCs לייצור TGF-, IL-10 בהתאמה [21]. גידול משותף של פרוביוטיקה עם PBMCs במשך 48 שעות. מדידת סופרנטנט המכיל ציטוקינים IL-10 ו-TGF- על ידי אנליזה של אנזימים מקושרים אימונוסורבנט (ELISA) (Thermo Scientific, Carlsbad, CA, ארה"ב). כל הניסויים נמדדו ופעלו לפי הפרוטוקול המסחרי לפחות בשלושה עותקים.

הערכת התפקוד האנטיבקטריאלי בחלל הפה

Streptococcus mutans הוא איום נפוץ בבריאות הפה, הגורם לעששת בשיניים על ידי יצירת מגיפה או ביופילם [22]. דגימות Streptococcus mutans נאספו מהספוגיות, שבאמצעותן אספנו את ה-S. mutans על החלק העל-זיני, חניכיים ורירית הפה, בשבועות 0, 2, 4 ו-6. S. mutans נשמר בטריפטיקה מרק סויה (TSB, 5 מ"ל) בתוספת 50% גליצרול. המדיום של S. mutans היה מדולל באופן סדרתי והוסיף לצלחת Mitis Salivarius-Bacitracin Agar (MSBA, 0.2 U/mL), אשר הודגרה ב-37 מעלות למשך 2 ימים. לבסוף, מספר מושבות S. mutans בכל מדגם משתתף נספר כדי לחשב שיעורי הישרדות פתוגניים; שיעור ההישרדות של S. mutans שנאסף בשבוע 0 נחשב ל-100%. השיטה הניסיונית באה בעקבות עבודות שפורסמו בעבר [18].

פעילות אנטיבקטריאלית במבחנה של טבליות דרך הפה

Oral tablets (1 g) that contained viable (AP-32, CP-9, and ET-66; > 109 CFUs) and heat-killed (AP-32 and ET-66,>1010 CFUs) זני פרוביוטיקה הומסו ב-TSB ובמדיום עירוי לב במוח, בהתאמה, כדי להשיג ריכוז סופי של 0.1 גרם/מ"ל. רק המדיום שימש עבור הקבוצה הריקה, ואילו טבליות (1 גרם) ללא כל רכיבים פרוביוטיים הומסו במדיה המתאימה לקבוצת הפלצבו. לאחר מכן, פתוגנים דרך הפה (106 CFUs) הוכנסו לתמיסות הטבליות והודגרו יחד ב-37 מעלות עבור 2 (S. mutans) או 3 (Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum, ו-Aggregatibacter actinomy cetemcomitans) ד. פתוגנים התקבלו מה-BCRC. שיעור עיכוב הפתוגן האוראלי (%) חושב באופן הבא: (בקרת CFUblank-CFU ניסוי)/בקרת CFUblank. שיטת הניסוי באה בעקבות בדיקות שפורסמו בעבר [11].

ניתוח סטטיסטי

תוכנת GraphPad Prism שימשה לניתוח סטטיסטי של תוצאות מבחן t דו זנבות. הנתונים הוצגו כסטיית התקן הממוצעת (SD) או הממוצע של התוצאות של שניים או שלושה ניסויים בלתי תלויים. הבדלים סטטיסטיים נחשבו מובהקים בערך P<0.05.

תוצאות

טבליות פרוביוטיות הגדילו את אוכלוסיית הביפידובקטריה בחלל הפה

אוכלוסיית Bifidobacterium עלתה ביציבות בחלל הפה לאחר מתן טבליות פרוביוטיות. אוכלוסיות החיידקים לאחר הטיפולים נורמלו על ידי אוכלוסיות חיידקים לפני הטיפולים (שיעור אוכלוסין %=CFU לאחר טיפול/CFU לפני טיפול). בקבוצת הפרוביוטיקה בת-קיימא, שיעור האוכלוסייה עלה באופן משמעותי ל-244.14±164.96% בשבוע 2 (**P<0.01, Fig. 1a) and 438.41±308.58 at Week 4 (***P<0.001), compared to Week 0. The Bifidobacterium population rate remained high at Week 6 (no administration of viable probiotic tablets for 2 weeks after Week 4, 550.16±448.19%, ***P<0.001), compared to Week 0. The Bifidobacterium population number was significantly different between the viable probiotic and placebo groups at Week 6 (**P<0.01). In the heat-killed probiotic group, the Bifidobacterium population was increased at Weeks 2 (149.92±60.47%, **P<0.01) and 4 (199.87±148.64%, *P<0.05), but was decreased at Week 6 after administration of the heat-killed probiotic tablets was stopped for 2 weeks (182.98±163.73%, Fig. 1a).

טבליות פרוביוטיות הגדילו את אוכלוסיית הלקטובצילוס בחלל הפה

השינוי באוכלוסיית ה-Lactobacillus דרך הפה עקב מתן טבליות פרוביוטיות חשף דפוס דומה לזה שאחריו השינוי באוכלוסיית Bifidobacterium דרך הפה. אוכלוסיות החיידקים לאחר הטיפולים נורמלו על ידי אוכלוסיות החיידקים לפני הטיפולים. בקבוצת הפרוביוטיקה בת-קיימא, שיעור אוכלוסיית לקטובצילוס עלה באופן משמעותי ל-447.74±337.89% בשבוע 2 (**P<0.01, Fig. 1b) and 982.27±726.66% at Week 4 (***P<0.001), compared to Week 0. The Lactobacillus population rate was higher at Week 6 (no administration of viable probiotic tablets for 2 weeks after Week 4, 727.57±539.76%, ***P<0.001) than at Week 0. The Lactobacillus population number was significantly different between the viable probiotic and placebo groups at Week 6 (***P<0.001). In the heat-killed probiotic group, the Lactobacillus population was increased at Weeks 2 (256.66±183.78%, **P<0.01) and 4 (312.85 ± 279.71%, *P < 0.05). Additionally, the Lactobacillus number remained but showed no significant difference at Week 6 after the administration of heat-killed probiotics was stopped for 2 weeks (208.00±199.50%, Fig. 1b).

איור 1 א מדידה של אוכלוסיות Bifidobacterium על משטחי רירית הפה. V טבליות פרוביוטיקה קיימא; H טבליות פרוביוטיות מומתות בחום; C טבליות פלצבו (בקרה); וחיידקי חומצת חלב LAB. בוצע איסוף וניתוח של דגימות רוק בשבועות 0, 2, 4 ו-6. הנתונים הוצגו כסטיית התקן הממוצעת (SD). נעשה שימוש במבחן t דו-זנב לניתוח הבדלים סטטיסטיים. מובהקות סטטיסטיות סומנו ב-*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. b Measurement of Lactobacillus populations on the oral mucosal surfaces. V viable probiotic tablets; H heat-killed inactivated probiotic tablets; C placebo tablets (control); and LAB lactic acid bacteria. Collection and analysis of salivary samples at Weeks 0, 2, 4, and 6 were performed. Data were presented as the mean standard deviation (SD). A two-tailed t-test was used to analyze statistical differences. Statistical significances were marked with *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

טבליות פרוביוטיות המכילות AP-32, ET-66 ו-CP-9 העלו משמעותית את ריכוז ה-IgA ברירית הפה

מכיוון שהוכח שצריכת טבליות פרוביוטיות (כדאיות או מומתות בחום) מעלה את רמות הביפידובקטריום והלקטובצילוס בחלל הפה, ניתחנו עוד את השינויים בריכוז IgA ברוק, שהתרחשו עקב ספיגת מוצרים פרוביוטיים. רמות ה-IgA לאחר הטיפולים נורמלו לפי רמות ה-IgA לפני הטיפולים. בקבוצת הפרוביוטיקה הקיימא, ריכוז IgA ברוק עלה מעט ל-103.24 ± 8.10% בשבוע 2 (איור 2) ו-104.81 ± 13.26 בשבוע 4, אך ללא הבדלים מובהקים סטטיסטית. עם זאת, ריכוז ה-IgA ברוק בקבוצת הפרוביוטיקה בת קיימא, בהשוואה לקבוצת הפלצבו, עלה משמעותית ל-119.30 ± 12.63% בשבוע 6 (ללא מתן טבליות פרוביוטיות בר-קיימא במשך שבועיים לאחר שבוע 4), בהשוואה לשבוע 0 ( ***פ<0.001). Furthermore, in the heat-killed probiotic group, the salivary IgA concentration was slightly increased at Weeks 2 (102.51± 7.20%) and 4 (104.35 ± 10.27%). The saliva IgA concentration was increased at Week 6 (116.78 ± 12.28%, ***P < 0.001, Fig. 2), compared to Week 0.

זנים קיימא הגדילו את רמות IL-10 ו-TGF-Beta ב-PBMCs

הבקרה החיובית של 10 µg/ml Phytohaemagglutinin (PHA) העלתה בהצלחה את רמות IL-10 (58.2 ± 7.9 pg/ml, ***P < 0.001, איור 3a) ו-TGF- (53.4±8 pg/ml, ***P<0.001, Fig. 3b) in PBMCs by comparing to the negative control (PBMCs treated with medium only). Viable strains of CP-9, AP-32 and ET-66 signifcantly increased the levels of IL-10 in PBMCs to 84.2±9 pg/ml (***P<0.001, ##P<0.01), 303.1±170.9 pg/ml (*P<0.05, ##P<0.01) and 98.2±17.5 pg/ml (***P<0.01, ##P<0.01), respectively. Symbol *indicated a significant difference by comparing to the medium-treated control; symbol #indicated a significant difference by comparing to the PHA control (Fig. 3a). Besides, viable strains of CP-9, AP-32, and ET-66 significantly increased the levels of TGF-beta in PBMCs to 23.2 ± 4.7 pg/ml (***P < 0.001), 130.9 ± 16 pg/ ml (***P < 0.001, ###P < 0.001) and 31.4 ± 5.5 pg/ml (***P<0.01), respectively (Fig. 3b).

איור 2 ריכוז אימונוגלובולין A (IgA) בדגימות הרוק. V טבליות פרוביוטיקה קיימא; H טבליות פרוביוטיות מומתות בחום; C טבליות פלצבו (בקרה); וחיידקי חומצת חלב LAB. בוצע איסוף וניתוח של דגימות רוק בשבועות 0, 2, 4 ו-6. הנתונים הוצגו כסטיית התקן הממוצעת (SD). נעשה שימוש במבחן t דו-זנב לניתוח הבדלים סטטיסטיים. סטָטִיסטִי

טבליות פרוביוטיות המכילות AP-32, ET-66 ו-CP-9 אסרו את אוכלוסיית S. mutans ברוק

אוכלוסיות מוגברות של Bifidobacterium ו-Lactobacillus ועלייה בריכוז IgA ברוק עשויים לתרום למאבק במיקרואורגניזמים פתוגניים דרך הפה. בניסוי שלאחר מכן, בדקנו את השינוי באוכלוסיית הפתוגן הפתוגן S. mutans עקב התערבות פרוביוטית. אוכלוסיות החיידקים לאחר הטיפולים נורמלו על ידי אוכלוסיות החיידקים לפני הטיפולים. בקבוצת הפרוביוטיקה הקיימא, אוכלוסיית S. mutans הופחתה באופן משמעותי בשבועות 2 (53.55±31.60%, ***P<0.001), 4 (49.60±31.01%, ***P<0.001), and 6 (55.19±42.72%, **P<0.01, Fig. 4). At week 6, S. mutans was significantly inhibited in the viable probiotic group (55.19±42.72%, ***P<0.001), compared to in the placebo group. Furthermore, in the heat-killed probiotic group, the S. mutans population was slightly decreased at Week 2 (85.81±49.87%) and significantly reduced at Week 4 (58.35 ± 33.17%, ***P<0.001). The S. mutans population level in the heat-killed probiotic group (202.81±167.99%) reverted to that in the placebo group (225.05±127.01%) at Week 6 (no administration of heat-killed probiotic tablets for 2 weeks from Week 4) (Fig. 4).

איור 3 זנים קיימא הגדילו את רמות ה-IL-10 ו-TGF-beta ב-PBMCs. רמת ה-IL-10 ו-b TGF-beta ב-PBMCs נבדקו על ידי טיפול בזנים פרוביוטיים. הוספת 5*105 cfu/20 µl זנים קיימא של CP-9, AP-32 ו-ET-66 ל-PMBCs 10 µg/ml. Phytohaemagglutinin (PHA) שימש כביקורת חיובית. הביקורת השלילית הייתה PBMCs שטופלו במדיום RMPI-1640 בלבד. בוצעו בדיקות משולשות. הנתונים הוצגו כסטיית התקן הממוצעת (SD). נעשה שימוש במבחן t דו-זנב לניתוח הבדלים סטטיסטיים. מובהקות סטטיסטית סומנו עם P<0.05, P<0.01, P<0.001. The symbol *indicated a significant difference by comparing to the medium-treated control; symbol #indicated significant difference by comparing to the PHA control

איור 4 מדידה של אוכלוסיות Streptococcus mutans פתוגניות על משטחי רירית הפה. V טבליות פרוביוטיקה קיימא; H טבליות פרוביוטיות מומתות בחום; C טבליות פלצבו (בקרה); וחיידקי חומצת חלב LAB. בוצע איסוף וניתוח של דגימות רוק בשבועות 0, 2, 4 ו-6. הנתונים הוצגו כסטיית התקן הממוצעת (SD). נעשה שימוש במבחן t דו-זנב לניתוח הבדלים סטטיסטיים. מובהקות סטטיסטית סומנו ב-*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

אישור של יכולתן של טבליות פרוביוטיות לעכב את צמיחת פתוגן דרך הפה על ידי בדיקה חוץ גופית

המחקר במבחנה גילה כי טבליות פרוביוטיות בנות קיימא מעכבות באופן משמעותי את שיעור ההישרדות של פתוגנים דרך הפה (איור 5א). אוכלוסיות החיידקים לאחר הטיפולים נורמלו על ידי אוכלוסיות החיידקים לפני הטיפולים. שיעור ההישרדות של S. mutans, P. gingivalis, F. nucleatum ו-A. actinomy cetemcomitans בקבוצת הפרוביוטיקה הקיימא, בהשוואה לקבוצת הפלצבו, ירד ל-4.23% (***P < 0 .001, פלצבו=91%), 8.64% (***P < 0.001, פלצבו=89%), 5.77% (**P<0.01, placebo=98%), and 6.23% (**P<0.01, placebo=87%), respectively. However, the heat-killed probiotic tablet exerted weaker antibacterial effects than the viable probiotic tablet (Fig. 5b). The survival rate of S. mutans, P. gingivalis, F. nucleatum, and A. antinomy cetemcomitans in the heat-killed probiotic group, compared to in the placebo group, was slightly decreased without statistical significance (82%, placebo=91%), significantly reduced to 53% (*P<0.05, placebo=89%), not inhibited (96.88%, placebo=98%), and significantly reduced to 80% (**P<0.01, placebo=87%), respectively.

דִיוּן

בהשוואה לקבוצת הפלצבו, אוכלוסיות הפה של לקטובצילוס וביפידובקטריום יגדלו באופן משמעותי על ידי האכלת טבליות פרוביוטיות בנות קיימא או טבליות פרוביוטיות מומתות בחום למשך 4 שבועות. בנוסף, מספרי ה-Lactobacillus וה-Bifidobacterium נותרו ברמות גבוהות משמעותית במשך שבועיים לאחר השעיית צריכת צריכת פרוביוטיקה בת קיימא (איור 1a ו-b). באופן דומה, Camila Casuccio Almeida et al. הראה כי מתן טיפול פרוביוטי בן ארבעה שבועות יכול להימשך לשפר את הסימפטומים בחולים אי סבילות ללקטוז לפחות 3 חודשים לאחר הפסקת צריכת פרוביוטיקה [23]. עם זאת, יש להעריך את ההשפעה המתמשכת של פרוביוטיקה בטיפול ארוך טווח בעתיד. בנוסף, ריכוז IgA ברוק עלה באופן משמעותי במתן טבליות פרוביוטיות בנות קיימא ומומתות בחום. הן קבוצות פרוביוטיקה שנרצחו בחום והן בנות קיימות העלו את IgA ברוק על ידי מתן טבליות דרך הפה למשך 4 שבועות, אך מבלי להראות הבדל סטטיסטי לפלצבו. ריכוז ה-IgA בקבוצות פרוביוטיות מומתות חום ובעלות קיימא הראה עלייה משמעותית בשבוע 6. עם זאת, יש לחקור את המנגנון של עליית IgA לאחר הפסקת מתן הפרוביוטיקה למשך שבועיים (איור 2) Braathen et al. דיווחו על תוצאות דומות על התפקיד המווסת את מערכת החיסון של זנים פרוביוטיים בחלל הפה [24]. בנוסף, דווח כי זנים פרוביוטיים מגבירים את ריכוז ה-IgA בצואה באופן משמעותי בזרולים וחזרזירים [25]. עם זאת, מחקרים על תסמינים המקלים על IgA בדלקות בדרכי הנשימה העליונות נותרו לא מספיקים. ניתן לחקור את המנגנון המולקולרי המפורט של עיכוב ומניעה של זיהומים בדרכי הנשימה העליונות על ידי זנים פרוביוטיים CP-9, AP-32 ו-ET-66 במחקרים עתידיים. במחקר הנוכחי, זנים ברי קיימא CP-9, AP-32 ו-ET-66 יעלו את רמת ה-IL-10 ו-TFG-beta בתאי PBMC. AP-32 הראה יכולת יעילה בהגדלת IL-10, ו-TFG-beta ב-PBMCs על ידי השוואתם לבקרת PHA חיובית (איור 3a ו-b). היא הניחה שזנים ברי קיימא CP-9, AP-32 ו-ET-66 עשויים לגרום להפרשת תאי B IL-10 ו-TFG-beta כדי להגביר את רמות IgA ברוק. עם זאת, יש לבדוק את המתאם בין IL-10 ברוק, TFG-beta ו-IgA ברוק [26]. חוץ מזה, האם פרוביוטיקה שהומתה בחום העלתה את ה-IgA באמצעות השראת IL-10 ו-TFG-beta עדיין לא ברורה. בדיקה חוץ גופית הראתה ש-AP-32 שהומת בחום מקדם הפרשת אינטרפרון ו-IL-12p70 והוריד את רמות IL-13 [27]. לפיכך, במחקר קליני זה, היכולת של זני CP-9, AP-32, AP-66 ו-ET-66 פרוביוטיים ו-AP-32 ו-ET שהומתו בחום-66 זנים לעיכוב חיידקים פתוגניים בחלל הפה עברו תוקף נוסף (איור 4). לכסניות פרוביוטיות קיימא הציגו יכולת אנטי-פתוגנית טובה יותר מאשר לכסניות המומתות בחום באמצעות הפרשת חומצות אורגניות, פפטידים אנטי-מיקרוביאליים [28], אקסופוליסכרידים (EPSs) [29] בקטריוצינים [30] (איור 5a ו-b). הרכיבים האנטי-מיקרוביאליים הפונקציונליים המיוצרים על ידי זנים פרוביוטיים ברי קיימא צריכים להתגלות על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) וכרומטוגרפיה נוזלית (LC)-ספקטרומטריית מסה בעתיד [31]. דווח כי לפרוביוטיקה המומתת בחום היו יתרונות מרכזיים של פרוביוטיקה בת קיימא, אך ללא חששות בטיחות מסוימים של זני פרוביוטיקה ברי קיימא [32]. עם זאת, יש לאמת עוד יותר את הרכיבים האנטי-מיקרוביאליים של פרוביוטיקה מומתת בחום.

איור 5 אישור ליכולת של טבליות פרוביוטיות לעכב את צמיחת הפתוגן דרך הפה על ידי בדיקה חוץ גופית. אומתה היכולת של טבליות פרוביוטיות בנות קיימא ומומתות בחום לעכב את שיעור ההישרדות של פתוגנים דרך הפה, כולל Streptococcus mutans, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum ו-Aggregatibacter actinomycetemcomitans. קבוצה ריקה, בינונית בלבד; קבוצת פלצבו, טבליות (1 גרם) ללא כל רכיבים פרוביוטיים. בוצעו בדיקות משולשות. הנתונים הוצגו כסטיית התקן הממוצעת (SD). נעשה שימוש במבחן t דו-זנב לניתוח הבדלים סטטיסטיים. מובהקות סטטיסטית סומנו ב-*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

סיכום

טבליות פרוביוטיות מעורבות בת קיימא, המורכבות מ-L. salivarius subsp. salicinius AP-32, B. animalis subsp. לקטי CP-9, ו-L. paracasei ET-66, ופרוביוטיקה מומתת בחום, כולל L. salivarius subsp. salicinius AP-32 ו-L. paracasei ET-66, הפעילו את תפקידיהם המועילים על ידי העלאת אוכלוסיות הפה של Lactobacillus ו-Bifdobacterium, הפחתת S. mutans בחלל הפה והעלאת ריכוז IgA ברוק במשתתפים בריאים. תוצאות בדיקות חוץ גופיות אימתו כי פרוביוטיקה בת קיימא מעכבת ביעילות פתוגנים דרך הפה, כולל S. mutans, P. gingivalis ו-F. nucleatum subsp. פולימורפיזם, ו-A. actinomycetemcomitans. חסינות רירית הפה-אף היא ההגנה הקדמית מפני מיקרואורגניזמים פולשים, וזה הפך לנושא מכריע. לפיכך, מחקר זה יציע אסטרטגיה חלופית (תוספת פרוביוטיקה) לשמירה על חסינות הפה ובריאות הפה.

יתרונות תוסף cistanche-איך לחזק את המערכת החיסונית

הפניות

1. Takaki H, Ichimiya S, Matsumoto M, Seya T (2018) תגובה חיסונית של הרירית ברקמה לימפואידית הקשורה באף לאחר מתן תוך-אף על ידי אדג'ובנטים. J Innate Immun 10(5–6):515–521

2. Wu RQ, Zhang DF, Tu E, Chen QM, Chen WJ (2014) מערכת החיסון הרירית בחלל הפה - תזמורת של מגוון תאי T. Int J Oral Sci 6(3):125–132

3. Man WH, de Steenhuijsen Piters WAA, Bogaert D (2017) המיקרוביוטה של ​​דרכי הנשימה: שומר סף לבריאות הנשימה. Nat Rev Microbiol 15(5):259–270

4. Wald ER, Guerra N, Byers C (1991) זיהומים בדרכי הנשימה העליונות בילדים צעירים: משך ותדירות של סיבוכים. רפואת ילדים 87(2):129–133

5. Marcotte H, Lavoie MC (1998) אקולוגיה מיקרוביאלית אוראלית ותפקידו של אימונוגלובולין ברוק A. Microbiol Mol Biol Rev 62(1):71-109

6. Weltzin R, Traina-Dorge V, Soike K, Zhang JY, Mack P, Soman G et al (1996) נוגדן IgA מונוקלוני תוך-נאלי לנגיף סינציאלי נשימה מגן על קופי רזוס מפני זיהום בדרכי הנשימה העליונות והתחתונה. J Infect Dis 174(2):256–261

7. Ruggeri FM, Johansen K, Basile G, Kraehenbuhl JP, Svensson L (1998) Antirotavirus immunoglobulin A מנטרל וירוס במבחנה לאחר טרנסציטוזיס דרך תאי אפיתל ומגן על עכברי תינוקות משלשולים. J virol 72(4):2708–2714

8. Millet N, Solis NV, Swidergall M (2020) Mucosal IgA מונע קנדידה אלביקנס דיסביוזיס commensal בחלל הפה. פרונט אימונול 11:2448

9. Katz J, Harmon CC, Buckner GP, Richardson GJ, Russell MW, Michalek SM (1993) תגובות אימונוגלובולין A של רוק מגן נגד זיהום Streptococcus mutans לאחר חיסון תוך-אף עם אנטיגן S. mutans I/II בצימוד לתת-יחידה B של רעלן כולרה . Infect Immun 61(5):1964–1971

10. Moutsopoulos NM, Konkel JE (2018) חסינות ספציפית לרקמות במחסום רירית הפה. מגמות Immunol 39(4):276–287

11. Lin CW, Chen YT, Ho HH, Hsieh PS, Kuo YW, Lin JH, Liu CR, Huang YF, Chen CW, Hsu CH, Lin WY, Yang SF (2021) לוזינגינים עם זנים פרוביוטיים משפרים את התגובה החיסונית והבריאות של הפה . Oral Dis. https://doi.org/10.1111/odi.13854

12. Ericson D, Hamberg K, Bratthall G, Sinkiewicz-Enggren G, Ljunggren L (2013) תגובת IgA של רוק לחיידקים פרוביוטיים ו-mutans streptococci לאחר שימוש במסטיק המכיל Lactobacillus reuteri. פאתוג דיס 68(3):82–87

13. Defrance T, Vanbervliet B, Briere F, Durand I, Rousset F, Banchereau J (1992) Interleukin 10 ו-Transforming growth factor beta משתפים פעולה כדי לגרום לתאי B אנושיים נאיביים40-שפעלו נגד CD להפריש אימונוגלובולין A. J Exp Med 175(3):671–682

14. Papone V, Verolo C, Zafaroni L, Batlle A, Capo C, Bueno L et al (2015) איתור ושכיחות של פתוגנים חניכיים באוכלוסיה אורוגוואית עם דלקת חניכיים כרונית באמצעות מתודולוגיה ומטאנומיה קונבנציונלית. Odontoestomatologia 17(25):23–32

15. Butera A, Gallo S, Maiorani C, Molino D, Chiesa A, Preda C, Scribante A (2021) חלופה פרוביוטית לכלורהקסידין בטיפול חניכיים: הערכת פרמטרים קליניים ומיקרוביולוגיים. מיקרואורגניזמים 9(1):69

16. Wang Y, Li X, Ge T, Xiao Y, Liao Y, Cui Y et al (2016) פרוביוטיקה למניעה וטיפול בדלקות בדרכי הנשימה בילדים: סקירה שיטתית ומטה-אנליזה של מחקרים אקראיים מבוקרים. רפואה 95(31): e4509. https://doi.org/10.1097/ MD.0000000000004509

17. Laufer AS, Metlay JP, Gent JF, Fennie KP, Kong Y, Pettigrew MM (2011) קהילות מיקרוביאליות של דרכי הנשימה העליונות ודלקת אוזן תיכונה בילדים. mBio 2(1):e00245-10. https://doi.org/10. 1128/mBio.00245-10

18. Chen YT, Hsieh PS, Ho HH, Hsieh SH, Kuo YW, Yang SF, Lin CW (2020) פעילות אנטיבקטריאלית של זנים פרוביוטיים קיימא ומומתים בחום כנגד פתוגנים דרך הפה. Lett Appl Microbiol 70(4):310–317

19. Bonifait L, Chandad F, Grenier D (2009) פרוביוטיקה לבריאות הפה: מיתוס או מציאות? J Can Dent Assoc 75(8):585–90

20. Hsieh PS, An Y, Tsai YC, Chen YC, Chuang CJ, Zeng CT, King AE (2013) פוטנציאל של זנים פרוביוטיים לווסת את התגובות הדלקתיות של תאי אפיתל ותאי חיסון במבחנה. New Microbiol 36(2):167–179

21. Elrefaei M, Burke CM, Baker CA, Jones NG, Bousheri S, Bangsberg DR, Cao H (2009) ייצור TGF- ו-IL-10 על ידי תאי T מסוג HIV ספציפיים CD8+ מוסדר על ידי CTLA{ איתות {5}} בתאי T4+ בתקליטור. PloS ONE 4(12):e8194

22. Ranganathan V, Akhila CH (2019) Streptococcus mutans: האם זה הפך להיות גורם ראשי לביטויים אוראליים? J Microbiol Exp 7(4):207–213

23. Almeida CC, Lorena SLS, Pavan CR, Akasaka HMI, Mesquita MA (2012) השפעות מועילות של צריכה ארוכת טווח של שילוב פרוביוטי של Lactobacillus casei Shirota ו-Bifidobacterium breve Yakult עשויות להימשך לאחר הפסקת הטיפול בחולים עם אי סבילות ללקטוז. Nutr Clin Practice 27(2):247–251

24. Braathen G, Ingildsen V, Twetman S, Ericson D, Jørgensen MR (2017) נוכחות של Lactobacillus reuteri ברוק עולה בקנה אחד עם IgA רוק גבוה יותר במבוגרים צעירים לאחר צריכת לכסניות פרוביוטיות. Benef Microbes 8(1):17–22

25. Scharek L, Guth J, Filter M, Schmidt MFG (2007) השפעת החיידקים הפרוביוטיים Enterococcus faecium NCIMB 10415 (SF68) ו-Bacillus cereus var. אליך NCIMB 40112 על פיתוח IgG בסרום ו-IgA צואה של זרולים והחזרזירים שלהן. Arch Anim Nutr 61(4):223–234

26. Ebrahimpour-Kujan S, Milajerdi A, Larijani B, Esmaillzadeh A (2020) השפעות של פרוביוטיקה על ציטוקינים ברוק ואימונוגלובולינים: סקירה שיטתית ומטה-אנליזה על ניסויים קליניים. Sci Rep 10(1):1–11

27. Ou CC, Lin SL, Tsai JJ, Lin MY (2011) חיידקי חומצת חלב שנרצחו בחום משפרים את הפוטנציאל האימונומודולטורי על ידי הטיית התגובה החיסונית לכיוון קיטוב Th1. J Food Sci 76(5):M260–M267. https://doi.org/10.1111/j.1750-3841.2011. 02161.x

28. Nair MS, Amalaradjou MA, Venkitanarayanan K (2017) תכונות אנטי-וירוסיות של פרוביוטיקה במאבק בפתוגנזה של חיידקים. עו"ד Appl Microbiol 98:1–29

29. Wu MH, Pan TM, Wu YJ, Chang SJ, Chang MS, Hu CY (2010) פעילויות אקסופוליסכריד מ-bifidobacterium פרוביוטי: השפעות אימונומודולטוריות (על מקרופאגים J774A. 1) ותכונות אנטי-מיקרוביאליות. Int J Food Microbiol 144(1):104–110

30. Barefoot SF, Klaenhammer TR (1983) איתור ופעילות של לקטצין B, בקטריוצין המיוצר על ידי Lactobacillus acidophilus. Appl Environ Microbiol 45(6):1808–1815

31. Kim PI, Sohng JK, Sung C, Joo HS, Kim EM, Yamaguchi T, Kim BG (2010) אפיון וזיהוי מבנה של פפטיד אנטי-מיקרוביאלי, הומינין, המיוצר על ידי Staphylococcus hominis MBBL 2-9. Biochem Biophys Res Commun 399(2):133–138

32. Piqué N, Berlanga M, Minana-Galbis D (2019) יתרונות בריאותיים של פרוביוטיקה מומתת בחום (Tyndallized): סקירה כללית. Int J Mol Sci 20(10):2534