מיצוי בסיוע אולטרסאונד של חומצות פנוליות, פלבונולים ופלאבן-3-אולים מקליפות וזרעים של ענבי Muscadine תוך שימוש בממיסים טבעיים אוקטיים עמוקים ומודל חיזוי על ידי רשתות עצביות מלאכותיות

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

תַקצִירמטרת מחקר זה הייתה לחקור את יעילות המיצוי של 9 ממיסים טבעיים אוטקטיים עמוקים (NDES) בסיוע אולטרסאונד עבורחומצות פנוליות, פלבנולים, ו-flavan-3-אולים בקליפות וזרעים של ענבי מוסקדין (קרלוס) בהשוואה ל-75 אחוז אתנול. רשת עצבית מלאכותית (ANN) יושמה כדי לייעל את תכולת המים של NDES, זמן האולטרסאונד, יחס מוצק לממס וטמפרטורת המיצוי כדי להשיג את תשואות המיצוי הגבוהות ביותר עבור חומצה אלגית, קטצ'ין ואפיקטצ'ין. NDES חדש שנוסח (#1) מורכב מכולין כלוריד:חומצה לוולינית: אתילן גליקול 1:1:2 ו-20 אחוז מים הוציאו את הכמות הגבוהה ביותר של חומצה אלגית בעור ב-22.1 מ"ג/גרם. התשואה הזו הייתה פי 1.73- מזה ב-75 אחוז אתנול. NDES שונה (#3) המורכב מכולין כלוריד: פרולין: חומצה מאלית 1:1:1 ו-30 אחוז מים הוציא את הכמות הגבוהה ביותר של קטצ'ין (0.61 מ"ג/ג) ואפיקטכין (0.89 מ"ג/ג') בעור, ו-2.77 מ"ג/ג' ו-0.37 מ"ג/ג' בזרע, בהתאמה. התשואה האופטימלית של חומצה אלגית בעור באמצעות NDES #1 הייתה 25.3 מ"ג/ג (נצפה) ו-25.3 מ"ג/ג' (חזוי). התשואה האופטימלית של (קטצ'ין פלוס אפיקטכין) בזרע באמצעות NDES #3 הייתה 9.8 מ"ג/ג' (נצפה) ו-9.6 מ"ג/ג' (חזוי). מחקר זה הראה את יעילות המיצוי הגבוהה של NDES נבחרים עבור פוליפנולים בתנאים אופטימליים.

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

מבוא

ממיסים אוטקטיים עמוקים טבעיים (NDES) מוכנים על ידי ערבוב של תורמי קשרי מימן עם מקבלי קשרי מימן ביחס מולרי מתאים [1]. נקודת ההיתוך של רכיב אחד צריכה להיות נמוכה מנקודת ההיתוך של השני [1]. לאחר חימום וערבוב, המדיום הזה הופך לנוזל בטמפרטורת החדר. מוסיפים מים כדי לייצב ולקטב את התערובת. המחקר בתחום המיצוי הפיטוכימי באמצעות NDES התרחב בשל יכולת המיצוי והמסיסות האפקטיביים שלהם. עם זאת, מספר גורמים ממלאים תפקיד משמעותי בהשוואה של NDES לממיסים אורגניים, כולל תשואה, עלות, התאוששות ורעילות. מחקר קודם חקר NDES על מיצוי של פוליפנולים שונים ממטריצות מזון שונות. לדוגמה, Bubalo et al. (2016) השוו 5 NDES, מים, 70 אחוז מתנול (v/v) ו-70 אחוז מתנול מחומצן (v/v) כדי להפיק אנתוציאנינים, קטצ'ין וקוורצטין -3-O-glucoside מקליפת ענבים אדומים. NDES המורכב מכולין כלוריד: חומצה אוקסלית (1:1) עם 25 אחוז מים (v/v) נמצא כממס המיצוי היעיל ביותר [2]. במחקר אחר, Pani´c et al. (2019) בדקו 8 NDES והחמיצו 70 אחוזים של אתנול וראו כולין כלוריד: חומצת לימון (2:1) עם 30 אחוז מים (V/v) כ-NDES הטוב ביותר להפקת אנתוציאנינים משאריות ענבים [3]. ענבי מוסקדין (Vitis rotundifolia) הם ילידי מדינות דרום מזרח וענבי הבר התרבותיים הראשון בארצות הברית [4]. ענבי מוסקדין מיוצרים ב-12 מדינות ובסך הכל כ-5000 דונם [5]. ישנם 100 זנים של ענבי מוסקדין וכל אחד מהם משתנה במאפיינים פיזיים, תחושתיים או כימיים [4]. ביניהם, קרלוס הוא ענב מוסקדין נטוע נרחב בשל תפוקת היבול הגבוהה שלו ועקביות הגידול שלו [4]. ענב קרלוס מוסקדין בינוני בגודלו, צבעו ברונזה, עבה יותר בקליפתו ומכיל ארבעה זרעים בממוצע [6]. ענבי מוסקדין מכילים כמויות משמעותיות שלפוליפנוליםאשר ידועים כמפחיתים דלקת [7], מעכבים את צמיחת גידול הערמונית [8], ומשפרים תגובות מטבוליות של חולי סוכרת [9]. שריר ענבי מוסקדין, תוצר לוואי של מיץ ענבי מוסקדין או ייצור יין, מורכב מקליפות וזרעים. מחקר קודם השתמש באצטון: מים: תערובת חומצה אצטית (70:29.7:0.3, v/v) כדי לחלץ תרכובות פנוליות מהזרעים, הקליפה והעיסה של שמונה זנים של ענבי מוסקדין שגדלו בפלורידה, כולל קרלוס [10]. עם זאת, השימוש בממיסים אורגניים דליקים ויעילות המיצוי הנמוכה שלהם הפריעו ליישומים מעשיים. רוב גרגירי ענבי המוסקדין עדיין מושלכים כפסולת. רשת עצבית מלאכותית (ANN) היא מערכת מיפוי לא ליניארית המורכבת מיחידות עיבוד בסיסיות שונות המחוברות באמצעות אסוציאציות משוקללות. יחידות עיבוד אלו נקראות "נוירונים" [11]. רשת עצבית מלאכותית היא גישת למידת מכונה לניבוי או חיזוי תגובה המבוססת על מספר כניסות [11]. מחקר קודם יישם שיטות משטח תגובה (RSM) לאופטימיזציה וחיזוי של מיצוי. עם זאת, מעט מחקרים השתמשו ב-ANN לאותה מטרה. לדוגמה, Sinha et al. (2013) הציע של-ANN יש ביצועי חיזוי טובים יותר מאשר ל-RSM על מיצוי של צבע טבעי מזרעים של Bixa Orellana (Annatto) [12]. במחקר דומה, Ciric et al. (2020) דיווח כי מודל ה-ANN היה טוב יותר מ-RSM לחיזוי מיצוי תרכובות פנוליות מהשום [13]. מטרת המחקר הזה הייתה לחקור את יעילות המיצוי של 9 NDES עבור חומצות פנוליות, פלבנולים ו-flavan-3- בהשוואה לאתנול של 75% בעזרת אולטרסאונד. ANN הוחל כדי לחזות ולייעל את תנאי המיצוי על תפוקה פנולית. ההשערה הייתה ש-NDES עם הרכבים ספציפיים מחלצים כמויות גבוהות יותר של חומצות פנוליות, פלבנולים ו-flavan-3- מ-75 אחוז אתנול, וניתן להשיג את יעילות המיצוי הגבוהה ביותר על ידי מודל חיזוי מבוסס ANN.

2. חומרים ושיטות 2.1. כימיקלים וריאגנטים כולין כלורי, חומצה לוולינית, 1,2-פרופאנדיול, חומצה DL-מאלית, חומצה אוקסלית, חומצה הידרוכלורית וחומצה פורמית התקבלו מ-Acros Organics (Morris Plains, NJ, ארה"ב). חומצה לקטית, אתילן גליקול, גליצין, אצטוניטריל בדרגת HPLC, מתנול ואתנול נרכשו מ- Fishers Scientific (Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב). L-proline ו-betaine hydrochloride נרכשו מאלפא אייסר (Ward Hill, MA, ארה"ב). סטנדרטים בדרגת HPLC של חומצה אלגית, חומצה גאלית, חומצה פרולית, (פלוס)-קטצ'ין, (-)-אפיקאצ'ין, מיריצין, קוורצטין וקאמפרול נרכשו מסיגמא אולדריץ' (סנט לואיס, מונטריה, ארה"ב).

2.2. עיצוב של NDESNDES #1-2 בטבלה 1 תוכננו במחקר הקודם שלנו [14]. כולין כלוריד ב-NDES #1-2 נבחר כמקבל מימן, בעוד שני תורמי מימן שונים נבחרו עבור כל NDES חדש. יחסים מולרים בין תורמי מימן לתכולת המקבל והמים נקבעו בניסויים ראשוניים. NDES מס' 3-9 בטבלה 1 נבחרו מהספרות שכן מחקרים קודמים מינו אותם כ-NDES יעילים בהפקת פוליפנולים. תכולת המים ב-NDES #3 שונה מהספרות המצוטטת. שיטת חימום יושמה להכנת ה-NDES [15]. בקצרה, מקבל קשרי המימן היה מעורבב עם כל אחד ממרכיבי תורם קשרי המימן בצלוחיות Erlenmeyer עם מוט ערבוב. התערובת בבקבוק נסגרה וחוממה ל-50 ◦C למשך כ-30 דקות או עד שנוצר נוזל שקוף ונשאר יציב בטמפרטורת החדר. תכולת המים בטבלה 1 חושבה לפי הנפח הסופי של תערובות NDES. ה-pH של NDES המפורט בטבלה 1 נמדד באמצעות מד pH (AB15, Accumet, Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב). 2.3. הכנת דגימה / מיצוי בעזרת אולטרסאונד קליפות וזרעים של ענבי מוסקדין קפואים (Vitis rotundifolia) (זן: קרלוס) סופקו על ידי Paulk Vineyards (Wray, ג'ורג'יה, ארה"ב). לאחר הסרת קליפות, עלים או פטוטרות, החריף הופרד לזרעים ועור. לאחר מכן הדגימות יובשו באמצעות תנור ואקום (Isotemp, דגם 285A, Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) ב-60 ◦C ולחץ ואקום נמוך מ-30 אינץ' כספית. לאחר מכן, הדגימות הומוגגו לאבקה דקה באמצעות מטחנה כימרית (A1{{105}}00, RRH Inc., 2800 W, Zhejiang, סין). באמצעות יחס מוצק לממס ראשוני של 1:20 (גרם: מ"ל), 0.50 גרם של קליפה או זרעים של ענבי מוסקדין עורבבו ב-10 מ"ל NDES או 75 אחוז אתנול בשלושה עותקים. הדגימות הונחו לאחר מכן באמבט מים (60 ◦C) ועברו צלילים (VCX 1500, Sonics & Materials Inc., 1500-Watt, 50/60 Hz, Newtown, CT, ארה"ב) למשך 30 דקות ב-100 אחוז משרעת לשני סבבים (15 דקות/סיבוב). לאחר מכן, הדגימות עברו צנטריפוגה מיידית (Sorvall ST 8, Fisher Scientific, Suzhou, סין) ב-3,260 גרם עד לקבלת סופרנטנט שקוף. לבסוף, הסופרנטנטים נאספו ואוחסנו במקפיא של -20 ◦C לניתוח HPLC של חומצות פנוליות (חומצה אלגית, חומצה גאלית, חומצה פרולית), פלבנולים (מיריצין, קוורצטין וקאמפרול) ופלאבן-3-אולים. (קטצ'ין ואפיקטכין). 2.4. ניתוחי HPLC של חומצות פנוליות, פלבנולים ופלאבן-3-אולים חומצות פנוליות, פלבנולים ופלאבן-3-אולים נותחו על מערכת HPLC (Agilent Technologies 1200, Waldbronn, גרמניה) לפי השיטה המתוארת ב- Sandhu and Gu (2013) [16]. מערכת HPLC מורכבת ממשאבה בינארית, דגימה אוטומטית, תא עמודה עם תרמוסטט, גלאי מערך דיודות וגלאי פלואורסצנטי. תמציות עור ענבים או זרעים עברו הידרוליזה לפני הניתוח של חומצות פנוליות ופלבנולים. ההידרוליזה בוצעה על ידי ערבוב של 1 מ"ל מהתמצית עם 4 מ"ל תמיסת הידרוליזה (1.2 M HCI המכילה 50 אחוז מתנול) והכנסתה לאמבט מים (Precision, דגם 2837, 400 W, 50/60 Hz, Thermo Scientific, Marietta , OH, ארה"ב) ב-90 ◦C למשך 80 דקות. לאחר מכן, הדגימות צוננו ל-25 ◦C ולאחר מכן ביצוע קולי למשך 5 דקות. ההידרוליזה של התמצית לא הייתה נחוצה לניתוח של קטצ'ין ואפיקטכין. התמציות שעברו הידרוליזה ולא הידרוליזה סוננו דרך ממברנת 0.45 מיקרומטר פולי-טטרפלואורואתילן (PTFE) לפני ניתוח HPLC. לניתוח חומצה אלגית, חומצה גאלית, חומצה פרולית, מיריצטין, קוורצטין, קמפפרול, קטצ'ין ואפיקטצ'ין, הוזרק 10 μL לעמודת SB-C18 (4.6 × 250 מ"מ, 5 מיקרומטר, Zorbax, Agilent, Santa Clara, CA, CA, ארה"ב). השלבים הניידים היו (A) 0.5 אחוז חומצה פורמית ו-(B) 100 אחוז אצטוטריל. קצב הזרימה היה 1 מ"ל/דקה עם שיפוע שונה של 25 דקות כדלקמן: 0-5 דקות, 10-30 אחוז B; 5-10 דקות, 30-40 אחוז B; 10–20 דקות, 40–50 אחוז B; 20–25 דקות, 50–10 אחוז B; ואחריו 5 דקות של שיווי משקל. הטמפרטורה של העמוד נקבעה ל-30 ◦C. אורך הגל לזיהוי היה 260 ננומטר עבור חומצה אלגית, חומצה גאלית וחומצה פרולית ו-360 ננומטר עבור מיריסטין, קוורצטין וקאמפרול בגלאי מערך פוטודיודות. העירור והפליטה של ​​קטצ'ין ואפיקטצ'ין היו 230 ננומטר, 321 ננומטר, בהתאמה, באמצעות גלאי פלואורסצנטי. תרכובות פוליפנול כומתו באמצעות עקומות סטנדרטיות של חומצה אלגית, חומצה גאלית, חומצה פרולית, מיריצטין, קוורצטין, קמפרול, קטצ'ין ואפיקטצ'ין. לכל העקומות הסטנדרטיות היו 7 נקודות ו-R2 > 0.99. 2.5. עיצוב מותאם אישית לרשת עצבית מלאכותית ארבעה משתני מיצוי בלתי תלויים עם ארבע רמות: תכולת מים (15-60 אחוז), זמן אולטרסאונד (5-35 דקות), יחס מוצק לממס (1:5-1:20) ומיצוי טמפרטורה (30-60 ◦C) (טבלה S1) יושמו כדי לייעל את תפוקת המיצוי של חומצות פנוליות, פלבונולים ו-flavanols. בניגוד לעיצובים הקלאסיים כגון עיצוב משטח התגובה, עיצוב מבוסס ANN אינו דורש ריצות חוזרות ומעדיף מבנה נתונים שונה. במחקר הקודם שלנו [14], ANN הייתה שיטה אמינה יותר לניבוי תפוקת מיצוי מאשר RSM. לכן, ANN נבחר במחקר זה כדי לחזות את תפוקת המיצוי של חומצה אלגית, קטצ'ין ואפיקטכין. עיצוב מותאם אישית עם 40 ריצות (טבלה S2) נוצר ב-JMP Pro (גרסה 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, ארה"ב) כדי לספק נתונים במיוחד עבור מודלים חזויים של ANN. אקראית של 40 הריצות יושמה כדי לבטל כל הטיה. המשוואה הראשית של ANN מוצגת באופן הבא: ה-= ∑jj=1 wh jpg בתוספת bhk, k=1toK (1) כאשר h הוא מספר הנוירונים בשכבה המוסתרת, j ו-k הם מספר משתני הקלט ונוירונים נסתרים, בהתאמה, p הוא משתנה הקלט, bh הוא ההטיה של השכבה הנסתרת, ו-wh הוא המשקל בשכבה הנסתרת. תשואות המיצוי של חומצה אלגית, קטצ'ין ואפיקטכין ביחס לארבעת המשתנים הבלתי תלויים נותחו באמצעות ANN על ידי אימון הנתונים תחילה ולאחר מכן בחירת סוג ההפעלה הטוב ביותר ומספר נוירונים שמביאים להתאמה נאותה של הנתונים. כדי להעריך את הצלחתם של מודלים חיזויים, הוערכו שלושה ערכים: ריבוע R, השורש הריבועי של טעות החיזוי הממוצעת בריבוע (RASE) (משוואה (2)), והשגיאה המוחלטת הממוצעת (AAE). RASE הוא RASE=̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅ SSE/n √ (2) כאשר SSE תורם עבור ריבוע ומסכם את שגיאות החיזוי (הבדלים בין התגובות בפועל לתגובות החזויות) ו-n עבור מספר תצפיות. ריבוע R קרוב ל-1 עם RASE ו-AAE קרובים לאפס פירושו התאמה גבוהה יותר של הנתונים למודל. 2.6. תשואות מיצוי סטטיסטיקה של חומצות פנוליות, פלבנולים ו--3-פלאבן הושוו ל-ANOVA חד כיווני ואחריו מבחן t של הסטודנט ב-p פחות או שווה ל-0.05 באמצעות JMP Pro (גרסה 14.2, SAS Institute Inc., קארי, צפון קרוליינה, ארה"ב). כל nde ו-75 אחוז אתנול הושוו באמצעות הבדיקות של Dunnett ב-p פחות מ-0.05 או שווה ל-0.05. ניתוח רכיבים עקרוני (PCA) בוצע ב-JMP Pro (גרסה 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, ארה"ב) עבור התרכובות הפנוליות המופקות מקליפת וזרעי ענבי מוסקדין. 3. תוצאות ודיון 3.1. פוליפנולים המופקים על ידי NDES מקליפות ענבי מוסקדין תשעה NDES ו-75 אחוז אתנול נוצלו להפקת פוליפנולים מקליפות ענבי מוסקדין. טבלה 2 מציגה את תפוקת המיצוי של חומצה אלגית, חומצה גאלית, חומצה פרולית, מיריצטין, קוורצטין, קמפפרול, קטצ'ין ואפיקטצ'ין. חומצה אלגית הייתה הפוליפנול הניתן למיצוי הנפוץ ביותר בקליפת הענבים, ואחריה חומצה גאלית וחומצה פרולית, בהתאמה. ממצא זה היה עקבי עם מחקרים קודמים [17,18]. NDES #1, #8, #7, #3, #2 ו-#9 הוציאו כמויות גבוהות משמעותית של חומצה אלגית בקליפת הענבים מאשר 75 אחוז אתנול. תפוקת המיצוי הגבוהה ביותר של חומצה אלגית הושגה על ידי NDES #1 ואחריו NDES #8 ב-22.1 ± 2.2 מ"ג/ג ו-21.3 ± 2.5 מ"ג/ג', בהתאמה (טבלה 2). עם זאת, לא היה הבדל משמעותי בין NDES #1 ל-NDES #8 לפי מבחן ה-t של הסטודנט. מעניין לציין ש-NDES #1 נמצא כ-NDES הכי פחות יעיל להפקת אנתוציאנינים

ריבה חמוציות [14]. זה הציע ש-NDES #1 עשוי לחלץ חומצה אלגית או אלגיטנינים באופן סלקטיבי ממטריקס מזון המכילים גם אנתוציאנידינים. סלקטיביות כזו עשויה להיות מיוחסת להבדלים באינטראקציות המולקולריות בין ה-NDES לבין מחלקות פנוליות ספציפיות. איור S1 (חלונית A) מציגה את כרומטוגרמת HPLC של חומצה גאלית, חומצה אלגית וחומצה פרולית המופקת מקליפת הענבים על ידי NDES #1 וזוהה ב-260 ננומטר. אתנול 75 אחוז הוציא 12.7 ± 1.2 מ"ג של חומצה אלגית לגרם של קליפה של ענבים. תפוקת המיצוי הנמוכה ביותר של חומצה אלגית נצפתה ב-NDES #4 ב-7.44 ± 0.6 מ"ג/גרם. תפוקת המיצוי של חומצה גאלית לפי NDES #9, #8, #1, #4, #7 ו- #3 הייתה דומה וגבוהה משמעותית מ-75 אחוז אתנול. הכמות הגבוהה ביותר של חומצה גאלית הוצאה על ידי NDES #9 ב-10.4 ± 0.5 mg/g, בעוד הכמות הנמוכה ביותר של 5.55 ± {{40}} .1 מ"ג/גרם חולץ על ידי NDES #5. הכמות הגבוהה ביותר של חומצה פרולית הופצה על ידי NDES #1 ב-6.32 ± 0.7 מ"ג/ג' והכמות הנמוכה ביותר הופצה על ידי NDES #5 ב-3.11 ± 0.{{5{{52 }}}} מ"ג/גרם. יתר על כן, לא היה הבדל משמעותי בין NDES #1 לבין 75 אחוז אתנול בהפקת חומצה פרולית (טבלה 2). הכמות הגבוהה ביותר של קטצ'ין ואפיקטצ'ין הוצאה על ידי NDES #3 ב-0.61 ± 0.1 מ"ג/ג ו-0.89 ± 0.1 מ"ג/ g, בהתאמה (טבלה 2). בינתיים, NDES #3 ו-#6 חילצו כמויות גדולות משמעותית של epicatechin מאשר 75 אחוז אתנול. איור S2 (פאנל A) מציג את כרומטוגרמת HPLC של קטצ'ין ואפיקטצ'ין המופקים על ידי NDES #3 מקליפת הענבים. עם זאת, קטצ'ין לא זוהה בתמצית אתנול של 75 אחוז. הכמויות הנמוכות ביותר של קטצ'ין (0.02 מ"ג/ג) ואפיקטכין ({{90}}.14 מ"ג/ג) חולצו על ידי NDES #2 ו-NDES # 5, בהתאמה. Myricetin היה הפלבונול השופע ביותר וקאמפרול היה הכי פחות. הבדיקה של דאנט גילתה ש-NDE ו-75% אתנול היו דומים בהפקת מיריציטין, קוורצטין וקאמפרול (טבלה 2). כמות ה-myricetin הגבוהה ביותר הופצה על ידי NDES #1 (1.84 מ"ג/ג), ואחריה 75 אחוז אתנול (1.73 מ"ג/ג), ולאחר מכן NDES #8 (1.67 מ"ג/ג). כמות הקוורצטין הגבוהה ביותר הופצה על ידי 75 אחוז אתנול (0.41 מ"ג/ג), NDES #1 (0.40 מ"ג/ג) ו-NDES #8 ({ {143}}.38 מ"ג לגרם). לעומת זאת, הכמויות הנמוכות ביותר של myricetin ו-quercetin חולצו על ידי NDES #5 ב-0.87 mg/g ו-0.27 mg/g, בהתאמה. ממצא זה מדגיש עוד יותר יכולת חלשה כללית של NDES #5 לחלץ פוליפנולים מקליפת הענבים. כמות הקאמפרול הגבוהה ביותר הופצה על ידי 75 אחוז אתנול (0.05 מ"ג/ג), והנמוכה ביותר הופצה על ידי NDES #5 ו-NDES#6 (0.03 מ"ג/ג). איור S1 (לוח B) מציג את כרומטוגרמת HPLC של myricetin, quercetin, ו-kaempferol המופקים מקליפת הענבים על ידי NDES #1 שזוהה ב-360 ננומטר. הכמות הגבוהה ביותר של חומצות פנוליות, פלבנולים ו-flavan-3- ols הייתה 40.7 מ"ג/ג' שחולצו עם NDES #1 ואחריו 39.8 מ"ג/ג' שחולצו עם NDES #8, בעוד שהסכום הנמוך ביותר היה 18.4 מ"ג/ג' שחולץ על ידי NDES #5 (טבלה 2). ה-pH של NDES נע בין 0.3 ל-3.3 (טבלה 1). המתאם Rsquared בין ה-pH של NDEs ותשואות חומצות פנוליות, פלבונולים ו-flavan-3- נרשמו בטבלה 2. חוסר המתאם בין pH ותשואות מיצוי הציע שה-pH לא השפיע על יעילות המיצוי. 3.2. פוליפנולים המופקים על ידי NDES מזרעי ענבים מוסקדין התשואות הכוללות של המיצוי של חומצות פנוליות, פלבנולים ו-flavan- 3- מזרעי ענבים היו נמוכות באופן ניכר מאלו מקליפות (טבלה 3). הפוליפנולים הניתנים לחילוץ הנפוצים ביותר בזרעים היו קטצ'ין ואפיקטכין, בעוד קאמפרול לא זוהה. מטריצת הזרעים המורכבת המכילה שמן (13 אחוז, משקל בסיס יבש) היא הסבר אפשרי ליכולת המיצוי הנמוכה של תרכובות פנוליות מזרעי הענבים [19]. הכמות הגבוהה ביותר של קטצ'ין הוצאה על ידי NDES #3 ב-2.77 מ"ג/גרם (טבלה 3). תשואה זו הייתה גבוהה משמעותית מכל NDES אחרים ו-75 אחוז אתנול. איור S2 (פאנל B) מציג את כרומטוגרמת HPLC של קטצ'ין ואפיקטצ'ין המופקים על ידי NDES #3 מזרעי ענבים. הכמות הנמוכה ביותר של קטצ'ין הופצה על ידי NDES #5 ב-0.30 מ"ג/גרם. כל ה-NDES למעט NDES #1, #2 ו-#9 הוציאו כמויות גבוהות משמעותית של epicatechin מאשר 75 אחוז אתנול (טבלה 3). ריכוזי האפיקטצ'ין הגבוהים ביותר הופצו על ידי NDES #4 (0.71 מ"ג/ג) ו-NDES #5 (0.68 מ"ג/ג), בעוד שהנמוך ביותר הופץ על ידי 75 אחוז אתנול (0.11 מ"ג/ג). חומצה גאלית הייתה החומצה הפנולית הניתנת למיצוי השכיח ביותר בזרעי הענבים, ואחריה חומצה פרולית וחומצה אלגית, בהתאמה. הכמות הגבוהה ביותר של חומצה גאלית הופצה על ידי NDES #4 ב-0.45 מ"ג/ג, ואחריה NDES #9 ו-NDES #8. NDEs אלה חילצו כמויות גבוהות משמעותית של חומצה גאלית מאשר 75 אחוז אתנול. הכמות הנמוכה ביותר של חומצה גאלית (0.2 מ"ג/גרם) הופצה על ידי NDES #3. המיצוי הגבוה ביותר

התשואה של חומצה אלגית התקבלה על ידי NDES #9 (0.26 mg/g) ואחריו NDES #6 (0.17 mg/g), שהיו גבוהים משמעותית מ-75 אחוז אתנול. באופן דומה, NDEs #3 חילצו את כמות החומצה האלגית הנמוכה ביותר ב-0.05 מ"ג/גרם. בנוסף, NDES #6, #7 ו-#3 חילצו כמויות גבוהות משמעותית של חומצה פרולית מאשר 75 אחוז אתנול. התשואה הנמוכה ביותר למיצוי חומצה פרולית הייתה 0.5 מ"ג/ג לפי NDES #5. יתר על כן, חומצה פרולית לא זוהתה בתמצית NDES #9. זה היה כנראה בגלל שהמסיסות של חומצה פרולית הייתה נמוכה יותר ב-NDES #9 מאשר ב-NDEs אחרים. תמצית ה-myricetin הגבוהה ביותר התקבלה על ידי 75 אחוז אתנול ו-NDES #7 ב-0.18 מ"ג/ג, שהיו גבוהים יותר מכל ה-NDEs. התשואה הגבוהה ביותר למיצוי קוורצטין הייתה לפי NDES #6 (0.14 מ"ג/ג) ו-NDES #3 (0.13 מ"ג/ג) ושני ה-NDES היו טובים יותר מ-75 אחוז אתנול. באופן דומה, ה-pH של NDES לא השפיע על תפוקת המיצוי כפי שמצוין על ידי המתאם הנמוך (R-squad) בין ה-pH של NDEs לבין התשואות של חומצות פנוליות, פלבנולים ו-flavanols המפורטים בטבלה 3. 3.3 . ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) בוצע כדי לקשר את תפוקת המיצוי של תרכובות פנוליות שונות בקליפת ענבים ובזרעים עם NDEs ו-75 אחוז אתנול (איור 1). ה-PCA בוצע על מטריצת מתאם כדי לזהות סלקטיביות אפשרית של כמה NDEs לקראת מיצוי תרכובות או קבוצות פנוליות ספציפיות. כ-85 אחוז מהשונות של נתוני העור הוסברו על ידי רכיבים עיקריים 1 ו-2. חלקת הטעינה (איור 1B) מראה מתאם גבוה בין חומצות פנוליות (חומצה אלגית, חומצה גאלית, חומצה פרולית) ופלבנולים (מיריצין, קוורצטין, וקאמפרול). כדי לחלץ קבוצות אלה, הממיסים הטובים ביותר הם NDES #1, #8, #7, ו-75 אחוז אתנול כפי שמוצג בחלקת הציון (איור 1A). בינתיים, קטצ'ין ואפיקטצ'ין נראו מופרדים משאר הקבוצות הפנוליות. כפי שמוצג באיור 1A, NDES #3 היה סלקטיבי לחילוץ קטצ'ין ואפיקטצ'ין מקליפות ענבים. זו הייתה תצפית מעניינת מכיוון ש-NDES#3 היה בין ה-NDES הפחות יעילים למיצוי פרואנטוציאנידינים, שהם אוליגומרים ופולימרים של קטצ'ין ואפיקטכין [14]. זה הצביע על כך ש-NDES #3 עשוי להיות סלקטיבי ל-proanthocyanidins בגדלים מולקולריים קטנים יותר. התקבצות של תרכובות פנוליות בחלקת הטעינה של הקליפה (איור 1B) הייתה שונה מהזרע (איור 1D) ללא קשר לתשואות הנמוכות של תרכובות אלו בזרעי הענבים. המרכיב העיקרי הראשון והשני הסביר כ-73 אחוז מהשונות של נתוני הזרע. Quercetin, myricetin וחומצה ferulic חולצו ביעילות רבה יותר על ידי NDES #6, #7 ו-75 אחוז אתנול, כפי שמוצג בתרשים הניקוד (איור 1C). חומצה אלגית וחומצה גאלית הופצו ביעילות רבה יותר על ידי NDES #9. שוב, קטצ'ין הופץ ביעילות הגבוהה ביותר על ידי NDES #3 שהיה דומה לזה שנצפה עם קליפות ענבים. Epicatechin הופץ ביעילות גבוהה יותר על ידי NDES #5, #4 ו-NDES #8.

3.4. אופטימיזציה של מיצוי של חומצות פנוליות ופלבנולים מקליפות ענבי מוסקדין ומודל חיזוי ANN כולין כלוריד: חומצה לוולינית: אתילן גליקול 1:1:2 (NDES #1) הראתה את תפוקת המיצוי הגבוהה ביותר עבור חומצה אלגית, ולכן נבחרה לאופטימיזציה נוספת. נְבוּאָה. ההשפעות של ארבעה גורמים, כולל תכולת מים, זמן בדיקת קול, יחס מוצק לממס וטמפרטורת מיצוי הוערכו עבור מיצוי של חומצות פנוליות ופלבנולים. יתר על כן, ארבע רמות עבור כל גורם חילוץ יושמו בסך הכל 40 ריצות אקראיות. תפוקת המיצוי הניסיונית של חומצה אלגית, חומצה גאלית, חומצה פרולית, מיריצין וקוורצטין, יחד עם סכום החמישה הללו, מוצגות בטבלה 4. בסך הכל, טווח ההפרש של תפוקת המיצוי בין הנמוך לגבוה היה גדול יחסית עבור חומצות פנוליות. לדוגמה, התשואה הנמוכה ביותר עבור חומצה אלגית הייתה 9.03 מ"ג/ג (ריצה מס' 17) והגבוהה הייתה 25.3 מ"ג/ג (ריצה מס' 15), מה שהביא להפרש של 16.2 מ"ג/ג' (ריצה מס' 17). יתרה מכך, סכום התשואה הנמוך ביותר היה 20.7 מ"ג/ג', והגבוה ביותר היה 71.5 מ"ג/ג'. זה ממחיש את ההשפעות המשמעותיות של הרמות השונות של כל גורם מיצוי על תפוקת המיצוי. ריצה #15 חילצה את הכמות הגבוהה ביותר של חומצה אלגית. תנאי המיצוי של ריצה מס' 15 היה 45 מ"ל /10{{130}} תכולת מים של מ"ל, 25 דקות של בדיקת קול, 1:10 (גרם: מ"ל) יחס מוצק לממס , וטמפרטורת מיצוי של 60 ◦C. איור S3 מציג את הכרומטוגרמה HPLC של חומצות פנוליות אופטימליות המופקות מקליפת הענבים על ידי NDES #1 (ריצה מס' 15 בטבלה 4). החומצה הגאלית הגבוהה ביותר (18.7 מ"ג/ג') הושגה בתנאי המיצוי בריצה מס' 24 והנמוכה ביותר הייתה 6.63 מ"ג/ג' באמצעות ריצה מס' 40. עבור חומצה פרולית, ריצה מס' 22 הוציאה את הכמות הגבוהה ביותר ב-19.2 מ"ג/ג, בעוד שלא זוהתה חומצה פרולית בריצות מס' 14, מס' 17, מס' 29 ו-#34. ריצה מס' 22 חולצה עם 60 מ"ל / 100 מ"ל תכולת מים, 5 דקות של בדיקת קול, 1:5 ליחס מוצק לממס, וטמפרטורת מיצוי של 60 ◦C. ריצה מס' 2 הוציאה את ה-myricetin הגבוה ביותר (10.1 מ"ג/ג) וקוורצטין (1.87 מ"ג/ג'). תנאי המיצוי של ריצה מס' 2 היו 60 מ"ל / 100 מ"ל תכולת מים, 35 דקות של בדיקת קול, 1:20 עבור יחס מוצק לממס, וטמפרטורת מיצוי של 60 ◦C. התשואה הוודאית הנמוכה ביותר שלי (3.79 מ"ג/ג) חולצה על ידי ריצה מס' 40. קווי המתאר באיור 2 מדגימים את ההשפעה של פרמטרי מיצוי (X1, X2, X3 ו-X4) על התשואה החזויה של חומצה אלגית המופקת על ידי NDES #1 מקליפת הענבים. התשואות החזויות של חומצה אלגית בטבלה 4 נוצלו לבניית חלקות ספירה אלו. כל פאנל ממחיש את ההשפעה של 2 פרמטרי מיצוי. קווי המתאר מסומנים בתפוקה של חומצה אלגית (מ"ג/ג). תכולת המים החזויה האופטימלית הייתה כ-35-45 מ"ל/100 מ"ל NDES, כפי שמוצג באיור 2B ו-2C. זמן ultrasonication ארוך יותר הגדיל את התשואה של חומצה אלגית (איור 2D ו 2E), המצביע על תפקיד קריטי של sonication בחילוץ NDES. במהלך המיצוי, ערבוב קליפות או זרעים של ענבים עם NDES הכניס חלקיקים וגז, אשר הוסיפו אתרי קוויטציה אקוסטית עבור אולטרסאונד כדי ליצור בועות קטנות רבות ב-NDES. התפוצצות הבועות הללו הובילה לטמפרטורה קיצונית, הפרש לחץ, כוח גזירה גבוה, מאקרו-טורבולנציות ומיקרו-ערבוב, אשר הסעירו למעשה NDES כדי להאיץ את דיפוזיה והעברה של מסה. כאשר בועות קוויטציה התפוצצו על פני השטח של זרעי ענבים או חלקיקי קליפה, המיקרו-סילונים וההתנגשויות בין חלקיקים הובילו לקילוף פני השטח, שחיקה, פירוק חלקיקים, סונופורציה ושיבוש תאים [20]. כל ההשפעות המכניות הללו של קוויטציה המושרה על ידי אולטרסאונד העצימו את החדירה של NDEs לפנים התא, כך שפנולים בין-תאיים ממטריצת המזון הועברו לממסים. היחס האופטימלי של מוצק לממס היה 1:10, כפי שמצוין באיור 2B, 2D ו-2F. לבסוף, נראה שלטמפרטורות מיצוי גבוהות יותר עד 60 ◦C יש השפעה חיובית על יכולת המיצוי של החומצה האלגית כפי שמוצג באיור 2C, 2E ו- 2F. זה מצביע על קשר ישיר בין טמפרטורת המיצוי לבין התפוקה של חומצה אלגית המופקת מקליפת הענבים. תשואות מיצוי חומצה אלגית (טבלה 4) נותחו עבור מודל חיזוי באמצעות רשת עצבית מלאכותית. נתוני הניסוי פוצלו באופן אקראי לסט אימון ולערכת אימות. הסיבה לכלול אימות שנקבע על ידי התוכנה הסטטיסטית היא לדכא התאמת יתר. כדי לחזות את תפוקת החומצה האלגית (Y), הוערכו אותם ארבעה גורמי מיצוי בלתי תלויים (X1, X2, X3 ו-X4), 1-2 שכבות נסתרות עם מספר שונה של נוירונים ושלוש פונקציות הפעלה. פונקציות ההפעלה המיושמות היו משיקות היפרבוליות, ליניאריות וגאוסיות. לאחר מכן, מערכי הנתונים אומנו עד שהושג ערך ריבוע R גבוה הן לאימון והן לאימות. נוצרו נתוני החיזוי והמודל. מבנה ה-ANN הטוב ביותר נבחר על ידי ניתוח ארבעת התשומות (X1, X2, X3 ו-X4) עם שכבה נסתרת אחת באמצעות הפונקציה גאוסית עם עשרה נוירונים (איור S5). ריבוע ה-R של ערכות האימון והאימות היה 0.99, בעוד שה-RASE וה-AAE של המודל היו 0.062 ו-0.044, בהתאמה. ריבוע ה-R של אימות ANN של חומצה אלגית במחקר זה (0.99) היה גבוה יותר מאשר אימות ANN של procyanidins (0.95) ואנתוציאנינים (0.91) במחקר קודם [14]. עם זאת, עלייה זו ב-R2 עשויה להיות מיוחסת להתאמת המודל שנוצרה טוב יותר של הנתונים במחקר זה, שיכולה לנבוע מהטעויות הניסויות הקטנות יותר. המודלים החזויים של ANN למיצוי חומצה אלגית באמצעות NDES #1 הוצגו כמשוואה 3-13:

Cistanche לשיפור חסינות

סיכום

הממצאים הנוכחיים הציגו ראיות נוספות על היעילות של יכולות NDES להפיק פוליפנולים מתוצרי לוואי של תעשיית המזון. התוצאות תמכו בהשערה של מיצוי בסיוע אולטרסאונד מעולה של NDES מעל 75 אחוז אתנול. NDES הוציא ביעילות שלוש חומצות פנוליות, שני פלבנולים ושלושה פלוואנים-3- מקליפות וזרעים של ענבים. NDES #1 היה ה-NDES היעיל ביותר למיצוי חומצה אלגית, ואילו NDES #3 היה סלקטיבי במיוחד למיצוי קטצ'ין ואפיקטכין. חסרון בולט של NDES הוא הצמיגות הגבוהה שלהם, מה שמציב אתגרים במהלך הטיפול והתאוששות. במחקר הנוכחי, רשתות עצביות מלאכותיות, ללא קשר למגבלות התוצאות שלה, הדגימו גישה מעשית למידול חזוי. NDEs הם מדיה חזקה לשחזור פיטוכימיקלים ממערכות מזון. חלק מה-NDEs מציגים גם ממס פחות רעיל לחקר הפיטוכימיקלים הללו בתאים חיים [21,22]. סוף סוף, ממיסים אוטקטיים עמוקים טבעיים הם אמצעי מיצוי אלטרנטיבי יעיל לממיסים אורגניים.

הפניות

[1] W. Bi, M. Tian, ​​KH Row, Evaluation of alcohol-based deep eutectic solvent in extracting and determination ofפלבנואידיםעם אופטימיזציה של מתודולוגיית משטח תגובה, J. Chromatogr. A 1285 (2013) 22–30, https://doi.org/10.1016/j. chroma.2013.02.041.
[2] M. Cvjetko Bubalo, N. ´ Curko, M. Tomaˇsevi´c, K. Kovaˇcevi´c Ghani's, I. Radojˇci´c Redovnikovi´c, מיצוי ירוק של פנולים מקליפת ענבים על ידי שימוש בממיסים אוטקטיים עמוקים, Food Chem. 200 (2016) 159–166, https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2016.01.040.
[3] M. Panic, V. Gunjevi´c, G. Cravotto, I. Radojˇci´c Redovnikovi´c, טכנולוגיות המאפשרות להפקת אנתוציאנינים שברי ענבים באמצעות ממיסים טבעיים אוטקטיים עמוקים באצוות של עד חצי ליטר מיצוי של אנתוציאנינים מארי ענבים באמצעות NADES, Food Chem. 300 (2019) 125185, https://doi.org/ 10.1016/j.foodchem.2019.125185.
[4] M. Hoffmann, et al., Muscadine Grape Production Guide for the Southeast, North Carolina State University, NC State Extension Publications, 2020 https://content. ces.ncsu.edu/muscadine-grape-production-guide (נגישה ב-18 בינואר 2021). [5] Cline, B. and C. Fisk, סקירה של שטחי ענבי מוסקדין, זנים ואזורי ייצור בדרום מזרח ארה"ב. סדנת ענבי מוסקדין לסוכני הרחבה שיתופית, בקונסורציום פירות קטנים באזור הדרום. 2006: קונסורציום פירות קטנים באזור הדרום.
[6] PC Andersen A. Sarkhosh D. Huff J. Breman 2020 6 10.32473/edis-hs100-2020.
[7] P. Greenspan, et al., Antiinflammatory properties of the muscadine grape (Vitis rotundifolia), J. Agric. מזון. Chem. 53 (22) (2005) 8481–8484, https://doi.org/ 10.1021/jf058015.
[8] DN Ignacio, KD מייסון, EC Hackett-Morton, C. Albanese, L. Ringer, WD Wagner, PC Wang, MA Carducci, SK Kachhap, CJ Paller, J. Mendonca, L. Li Ying Chan, Bo Lin, DK Hartle, JE Green, CA. .org/10.1016/j.heliyon.2019.e01128.