סך הגליקוזידים של Cistanche Deserticola מעודדים התאוששות תפקוד נוירולוגי על ידי גרימת התחדשות נוירווסקולרית

איש קשר:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Fujiang Wang1, Ruiyan Li 2, Pengfei Tu1, Jianping Chen3, Kewu Zeng1* ו-Yong Jiang1*

רקע כללי:דווח כי הרפואה הסינית המסורתית Cistanche deserticola תקפה עבור מחלות לב וכלי דם וכלי דם במוח. עם זאת, המרכיבים הפעילים שלו להגנה על שבץ איסכמי אינם ברורים. מטרתנו הייתה לחקור את הרכיבים הפעילים של C. deserticola נגד שבץ איסכמי, כמו גם את המנגנונים הפוטנציאליים שלו.

שיטות:חקרנו את ההשפעות המגנות על המוח של תמציות מ-C. deserticola, סך גליקוזידים (TGs), פוליסכרידים (PSs) ואוליגוסכרידים (OSs) במודל של חולדה של חסימת עורק מוח-אמצעי (MCAO/R). 2, 3, 5-מכתים טריפניל טטרזוליום כלוריד (TTC) שימשו להערכת נפח האוטם המוחי, ומבחן Evansblue אומץ כדי להעריך את חדירות מחסום הדם-מוח (BBB). לאחר מכן, הביטויים CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin-5, occludin,Keap-1 ו-Nrf{{13 }} נותחו באמצעות Western blotting או אימונופלואורסצנטי, והפעילויות MDA, SOD, CAT ו- GSH-Px נותחו באמצעות ערכות.

תוצאות:הטיפול ב-TGs הפחית באופן מדהים את ציוני החסר הנוירולוגי ואת נפח האוטם, קידם אנגיוגנזה ועיצוב עצבי, ושמר ביעילות על שלמות מחסום דם-מוח בהשוואה לקבוצת המודלים. יתר על כן, TG הפחית משמעותית את רמות ה-MDA והגדילה את פעילות נוגדי החמצון (SOD, CAT ו-GSH-Px) במוח. בינתיים, TGs הורידו להפליא את ביטוי Keep-1 והקלו על טרנסלוקציה גרעינית של Nrf-2. להיפך, לא נצפו השפעות הגנה עבור קבוצות PSs ו-OSs.

סיכום:TGs הם המרכיבים הפעילים העיקריים של C. deserticola נגד פגיעה מוחית הנגרמת על ידי MCAO/R, וההגנה היא בעיקר באמצעות מסלול Nrf-2/Keap-1.

מילות מפתח:Cistanche deserticola,פגיעה מוחית, סך גליקוזידים, פוליסכרידים, אוליגוסכרידים, מסלול Nrf-2/Keap-1

cistanche amazon deserticola

מבוא

שבץ מוחי נחשב לגורם עיקרי למוות ולנכות בעולם (Donnan et al., 2008). כמעט 87 אחוזים ממקרי השבץ מופעלים על ידי שבץ איסכמי (Ovbiagele and Nguyen-Huynh,2011). נכון לעכשיו, הסוכן היעיל ביותר והתרופה היחידה שאושרה על ידי ה-FDA המשמשת לטיפול בשבץ איסכמי הוא מפעיל רקמת פלסמינוגן רקקומביננטי. עם זאת, מספר גדול של חולי שבץ אינם מגיבים לתרופה זו, בשל חלון הזמן הטיפולי הצר שלה וסיכון רציני לסיבוכים דימומיים (Lee et al., 2012; Schellinger and Kohrmann, 2014). האתגר העיקרי של טיפול תרומבוליטי הוא פציעת איסכמיה/פרפוזיה (I/R), הנחשבת לגורם העיקרי לפציעה מוחית ולהרס תפקוד. רפרפוזיה לאחר איסכמיה מוחית מגבירה את הסיכון לדימום מוחי תוך כדי פגיעה נוירווסקולרית וייצור מיני חמצן פעילים יתר (ROS) אשר פוגעים במחסום הדם-מוח (Alluri et al., 2015). מספר מחקרים אישרו שהשיבוש ב-BBB הוא הגורם העיקרי לפתוגנזה של שבץ איסכמי (Cao et al., 2016b).

BBB מורכב בעיקר מתאי אנדותל, פריציטים, אסטרוציטים, נוירונים וממברנות בסיס. מרכיבי הליבה של BBB הם תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים מוחיים המחוברים באמצעות צמתים הדוקים, ובכך מגבילים מולקולות אקסוגניות לתוך המוח. השינויים הפתולוגיים של צמתים הדוקים - במיוחד occludin, claudin-5 ו-zonulaoccludens-1 (ZO-1) - משפיעים באופן משמעותי על תפקוד BBB במהלך שבץ איסכמי, במיוחד חדירות מחסום (Liuet al., 2014 ; Hu et al., 2018; Liu et al., 2019). במהלך תקופות I/R, ROS מוגזם הוא אחד הגורמים העיקריים המובילים לנזק ישיר של נוירונים במוח (Ding et al., 2014). ייצור יתר של ROS מוביל להתדרדרות של צמתים מסוימים ולהפרעה ב-BBB, מה שגורם למולקולה אקסוגנית של המוח דרך ה-BBB, מה שמוביל להחמרה בנזקי מוחי (Cheon et al., 2016; Zhang QY et al.,2017). לכן, הגנה על ה-BBB על ידי נוגדי חמצון נחשבה כדרך פוטנציאלית למניעת פגיעה חוזרת.

מלבד התמוטטות ה-BBB, I/R עלול לגרום לפציעה פנימית וכלי דם ולמוות נוירוני (Jung et al., 2010). במהלך שבץ מוחי, מוות מוגבר של תאי עצב עלול לנבוע מלחץ חמצוני (Chi et al., 2018), וממחקרים רבים הראו כי ROS מחמיר את חומרת השבץ ואת הנזק הנוירולוגי (Kondo et al., 1997; Crack et al., 2001; Crack et al., 2006). למרות שניסויים קליניים לא הביאו תוצאות משביעות רצון, הגנה נוירובית היא עדיין אסטרטגיה מבטיחה לטיפול בשבץ איסכמי חריף (Moretti et al., 2015). לפיכך, מציאת תרופות נוירו-הגנה יעילות לטיפול בשבץ היא יתרון לחולי שבץ.

הרפואה הסינית המסורתית (TCM) נוקטת באמצעים להתערבות נגד חוסר האיזון הפנימי של הגוף (Gaire, 2018). בשל הפתוגנזה המורכבת של שבץ איסכמי, ההשפעה הרב-פקטוריאלית של TCM ומרכיביו הפעילים ממלאים תפקיד קריטי בטיפול בשבץ מוחי. Cistanche deserticola YC Ma, נפוץ באזורים צחיחים או צחיחים למחצה ברחבי מונגוליה וצפון מערב סין, היה צמח TCM בשימוש נרחב לטיפול במחלות שונות כגון שכחה ודיכאון במשך יותר מ-1,000 שנים בסין. מחקרים פרמקולוגיים מודרניים הצביעו על כך שהתמציות הגולמיות מ-C. deserticola הראה פעילויות תרופתיות מרובות, כגון שיפור תפקוד למידה וזיכרון, הגנה עצבית, שיפור חסינות, נוגדי חמצון, אנטי-אייג'ינג ואנטי עייפות (Ko and Leung, 2007; Wang et al., 2012; Li et al., 2015). ניתוח כימי של C. deserticola הראה שהמרכיבים העיקריים שלו כוללים גליקוזידים פנילתנואידים, אירידואידים, פוליסכרידים ואוליגוסכרידים (Jiang and Tu,2009). עם זאת, הרכיבים הפעילים של C. deserticola להגנה על המוח אינם ברורים במיוחד.

התכונה הנוירו-פרוטקטיבית של C. deserticola מרמזת על הפוטנציאל הטיפולי שלו במחלות הקשורות לקוגניטיביות כגון שבץ מוחי ודיכאון, כמו גם מחלת אלצהיימר (Wang et al.,2017). עם זאת, המחקר על ההשפעה של התקפי C. deserticola, כולל מרכיביו הפעילים ומנגנוני הפעולה, מוגבל מאוד. בעבודה הנוכחית, בדקנו את ההשפעה המגנה של שלוש תמציות מ-C. deserticola, סך גליקוזידים (TGs, phenylethanoid glycosides וגליקוזידים אחרים), פוליסכרידים (PSs) ואוליגוסכרידים (OSs) על פציעות I/R מוחיות. הממצאים שלנו עשויים לתרום ליישום הקליני המדויק של C. deserticola ולספק סוכן מועמד לטיפול בשבץ מוחי.

Cistanche יש לאפוטנציאל הרפיוטיבמחלות הקשורות לקוגניטיביות כמו שבץ ודיכאון,כמו גם מחלת אלצהיימר.

חומרים ושיטות

כימיקלים וריאגנטים

הגבעולים של Cistanche deserticola נרכשו מאלשאן, מונגוליה הפנימית, וזוהו על ידי אחד המחברים (P.-F. Tu). TGs, PSs ו-OSs הוכנו לפי השיטה שדווחה קודם לכן (Gao et al., 2015) . ניתוח כמותי של TGs בוצע על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) כפי שתואר קודם לכן (Li et al, 2019), ו-itchromatogram מוצגת באיור 1. המרכיבים העיקריים של TGs הם echinacoside, tubuloside A, acteoside, isoacteoside ו-2'- אצטילקטאוזיד; התוכן שלהם הוא 163.05 מ"ג/ג', 4.125 מ"ג/ג', 41.66 מ"ג/ג', 22.655 מ"ג/ג' ו-12.045 מ"ג/ג', בהתאמה. התוכן של PSs ו-OSs הוא 69.42 אחוזים ו-65.24 אחוזים, בהתאמה, כפי שנקבע על ידי HPLC וניתוח חומצה גופרתית פנול, בהתאמה (Zhang A. et al., 2018; Shi et al, 2019).

ההתייחסויות הסטנדרטיות של echinacoside (A0282), tubulosideA (A0942), acteoside (A0280), isoacteoside (A0281) ו-2'-acetylacteoside (A0943) נרכשו מ-Chengdu MustBiotechnology (Sichuan, סין). הטהרה של כל התקנים הם יותר מ-98 אחוז. ערכות Nissl stain H&E נקנו מ- Boster (Wuhan, סין). Edaravone (T0407-1) ​​נקנה מ-TargetMol (שנחאי, סין). ארנב נגד חולדות MAP-2 (ab32454), Nrf-2(ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620), ועכבר נגד חולדות CD31 (ab24590) נרכשו מ- Abcam Inc (Cambridge, MA, ארה"ב). ארנב נגד חולדות Claudin5 (BS1069),ZO-1 (BS9802M), ו-Occludin (BS72035) נקנו מ-Bioworld Technology (נאנג'ינג, סין). Cell SignalingTechnology Inc. (בוסטון, MA, ארה"ב) הייתה המקור לסינפסין -1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-SmoothMuscle Actin (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) נרכש מ-Proteintech Group, Inc. (שיקגו, ארה"ב). נוגדנים משניים סופקו על ידי Zhongshan GoldenBridge Biotechnology (בייג'ינג, סין). Hoechst 33258 הושג מביוטיים (ג'יאנגסו, סין).

איור 1|כרומטוגרמות HPLC של ה-TGs (A) והפניות סטנדרטיות (B).

חיות

חולדות Sprague-Dawley (זכר, במשקל 250-300 גרם) הושגו מ-Vital River Laboratory Animal Technology (בייג'ינג, סין) ושוכנו בחדר ממוזג שנערך במחזור אור/חושך של 12 שעות. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ARRIVE למחקר בבעלי חיים (Kilkenny et al.,2010; McGrath et al., 2010), ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מרכז הבריאות למדעי הבריאות של אוניברסיטת פקינג (LA2019123).

פרוטוקולים של ניסויים בבעלי חיים

החולדות עברו MCAO/R, כפי שתואר קודם (Wang et al., 2018). בקצרה, נחשפו עורק הצוואר המשותף השמאלי (CCA), העורק הצוואר החיצוני (ECA) והעורק הצוואר הפנימי (ICA), ותפר 3-0 ניילון הוחדר מה-ECA לתוך ה-ICA עד שהגיע לעורק המוח האמצעי ( MCA). לאחר 1.5 שעות של חסימת MCA, בוצע הדמיה של הפרפוזיה מחדש על ידי הסרת החוט. במהלך ההליך הניתוחי, טמפרטורת הגוף של כל החולדות נשמרה על 37.0 מעלות.

מנהל התרופות

החולדות הופרדו באופן אקראי לשש קבוצות באמצעות תוכנת SPSS גרסה 22.0 כמתואר (Jiang et al., 2014): normalgroup (NOR); קבוצת מודל (MOD); קבוצת edaeavone (תרופה חיובית, 6 מ"ל/ק"ג, EDI); קבוצת TGs (280 מ"ג/ק"ג, TGs); קבוצת PSs (280 מ"ג/ק"ג, PSs) וקבוצת OSs (280 מ"ג/ק"ג, OSs). TGs, PSs ו-OSs ניתנו ig פעם ביום לאחר MCAO/R במשך 14 ימים. קבוצות NOR ו-MOD טופלו ב-Normalsaline. מספרי החיות מוצגים בטבלה 1.

טבלה 1|מספר בעלי חיים לקבוצות ניסוי שונות ופרמטרים שונים ב-14 ימים לאחר מתן.

מדידת ציוני משקל וציוני גירעון נוירולוגי שונה (mNSS)

משקל הגוף נוטר ביום ה-14 באמצעות סקאלה דיגיטלית של ADVENTURE™ (OHAUS, ניו ג'רזי, ארה"ב). ה-NSS הוערך על פי השיטה שתוארה על ידי FJ Wang (Wang et al., 2018), עם תיקונים קלים.

2, 3, 5-צביעת טריפנילטטרזוליום כלוריד (TTC)

נפח האוטם נמדד כפי שתואר קודם (Wanget al., 2015). בקצרה, המוחות חולקו לשבעה בלוקים קורונליים ברווח שווה (2 מ"מ). קטעים אלה הוכתמו ב-2% TTC (Coolaber, בייג'ינג, סין) ב-37 מעלות למשך 15 דקות. נפח אוטם ( אחוזים )=(נפח ההמיספרה האיסכמית האיפסי-צדדית-נפח ההמיספרה האיסכמית הנגדית)/נפח ההמיספרה האיסכמית הנגדית × 100.

Nissl ו-H&E Staining

החולדות הורדמו עמוקות, והמוח כולו הוסר במהירות מהגולגולת ותוקן באמצעות 4 אחוז פרפורמלדהיד והוטמע בשעווה פרפין, ונחלק לפרוסות בעובי 7 מיקרומטר. הקטעים היו מוכתמים בניסל ו-H&E. במחקר זה נלכדו שישה שדות אקראיים של 200 ×200 מיקרומטר בכל דגימת רקמה עם מיקרוסקופ אור. מספר הגופות של ניסל נספר בגרסה 6.0 של תוכנת IPP (Media Cybernetics, Bethesda, ארה"ב).

אוונס בלו מבחן

לחולדות הוזרק EB של 2 אחוזים (Coolaber Science & TechnologyCo., LTD) לאחר MCAO/R. שעתיים לאחר מכן, החולדות הורדמו וכל המוח הוסר במהירות והומוגג באצטון. הסופרנטנטים נותחו ב-620 ננומטר על ידי קורא ספיגה של 800 TS (BioTek, ארה"ב).

מדידת הפעילויות של Catalase (CAT), Superoxide Dismutase (SOD), Malondialdehyde (MDA) וגלוטתיון פרוקסידאז (GSH-Px)

כל דגימות הסרום עברו צנטריפוגה ב-4,000 × סל"ד למשך 15 דקות ב-4 מעלות ולאחר מכן נותחו כדי לזהות את הפעילויות של MDA, CAT,SOD ו-GSH-Px בהתאם להוראות היצרן (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. , חרסינה).

Western Blotting Analysis

רקמות מוח (100 מ"ג) שנאספו מכל חולדה עברו הומוגניות וסוכנו במאגר תמוגה RIPA, ולאחר מכן נותחו כדי לזהות את ריכוז החלבון באמצעות ערכת BCA (Beijing TransGenBiotech Co., Ltd.). החלבונים הכוללים של רקמות הועמסו על 10 אחוזים SDS-PAGE ג'לים והועברו על גבי ממברנה ניטרוצלולוזה. הממברנה נחסמה באמצעות 5 אחוז חלב רזה, ולאחר מכן הודגרה למשך הלילה עם נוגדנים ראשוניים ב-4 מעלות. לאחר מכן הודגרה הממברנה עם נוגדן משני. ניתוח הכתם המערבי נותח באמצעות מערכת הדמיה דיגיטלית של Kodak (5200 Multi, Tanon, סין).

ניתוח אימונופלואורסצנטי

בוצעו צביעה אימונופלואורסצנטית עבור CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 ו-Keap-1. נוגדנים ראשוניים נגד Nrf-2,CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN,PSD95, MAP-2 ו-Keap-1 דוללו ל- 1:200 ו-1:100, בהתאמה. הנוגדנים המשניים של Alexa Flur 488 mouseanti-rabbit IgG ו-rhodamine (TRITC) עז נגד ארנב IgG היו מדוללים שניהם ל-1:200. הגרעינים נצבעו על ידי Hoechst 33258. התמונות נלכדו באמצעות מערכת הדמיה פתולוגית כמותית של Vectra® Polaris™ (PerkinElmer, ארה"ב). ביטוי החלבון נותח באמצעות תוכנת IPP גרסה 6.0.

ניתוח סטטיסטי

כל הנתונים תוארו כממוצע ± SD. תוכנת SPSS גרסה 22.0בוצעה לצורך ניתוח סטטיסטי. נעשה שימוש ב-ANOVA חד כיווני בהשוואה בין קבוצות שונות. P < 0.05="" נחשב="" להפרש="">

הגנה עצבית לפיתוח גוף cistanche

תוצאות

TGs מגדילים את משקל הגוף ומפחיתים נזקי מוח בחולדות MCAO/R

לאחר 14 ימים של ריפוי עם TGs, PSs, Oss ו-EDI, הוערכו משקלי הגוף, החסרים הנוירולוגיים ונפחי האוטם של חולדות I/R. התוצאות הראו כי משקלי הגוף בקבוצת MOD ירדו במידה ניכרת, בעוד שהמשקלים המופחתים ב-TGs, PSs ו-EDI גדלו ללא ספק (איור 2A). ציוני הגירעון הנוירולוגי הורדו באופן משמעותי על ידי EDI ו-TGs (איור 2B). פרוסות המוח בחולדות מקבוצת NOR היו אדומות עמוקות ולא היו אוטמים, בעוד שהחולדות מקבוצת ה-MOD הראו אוטם מוחי חד-צדדי גדול. לאחר טיפול ב-TG, נפחי האוטם הופחתו באופן משמעותי (איורים 2C, D). הטיפול ב-PSs ו-OSs לא הראה השפעה ברורה על המדדים לעיל. הנתונים שלעיל הראו ש-TGs יכול להקל באופן ניכר על הפגיעה המוחית הנגרמת על ידי I/R, אך PSsand OSs לא יכלו.

איור 2|TGs מפחיתים את הנזק המוחי הנגרם על ידי איסכמיה מוחית מוקדית חולפת.

TGs משפר את הנזק ההיסטופתולוגי בחולדות MCAO/R

על מנת לקבוע חלק מההשפעות של TGs, PSs ו-OStreatment על נזקים היסטופתולוגיים, נעשתה צביעת H&E כדי לחשוף נזק פתולוגי. המבנים ההיסטומורפולוגיים של המוח בקבוצת NOR היו מסודרים באופן קבוע. השינויים המורפולוגיים בקבוצות ה-TGs היו קלים יותר מאלה שבקבוצת MOD. עם זאת, קבוצות הטיפול ב-PSs ו-OSs לא הראו שיפור משמעותי בשינויים המורפולוגיים (איור 3).

TGs מחליש פגיעה עצבית לאחר חולדות הנגרמות על ידי I/R

צביעת Nissl הראתה את השינויים ההיסטופתולוגיים של נוירונים בפנומברה של האזור האיסכמי. כפי שמוצג באיור 4, לנוירונים הנורמליים היה גרעין ברור ומבנה שלם. בקבוצת MOD, לנוירונים היו חללים בין-תאיים מוגדלים. גופות הניס נעלמו, מכווצות ומוכתמות עמוקות. עם זאת, שינויים אלה נצפו רק לעתים רחוקות בקבוצות EDI, TGs ו-PSs. תוצאות אלו המחישו כי TGs ו-PSs יכולים להחליש משמעותית פגיעה נוירונית הנגרמת על איסכמיה/פרפוזיה חוזרת.

TGs מחליש שיבוש BBB לאחר חולדות שטופלו ב-I/R

Evans blue assay היא שיטה קלאסית לחקר השינוי בחדירות BBB. תוצאות הניסוי הראו כי כחול אוונס מוגבר נצפה בקבוצת MOD, בעוד שהיה ירידה משמעותית בכחול אוונס בחולדות שטופלו ב-TGs וב-EDI. יתר על כן, לא היה הבדל משמעותי בין קבוצות טיפול ב-PSs ו-OSs (איור 5). תוצאות אלו הצביעו על כך ש-TGs יכולים להחליש באופן משמעותי את הפרעת BBB.

איור 3|TGs משפר את הנזק ההיסטופתולוגי בחולדות MCAO/R.

TGs מקדמים אנגיוגנזה ב-I/R Injured Rats

מחקרים עדכניים יותר מראים שאנגיוגנזה ממלאת תפקיד קריטי בהחלמה תפקודית נוירולוגית ותוצאה פרוגנוסטית לאחר שבץ איסכמי חריף (Yuen et al., 2015). כדי להעריך את ההשפעות של TGs, PSs ו-OSs על אנגיוגנזה, נעשה שימוש ב-CD31 ו-a-SMA כדי לכמת את המספרים הנימים. צביעה אימונופלואורסצנטית הראתה כי קבוצת MOD גרמה לירידה ניכרת בביטויים של CD31 (איורים 6A, B) ו-a-SMA (איורים 6C, D) בחצירה של אזורים איסכמיים של I/Rrats, בהשוואה לחולדות רגילות. תוצאה זו המחישה ש-I/R עלול לגרום לנזק לכלי הדם ב-cortex penumbra של ההמיספרות האיסכמיות. עם זאת, הטיפול ב-TGs ו-EDI הגדילו בצורה יוצאת דופן את צפיפות הנימים, אנגיוגנזה וארטריוגנזה כפי שמצוין על ידי ביטויים מוגברים של CD31 ו-a-SMA. תוצאות אלו מצביעות על כך ש-TGs יכולים לקדם אנגיוגנזה בפנומברה האיסכמית של חולדות I/R, אך ה-PSsand OSs לא יכלו.

TGs מגדילים את הביטוי של Tight JunctionProteins בחולדות שנפגעו ב-I/R

הפרעה ב-BBB יכולה להעלות את תכולת המים במוח ואת התנפחות הרקמות, מה שמוביל לפגיעה מוחית. חלבוני צומת הדוקים הם מרכיבים מבניים חשובים של BBB (Tenreiro et al.,2016; Jiang et al., 2018). כדי לבדוק אם טיפול ב-TGs, PSs ו-OS לאחר שבץ עלולים להשפיע על שלמות BBB, הביטויים של ZO-1, claudin-5 ו-occludin בוצעו על ידי ניתוח אימונופלואורסצנטי. התוצאות הצביעו על כך שהביטויים של claudin-5, occludin ו-ZO-1 היו מופחתים באופן ניכר בקבוצת MOD. עם זאת, הם גדלו באופן משמעותי לאחר 14 ימים של מתן TGs. PSs ו-OSsgroups לא הראו שינויים משמעותיים בביטויי חלבון אלה (איור 7). נתונים אלה הצביעו על כך שה-TGs יכולים לווסת את ביטויי החלבון בצומת הדוקים וככל הנראה לשמור על שלמות BBB לאחר פציעת I/R.

TGs מגדילים את כיסוי הפריציטים על נימי דם בחולדות שנפגעו ב-I/R

כיסוי פריציטים על נימים ממלא תפקיד קריטי בשמירה על שלמות ה-BBB (Armulik et al., 2010; Daneman et al., 2010). לפיכך, בדקנו האם ניתן להגדיל את כיסוי הפריציטים על ידי טיפול ב-TGs, PSs ו-OSs. תוצאות ניתוח עוצמת החיסון הראו שביטויי PDGFRb ו-CD31 ירדו באופן דרמטי בקבוצת MOD. מתן TG לחולדות ה-I/R התאוששו באופן משמעותי או אפילו הגדיל את עוצמות הביטוי של ה-PDGFRb ו-CD31, אך נצפתה הבדלים בקבוצות הטיפול ב-PSs ו-OSs (איור 8). לפיכך, טיפול ב-TGs יכול להגדיל משמעותית את כיסוי הפרציטים. ממצאים אלה אישרו עוד כי TGs יכולים לשמור על שלמות BBB לאחר I/R.

TGs מקדמים שיפוץ עצבי בחולדות נפגעות

על פי מחקרים רבים, נוירוגנזה לאחר שבץ יכולה לשפר באופן משמעותי את ההתאוששות התפקודית (Grefkes andWard, 2014; Zhang et al., 2019). חלבוני Synaptophysin (SYN), צפיפות פוסט-סינפטית 95 (PSD-95) וחלבון 2 (MAP-2 הקשור למיקרו-צינוריות) שימשו כסמנים לבחינת הפלסטיות העצבית בחציית המוח האיסכמית של הקורטקס. על מנת להעריך את ההשפעות של TGs, PSs ו-OStreatment על נוירוגנזה בחולדות פגועות I/R, בוצעו theimmunofluorescence ו-Western blot עבור ביטויי SYN, PSD95 ו-MAP-2. כפי שמוצג באיורים 9 ו-10, רמות הביטוי SYN, PSD95 ו-MAP-2 ב-I/Rrats לאחר 14 ימים של פרפוזיה חוזרת ירדו בהשוואה לחולדות NOR, בעוד שה-TGs וה-PSs יכלו לווסת משמעותית את רמות הביטוי שלהם. . לקבוצת OSs היה שינוי לא משמעותי בהשוואה לקבוצת MOD. הנתונים הצביעו על כך שהריפוי TGs ו-PSs הצליחו לקדם באופן דרמטי שיפוץ עצבי לאחר פציעת I/R.

TGs Alter Nrf-2 ושומרים-1 ביטויים ב-I/R פצועים חולדות

מתח חמצוני הוא מנגנון פתוגני עיקרי בפציעת I/R (Ya et al., 2018; Yu et al., 2018). המחקרים אימתו כי Nrf-2 הוא רגולטור ראשי של תגובות נוגדות חמצון (Thompson et al.,2015). כדי לחקור תגובות חמצון בתיווך Nrf-2 ו-Keap-1 לאחר פגיעה ב-I/R, הערכנו את הביטוי הציטופלזמי וכן את הטרנסלוקציה הגרעינית של Keap-1. בינתיים, הביטוי של Nrf{{7 }} ב-I/R פצוע רקמות המוח של חולדה נבדקו גם הם (איורים 10 ו-11). לפי ניתוח האימונופלוארסצנציה, נמצא כי Nrf-2 ממוקם בעיקר בציטופלזמה בקבוצת NOR. בקבוצת ה-TGs, הביטוי של Nrf-2 בלוקליזציה ציטופלזמית היה מווסת מטה, אך הוסדר בגרעין, ונצפה גם ביטוי מופחת של Keap-1. הנתונים הראו שההגנה המוחית של TGs יכולה להיות קשורה לאפונון של Nrf-2 ו-Keap-1.

איור 4|TGs מחליש פגיעה נוירונית לאחר חולדות שטופלו ב-I/R.

TGs מחליש את מתח חמצון רקמות המוח בחולדות נפגעות I/R

על מנת לאשר את ההשפעות נוגדות החמצון של TGs, הפעילויות של SOD, CAT, GSH-Px ו-MDA הוערכו במטופלים שנפגעו ב-I/R. באיור 12, תכולת ה-MDA גדלה באופן ניכר בקבוצת ה-MOD, ובמקביל, הפעילות של SOD,CAT ו-GSH-Px ירדה, בהשוואה לחולדות הרגילות. לעומת זאת, טיפול ב-TGs הוביל לירידה משמעותית בתוכן של מד"א ועלייה בפעילות של SOD, CAT ו-GSH-Px. תוצאות אלו אישרו עוד יותר את פעילות נוגדת החמצון של TGs.

דִיוּן

מחקרים רבים מצביעים על כך של-TCM C. deserticola יש פעילויות ביולוגיות נרחבות, למשל שיפור יכולת הלמידה, הזיכרון והחסינות (Dong et al., 2007; Jiang and Tu, 2009; Wanget al., 2017; Xia et al., 2018 ). עם זאת, הרכיבים הפעילים של C. deserticola להגנה עצבית נותרה לא ברורה. העבודה הנוכחית שואפת לסנן את הרכיבים הפעילים מ-C. deserticolaagainst שבץ איסכמי במודל MCAO/R. שלוש תמציות מ-C. deserticola (TGs, PSs ו-OSs) שימשו להערכת השפעותיהן על חולדות MCAO/R, כמו גם מנגנונים אפשריים.

שבץ הוא מחלה חריפה של כלי דם במוח. מחקרים אפידמיולוגיים מראים ששבץ נפוץ יותר בגברים מאשר בנשים (Sealy-Jefferson et al., 2012; Guzik and Bushnell, 2017). לפיכך, בניסוי שלנו, חולדות זכר אומצו לבדיקות. התוצאות שלנו הוכיחו שאינדוקציה של I/R האצה את הלחץ החמצוני ואת נפח האוטם, שבירת BBB והובילה לפגיעה עצבית וכלי דם במוח. לאחר ההקרנה, נמצא כי TGs מקטינים את נפח האוטם ומעודדים חידוש עצבי ואנגיוגנזה. יתרה מכך, TGs נצפו כדי לשמור על שלמות BBB לאחר פציעת I/R. להיפך, PSs ו-OS לא מביאים הקלה משמעותית לפציעת I/R. לפיכך, TGs נחשבים לחלק הפעיל העיקרי של C. deserticola forneuroprotection, פוטנציאלית באמצעות קידום עצבים מחדש, אנגיוגנזה ושלמות BBB באמצעות הפעלת מסלול Nrf-2/Keap-1.

איור 5|TGs מחליש שיבוש BBB לאחר פציעת I/R.

עדויות מצטברות מצביעות על כך שהקמת מחזור צדדי יעיל חשוב באופן משמעותי למניעת היווצרות של אוטם ופנומברה איסכמית, והיא טיפול קריטי בשלב מוקדם של שבץ איסכמי (ElAli, 2016; Iwasawa et al., 2016). התפשטות של תאי אנדותל כלי דם ותאי שריר חלק לאחר אוטם איסכמי קובעת את הקמת מחזור הדם הצדדי. עם זאת, למודלים של איסכמיה יש תופעה משותפת - כלומר, מתח חמצוני קיים באופן נרחב במיקרו-וסקולטורה של המוח. נתוני מחקר הראו שמספר רב של נוגדי חמצון עלולים להפריע לתפקוד ה-BBB ולתכונות האנגיוגנזה (מנטור ופישר, 2017). CD31 ו-a-SMA הם הסמנים של תאי אנדותל כלי דם וכן תאי שריר חלק, בהתאמה (Saboor et al., 2016). כדי לחקור את ההשפעה על התפשטות התאים הנ"ל של התמציות מ-C.deserticola, בדקנו את הביטויים של CD31 ו-a-SMAin homogenate penumbra איסכמית מוחית. הנתונים שלנו הראו ש-TGs שיפרו בצורה מדהימה את הביטויים של CD31 ו-a-SMA. עם זאת, לא היו הבדלים משמעותיים עבור קבוצות PSs ו-OSs. לכן, הסקנו ש-TGs עשויים להפחית נזק מוחי על ידי קידום אנגיוגנזה באמצעות הגדלת הביטויים של CD31 ו-a-SMA, בעוד שPSs ו-OSs לא סיפקו הגנה כזו מפני נזק מוחי. תוצאות אלו אישרו עוד שרק TGs יכול למנוע פגיעה I/R מוחית.

שבץ איסכמי יכול להיחשב כתוצאה ממוחין הנגרמת על ידי פגיעה בפלסטיות העצבית או עיצוב מחדש של אזורי מוח. רוב חולי השבץ סובלים מליקויים נוירולוגיים. הפעלת נוירוגנזה היא אסטרטגיה מבטיחה לחולי שבץ לשיפור התפקודים הנוירולוגיים שלהם (Cramer and Chopp, 2000). נוירוגנזה משתתפת ישירות בהתאוששות של תפקוד נוירולוגי לאחר I/Rinjury במוח (Zhang et al., 2019). מחקרים קודמים מראים ש-TGs יכולים לשפר את שיעור ההישרדות של תאי פירמידה בהיפוקמפוס ולעורר נוירוגנזה (Lian et al., 2017). מתח חמצוני גורם לאובדן נוירונים במהלך הרבה מחלות, כגון פרקינסון, שבץ מוחי וכן הלאה (Duan and Si, 2019; Singh et al., 2019). Nrf-2מתמלל הרבה גנים הקשורים להגנה עצבית באזור המקדם שלהם, בעיקר כולל SOD, MDA, CAT ו-g glutamyl cysteine ​​ligases וכו' (Satoh et al., 2006). חלבוני SYN, PSD-95 ו-MAP-2, הקשורים בקשר הדוק להיווצרות סינפטית והולכה עצבית, יכולים להיחשב כסמנים של פלסטיות עצבית מחקרית באזור הפנימברה האיסכמית. לאחר מחקר, מצאנו שהריפוי עם TGs יכולים להגביר באופן משמעותי את הביטויים של PSD95, SYN ו-MAP-2, מה שמצביע על כך שההגנה המוחית של TGs הייתה בקורלציה עם הפלסטיות הנוירונית המוגברת במהלך I/R. עם זאת, חבל שאין הבדל ברור גם עבור PSss כקבוצות מערכת הפעלה. תוצאות אלו הצביעו על כך ש-TGs יכולים לשפר את הנוירופלסטיות לאחר פגיעה I/R מוחית.

מחקר הדמיה של חולי שבץ הראה שניתן לחשוב על תפקוד לקוי של BBB כתכונה בולטת של המוח הפרי איסכמי (Bang et al., 2007). ה-TJs, המורכבים מחלבונים ציטופלזמיים, חלבונים טרנסממברניים ומולקולות הדבקה בצמתים בין תאי אנדותל נימיים, חשובים מאוד בשמירה על שלמות BBB (Ye et al., 2019). ביניהם, ZO-1, claudin-5 ואוקלודין הם החלבונים החשובים ביותר ב-TJs. עדויות מצטברות מצביעות על כך שהחדירות המוגברת של BBB הנגרמת על ידי איסכמיה תואמת בדרך כלל את השינויים של ZO-1, claudin-5 ו-occludin (Cao et al.,2016a; Page et al., 2016; Yu et al. ., 2017; Liu et al., 2018). בעבודה זו, התוצאות הוכיחו שלמרות ש-TGs יכולים להגביר באופן משמעותי את הביטויים של חלבוני ZO-1, claudin-5, andoccludin ברקמות מוח הנגרמות על ידי MCAO, גם PSss או OSs לא עשו זאת. ה-BBB מורכב מתאי אנדותל מוחיים והוא קשור קשר הדוק לפריציטים (Nyul-Toth et al., 2016). Pericytes חיוניים לשלמות BBB (Bell et al., 2010). שבץ איסכמי גורם למוות של פריציטים וניתוק מתאי אנדותל במוח בשלב החריף, ובכך מערער את ה-microvasculature ושינוי תכונות BBB (Zechariahet al., 2013). הנתונים שלנו הראו ש-TGs יכולים להגביר את כיסוי הפריציטים על נימי הדם ולהגדיל את רמות הביטוי של ZO-1, קלאודין-5 ואוקלודין. תופעות אלו הוכיחו ש-TGs יכולים להגן ביעילות על שלמות BBB לאחר פגיעה I/R מוחית. לסיכום, TGs עשויים להחליש פגיעה מוחית במספר דרכים, כגון קידום אנגיוגנזה, שיפור הפלסטיות הנוירונית ושמירה על שלמות ה-BBB.

לאחר מכן חקרנו את מסלול האיתות כדי לחקור את המנגנון העומד בבסיס הגנת המוח של TGs. תהליך הפגיעה ב-I/R הוא רב גורמים, ולכן מנגנונים רבים מעורבים בפתוגנזה. מתח חמצוני הוא גורם סיכון בסיסי התורם לפציעה מוחית הנגרמת על ידי I/R (Suda et al., 2013), כגון נזק למבנה BBB, חוסר תפקוד אנדותל כלי דם והחמרה של פגיעה עצבית איסכמית (Xiong et al., 2015; Caglayan et al. al., 2019; Priestley et al., 2019). לפיכך, מתח חמצוני הפך למטרה טיפולית מושכת בפגיעה מוחית הנגרמת על ידי I/R. אנזימים שלב 2, המתווכים על ידי גורם גרעיני E2-relatedfactor-2 (Nrf-2), יש נחשב כאמצעי חשוב שבאמצעותו נוירונים מגנים על עצמם מפני עקה חמצונית (Suzukiand Yamamoto, 2015; Ya et al., 2018). עדויות מצטברות מצביעות על כך שהפעלה של Nrf-2 במהלך I/R היא יעד טיפולי פוטנציאלי להגנה עצבית (Ding et al., 2015; Zhang R. et al., 2017). Nrf-2, כמווסת חשוב של הגנה נוגדת חמצון אנדוגנית, מתווך את רמת ה-heme oxygenase 1 (HO-1) ואנזימים נוגדי חמצון אחרים, כגון NAD(P)H quinone oxidoreductase1 (NQO1), SOD, CAT, GSH ומד"א (Siow et al., 2007; Dinget al., 2014). יתר על כן, Nrf-2 ממלא תפקיד רגולטור חשוב באנגיוגנזה. המחקר הנוכחי מראה כי Nrf-2 יכול לשפר ולהפעיל באופן משמעותי בתהליך של התפתחות כלי דם (Wei et al., 2013).

כפי שתואר בעבר (Jiang and Tu, 2009), TGs מכילים הרבה תרכובות ביו-אקטיביות, למשל, echinacoside, tubuloside A,acteoside, isoacteoside ו-2'-acetylacteoside, וחלקם הראו תפקודים נוירו-פרוטקטיביים לאחר פגיעת I/R מוחי (Penget al). ., 2016). לאכינאקוסיד יש הרבה השפעות תרופתיות, כגון נוגד חמצון, אנטי-הזדקנות, הגנה עצבית, אנטי דלקת, קידום של ציקטריזציה, הגנה על הכבד, קידום יצירת עצמות ופעילויות אנטי-גידוליות (Yu et al., 2016; Li et al., 2018; Zhang Y. et al., 2018; Ji et al., 2019; Xu et al., 2019). לאחרונה, Echinacoside זוהה כנוגד חמצון חזק במערכת העצבים המרכזית (Lu et al., 2016). Echinacoside יכול לצמצם את תוכן ה-MDA ולשפר את הפעילויות של SOD ו-GSH Px בפגיעה מוחית באיסכמיה, וניתוח עגינה מולקולרי הראה כי Echinacoside עשוי להיקשר ל-Keap-1, מה שמוביל לטרנסלוקציה הגרעינית של Nrf-2 (Li et al. , 2018). המחקר של Xia הראה שאקטאוזיד יכול להפחית את נפח האוטם ואת תכולת המים במוח כדי לשפר את החסרים הנוירולוגיים בחולדות MCAO/R באמצעות הפחתת מתח חמצוני (Xia et al., 2018). מחקרים אחרים הוכיחו שאיזואקטאוזיד יכול להגביר את הפעילות של אנזימים נוגדי חמצון תאיים, SOD ו-CAT בתאי V79-4 שטופלו ב-H2O (Chae et al., 2005). בהתבסס על הדיווחים לעיל על התרכובות הפעילות הכלולות ב-TGs, ניתן להסיק ש-TGs יכולים להגן מפני שבץ איסכמי באמצעות מסלולי נוגד חמצון.

Li דיווח על ההשפעות הנוירו-פרוקטטיביות של phenylethanoidglycosides (PhGs) על אפופטוזיס המושרה על ידי H2O2- על תאי PC12 דרך מסלול ה-Nrf2/ARE (Li et al., 2018). PhGs אלה דוכאו באופן משמעותי על ידי הפעלת טרנסלוקציה גרעינית Nrf2 והגברת הביטויים של HO-1, NQO1, תת-יחידה קטלטית של גלוטמט-ציסטאין ליגאז (GCLC), ותת-יחידה מגבילה של גלוטמט-ציסטאין ליגאז (GCLM) (Li et al., Gong et al., 2018 אל., 2019). לכן, ממצאים אלה מצביעים על כך שמסלול Nrf-2/ARE ממלא תפקיד מכריע בהשפעות הגנה מתווכות PhGs על תאי עצב. באופן דומה, במחקר זה, מצאנו ש-TGs יכולים להפחית את רמת ה-MDA ולהגדיל את רמות SOD, CAT ו-GSH-Px בחולדות I/R. thecytoplasm, ולהקטין באופן משמעותי את ביטוי Keap-1. לכן, מסלול Nrf-2/Keap-1 עשוי להיות מעורב בהשפעות נוירו-פרוטקטיביות בתיווך TGs. אימות נוסף של מסלול זה יתבצע בעתיד בתרבית תאים במבחנה עם מודלים של פגיעה בחמצן-גלוקוז/חמצן מחדש. יתר על כן, C. תמציות deserticola ניתנו במחקר שלנו במשך 14 ימים ברציפות. מכיוון שנוירוגנזה של מבוגרים תשפיע על הפרשנות של השפעות נוירו-פרוטקטיביות במהלך 14 ימים של פרפוזיה חוזרת, לא ניתן לשלול נוירוגנזה בתכנון הניסוי הנוכחי שלנו בבחינת ההשפעה הנוירו-פרוטקטיבית של CTs. זוהי המגבלה של המחקר שלנו.

לסיכום, ה-TGs מ-C. deserticola הם שיכולים לשפר אנגיוגנזה ונוירוגנזה, כמו גם לשמור על שלמות ה-BBB בחולדות פגיעות I/R, אך לא ה-PSs ו-OSs. ההשפעות יכולות להיות מתווך על ידי הפעלת מסלול Nrf-2/Keap-1.

C. deserticolaיכול לשפראנגיוגנזה ונוירוגנזה.

למידע נוסף, אנא לחץ כאן.