קביעה מבנית NMR חד-משמעית של (פלוס)-קטצ'ין-מוצרי תגובה דימריים של לקקאזה כסמנים פוטנציאליים של חמצון ענבים ויין

לפרטים נוספים צרו קשר עם:tina.xiang@wecistanche.com

תַקצִיר:( פלוס )-קטצ'ין-לקקאזחִמצוּןסטנדרטים דימריים עברו סינתזה של Hemi באמצעות Laccase מבית Trametes Versicolor הוא תמיסת מים-אתנול ב-pH 3.6. זוהו שמונה חלקים התואמים לשמונה מוצרים דימריים פוטנציאליים של חמצון. פרופילי השברים הושוו עם פרופילים שהתקבלו עם שני אוקסדורודקטאזים אחרים:פוליפנול אוקסידאזמופק מענבים ולקסה מ- Botrytis cinerea. הפרופילים היו מאוד דומים, אם כי כמה הבדלים מינוריים הצביעו על הבדלים אפשריים בתגובתיות של אנזימים אלה. לאחר מכן בודדו חמישה חלקים ונותחו על ידי ספקטרוסקופיה 1D ו-2D NMR. הוספה של עקבות של חנקתי קדמיום בדגימות הממוססות באציטון הובילה לאותות NMR שנפתרו במלואם של פרוטונים פנוליים, המאפשרים קביעה מבנית חד משמעית של שישה תוצרי תגובה, אחד מהשברים המכילים שני אננטיומרים. מוצרים אלה יכולים לשמש בנוסף כסמני חמצון כדי לחקור את נוכחותם והתפתחותם ביין במהלך ייצור יין ויישון יין.

מילות מפתח: סמן חמצון;( פלוס )-קטצ'ין; אותות NMR פנוליים; לאקסה; קדמיום חנקתי; פוליפנול אוקסידאז

לחץ כדי לקבל מידע נוסף

1. הקדמה

פוליפנוליםהם משפחה של תרכובות כימיות הקיימות באופן נרחב בטבע. הם נמצאים בכמויות משמעותיות בתה [1], קקאו [2,3], אוכמניות [4], ענבים [5 ליטר, ומוצרים מותססים כמו יין [6]. בהיותם יעדי חמצון ראשוניים J7,8], המבנים הכימיים של הפוליפנולים מתפתחים ללא הרף. שינויים אלה משפיעים על התכונות האורגנולפטיות של סוגי מזון רבים; הם אחראים לתופעות כמו השחמת מזון [9] ושינויים במאפיינים התחושתיים של היין [10,11. באנולוגיה, תופעת החמצון הזו מתרחשת בענבים או ביינות. לגבי חמצון אנזימטי, האנזימים העיקריים שאחראים על ההשחמה הם אוקסדורודקטאזים, ליתר דיוק,פוליפנול אוקסידאזקיים בענבים ולקסה המיוצרים על ידי Botrytis cinerea [12].

אנזימטיחִמצוּןמתרחש בעיקר בתירוש ענבים, אך השחמת יין נוספת עשויה לנבוע מתגובות חמצון כימיות |7,13]או מ- Botrytis cinerea laccase שיכול להיות יציב מאוד במהלך יישון היין14. שתי פעילויות אנזימטיות חמצון עשויות להתרחש על מצעים פנוליים: פעילות מונופנול אוקסידאז המאופיינת בהידרוקסילציה של מיקום סמוך לקבוצת הידרוקסיל קיימת ופעילות דיפנול אוקסידאז המקבילה לחמצון של אורתו-דיהידרוקסיבנזנים לאורתו-בנזוקינונים.

לפי ועדת המינוח של האיגוד הבינלאומי לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית (NC-IUBMB), פעילויות אנזימטיות אלו מזורזות על ידי אנזימים מסוג EC1- התואמים לאוקסידדורדוקטאזים. ביניהם, שלושת הקבוצות העיקריות של oxidoreductases המזרזות חמצון פוליפנול הן EC1.14.18.1 (מונופנול מונואוקסיגנאז), EC1.11.1 (פרוקסידאז/POD) ו-EC1.10.3 (אוקסידדורדוקטאזות הפועלות על דיפנולים).

מחלקה אחרונה זו מחולקת לתת-מחלקות שונות, ושתיים מהן נראו מעניינות במיוחד עבור מחקר זה: EC1.10.3.1 (פוליפנול אוקסידאז/PPO) ו-EC1.10.3.2 (לאקאז) (ראה חומרים משלימים איור S1).

PPO, לקקאז ופרוקסידאז הם ה-oxidoreductases האחראים בעיקר על השחמה במהלך עיבוד ענבים [13]. השחמה הנגרמת על ידי POD זניחה בפירות אך עלולה להגביר את פירוק הפנולים בשילוב עם PPO[15]. PPO קיים באופן טבעי בענבים והוא מסוגל לזרז את החמצון של מונופנולים לקטכולים ושל קטכולים לפיגמנטים חומים [8,13,16]. לקאזות, המופיעות בענבים הנגועים בבוטריז, יש ספקטרום פעולה רחב יותר|17|כיוון שהם יכולים לזרז את החמצון של מצעים רבים ושונים. יעדי החמצון העיקריים של הלקסים נותרו 1-2 ו-1-4 דיהידרוקסיבנזן.

ביין, בנזוקווינון המיוצר על ידי חמצון (PPO או לאקסים) יכול בקלות לעבור תגובות נוספות בהתאם לתכונות החיזור והזיקה האלקטרונית שלהם [15]. הם יכולים לפעול כאלקטרופילים ולהגיב עם נגזרות אמינו [18] או לפעול כחמצון ולהגיב, בין היתר, עם מצעים פנוליים. בהתאם למבנה הכימי שלהם (קינון או חצי-כינון), בנזוקינון יכול להוביל לתוצרי תגובת חמצון שונים. ב-pH ניטרלי, (פלוס)-קטצ'ין יתחמצן לכינון במיקום טבעת A C5 או C7 ויוביל ליצירת שישה איזומרים דימריים אפשריים המרמזים על קישור בין מיקום טבעת B C2', C5', או C6' של יחידת הקטצ'ין העליונה ומיקום טבעת A C6 או C8 של היחידה התחתונה [19,20]. Dehydrodicatechin הוא מוצר ידוע של צימוד זה [21]. מיקומי התיוג של המבנים מוצגים באיור 1. בתנאים חומציים, צורות חצי-כינון יכולות להיות נוכחות גם על טבעת B (מיקום OH3'או OH4') ולהוביל לארבעה איזומרים דימריים אפשריים [20,22] עם יחידת הקטצ'ין העליונה וטבעת A של היחידה התחתונה (מצב C6 או C8). חמצון אנזימטי של קטכין נחקר במחקרים קודמים [22,23], ותוצרי החמצון הקשורים אופיינו על ידי HPLC [24], אם כי לעתים רחוקות יותר מבודדים ולעולם לא מאופיינים לחלוטין על ידי NMR.

מטרת עבודה זו הייתה תחילה להשוות על ידי UHPLC-MS את פרופילי מוצרי החמצון הדימריים( פלוס )-קטצ'ין בנוכחות שלוש תמציות אוקסידודורדוקטאז, כלומר PPO המופק מענבים, לקקאזה מהפטרייה Botrytis cinerea הקיימת ביינות מתוקים שעברו בוטריט. [14], ולקסה מ-Trametes Versicolor.

המטרה השנייה הייתה לסנתז חצי ולאפיין את המבנים של כמה תוצרי חמצון דימריים על ידי ספקטרוסקופיה של NMR שהושגה עם לקקאזה מ-Trametes Versicolor.

2. תוצאות ודיון

2.1. השוואה של פרופילי מוצרי ריאקציה דימריים עם שלושה אוקסידורדוקטזים שונים ו-(פלוס)-קטצ'ין

(פלוס)-קטצ'ין חומצן לראשונה בנוכחות לקקאזה מ-Trametes Versicolor ב-pH3.6 בתמיסת היין של הדגם. לאחר הפרדת השבר הדימרי משברי (פלוס)-קטצ'ין ושברים פולימריים אחרים, נאספו שמונה חלקים עיקריים ונותחו על ידי UHPLC-UV-MS, שצוינו מ-N1 עד N8 בסדר זמן שמירה הולך וגדל (טבלה 1). ספקטרום המסה האלקטרוספריי במצב חיובי הראה את פסגות היונים [M ועוד H] פלוס ב-m/z 579 עבור N1 עד N6, התואמים באופן היפותטי לדימר שנוצר על ידי קשר בודד בין שתי יחידות קטצ'ין, ו-[M ועוד H] פלוס ב- m/577 עבור N7 ו-N8, מה שמרמז באופן היפותטי על היווצרות הצמדה נוספת.

השמונה האלהחִמצוּןשברים נצפו בפוטנציה לאחר דה-פולימריזציה כימית של שבר טאנין בעבודות קודמות [25,26] ויכולים להיות זהים לאלה שתוארו כבר על ידי Guyot et al. [20], גם אם תנאי הניסוי היו מעט שונים. ואכן, במחקר הקודם זה, נעשה שימוש בתמצית PPO גולמית ב-pH3 ו-6 כדי להשיג שמונה חלקים. במחקר הנוכחי, שלושה אנזימים שונים הושוו ב-pH3.6 בתמיסת היין המודל. הניתוח ההשוואתי של LC-MS של חלקי החמצון העיקריים שהתקבלו עם שלושת האנזימים השונים (לקקאז מ-Trametes Versicolor, lac-case מ-Botrytis cinerea ופוליפנול אוקסידאז המופק מענבים) מוצג בטבלה 2. עבור כל אחד משמונת השברים, זמני השמירה היו כמעט זהים לאנזימים השונים, ו-m/z דומים נקבעו בניתוח MS. תוצאות אלו תומכות בהשערה כי התקבלו אותם חלקים עבור כל אנזים, המכילים מוצרים בעלי מבנים דומים לאלו שהשערו על ידי Guyot וחב'. [20]. Lopez-Serrano ו-Ros Barcel6 [27] ביצעו גם מחקר השוואתי של תוצרי חמצון (פלוס)-קטצ'ין עם שני אנזימים שונים: פרוקסידאז ופוליפנול אוקסידאז, שניהם מופקים מתותים. הם הגיעו למסקנה שהמוצרים שהתקבלו עם שני האנזימים היו זהים מבחינה איכותית. תרכובת נוספת בשם N4' עם m/z=578 Th ו-Rt=15.66 דקות נצפתה בניסויים עם לקקאז מ-Botrytis cinerea ו-PPO מופק אך לא עם לקקאז מ-Trametes Versicolor, מה שמצביע על הבדלים אפשריים בתגובתיות לאנזימים אלו.

2.2. מחקר ואופטימיזציה של פרמטרים פיזיקוכימיים על אותות OH פנוליים ואליפטיים של 1H-NMR

ניתן להשיג את האפיון המבני של דימרים של פרוסיאנידינים על ידי ניתוח NMR. בפרט, ניתן לקבוע את מיקום ההצמדה המדויק בין יחידות באמצעות ספקטרום מתאם HMBC ו/או ROESY [28,29] (איורים S2 ו-S3). במקרה של קשר מסוג אתר (COC), ייחוס פרוטוני האות ההידרוקסיל הכרחי. זה עשוי להיות קריטי גם במקרה של קישורי CC אם כמה פרוטונים אליפטים או ארומטיים חופפים או אם כמה מתאמים מרכזיים חסרים. עם זאת, אפילו בממס אפרוטי, פרוטוני ההידרוקסיל של פוליפנולים מופיעים לעתים קרובות כאותות רחבים שלא ניתן לקבל מהם מידע מבני [30]. נושא זה טופל בהיסוס על ידי הוספת עקבות של

Cd(NO3)2 בתמיסות המדגם. ואכן, אותות 'H רחבים של קבוצות OH נובעים מהחילוף הבין-מולקולרי בין פרוטונים OH אלה לפרוטונים אחרים בממס או במומס. על ידי הפחתת קשרים בין-מולקולריים, הנוכחות של חנקתי קדמיום בדגימות עשויה להפחית את ההחלפות הללו, ובכך לשפר את החדות של אותות פרוטונים OH.

2.2.1.השפעת תוספת קדמיום

לאחר ייבוש בהקפאה, חמשת השברים N2, N3, N4, N6 ו-N8 הוסבו באצטון-dg. לאחר מכן, ספקטרום NMR של פרוטונים 1D נרכשו ב-25 מעלות לפני (איור 2A) ולאחר הוספת כמויות קטנות של קדמיום (איור 2B). באצטון-d טהור, פרוטוני ה-OH הפנוליים של כל השברים הופיעו כפסגות רחבות. לאחר הוספת קדמיום, הפרוטונים הללו הראו אותות בעלי רזולוציה גבוהה במקרה של שברים N6 ו-N8, בעוד שלשברים N2, N3 ו-N4 האותות היו רק מעט יותר חדים. כמו כן, יש להזכיר כי להגדלת תוכן ה-Cd לא הייתה השפעה על רזולוציית האות של OH, מכיוון שלא נצפתה חדות או רוחב שיא של רוחב הקו כאשר כמויות קטנות עוקבות של Cd נוספו לדגימות (לא מוצגים נתונים).

אותות OH פנוליים בעלי פתרון גבוה מהמוצרים N2, N3 ו-N4 הושגו הודות לייבוש נוסף ומסיסה מחדש (איור 2C,D).

ההבדל בהתנהגות עם הוספת Cd בין השברים עשוי להיות מוסבר על ידי החוזק של אינטראקציות מולקולריות: חזק יותר במקרה של N2, N3 ו-N4 בהשוואה ל-N6 ו-N8, שלב נוסף נחוץ כדי לשבור את הקשרים הללו.

שלב נוסף זה עשוי להיות שלב המפתח בעת שימוש ב-Cd להשגת אותות OH פנוליים בעלי פתרון גבוה בכל מצב, לא משנה מה מקור הדגימות, תגובת הסינתזה או המוצרים הפוליפנוליים הטבעיים.

עבודה קודמת העוסקת באפיון מבני חד משמעי שלפוליפנולדימרים המשתמשים באותות NMR פנוליים של OH עם רזולוציה גבוהה הודות לתוספת קדמיום חנקתי פורסם בשנת 1996[30]. למיטב ידיעתנו, לא פורסם מאז מאמר מחקר אחר המשתמש במתודולוגיה זו. חקירות אחרות בוצעו לאחר מכן כדי להגיע למטרה זו, או על ידי תוספות במינון חומצה פיקרית [31] או על ידי שימוש בטמפרטורת רכישה נמוכה [32]. זה עשוי להיות מוסבר על ידי הצעד הנוסף הדרוש כדי לקבל השפעה מכרעת על חדות שיא OH עם תוספת Cd, כמתואר לעיל. עם זאת, נראה שלקדמיום יש ערך רב, שכן ניתן לקבל אותות בעלי רזולוציה גבוהה ללא צורך בהוספת כמויות מדויקות, בניגוד לרכישת ספקטרום של חומצה פיקרית או NMR בטמפרטורות נמוכות.

2.2.2. השפעת הטמפרטורה

לירידה בטמפרטורה מ-25 מעלות צלזיוס ל-15 מעלות לא הייתה השפעה על החדות של אותות OH פנולי או אליפטי. עם זאת, שינויים בשדה למטה של ​​פסגות פרוטונים הניתנות להחלפה אפשרו לנו להפריד כמה אותות OH פנוליים ואליפטיים חופפים, מה שהופך את הזיהוי שלהם לברור יותר (איור 3). על ידי הפחתת הטמפרטורה, קצב חילופי הפרוטונים הופחת, וניתן לצפות לפסגות OH אליפטיות חדות יותר [31]. ברור שהטמפרטורה של 15 מעלות אינה נמוכה מספיק כדי להשיג אותות OH אליפטיים שנפתרו היטב. עם זאת, זה אפשר לנו לזהות בבירור את התהודה של שני פרוטונים OH אליפטיים בדגימות N3 ו-N6 ושל אחד בדגימה N8. הספקטרום של מדגם N2 הציג גם שני אותות פרוטונים אליפטיים של OH, שהיו מובחנים יותר ב-25 מעלות צלזיוס מאשר ב-15 מעלות (איור 2E). במקרה של המדגם N4, האותות הנובעים מ-OH אליפטי נראו רק בחלקם ב- ספקטרה, בין אם הטמפרטורה נקבעה ל-25 מעלות או ל-15 מעלות צלזיוס, עקב חפיפה מתמשכת (איור 2E).

2.3. אפיון מבני של התקנים הדימריים - ניתוח ספקטרום NMR

ספקטרום ה-NMR של שברים N2, N3, N4, N6 ו-N8 הראו שתוצרי החמצון היו בעלי טוהר גבוה מאחר שעוצמות האות של תרכובות אחרות שזוהו היו פחות מ-10 אחוז בהשוואה לאלו של מוצרים אלה.

בכל הספקטרום, ניתן להבחין בארבעה אזורי תזוזה כימית של lH האופייניים ליחידות קטצ'ין (איור 2C): אותות של הפרוטונים האליפטיים של טבעות פיראן (טבעות C) נמצאים באזור שבין 2.3 ל-5.0 ppm, ואלו של פרוטוני האות הארומטיים של טבעות רסורצינול (טבעות A) ושל טבעות קטכול (מביא) מ-5.5 עד 6.3 ppm ו-6.3 עד 7.1 ppm, בהתאמה. אותות הפנול OH של טבעות A ו-B כאחד הופיעו בין 7.1 ל-10 ppm. ספקטרום ה-NMR של שני השברים הראה נוכחות של קבוצות אותות נפרדות של יחידות קטצ'ין ביחס עוצמה קבוע: שתי קבוצות של אותות נצפו בספקטרום של שברים N2, N3, N6 ו-N8 בהתאם לנוכחות של דימרים, וכן ארבעה סטים בספקטרום N4, שיכולים להתאים לטטרמר אחד, שני דימרים או תערובת של אוליגומרים שונים, כלומר טרימר אחד ועוד מונומר אחד. על מנת לקבוע את מידת האוליגומריזציה של התוצרים הקיימים בשבריר N4, בוצע ניסוי 'H DOSY באמצעות תערובת המכילה מנות של שני השברים N4 ו-N2. מקדמי הדיפוזיה של כל האותות הציגו ערכים דומים (איור 4), המצביעים על נוכחותם של שני דימרים של קטצ'ין בשבריר N4.

הודות לאותות פנול OH שנפתרו במלואם המספקים תוצאות כמותיות אמינות, ניתן להסיק ישירות את סוג הקישור בין יחידות הקטצ'ין משילוב שיא שטח הפנים. לפיכך, עבור שני השברים, N3 ו-N6, היעדר OHphenol אחד (השייך ל-resorcinol או לטבעת קטכול) והיעדר פרוטון ארומטי אחד של resorcinol הצביעו על קישור אינטרפלבני (IFL) מסוג אתר המרמז על התנגדות ב-A או טבעת B ועמדה C6 או C8 בטבעת A. במקרה של מדגם N2, חסרו שני פרוטונים ארומטיים, אחד של טבעת B ואחד של טבעת A, מה שמרמז על CA-CB IFL. ספקטרום 1D 'H של שבריר N4 הראה שחסרים שני פרוטונים של טבעת B, כמו גם שני פרוטונים של טבעת A. הקשרים בין יחידות הדימר של חלק N4 הם לפיכך שני סוגי CC. הספקטרום של שבר N8 היה שונה למדי מארבעת האחרים. כמה אותות היו אופייניים ליחידות קטצ'ין, שבהן חסרו שלושה פנולים OH, טבעת A ארומטית אחת ופרוטונים טבעת B אחת, וכן OH אחד אליפאטי. מצד שני, כמה אותות NMR אחרים הם לא טיפוסיים ליחידת קטצ'ין: מתילן עם שינויים כימיים של 13C (~40 ppm) וקבוצת קטון (~192 ppm).

מערכות ספין הפרוטונים של טבעות C, A ו-B נקבעו תוך שימוש בספקטרום של 'H 1D ו-1H 2D TOCSY (לא מוצג). שתי מערכות ספין של ABMX C-ring (אופייני לקטצ'ין) נצפו בספקטרום של שברים N2, N3, N6 ו-N8, וארבע עבור שבר N4. בספקטרום של שברים N2, N3, N6 ו-N8, שני כפולות מטה-צימודים (J~2Hz) ויחיד באזור הטבעת הארומטי A הוקצו, בהתאמה, לפרוטוני הטבעת A של יחידת הקטצ'ין הלא מקושרת. ולפרוטון שיורי טבעת A של יחידת הקטכין המקושרת של C6-או C8-. בספקטרום של N4, עקב נוכחותם של שני דימרים, זוהו ארבעה כפולים מטה-צימודים ושני סנגלטים והוקצו כמתואר לעיל. גם מערכות פרוטון הטבעת B נקבעו בקלות מהספקטרום הללו ואפשרו לנו לזהות שתי מערכות ספין פרוטונים ABM עבור הדימרים של שברים N3 ו-N6, בעוד שמערכת ספין ABM ואחת AB פרוטון זוהתה עבור דימר N2, ואחת ABM ו-N6. מערכות ספין פרוטון אחד AM עבור dimer N4. הדימר N8 הציג רק מערכת ספין ABM B-ring אחת האופיינית למונומר קטצ'ין.

2.3.1. קביעת מיקום הטבעת A של IFL של הממדים של שברים N2, N3, N4 ו-N6

הקמת הגשר הממוקם על טבעת הדימרים A (כלומר, מיקום C6A או C8A) דורשת ייחוס של פרוטון ה-HA השיורי של יחידת הקטצ'ין המקושרת CA. הודות לאותות OH פנוליים בעלי פתרון גבוה, נקודת התחלה קלה הייתה זיהוי שני הפרוטונים OHphenol של היחידות המקושרות טבעת A, כלומר, טבעת A ש

had one isolated lHspin. This may be achieved using lH-13C long-range correlations, as illustrated in Figure5. The OH5A has readily been identified thanks to a correlation with the C4aC. This quaternary carbon is indeed characterized by both its chemical shift at~100 ppm and a long-range correlation observed with the H4Cprotons. OH5A also correlated with two other carbons∶ the most deshielded （δ>145 ppm） was obviously C5A, while the other (6>125 ppm) was C6A, which also showed a correlation with the other OHA phenol proton,i.e., OH7A. This latter correlated with two other carbons: a deshielded quaternary carbon（δ>145ppm） and a more shielded carbon（δ>125 ppm） אשר יוחסו בקלות ל-C7A ו-C8A, בהתאמה. לאחר הקצאת C6A ו-C8A, ניתן לייחס ישירות את פרוטון ה-HA שיורי לספקטרום HSQC. לפיכך נמצא כי פרוטון HA שיורי זה היה H6A עבור כל השברים N2, N3, N4, N6. ה-IFL בין יחידות קטצ'ין רמז אפוא על עמדת C8A עבור כל הדימרים.

2.3.2. קביעת עמדת הטבעת B של IFL

מימדים של שברים N2 ו-N4. הספקטרום של שבר N2 הראה שני סוגים שונים של מערכות ספין פרוטונים טבעת B: אחת AMX התואמת לטבעת B של היחידה הלא מקושרת, ואחת AM עם קבוע צימוד של כ-8 הרץ, אופייני ל-H6'B ו-H5' B של יחידה צמודה C2'B. הקישור בין היחידות של דימר N2 הוא אפוא C2'B-C8A. ספקטרום ה-NMR של חלק N4 הראה גם מערכות ספין B שונות: שתי AMX, התואמות לטבעת B הלא מקושרת, ושתי מערכות AXspin, שתיהן מציגות קבועי צימוד של כ-2 הרץ, האופייניים ל-H2'B ו-H6' פרוטונים B של יחידות מקושרות C5'B. הנוכחות של מתאמים ארוכי טווח'H/13C בין H6'Band C8A, אשר נצפו בספקטרום HMBC של שני הדימרים, הם בהתאם לקישור C5/'B-C8A (איור 5).

מימדים של שברים N3 ו-N6. הספקטרום של שברים N3 ו-N6 הראו נוכחות של שתי מערכות פרוטונים טבעות AMX והיעדר אות פנול OH אחד. מכיוון שכל הפרוטונים הפנוליים של ה-OHA של יחידות הדימר זוהו (כמתואר לעיל), האות הפנולי החסר של OH יכול להיות זה של OH3'B או זה של OH4'B.

ניתן לקבוע בקלות את מיקום ה-OH (3'B או 4'B) באמצעות מתאמים של ROE עם H2'Bor H5'B, בהתאמה, או באמצעות מתאמי HMBC לטווח ארוך, כפי שמוצג באיור 5.

ייחוס ה-OH השיורי של טבעות B בוצע בקלות באמצעות מתאמים ארוכי טווח של HMBC או ROESY, כפי שמוצג באיור 5. במקרה של dimer N3, נצפה מתאם ROE בין H5'B ל-OH השיורי. 'B של יחידת הקטצ'ין מקושרת דרך טבעת ה-B שלה. OH זה זוהה אפוא כ-OH4'B. במקרה של שבריר N6, ה-OH'B השיורי הוקצה ל-OH3'B, מכיוון שנצפה מתאם ROE בין OH זה ל-H2'B. מתאמי HMBC ארוכי הטווח הם בהתאם לייחוסים אלה. מיקומי ההצמדה של שני הדימרים הללו נקבעו כדלקמן: CO3'B-C8A ו-CO4'B-C8A עבור N3 ו-N6. בהתאמה.

חלק N8. ניתוח ספקטרום של הדימר N8 הראה שיחידה אחת של דימר זה היא הקטכין עם שני מצבי הצמדה, האחד טבעת A, האחד במיקום C8A והשני במיקום C-O7A, מכיוון שהפרוטונים H8A ו-OH7A הם חָסֵר. היחידה האחרת של דימר זה הציגה מאפיינים ספקטרליים יחידים, המצביעים על אובדן הארומטיות של טבעת B ועל נוכחותם של מספר עמדות קישור על טבעות B ו-C כאחד.

אותות 'H NMR הנובעים מטבעת B היו שני כפילים ב-2.49 ו-2.71 ppm, שהציגו צימוד גמינלי של ~15 הרץ (12.03 ppm) אופייני לקבוצת מתילן וסינגלט ב-6.38 ppm הנובע מפרוטון אתני. מכיוון שפרוטונים מתילן ואתילן אלה לא היו מחוברים, סביר להניח שהם נמצאים בעמדות 2'B ו-5'B. ספקטרום ה-HIMBC הראה את כל המתאמים, ואיפשר ייחוס מדויק של פחמי טבעות B אלה, כפי שמוצג באיור 5. ה-H2C של יחידה זו נתן שלושה מתאמים עם פחמי טבעת B: האחד הוא פחמן המתילן ב-~45 ppm, אשר יוחס לפיכך ל C2'B, והשניים הנותרים, עם פחמנים מהדהדים ב~90 ppm ו~162 ppm, אשר ניתן לשייך ל-C1'B ו-C6'B.H5'B נתנו רק מתאמים חזקים של 3J עם שני פחמנים רבעוניים של טבעת B זו : האחד הוא הפחמן שהוקצה בעבר ל-C3'B(~95 ppm), והשני, שהדהד ב-~90 ppm, ניתן לפיכך לייחס ל-C1'B. לאחר מכן, הפחמן ב-162 ppm היה C6'B.

הנוכחות של OH אליפטי (~5.8 ppm) במיקום C3'B (~95 ppm) נקבעה באמצעות מתאם ROE שלו עם שני פרוטוני H2'B. יתר על כן, OH3/B נתן מתאם HMBC עם פחמן רבעוני ב-~192.5 ppm, אופייני לקבוצת קטון בעמדה C4'B.

המיגון של C1'B זה של כ-40 ppm הוא בהתאם לאובדן ארומטיות טבעת B. יתר על כן, היעדר OH בעמדת C7A של היחידה השנייה תואם להצמדת אתר C1'BO-C7A.

נתוני ה-NMR הראו שלטבעת C של יחידה זו אין OH3C. הנוכחות של קישור C3C-O-C3'B היא בהתאם למיגון של C3C של כ-1.5ppm וכן לשינוי הכימי של C3'B שאופייני לפחמן ההמייקטלי (95 ppm).

בסך הכל, הנתונים הספקטרליים של NMR מאפשרים לנו להסיק שדימר זה מתאים לדהידרוקטכין A שתואר קודם לכן על ידי Winges et al.[33] ואח"כ ע"י גיות ואח' [20].

המבנים של שש התרכובות הדימריות שנקבעו על ידי ניתוחי NMR אלה מוצגים באיור 6, N2, N3, N6 ו-N8 הם מוצרים טהורים, ו-N4 הוא תערובת של שני איזומרים.

3. חומרים ושיטות

3.1.כימיקלים

(פלוס)-Catechin hydrate גדול או שווה ל-98 אחוז; laccase מ-Trametes Versicolor(0.94 U·mg-1); נתרן פוספט דו-בסיסי דיהידראט גדול או שווה ל-98 אחוזים; חומצת לימון (ריאגנט ACS, קדמיום חנקתי טטרהידרט 99.997 אחוזים; חומצה פורמית ואמברליט XAD7HP התקבלו מסיגמא-אלדריך) (Saint-Louis, MO, ארה"ב). Acetone-dg נרכש מ-Euriso-top (Saarbrüicken, גרמניה), ו-trifluoroacetic חומצה (TFA) מ-Roth Labo (Karlsruhe, גרמניה). Water LC-MS, Acetonitrile LC-MS(ACN), ומתנול LC-MS (MeOH) היו כולם מ-VWR (Radnor, PA, ארה"ב).

3.2. הכנת דגם Wine Solution

תמיסת היין המודל הייתה תמיסת אתנול/מים (12/88;o/o) עם 0.033 M חומצה טרטרית, מותאמת ל-pH 3.6 עם NaOH 1 M [34].

3.3. תמציות PPO של ענבים גולמיים

תמצית PPO הוכנה כפי שתואר קודם על ידי Singleton et al.[35]. ענבים קפואים עורבבו תחילה במאגר אצטט (1.5 M, pH5; 10 gL-I חומצה אסקורבית). לאחר מכן התערובת עברה סינון וצנטריפוגה (3000 גרם; 10 דקות). השאריות נשטפו לבסוף עם אצטון (80 אחוז) ויובשו באוויר.

3.4.לקסה מבית Botrytis Cinerea

Laccase מ Botrytis cinerea הושג כמתואר על ידי Quijada-Morin et al.[36]. הוא הופק מזן VA612 (נאסף ב-2005 בכרם בהוטווילרס, שמפניה, צרפת, מזן הפינו נואר). בקצרה, תרביות על מדיום שמרי מאלט מוצקים הושארו למשך שבוע אחד ב-24 מעלות תחת אור כחול. לאחר מכן הנבגים גורדו וחוסנו לתוך בקבוק של 500 מ"ל ארלנמייר שהכיל 125 מ"ל של מצע תרבות (4{{30}} ג'ל-1גלוקוז, 7 gL{{10}}גליצרול, 0.5 גרם·L-1L-Histidine,0.1g:L-1 CuSO,1.8gL-1 NaNO3,0.5g:L -1 KCl,0.5gL-1 CaCl2·H2O,0.05g:L-1 FeSO4.7H2O,1.0g L-1KH2PO4, ו-0.7gL-1 MgSO 4-7H2O). לאחר 3 ימי דגירה ויומיים של גידול באותו המדיום הקודם, נוספה חומצה גאלית (2 גרם ליטר-1) לתרביות הקדם. לאחר 5 ימים, המדיום הנוזלי סונן, והסופרנטנט הועבר לסינון משיק במערכת סינון Quixstand (GE Healthcare UK, Little Chalfont, אנגליה) המצוידת במשקל מולקולרי של 30 kDa מנותק את הממברנה. התרכיז עבר לבסוף דיאפילטרציה נגד מים מזוקקים, ורק השברים שהציגו פעילות חמצונית נגד ABTS נשמרו (-80 תואר).

3.5. נוהל חמצון

תמיסת לקקאז (1 gL-1) במאגר פוספט-ציטראט הוכנה קודם לכן ונוספה לתמיסת 6g.L-1( פלוס )-קטצ'ין (דגם יין) כדי להשיג ריכוז סופי לקקאזה של { {6}}.3 gL-1. התמיסה שהתקבלה עברה לאט (180 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. הריכוזים עברו אופטימיזציה בעבר, והניסוי בוצע בשלושה עותקים.

3.6. עצירת תגובה על שרף Amberlite XAD7HP

עמודת ענבר לייט הותנה באתנול (אבסולוט) ונשטפה בשני נפחי עמודה של מי מילי-O. מדיום התגובה הקודם של laccase/( פלוס )-קטצ'ין הושמט על העמוד ונשלף תחילה עם שני נפחי עמודה של מילי-Qwater [37]. לאחר מכן, העמוד נחלץ עם אתנול עד שהחלק שנאסף לא נצבע. רק חלקי אתנול נשמרו, התאדו והופלו. האבקה אוחסנה ב--80 מעלות עד לשימוש.

3.7. נוהל טיהור של השבר הדימרי באמצעות פלאש כרומטוגרפיה

האבקה הליופילית טוהרה לראשונה באמצעות מערכת כרומטוגרפיה הבזק puriflash430 המצוידת בגלאי UV המוגדר ל-280 ננומטר ועמודת Puriflash diol 50 um f0025. השלב הנייד הבינארי כלל מאצטוניטריל (ממס A) ומתנול (ממס B), שניהם חומצים עם 0.1 אחוז TFA. סדרה של הזרקות בוצעה בקצב זרימה קבוע של 20 מ"ל·דקה-1, תוך שימוש בשיפוע הבא: 100 אחוז A למשך 4.4 דקות; 0-10 אחוז B תוך 10 דקות; 10 אחוז B למשך 5 דקות; 10-90 אחוז B ב-5 דקות; 90 אחוז B למשך 3 דקות;90-10 אחוז B ב-2 דקות; 10 אחוז B למשך 10 דקות. נפח ההזרקה היה 1 מ"ל (300 מ"ג אבקה ליופיליזית מומסת ב-1 מ"ל של ממס A). בכל פעם נאספו שלושה שברים שונים. הראשון תואם לשאריות (פלוס)-קטצ'ין, והשלישי היה תערובת של פוליפנולים בעלי משקל מולקולרי גבוה. החלק השני שנפלט, המכיל תערובת של תוצרי חמצון דימריים, התאדה והוליופיליז לפני שלב הטיהור השני.

3.8. הליך טיהור של מוצרי חמצון מהשבר הדימרי באמצעות מערכת כרומטוגרפית חצי הכנה

החלק המכיל מוצרי חמצון דימריים טוהר באמצעות מערכת כרומטוגרפיה בלחץ בינוני Bio-Rad NGC 10 הכנה למחצה המצוידת בעמודת Varian Dynamax C18 Microsorb הפוכה (250 × 21.2 מ"מ; 3 אום). הפאזה הניידת הבינארית כללה מים מילי-O (ממס A) ו-80 אחוז אצטוטריל, 20 אחוז מים Milli-Q (ממס B), שניהם חומצים עם 0.05 אחוז TFA. סדרה של הזרקות (300 μL) של האבקה הליופילית (20 מ"ג מומסת ב-200 ul של ממס A ו-100 ul של ACN) בוצעו בתנאי הגלישה הבאים: 100 אחוז A למשך 4 דקות; 0-35 אחוז B ב-46 דקות;35-100 אחוז B ב-2 דקות; 100 אחוז B במשך 5 דקות. שמונה חלקים נפרדים נאספו בכל פעם, התואמים לאותות UPLC טהורים ב-280 ננומטר. כל חלק היה אידוי והוליופיליז לפני ניתוח NMR.

3.9. הכנת דגימה לניתוח תמ"א

כ-1 מ"ג מכל אבקה ליופיליזית ששוקלה בצינורות אפנדורף נפתרה ל-500 μL של אצטון-dg. לאחר מכן נוספה לדגימות ~10 ul מתמיסה מרוכזת של קדמיום חנקתי באצטון-d, והתמיסות שהתקבלו הועברו לצינורות NMR בגודל 5 מ"מ לניתוח תמ"א. בוצע שלב נוסף עבור כמה דגימות: לאחר מסיסות של האבקות הליופיליות באצטון-dg בנוכחות עקבות של קדמיום, הדגימות אודו ליובש ולאחר מכן הוסבו מחדש באצטון-d ללא תוספת נוספת של Cd.

3.10. מפרטי מכשיר

ניתוח UPLC-MS. התגובות נוטרו באמצעות שתי מערכות UPLC-MS. הראשון שימש לזיהוי מדויק של זמני החזקה של מוצרים בשיטת שיפוע ארוך. כלומר, Waters Reversed Phase Ultra-High-Performance Liquid Chromatography בשילוב לספקטרומטריית מסה (UHPLC-MS). מערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית הייתה Acquity UPLC (Waters, Milford, MA, ארה"ב) המצוידת בגלאי מערך פוטודיודות. השתמשנו בעמודת Acquity UPLC HSS T3 (1.8 אום, 2.1 ×150 מ"מ). טמפרטורת העמודה הייתה 25 מעלות. השלב הנייד הבינארי כלל 0.1 אחוז חומצה פורמית במים (ממס A) ואצטוניטריל (ממס B). ההפרדה בוצעה בקצב זרימה קבוע של 0.25mL·min-1, תוך שימוש בשיפוע הבא:8-11 אחוז B תוך 2 דקות; 11 אחוז B למשך 8 דקות; 11-25 אחוז B ב-15 דקות;25-55 אחוזי פח 5 דקות;55-99 אחוז פח 1 דקה;99 אחוז B למשך 4 דקות;99-8 אחוז Bin1 דקות;8 אחוז B למשך 4 דקות נפח ההזרקה היה 5 μL. ספקטרומטר המסה היה קוודרופול פשוט של Waters Acquity QDa (ESI) פשוט (Waters, Milford, MA, ארה"ב). המתח הנימים נקבע על 0.8 קילו וולט. ספקטרום המסה נרכשו בטווח מסה של 200-900 דק במצב יון חיובי.

מערכת UHPLC-MS השנייה, ששימשה לאימות מהיר במהלך שלבי הטיהור, הייתה זהה לזו שתוארה קודם לכן, עם עמודת Acquity UHPLC HSS T3 (1.8 מיקרומטר, 2.1×100 מ"מ) מחוממת ב 38 מעלות. ההפרדה בוצעה בקצב זרימה קבוע של 0.55 מ"ל·דקה-1, תוך שימוש בשיפוע המהיר הבא: 0.1-40 אחוז B תוך 5 דקות; 40-99 אחוז B תוך 2 דקות; 99 אחוז B למשך דקה אחת; 99-0.1 אחוז B בדקה אחת. נפח ההזרקה היה 2 μL. ספקטרומטר המסה היה מלכודת יונים של Bruker Amazon X electrospray ionization (ESI) (Bruker Daltonics, ברמן, גרמניה). המתח הקפילרי נקבע ל--5.5 קילו וולט. ספקטרום המסה נרכשו בטווח מסה של 50-2000 מצב יון חיובי.

כל ניתוחי UPLC-MS בוצעו בשלושה עותקים.

מכשור NMR. כל ספקטרום ה-NMR תועדו בספקטרומטר Agilent DD{{0}} MHz (Agilent Technologies, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב), הפועל ב-500.05 ו-125.74 מגה-הרץ עבור גרעיני פרוטון ופחמן-13, בהתאמה, באמצעות בדיקת זיהוי עקיפה של 5 מ"מ המצוידת בסליל שיפוע. 1D'H ו-13C,2Dhomonuclear1H TOCSY ו-ROESY, וניסויי lH/13C HSQC ו-HMBC heteronuclear בוצעו באמצעות רצפי פולסים קלאסיים ונותחו באמצעות VNMRJ4.2 ו-Mest2Nova 14Re. .1 (Mestrelab Research, ספרד) תוכנה. מדידות DOSY נרכשו ועובדו כפי שתואר קודם לכן 38]. פרמטרי הרכישה של רצף הפולסים DgcsteSL היו כדלקמן: זמן עיכוב הדיפוזיה ורוחב הפולס הגרדיאנט נקבעו ל-50 ms ו-2 ms, בהתאמה, עוצמת השיפוע (g) הוגדלה ב-16 שלבים עם מרווח g2 שווה מ-0.3 ל- 32G·cm-I. לאחר תיקון פאזה, ספקטרום DOSY 2D נבנו ממדידת גובה השיא באמצעות תוכנת VNMRJ4.2.

כל הספקטרים ​​הופנו לאותות הממס של אצטון-dg (אות שיורי H ב-2.05 ppm ואות 13C ב-29.92 ppm).

4. מסקנות

נחקרה פעולתם של שלושה אוקסידודורדוקטאזים שונים (פוליפנול אוקסידאז המופק מענבים, לקקאז מ-Botrytis cinerea ולקסה מ-Trametes Versicolor) על (פלוס)-קטצ'ין, והפרופילים שנוצרו ב-LC-UV-MS היו דומים מאוד, אם כי כמה הבדלים קלים הציע הבדלים אפשריים בתגובתיות של אנזימים אלה.

המבנים של שישה מוצרי חמצון קטצ'ין-לקקאז (באמצעות לאקסה מבית Trametes Versicolor) הושגו על בסיס חתימות NMR ספציפיות (ארבעה מוצרים טהורים, כלומר, N2, N3, N6 ו-N8, ו-N4, המקבילים לתערובת של שני איזומרים). הייחוס המלא של אותות OH פנולי היה אפשרי הודות לתוספת של קדמיום חנקתי עם הליך הכנת דגימה שאיפשר את הייחוס החד משמעי של הקשרים בין יחידות הקטכין עבור חלק מהתרכובות המעניינות. הליך זה יפשט מאוד את ניתוח ה-NMR של תערובות פוליפנולים, מסונתזות או מופקות ממוצרים טבעיים.

הסטנדרטים המתקבלים בעבודה זו עשויים לשמש בעתיד כסמני חמצון כדי לחקור את נוכחותם והתפתחותם במהלך הבשלת הענבים ויישון היין. מלבד קטצ'ין, תרכובות פוליפנול אחרות, כולל פלבנואידים ולא פלבנואידים, עשויות לשמש גם כמצעים של לקקאזה כדי להשיג תקנים חדשים נוספים.

קיצורי מילים

NMR: תהודה מגנטית גרעינית,

תקליטור: קדמיום,

TOCSY: ספקטרוסקופיה של מתאם מוחלט,

ROESY: ספקטרוסקופיה גרעינית של אפקט Overhauser עם מסגרת מסתובבת,

HSQC: ניסוי מתאם קוונטי חד-גרעיני,

HMBC: קישוריות מרובת פסים הטרו-גרעינית,

DOSY: ספקטרוסקופיה לפי סדר דיפוזיה.

הפניות

1. חאן, נ.; Mukhtar, H. Tea Polyphenols לקידום בריאות. Life Sci. 2007, 81, 519–533. [CrossRef]

2. Fayeulle, N.; Vallverdu-Queralt, A.; Meudec, E.; Hue, C.; בולנג'ר, ר.; Cheynier, V.; Sommerer, N. Characterization of New Flavan-3-Ol Derivatives in Permented Cocoa Beans. Food Chem. 2018, 259, 207–212. [CrossRef] [PubMed]

3. רימבך, ג.; מלכין, מ.; מוהרינג, ג'; Wagner, AE פוליפנולים מקקאו ובריאות כלי דם - סקירה קריטית. Int. י.מול. Sci. 2009, 10, 4290–4309. [CrossRef]

4. אברם, א.מ.; מורין, פ.; בראונמילר, סי; הווארד, LR; סנגופטה, א.; Wickramasinghe, SR ריכוזי פוליפנולים מתמצית שאריות אוכמניות באמצעות ננופילטרציה. מזון ביופרוד. תהליך. 2017, 106, 91–101. [CrossRef]

5. אנטוניולי, א.; פונטנה, ארה"ב; פיקולי, פ.; Bottini, R. אפיון של פוליפנולים והערכת קיבולת נוגדת חמצון בשיבולת ענבים של ה-Cv. מלבק. Food Chem. 2015, 178, 172–178. [CrossRef]

6. Saucier, C. כיצד מתפתחים פוליפנולים של יין במהלך יישון היין? Cerevisia 2010, 35, 11–15. [CrossRef]

7. אוליביירה, ס"מ; Ferreira, ACS; דה פרייטס, ו'; Silva, AMS מנגנוני חמצון המתרחשים ביינות. Food Res. Int. 2011, 44, 1115–1126. [CrossRef]

8. Singleton, VL חמצן עם פנולים ותגובות קשורות בתירוש, יינות ומערכות מודל: תצפיות והשלכות מעשיות. אמ. J. Enol. ויטיק. 1987, 38, 69–77.

9. Mathew, AG; Parpia, HAB Food Browning כתגובת פוליפנול. בהתקדמות בחקר המזון; Chichester, CO, Mrak, EM, Stewart, GF, Eds.; עיתונות אקדמית: קיימברידג', MA, ארה"ב, 1971; כרך 19, עמ' 75–145. [CrossRef]

10. גמבוטי, א.; רינלדי, א.; Ugliano, M.; Moio, L. אבולוציה של תרכובות פנוליות ועפיצות במהלך יישון יין אדום: השפעת חשיפת חמצן לפני ואחרי הביקבוק. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 1618–1627. [CrossRef] [PubMed]