שיפור פרוטאומיקה מלמעלה למטה של רקמת מוח עם FAIMS חלק 2

ניתוח נתונים

זיהוי פרוטאופורמים בוצע עם TopPIC גרסה 1.3.53 הגדרות עבור TopPIC כללו חלון מבשר של 3 m/z (כדי לקחת בחשבון את המעטפת האיזוטופית), סובלנות שגיאות מסה של 15 ppm, תזוזה מסה לא ידועה מקסימלית/דקה של 500 Da, ומקסימום מספר השינויים הלא ידועים המותרים של 1.

בשנים האחרונות, יותר ויותר מחקרים מראים שיש קשר הדוק בין מורפולוגיה של חלבון לזיכרון. חלבונים הם המולקולות הבסיסיות ביותר בפעילויות החיים. הם יכולים לשלוט בפעילויות החיים של תאים ולשמור על פעולתו התקינה של גוף האדם. מחקרים מצאו כי המורפולוגיה של חלבונים לא רק ממלאת תפקיד חשוב בפעילויות חיי התא, אלא גם יש לה קשר בלתי נפרד עם תפקוד הזיכרון במוח. ברגע שהמורפולוגיה של החלבונים תשתנה, זה ישפיע על הקשר בין נוירונים, ובכך ישפיע על יכולת הזיכרון של אנשים.

בשלבים המוקדמים של החיים, לשינויים במורפולוגיה של החלבון תפקיד חיוני בהתפתחות ותפקוד המוח. אם המורפולוגיה של חלבונים אינה כפי שהיא אמורה להיות, היא תגרום לשורה של בעיות נוירולוגיות, שיובילו בסופו של דבר לאובדן זיכרון, פגיעה קוגניטיבית וכו'.

עם זאת, אין צורך לדאוג. טכנולוגיה רפואית מודרנית אפשרה לאנשים להתאים את המורפולוגיה של חלבונים באמצעות תזונה כדי לשפר את הזיכרון שלהם. תזונה עשירה ומגוונת עשירה בחלבון, אך בבחירת חלבון השתדלו לבחור במזונות דלי שומן, כולסטרול ופחמימות כדי להימנע מההשפעות השליליות של צריכה מופרזת על הגוף.

בקיצור, מורפולוגיה של חלבון וזיכרון אינם ניתנים להפרדה. כדאי לשים לב לתזונה בריאה וצריכת חלבון מאוזנת כדי לשמור על בריאות טובה תוך שמירה על זיכרון טוב. ניתן לראות שאנו צריכים לשפר את הזיכרון, ו-Cistanche יכולה לשפר משמעותית את הזיכרון מכיוון שיש לו השפעות נוגדות חמצון, אנטי דלקתיות ואנטי-אייג'ינג, שיכולות לסייע בהפחתת חמצון ותגובות דלקתיות במוח, ובכך להגן על בריאות המוח. מערכת העצבים. בנוסף, Cistanche יכול גם לקדם צמיחה ותיקון של תאי עצב, ובכך לשפר את הקישוריות והתפקוד של רשתות עצביות. השפעות אלו יכולות לסייע בשיפור הזיכרון, יכולת הלמידה ומהירות החשיבה, ויכולות גם למנוע את התרחשותם של הפרעות בתפקוד קוגניטיבי ומחלות ניווניות.

increase brain power

לחץ על Know כדי לשפר את הזיכרון לטווח קצר

הספקטרומים של MS2 נבדקו מול מסד נתונים המשולבים בערכים מ-Homo sapiens Swiss-Prot (20,352), Swiss-Prot splicevariants (22,000), ו-TrEMBL (54,436), כמו גם מזהמים נפוצים. פרוטאופורמים מזוהים סוננו לשיעור גילוי כוזב (FDR) של 1% באמצעות TopPIC.

ניתוח נתונים במורד הזרם בוצע בסביבת R עבור מחשוב סטטיסטי ויצירת דמויות.54 בניתוח במורד הזרם, פרוטאופורמים מאותו גן עם אותן חומצות אמינו מתחילות וסיום שנמצאו בטווח של ±5 Da שולבו כפרוטאופורם יחיד כדי להגביר את המחמירות מהמשימות שלנו.

למרות שסף ה-5Da הוא שרירותי, גישה זו פיצתה על פסגות מונואיזוטופיות שהוקצו בצורה שגויה, אי בהירות בתזוזות מסות לא ידועות וסטיות מלאכותיות אחרות. כדי לקבוע את סטיית התקן היחסית (RSD) של פרוטאופורמים בתוך רפליקטים, השתמשנו בפלט "עוצמת התכונה" מ- TopPIC.

מפות סיקור של רצף פיצול וספקטרים קשורים נוצרו באמצעות תוכנת LCMsSpectator.55

הגדרות ספציפיות עבור LCMsSpectator כללו סובלנות של יונים מבשר של 10 ppm, סובלנות ייצור של 10 ppm, סף S/N מינימלי של 1.5, סף מתאם Pearson של 0.7, החלקת ברירת מחדל של 9 נקודות, וסף עוצמה יחסי של איזוטופ מבשר של 0.1.

תוצאות ודיון

תוספת של FAIMS מגבירה בצורה חזקה את כיסוי הפרוטאומים

דגימת רקמת קליפת המוח ממטופל שאובחן עם אלצהיימר עובדה בעקבות זרימת העבודה, כפי שמוצג באיור 1. ראשית ביקשנו לנתח את הביצועים של FAIMS בקורות חיים שונים בהשוואה לאלה ללא FAIMS (המכונה "No FAIMS").

כדאי לזכור שממשק FAIMS מייצר אובדן צנוע של העברת יונים, ככל הנראה בשל נתיב היונים הארוך יותר דרך המקור.56 לכן, כדי לייצג טוב יותר תנאים טיפוסיים ולהבטיח השוואות שוויוניות, נתוני "No FAIMS" נאספו באמצעות אותה מדגם ללא יחידת FAIMS מותקנת.

נתוני "ללא FAIMS" אלו נאספו בשלושה עותקים ונותחו בהתאם לזרימת העבודה, כפי שמוצג באיור 1 עם ניתוח 6 DDA MS2 המובילים. מערכי הנתונים "ללא FAIMS" זיהו בממוצע 754 ± 35 פרוטאופורמים (איור 2A וטבלה S1) ו זיהו ביחד 1073 פרוטאופורמים ייחודיים (לא מיותרים) (Figure2B) שמקורם ב-293 גנים ייחודיים (איור 2C), המכסים 29,359 חומצות אמינו על פני הפרוטאומה (איור 2D).

ה"כיסוי הפרוטאומי" המטרי (איור 2D) מוגדר כחומצות אמינו לא מיותרות המכוסות על ידי רצף של כל פרוטאופורם. בעיקרו של דבר, מדד זה מסביר הן את האורך והן את הגיוון של הפרוטאופורמים שזוהו.

אנו רואים בכך מדד מאוזן יותר בהשוואה למספר הגולמי של פרוטאופורמים וגנים מכיוון שהוא נמנע מהטיות כלפי פרוטאופורמים קטנים יותר. למרות שספירות פשוטות של פרוטאופורמים או גנים אינטואיטיביות, נראה כי מדדים אלה מושפעים מאוד ממקטעים פרוטאוליטיים קצרים. מערכי הנתונים של FAIMS נאספו מ -50 עד -20 CV נסרק בשלבים של 5 V.

כל אחד מ-7 קורות החיים שהתקבלו נאסף בשלושה עותקים. לגבי פרוטאופורמים וגנים, FAIMS עמדה בביצועים טובים יותר מ-"No FAIMS" עבור כל קורות החיים שנבדקו בטווח -50 עד -30 CV (איור 2A-C).

לדוגמה, שלושת מערכי הנתונים ב--50 CV זיהו 1833 ± 17 פרוטאופורמים, עלייה ממוצעת של ~140% לריצה בהשוואה ל-"No FAIMS". ביחד, שלושת מערכי הנתונים הללו ב-50 CV זיהו 2564 פרוטאופורמים ייחודיים מ-530 גנים ייחודיים המכסים סך של 43,437 חומצות אמינו, עלייה של 95, 69 ו-69% על פני שלושת מערכי הנתונים "NoFAIMS", בהתאמה (איור 2B–D וטבלה S1).

increase memory

כמו כן, למרות ש-FAIMS ב-25V צופה בפחות פרוטאופורמים וגנים ייחודיים בהשוואה ל-"No FAIMS", הפרוטאופורמים עצמם הם הרבה יותר ארוכים בממוצע. לפיכך, כאשר בוחנים את אורך הפרוטאופורם, (Figure2D), מערכי הנתונים של -25 V מכסים כמעט כמו חומצות אמינו מהפרוטאום (28,398) ביחס ל-"No FAIMS" (29,359), ועושים זאת עם רק חצי יותר פרוטאופורמים (איור 2B) ).

כמו כן, בדקנו האם FAIMS יכולה לספק ניתוח חזק וניתן לשחזור בהשוואה ללא FAIMS. הערכנו את יכולת השחזור של כימות על ידי חישוב ה-RSD (שווה ערך למקדם השונות) של עוצמת התכונה של כל פרוטופורם, בתנאי שהפרוטופורם עומד בקריטריון של צפייה בכל שלושת מערכי הנתונים המשוכפלים עבור כל הגדרת CV.

מכיוון שמערכות הנתונים של FAIMS ו-"No FAIMS" נאספו כולם ממדגם ביולוגי אחד, השונות בין השכפולים צריכה להיות מיוחסת באופן בלעדי לגורמים אינסטרומנטליים.

עלילת הקופסה באיור 3 (כמו גם היסטוגרמות בודדות באיור S1) מדגימה כיצד ההתפלגות של RSDs משתווה בין מערכי הנתונים FAIMS ו-"No FAIMS".

בהתבסס על RSD חציוני, התוספת של FAIMS הביאה לאיכות כימות דומה או משופרת מעט ביחס ל-"No FAIMS". השיפור ב-RSDs בין מתחים נמוכים יותר (-20 עד -30 CV) עשוי להיות קשור לתצפית שפחות פרוטאופורמים מועברים בטווח זה, מספקים ספקטרום MS1 באיכות גבוהה יותר ולכן הערכות טובות יותר של עוצמת התכונה.

יתר על כן, ראוי לציין שה-RSDs שנקבעו משכפולים אלה דומים לניסויים קודמים מלמעלה למטה55 ולמטה למעלה57,58 שבוצעו עם מכשור דומה.

יחד, נתונים אלה מוכיחים כי התוספת של FAIMS ל-TDP מגדילה בצורה חזקה את זיהויי הפרוטאופורמים, ללא שום ויתור על איכות הכימות.

לאחר מכן חקרנו את החפיפה בזיהויים בין קורות החיים, שיכולה לספק את קבוצת התצפיות הלא מיותרת הגדולה ביותר.

באמצעות מקדמי חפיפה, המוגדרים כהצטלבות בין שני קבוצות חלקי הקטן מבין שתי הקבוצות, קבענו את הדמיון בין כל קבוצת נתונים. מקדם החפיפה הממוצע הכולל עבור זיהויי פרוטופורם וגנים בתוך כל FAIMS CV היה 0.76.

זה דומה למקדם החפיפה ממערך הנתונים "No FAIMS" (0.77), מה שמרמז שהשכפולים הטכניים מציגים יכולת שחזור דומה. מפת חום המציגה את מקדמי החפיפה של FAIMS של גנים פרוטאופורמים וגנים מוצגת באיורים 4 ו- S2, בהתאמה.

יש לציין, החפיפה של זיהויים של גנים על פני מרחב ה-CV היא הרבה יותר גדולה ביחס לפרוטאופורמים, אם כי היא בולטת במיוחד כאשר משווים את מרחקי ה-CV הארוכים ביותר.

לדוגמה, החפיפה בין −50 ל-−20 CV היא 0.64 ברמת הגן ו-0.06 ברמת הפרוטאופורם. זה היה צפוי מכיוון שכל גן יכול להיות מיוצג על ידי פרוטאופורמים מרובים.

ways to improve brain function

איור 4 מדגים שבעוד שהפרש של 5-10 V ב-CV מייצר מקדמי חפיפה לרוב מעל 0.5, מרחקים גדולים מ-15 V מייצרים דרגות גדולות יותר של אי-דמיון ולכן מרווחים יותר ללכידת קבוצות שונות מספיק של פרוטאופורמים.

עם מערכי נתונים אלה, המשכנו בשלב הבא לקבוע אילו שילובים של קורות חיים הם אופטימליים להשגת זיהוי גנים מקסימלי, זיהוי פרוטאופורמים וכיסוי רצף עם מגבלות על מספר קורות החיים עבור כל שילוב.

ראשית, קבע את השילובים האופטימליים עבור כל מספר של קורות חיים מ-1 עד 7 תוך שימוש במדדים של פרוטאופורמים ייחודיים, גנים וכיסוי רצף פרוטאום (איור 5).

באמצעות שילובים מוגבלים לשלושה קורות חיים כדוגמה, איור 5A, B מפרט כיצד -35, -40 ו-50 V הם אידיאליים אם רוצים למקסם את מספר הפרוטאופורמים או הגנים.

הפרוטאופורמים והגנים שזוהו בשלושת קורות החיים הללו (תשעה מערכי נתונים) מכסים 84% מהפרוטופורמים הייחודיים הכוללים ו-92% מכלל הגנים על פני כל הסט של 21 מערכי הנתונים.

כאשר שוקלים אורך של פרוטופורם עם כיסוי רצף כמדד, השילוב האידיאלי הוא −30, −40 ו-50 CV, המכסה 88% מחומצות האמינו הייחודיות מכל 21 מערכי הנתונים של FAIMS עם אובדן צנוע בלבד של זיהוי פרוטאופורם וגנים ( 4221 פרוטאופורמים ו-723 גנים, איור 5C). עם זאת, שילובים אלה כוללים את כל השכפולים ומייצגים את הזיהוי המקסימלי שניתן להשיג עבור שילוב נתון של קורות חיים. לכן, כדי להדגים את היתרון של צעדי קורות חיים חיצוניים, החלטנו לבדוק אילו מספרים ניתן להשיג באופן סביר בממוצע עם שלוש ריצות בלבד, כאשר כל ריצה היא קורות חיים שונים.

באמצעות מערכי הנתונים -50, -40 ו-30 V כדוגמה, קבענו את הפרוטאופורמים הייחודיים הממוצעים, הגנים הייחודיים וכיסויי רצף הפרוטאומים בהתבסס על 27 השילובים הייחודיים משלושת השכפולים השונים בכל קורות חיים.

בהתבסס על ניתוח זה, נוכל להשיג 2986 (±46) פרוטאופורמים ייחודיים ו-618 (±12) גנים ייחודיים המכסים 64,534 (±1089) חומצות אמינו בממוצע. בהשוואה למערך הנתונים המשולש של "No FAIMS", אשר זיהו 1073 פרוטאופורמים ייחודיים ו-293 גנים ייחודיים המכסים 29,359 חומצות אמינו, צעדי CV חיצוניים ב--50, -40 ו-30 V יכולים יותר מכפילים כל מדד.

עם זאת, השילוב האופטימלי של קורות חיים יהיה תלוי ככל הנראה באורגניזם וברקמה שממנו נגזרת הדגימה, בשלבי הכנת הדגימה המיושמים, כמו גם בכל חלוקה לא מקוונת נוספת המיושמת לפני ניתוח LC-MS.

בסך הכל, כאשר נלקחים יחד עם ניתוח החפיפה (איור 4), מצביעים על כך שמרחקים של 15 V או יותר בין קורות חיים מספקים את כמות החפיפה הנמוכה ביותר בין פרוטאופורמים, בעוד שהפרדה של 5-10 וולט בתוך -50 עד -30 CV ממקסמת את הגנים, הפרוטאופורמים והפרוטאומים. סיקור רצף.

כדי לקבוע עוד יותר את ההשפעה של FAIMS על עומק כיסוי הפרוטאומים, השווינו את הגנים שזוהו ממערך הנתונים מלמעלה למטה לניתוח טיפוסי מלמטה למעלה של המוח האנושי.

מערכי נתונים מקיפים מלמטה למעלה של רקמת מוח אנושית אפשרו לנו להעריך שפע של 8528 חלבונים באמצעות ספירה ספקטרלית משוקללת.59-61 חלבונים נכללו ב-10 אחוזוני שפע שונים על סמך ספירות ספקטרליות שנאספו ממספר מערכי נתונים מלמטה למעלה של המוח האנושי.

על ידי הצלבה עם מערכי הנתונים שלנו מלמעלה למטה, הצלחנו לקבוע מהיכן נגזרים הגנים והפרוטאופורמים ולדרג אותם במונחים של שפע חלבון משוער (באמצעות ספירות ספקטרליות מנורמלות של מערך נתונים) במוח האנושי (איור 6).

improve your memory