חיסונים מעוררים חסינות סלולרית תגובתית מאוד ל-SARS-CoV-2 Omicron Variant

איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

Jinyan Liu1*, Abishek Chandrashekar1*, Daniel Sellers1*, Julia Barrett1, Michelle Lifton1, Katherine McMahan1, Michaela Sciacca1,

היילי VanWyk1, Cindy Wu1, Jingyou Yu1, Ai-ris Y. Collier1, Dan H. Barouch1,2*

1 בית ישראל דיאקונס המרכז הרפואי, בוסטון, MA, ארה"ב;

2 Ragon Institute of MGH, MIT והרווארד, קיימברידג', MA, ארה"ב

הוכח כי וריאנט ה-SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) שעבר מוטציה גבוהה מתחמקת מחלק ניכר של תגובות נוגדנים מנטרלות שנוצרו על ידי חיסונים נוכחיים המקודדים ל-WA1/2020 Spike immunogen1, וכתוצאה מכך גידול בזיהומים פורצי דרך. והפחתת יעילות החיסון. תגובות חיסוניות סלולריות, במיוחד תגובות CD8 פלוס תאי T, הן ככל הנראה קריטיות להגנה מפני מחלת SARS-CoV-2 חמורה2-6. כאן אנו מראים שחסינות תאית הנגרמת על ידי חיסוני SARS-CoV-2 הנוכחיים היא מאוד תגובתית נגד וריאנט SARS-CoV-2 Omicron. אנשים שקיבלו חיסונים Ad26.COV2.S או BNT162b2 הפגינו תגובות עמידות של תאי CD8 פלוס ו-CD4 פלוס T שהראו תגובתיות צולבת נרחבת כנגד שני הוריאנטים Delta ו-Omicron, כולל בתת-אוכלוסיות תאי זיכרון מרכזי ואפקטור. חציון תגובות CD8 פלוס תאי T ספציפיות לאומיקרון היו 82-84 אחוזים מתגובות WA1/2020-ספציפיות CD8 פלוס תאי T. נתונים אלה מצביעים על כך שחיסונים נוכחיים עשויים לספק הגנה ניכרת מפני מחלות קשות עם וריאנט SARS-CoV-2 Omicron למרות הפחתה משמעותית של תגובות נוגדנים מנטרלים.

יתרונות בריאותיים של cistanche: שיפור חסינות

מחקרים אחרונים הראו כי נוגדנים מנטרלים מעוררי חיסון (NAbs) מופחתים במידה ניכרת לגרסה ה-SARS-CoV-2 Omicron בעלת מוטציה גבוהה, וכתוצאה מכך להתפשטות הגלובלית המהירה, כולל זיהומים פורצי דרך אצל אנשים מחוסנים לחלוטין1. כדי להעריך את התגובתיות ההדדית של תגובות חיסוניות תאיות מעוררות חיסון כנגד וריאנט SARS-CoV-2 Omicron, הערכנו תגובות CD8 פלוס ו-CD4 פלוס תאי T ב-51 אנשים שחוסנו עם Ad26 מבוסס וקטור אדנוווירוס. חיסון COV2.S7 (Johnson & Johnson; N=20) או חיסון BNT162b2 מבוסס mRNA8 (Pfizer; N=31).

לאחר חיסון BNT162b2, ראינו תגובות גבוהות של WA1/2020-NAb ספציפיות בחודש 1, ואחריה ירידה חדה עד חודש 8, כצפוי9,10 (איור 1a). לאחר חיסון Ad26.COV2.S, היו תגובות WA1/2020-NAb ספציפיות נמוכות יותר באופן ראשוני בחודש 1, אך תגובות אלו היו עמידות יותר ונמשכו בחודשים 89,11 (איור 1a). עם זאת, נצפו מינימליות של NAbs ספציפיים ל-Omicron עם תגובתיות צולבת עבור שני החיסונים (איור 1a), בהתאם לנתונים עדכניים בהיעדר חיזוק נוסף1. תגובות נוגדנים מחייבים ספציפיים לתחום הקולטנים (RBD) הוערכו על ידי ELISA והראו מגמות דומות, עם נוגדנים קושרים ספציפיים ל-Omicron-הצלבה מינימלית (איור 1b). בניגוד לתגובות נוגדנים, תגובות חיסוניות תאיות ספציפיות לספייק הוערכו על ידי מבחני IFN-g ELISPOT של פפטיד מאוחד הראו תגובתיות צולבת משמעותית לאומיקרון (נתונים מורחבים איור 1). בשלב הבא הערכנו תגובות של תאי CD8 פלוס ו-CD4 פלוס ספציפיים ל-Spike על ידי מבחני צביעת ציטוקינים תוך-תאיים. Ad26.COV2.S גרם לחציון תגובות IFN-g CD8 בתוספת תאי T של 0.061 אחוז, 0.062 אחוז, 0.0 72}}.051 אחוזים מול WA1/2020, דלתא ואומיקרון, בהתאמה, בחודש 8 לאחר החיסון (איור 2א). BNT162b2 גרם לחציון תגובות IFN-g CD8 של תאי T בתוספת ספציפית ל-Spike של 0.028 אחוז ו-0.023 אחוז כנגד WA1/2020 ואומיקרון, בהתאמה, בחודש 8 לאחר החיסון (איור 2א). נתונים אלו מצביעים על כך שתגובות CD8 פלוס T ספציפיות ל-Omicron היו 82-84 אחוזים בתגובות צולבות עם תגובות WA1/2020-ספציפיות של CD8 פלוס תאי T. תגובות IFN-g CD4 פלוס T ספציפיות ל-IFN-g שהופקו על ידי Ad26.COV2.S היו חציון של 0.026 אחוז, 0.030 אחוז ו-0.029 אחוז מול WA1/2020, דלתא ואומיקרון, בהתאמה, ולפי BNT162b2 היו חציון של 0.033 אחוז ו-0.027 אחוזים מול WA1/2020 ואומיקרון, בהתאמה, מה שמצביע על תגובתיות צולבת משמעותית של תגובות תאי CD4 פלוס T גם כן (איור 2ב). תגובתיות צולבת מהותית של Omicron נצפתה גם עבור TNF-a ו-IL-2 ספציפיים ל-Spike המפרישים תגובות CD8 פלוס ו-CD4 פלוס תאי T (תמונה מורחבת).

ניתוח רגרסיה ליניארי הראה שתגובות CD8 פלוס T ספציפיות לאומיקרון נמצאות בקורלציה עם תגובות WA1/2020-ספציפיות CD8 פלוס תאי T עבור החיסון Ad26.COV2.S עבור שתי נקודות הזמן (R=0.78, P<0.0001, slope="" 0.75)="" and="" the="" bnt162b2="" vaccine="" (r="0.56,"><0.0001, slope="" 0.81),="" although="" two="" individuals="" had="" undetectable="" omicron-specific="" cd8+="" t="" cell="" responses="" following="" bnt162b2="" vaccination="" (fig.="" 3a).="" similarly,="" omicron-specific="" cd4+="" t="" cell="" responses="" correlated="" with="" wa1/2020-specific="" cd4+="" t="" cell="" responses="" for="" both="" the="" ad26.cov2.s="" vaccine="" (r="0.79,"><0.0001, slope="" 0.83)="" and="" the="" bnt162b2="" vaccine="" (r="0.90,"><0.0001, slope="" 0.88)="" (fig.3b).="" spike-specific="" ifn-g="" cd8+="" and="" cd4+="" t="" cell="" central="" memory="" and="" effector="" memory="" subpopulations="" elicited="" by="" ad26.cov2.s="" also="" showed="" extensive="" cross-reactivity="" to="" delta="" and="" omicron.="" at="" month="" 8,="" cd8+="" central="" memory="" responses="" were="" 0.076%,="" 0.054%,="" and="" 0.075%,="" cd8+="" effector="" memory="" responses="" were="" 0.168%,="" 0.143%,="" and="" 0.146%,="" cd4+="" central="" memory="" responses="" were="" 0.030%,="" 0.035%,="" and="" 0.038%,="" and="" cd4+="" effector="" memory="" responses="" were="" 0.102%,="" 0.094%,="" and="" 0.083%,="" against="" wa1/202,="" delta,="" and="" omicron,="" respectively="" (fig.="">

הנתונים שלנו מוכיחים ש-Ad26.COV2.S ו-BNT162b2 מעוררים חסינות תאית צולבת באופן רחב נגד גרסאות SARS-CoV-2 כולל Omicron. העקביות של תצפיות אלה על פני שתי טכנולוגיות שונות של פלטפורמת חיסון (וקטור ויראלי ו-mRNA) מרמזת על יכולת ההכללה של ממצאים אלה. התגובתיות ההצלבה הנרחבת של תגובת CD8 פלוס ו-CD4 פלוס ספציפית לאומיקרון עומדת בניגוד חד לתגובות הנטרול והקושר הספציפי לאומיקרון. נתונים אלה עולים בקנה אחד עם מחקרים קודמים שהראו תגובתיות צולבת גדולה יותר של תגובות חיסוניות תאיות מעוררות חיסון בהשוואה לתגובות חיסוניות הומורליות כנגד גרסאות SARS-CoV-2 אלפא, בטא וגמא12. 82-84 אחוז התגובתיות ההדדית של תגובת תאי CD8 פלוס T לאומיקרון עולה בקנה אחד עם תחזיות תיאורטיות המבוססות על מוטציות Omicron6.

מחקרים פרה-קליניים הראו שתאי CD8 פלוס T תורמים להגנה מפני SARS-CoV-2 ב-rhesus macaques, במיוחד כאשר תגובות הנוגדנים אינן אופטימליות5. תגובות עמידות של תאי T CD8 פלוס ו-CD4 פלוס דווחו גם לאחר זיהום וחיסונים2- 4,6,9,11,13,14. בהתחשב בתפקידם של תאי CD8 פלוס T בפינוי זיהומים ויראליים, סביר להניח שחסינות תאית תורמת באופן משמעותי להגנה על חיסון מפני מחלת SARS-CoV-2 חמורה. זה עשוי להיות רלוונטי במיוחד עבור Omicron, אשר מתחמק מחלק ניכר מתגובות הנוגדנים. הנתונים שלנו מצביעים על כך שהחיסונים הנוכחיים עשויים לספק הגנה משמעותית מפני מחלות קשות עקב וריאנט SARS-CoV-2 Omicron למרות מופחתת תגובות נוגדנים מנטרלים והגברת זיהומים פורצי דרך.

אבקת cistanche

שיטות

אוכלוסיית המחקר

דגימות מאנשים שקיבלו את החיסון BNT162b2 התקבלו מהמאגר הביולוגי של דגימות בית ישראל Deaconess Medical Center (BIDMC). דגימות מאנשים שקיבלו Ad26.COV2.S התקבלו ממחקר COV1001 (NCT04436276). שני המחקרים אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של BIDMC. כל המשתתפים סיפקו הסכמה מדעת. אנשים לא נכללו במחקר זה אם היו להם היסטוריה של זיהומי SARS-CoV- 2, קיבלו חיסונים אחרים ל-COVID-19 או קיבלו תרופות מדכאות חיסון. בדיקת נוגדנים מנטרלת פסאודו-וירוס

נגיפי ה-SARS-CoV-2 המבטאים גן מדווח לוציפראז שימשו למדידת נוגדנים מנטרלי פסאודו-וירוס. בקצרה, האריזה בונה psPAX2 (תוכנית משאבים וריאגנטים לאיידס), פלסמיד מדווח לוציפראז pLentiCMV Puro-Luc (Addgene), ו-pcDNA3 המביע חלבון ספייק.1-SARS-CoV-2 SΔCT היו ביחד הועבר לתאי HEK293T (ATCC CRL_3216) עם lipofectamine 2000 (ThermoFisher Scientific). פסאודו-וירוסים של גרסאות SARS-CoV-2 נוצרו באמצעות זן WA1/2020 (Wuhan/WIV04/2019, מזהה גיוס GISAID: EPI_ISL_402124), וריאנט B.1.1.7 (אלפא, מזהה גישה ל-GISAID: EPI_ISL_601443), וריאנט B.1.351 (ביטא, מזהה גישה ל-GISAID: EPI_ISL_712096), B.1.617. 2 (דלתא, מזהה גיוס GISAID: EPI_ISL_2020950), או B.1.1.529 (Omicron, ID GISAID: EPI_ISL_7358094.2). הסופרנטנטים המכילים את הנגיפים הפסבדוטייפ נאספו 48 שעות לאחר ההעברה; וירוסים פסאודוטיפיים טוהרו על ידי סינון עם מסנן 0.45-מיקרומטר. כדי לקבוע את פעילות הנטרול של סרום אנושי, זרעו תאי HEK293T-hACE2 ב96-צלחות של תרבית רקמה בבאר בצפיפות של 1.75 × 104 תאים לבאר למשך הלילה. הוכנו דילולים סדרתיים פי שלושה של דגימות סרום מושבתות בחום ועורבבו עם 50 ul של פסאודו-וירוס. התערובת הודגרה ב-37 מעלות למשך שעה אחת לפני הוספה לתאי HEK293T-hACE2. לאחר 48 שעות, תאים חולקו ב-Steady-Glo Luciferase Assay (Promega) בהתאם להוראות היצרן. טיטר הנטרול של SARS-CoV-2 הוגדרו כדילול הדגימה שבו נצפתה הפחתה של 50 אחוז (NT50) ביחידות האור היחסיות ביחס לממוצע של בארות בקרת הנגיף.

בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA)

נוגדנים מחייבים ספציפיים ל-SARS-CoV-2 בנסיוב הוערכו באמצעות ELISA. 96-צלחות הבאר צפו ב-2 ug/mL של SARS-CoV-2 WA1/2020, B.1.617.2 (Delta), B.1.351 (Beta), או B.1.1.529 (Omicron) חלבון RBD ב-1× Dulbecco פוספט-buffered saltine (DPBS) והודגרה ב-4 מעלות למשך הלילה. לאחר הדגירה, הצלחות נשטפו פעם אחת עם חיץ כביסה (0.05 אחוז Tween 20 ב-1× DPBS) ונחסמו עם 350 μL של תמיסת בלוק קזאין לכל באר למשך 2 עד 3 שעות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, תמיסת בלוקים נזרקה והצלחות נסגרו יבשות. דילולים סדרתיים של סרום מושבת בחום מדולל בגוש קזאין נוספו לבארות, והצלחות הודגרו במשך שעה בטמפרטורת החדר, לפני 3 שטיפות נוספות ודגירה של 1-שעות עם דילול 1:4000 של אנטי- פרוקסידאז חזרת IgG אנושי (HRP) (Invitrogen, ThermoFisher Scientific) בטמפרטורת החדר בחושך. הצלחות נשטפו 3 פעמים, ולכל באר נוספו 100 μL של תמיסת SeraCare KPL TMB SureBlue Start; פיתוח הצלחת הופסק על ידי הוספת 100 μL של תמיסת SeraCare KPL TMB Stop לכל באר. הספיגה ב-450 ננומטר, עם התייחסות ב-650 ננומטר, תועדה עם קורא מיקרו-צלחות VersaMax (התקנים מולקולריים). עבור כל דגימה, טיטר נקודת הקצה של ELISA חושב באמצעות 4-התאמת עקומה לוגיסטית של פרמטר כדי לחשב את דילול הסרום ההדדי שמניב ערך ספיגה מתוקן (450 ננומטר -650 ננומטר) של 0.2. דווח על טיטרי נקודת קצה משולבים.

תמצית cistanche deserticola: שיפור חסינות

בדיקת נקודת אימונו מקושרת אנזים (ELISPOT).

צלחות ELISPOT צופו בנוגדנים חד שבטיים אנטי-אנושיים מסוג IFN מבית MabTech ב-1 מיקרוגרם/באר והודגרו למשך הלילה ב-4 מעלות. צלחות נשטפו עם DPBS ונחסמו עם מדיה R10 (RPMI עם 10 אחוז FBS מושבת בחום עם 1 אחוז של 100x פניצילין-סטרפטומיצין, 1M HEPES, 100mM Sodium pyruvate, 200mM L-Glutamine ו-0.5mM אחוזים של 2-Mercaptoethanol) למשך 2-4 שעות ב-37 מעלות . הוכנו פפטידים S מאוחדים של SARS-CoV-2 מ-SARS-CoV-2 WA1/2020, B.1.617.2 (Delta), או B.1.1.529 (Omicron) (ביוכימיקלים של המאה ה-21) מצופה בריכוז של 2 מיקרוגרם/באר, ונוספו לצלחת 100,000 תאים/באר. הפפטידים והתאים הודגרו למשך 15-20 שעות ב-37 מעלות. כל השלבים לאחר דגירה זו בוצעו בטמפרטורת החדר. הצלחות נשטפו עם חיץ כביסה ELISPOT והודגרו למשך 2-4 שעות עם נוגדן מונוקלונלי IFN-Monoclonal של עכבר Biotinylated מ-MabTech (1 מיקרוגרם/מ"ל). הצלחות נשטפו פעם שנייה והודגרו במשך 2-3 שעות עם אנטי-ביוטין עז מצומד מ-Rockland, Inc. (1.33 מיקרוגרם/מ"ל). לאחר הכביסה הסופית הוספת תמיסת מצע Nitor-blue Tetrazolium Chloride/5-Bromo-4-chloro 3 'indolyl phosphate p-toluidine salt (NBT/BCIP chromagen) במשך 7 דקות. הכרומגן הושלך והצלחות נשטפו במים ויובשו במקום אפלולי למשך 24 שעות. הצלחות נסרקו ונספרו ב- Cellular Technologies Limited Immunospot Analyzer.

בדיקת צביעת ציטוקינים תוך תאית (ICS).

תגובת תאי T CD4 פלוס ו-CD8 פלוס נכונו על ידי מבחני צביעת ציטוקינים תוך-תאיים (ICS) מאוחדים. בריכות פפטידים הכילו 15 פפטידים של חומצות אמינו החופפות על ידי 11 חומצות אמינו המשתרעות על ה-SARS-CoV-2 WA1/2020, B.1.617.2 (Delta), או B.1.1 .529 (Omicron) חלבוני ספייק (ביוכימיקלים של המאה ה-21). 106 תאים חד-גרעיניים בדם היקפי הושעו מחדש ב-100 µL של מדיה R10 בתוספת נוגדן חד-שבטי CD49d (1 מיקרוגרם/מ"ל) ונוגדן חד-שבטי CD28 (1 מיקרוגרם/מ"ל). כל דגימה הוערכה עם מדומה (100 μL של R10 בתוספת 0.5 אחוז DMSO; בקרת רקע), פפטידים (2 μg/mL), ו/או 10 pg/mL phorbol myristat acetate (PMA) ו- 1 μg/ml ionomycin (Sigma- Aldrich) (100 µL; בקרה חיובית) והודגר ב-37 מעלות למשך שעה אחת. לאחר הדגירה, 0.25 μL של GolgiStop ו-0.25 μL של GolgiPlug ב-50 μL של R10 נוספו לכל באר והודגרו ב-37 מעלות למשך 8 שעות ולאחר מכן הוחזקו ב-4 מעלות למשך הלילה. למחרת, התאים נשטפו פעמיים עם DPBS, נצבעו בצבע אקווה חי/מת למשך 10 דקות ולאחר מכן נצבעו בטיטרים שנקבעו מראש של נוגדנים חד שבטיים נגד CD279 (שיבוט EH12.1, BB700), CD4 (שיבוט L200, BV711), CD27 (שיבוט M-T271, BUV563), CD8 (שיבוט SK1, BUV805), CD45RA (שיבוט 5H9, APC H7) למשך 30 דקות. לאחר מכן התאים נשטפו פעמיים עם חיץ FBS/DPBS של 2 אחוזים והודגרו במשך 15 דקות עם 200 μL של BD CytoFix/CytoPerm Fixation/Permeabilization תמיסה. תאים נשטפו פעמיים עם חיץ 1X Perm Wash (BD Perm/WashTM Buffer 10X בערכת CytoFix/CytoPerm Fixation/Permeabilization מדולל במים MilliQ ועברו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר) והוצבעו תוך-תאי עם נוגדנים חד שבטיים נגד IFN- (; BUV395), ו-CD3 (שיבוט SP34.2, Alexa 700), למשך 30 דקות. התאים נשטפו פעמיים עם חיץ 1X Perm Wash וקובעו עם 250 µL של פורמלדהיד טרי שהוכן 1.5 אחוז. תאים קבועים הועברו לצלחת 96-תחתונה עגולה היטב ונותחו על ידי מערכת BD FACSymphony™. הנתונים נותחו באמצעות FlowJo v9.9.

תוסף cistanche:לשפר חסינות

הפניות

1. Cele S, Jackson L, Khan K, et al. ל-SARS-CoV-2 לאומיקרון יש בריחה נרחבת אך לא מלאה של Pfizer BNT162b2 גרם לנטרול ודורש ACE2 לזיהום. medRxiv 2021.

2. Dan JM, Mateus J, Kato Y, et al. זיכרון אימונולוגי ל-SARS-CoV-2 הוערך עד 8 חודשים לאחר ההדבקה. מדע 2021;371.

3. סט A, Crotty S. חסינות מסתגלת ל-SARS-CoV-2 ו-COVID-19. תא 2021;184:861-80.

4. Goel RR, Painter MM, Apostolidis SA, et al. חיסוני mRNA מעוררים זיכרון חיסוני עמיד ל-SARS-CoV-2 וגרסאות של דאגה. מדע 2021;374:abm0829.

5. McMahan K, Yu J, Mercado NB, et al. קורלציות של הגנה מפני SARS-CoV-2 במקוקי רזוס. Nature 2021;590:630-4.

6. Grifoni A, Weiskopf D, Ramirez SI, et al. יעדים של תגובות של תאי T ל-SARS-CoV-2 וירוס קורונה בבני אדם עם מחלת COVID-19 ואנשים לא נחשפים. Cell 2020;181:1489-501 e15.

7. Sadoff J, Grey G, Vandebosch A, et al. בטיחות ויעילות של חיסון Ad26.COV2.S במינון יחיד נגד קוביד-19. N Engl J Med 2021;384:2187-201.

8. Polack FP, Thomas SJ, Kitchin N, et al. בטיחות ויעילות של חיסון BNT162b2 mRNA Covid-19. N Engl J Med 2020.

9. Collier AY, Yu J, McMahan K, et al. קינטיקה דיפרנציאלית של תגובות חיסון הנגרמות על ידי חיסוני Covid-19. N Engl J Med 2021;385:2010-2.

10. Falsey AR, Frenck RW, Jr., Walsh EE, et al. נטרול SARS-CoV-2 עם BNT162b2 Vaccine Dose 3. N Engl J Med 2021.

11. Barouch DH, Stephenson KE, Sadoff J, et al. תגובות חיסוניות הומורליות ותאיות עמידות 8 חודשים לאחר חיסון Ad26.COV2.S. N Engl J Med 2021;385:951-3.

12. Alter G, Yu J, Liu J, et al. אימונוגניות של חיסון Ad26.COV2.S נגד גרסאות SARS-CoV-2 בבני אדם. Nature 2021;596:268-72.

13. Poon MML, Rybkina K, Kato Y, et al. זיהום SARS-CoV-2 מייצר זיכרון אימונולוגי הממוקם רקמות בבני אדם. אימונולוגיה מדע 2021;6:eabl9105.

14. Vidal SJ, Collier AY, Yu J, et al. מתאמים של נטרול כנגד SARS-CoV-2 וריאנטים של דאגה על ידי Sera Pandemic Early. J Virol 2021;95:e0040421.

היתרון של תוסף cistanche:לשפר חסינות