הקשר בין ציקלו-אוקסיגנאז (COX-2) לבין מחלה הנגרמת על ידי היפוקסיה

למידע נוסף:ali.ma@wecistanche.com

פרוסטגלנדין תוך תאי E2 תורם למוות של תאים צינוריים פרוקסימליים המושרה בהיפוקסיה

קורל גרסיה-פסטורל, סלמה בניטו-מרטינז, ריקרדו ג'יי בוש1, אנה ב' פרננדז-מרטינז, פרנסיסקו ג'יי לוסיו-קזנה

תאים צינוריים פרוקסימליים (PTC) פגיעים במיוחד לאפופטוזיס הנגרמת על ידי היפוקסיה, גורם רלוונטי עבורמחלת כליות. שיערנו כאן שמוות PTC תחת היפוקסיה מתווך על ידי ייצור תלוי ציקלו-אוקסיגנאז (COX-2) של פרוסטגלנדין E,(PGE,), אשר אושר בתאי HK-2 פרוקסימליים אנושיים בגלל היפוקסיה (1 אחוז O,) הנגרמת אפופטוזיס (i) נמנעה על ידי COX-2(cyclo-מעכב oxygenase) ועל ידי אנטגוניסטים של קולטני פרוסטגלנדין (EP) ו-(ii) היה קשור לעלייה ב-PGE התוך תאי,(iPGE,) עקב וויסות עלייה של COX-1 -תלוי בהיפוקסיה }}(cyclo-חמצן). אפופטוזיס נמנעה גם על ידי מעכבים של טרנספורטר ספיגת פרוסטגלנדין PGT, מה שהצביע על כך ש-iPGE, תורם לאפופטוזיס הנגרמת על ידי היפוקסיה (להיפך, מוות PTC שנגרם על ידי היפוקסיה/חמצן מחדש נבע אך ורק מ-PGE חוץ תאי,). לפיכך, iPGE הוא שחקן חדש בפתוגנזה של פגיעה צינורית הנגרמת על ידי היפוקסיה ו-PGT עשוי להיות יעד טיפולי חדש למניעת נגעים תלויי היפוקסיה במחלות כליה.

ידוע היטב כי היפוקסיה צינורית היא גורם רלוונטי הן לאקוטית והן לכרוניתמחלת כליות'2 תאים צינוריים פרוקסימליים (PTC) פעילים מאוד במונחים של צריכת חמצן בגלל פעילותם הדורשת אנרגיה של ספיגה מחדש, וכתוצאה מכך, הם פגיעים להיפוקסיה. הוכח כי אפופטוזיס ממלא תפקיד רלוונטי ב-PTC תרבותי הנחשף להיפוקסיה, אך מסלולי האיתות האחראים על הפעלת המנגנון האפופטוטי לא נחקרו. אנו ואחרים גילינו כי פרוסטגלנדין E, (PGE,), מתווך שומנים חשוב של תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים ב-כִּליָה, ממלא תפקיד רלוונטי באיתות המוביל לאפופטוזיס PTC לאחר טיפול ב-cisplatin7, albumin8or leptin ו-gentamycin. בכל המקרים, נמצא שהעלייה ב-PGE תלויה בביטוי משופר של cyclo-oxygenase-2(COX-2)(ציקלו-אוקסיגנאז), אנזים שניתן להשראתו שיחד עם COX-1l, הוא השלב המגביל את הקצב בסינתזה של פרוסטגלנדינים. באדםכִּליָה, COX בסיסי-2(ציקלו-אוקסיגנאז)הביטוי פחות אינטנסיבי מזה של COX-1. COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)זוהה בפודוציטים ובחלקים מהלולאה של הנלה ושל כלי הדם הכליות בתנאים פיזיולוגיים.כִּליָהכולל PTC, ואולי תורם לפגיעה כלייתית. מעניין שהיפוקסיה מגבירה את הביטוי של COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)ו/או ייצור PGE,12-i7 בסוגי תאים רבים. למעשה, גילינו בעבר שהיפוקסיה משפרת את התוכן התוך תאי ב-PGE, כמו גם את שחרורו למדיום החוץ-תאי8. לכן, תיאורטית ייתכן ש-PGE מתווך את ההשפעה האפופטוטית של היפוקסיה על PTC.

רוב המחקרים על אפופטוזיס תלוית PGE התמקדו בעיקרם במנגנונים המערבים PGE חוץ-תאי מכיוון שמקובל ש-PGE מפעיל את השפעותיו הביולוגיות באמצעות הפעלה של קולטני פרוסטגלנדין מסדרת E בשילוב של פרוסטגלנדין G-פרוטיני פלזמה. EP1-4)1. עם זאת, במודלים מסוימים, PGE תוך תאי,(iPGE,) רלוונטי במוות של תאים אפופטוטי720-22. זה מרמז שכדי לגרום לאפופטוזיס, PGE צריך להגיע שוב למדיום התוך תאי ולהפעיל תת-קבוצה של קולטני EP, הממוקמים בתוך התא (קולטני iEP). מכיוון שהמשימה של לכידת PGE, נעשית בעיקר על ידי טרנספורטר ספיגת פרוסטגלנדין (PGT)23-26, עיכוב PGT מביא למניעת iPGE, מתווך מוות של תאים אפופטוטיים7.

בהתחשב ברקע זה, בעבודה הנוכחית, למדנו האם COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)עלייה תלויה ב-iPGE, רמות מתווך אפופטוזיס המושרה בהיפוקסיה ב-PTC.

לחץ ל- Cistanche אורגני למחלת כליות

שיטות

ריאגנטים.

AG1478, Bromocresolgreen (BG), PGE, AH6809, GW627368X, קריסטל סגול, תמיסות כחולות טריפן, Bromosulfophthalein (BRS), 3-(5'-Hydroxymethyl2'-furyl)-1-בנזיל אינדאזול (YC1), ואקטינומיצין D נרכשו מ-Sigma (סנט לואיס, MO, ארה"ב). Z-VAD-FMK ו-celecoxib היו מ-Calbiochem (Darmstadt, גרמניה) ו-Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, ארה"ב), בהתאמה. TriReagent נרכש מ-Vitro (מדריד, ספרד), וממברנות PVDF ומגיב Western blotting luminol נרכשו מסנטה קרוז ביוטכנולוגיה (סנטה קרוז, קליפורניה. ארה"ב). מגיב ProLong Gold antidede with 4,6-diamidino{{14 }}פניל אינדול (DAPI), annexin-V-FITC(fluorescein isothiocyanate)/propidium iodide (PI) ערכת זיהוי אפופטוזיס ו-2',7'-dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA) בדיקה נרכשו מ-Invitrogen(Carlsbad, CA, ארה"ב), ובדיקות מולקולריות (אורגון, ארה"ב), בהתאמה. נוגדנים התקבלו מהמקורות הבאים: אנטי-PGE ואנטי-COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)הנוגדנים היו מ- Abcam (קיימברידג', בריטניה); anti-Bax ו-anti-Bcl-2 היו מ-Santa Cruz Technologies(Santa Cruz, CA.USA); anti-HIF-la נוגדן ו-rabbit-Alexa-Fluor 488 היו מ-BD Biosciences (Palo Alto, CA, ארה"ב) ו-Invitrogen (Carlsbad, CA, ארה"ב), בהתאמה; אנטי- -אקטין וארנב אנטי-עכבר מצומד IgG peroxidase נרכש מ-Sigma (St.Louis, MO, ארה"ב).

תרבית תאים ותנאי ניסוי.

תאי HK-2 פרוקסימליים צינוריים אנושיים נרכשו מ-American Type Culture Collection(ATCC)(Rockville, MD, ארה"ב). התאים נשמרו ב-5% CO, ב-37 מעלות Cin DMEM/F12 בתוספת של 10% בקר עוברי סרום (FBS), 1 אחוז פניצילין/סטרפטומיצין/אמפוטריצין B ו-1 אחוז גלוטמין (Invitrogen. Carlsbad, CA, ארה"ב) ו-1 אחוז אינסולין-טרנספרין-סלניום (ThermoFisher. Grand Island, NY, ארה"ב). בכל הניסויים, תאים היו מצופים ב-70-90 אחוזי מפגש, וכאשר הם מחוברים לחלוטין, הם טופחו בתנאים היפוקסיים (1 אחוז חמצן) או נורמוקסיים (21 אחוז חמצן).היפוקסיהניסויים בוצעו ב-In vivo200היפוקסיהתחנת עבודה (Ruskin Technology, מערב יורקשייר, בריטניה). להיפוקסיהניסויי חמצון מחדש, תאים עברוהיפוקסיהבמשך 24 שעות, ולאחר מכן, תאים הודגרו בתנאים נורמוקסיים למשך עד 3 שעות (תקופת החמצן מחדש).

ניתוח אימונופלואורסצנטי של iPGE וניתוח Western blot של COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)ו-HIF-1 .

תאים לניתוח אימונופלואורסצנטי וניתוח Western blot פוצלו בהתאמה על גבי כיסויי זכוכית (4×104 תאים/מכסה זכוכית) או לצלחות שש בארות (15×104 תאים/באר) והודגרו כמתואר ב"תוצאות". לאחר מכן, בוצעו ניתוח אימונופלואורסצנטי וניתוח אימונובלוטינג בעיקרו כפי שתואר קודם לכן. דילולים הפועלים נגד גוף היו: 1/50 עבור PGE,, 1/1000 עבור COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)/HIF-1a/a-rabbit-Alexa-Fluor 568 ו-1/5000 עבור -אקטין. זיהוי אימונופלואורסצנטי בוצע באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי Leica SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה), באמצעות שירות המיקרוסקופיה הקונפוקלית (ICTS 'NANBIOSIS'U17) של המרכז לרשתות מחקר ביו-רפואי על ביו-הנדסה, ביו-חומרים וננו-רפואה (CIBER-BBN) אוניברסיטת אלקל, מדריד, ספרד)

טרנספקציה חולפת.

טרנספקציה חולפת עם siRNA PGT(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), וקטור הביטוי היונקים pcDNA3 המכיל את ה-cDNA של 15-hydroxy-prostaglandin dehydrogenase (p15-PGDH) של האדם מסוג הבר. בונה פלסמיד של luciferase reporter עבור COX אנושי-2(ציקלו-אוקסיגנאז)phPES2-לוק, בן אדםהיפוקסיהאלמנט תגובה (HRE)p9HIF1-Luc ו-R. reniformis pRL-CMV(Promega, Madison, WI) וקביעת פעילות לוציפראז בוצעו כמתואר במקומות אחרים27,28.

ספירת תאים ומורפולוגיה של תאים/גרעין.

מספר התאים הנצמדים נקבע באופן ספקטרופוטומטרי עם שיטת צביעה של סגול קריסטל שונה2. כדי לזהות עדות לאפופטוזיס, נצפתה מורפולוגיה של התא באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. גרעיני תאים הוצגו להדמיה לאחר צביעת DNA עם DAPI כפי שתואר קודם0, מורפולוגיה אפופטטית טיפוסית שנבדקה כללה הצטמקות תאית, עיבוי גרעיני ופרגמנטציה ויצירת גופים אפופטוטיים. לצורך כימות, נבדקו שישה שדות בכל מצב ניסוי באופן עיוור כדי להעריך את אחוז הגרעינים בעלי מראה דמוי אפופטוזיס.

בדיקת אפופטוזיס של ציטומטריית זרימה ובדיקת כדאיות תאים על ידי בדיקת אי הכללת צבע טריפן כחול.

תאים נצמדים לצלחת נותקו על ידי טריפסיניזציה, ויחד עם התאים המנותקים שהתאוששו קודם לכן ממדיום התרבות, שימשו לבדיקה.

ערכת זיהוי אפופטוזיס של Annexin-V-FITC/PI אפשרה זיהוי ציטומטריית זרימה של תאי HK-2 אפופטוטיים ונמקיים, כפי שתואר קודם 7. תאים אפופטוטיים מוקדמים ומאוחרים היו חיוביים, בהתאמה, לצביעת אנקסין V ושניהם וגם אנקסין V הַכתָמָה. תאים נקרוטים היו חיוביים רק ל-PI ותאי HK-2 חיים לא הראו צביעה.

בדיקת אי הכללת צבע טריפן כחול שימשה להערכת כדאיות התא. תאים ברי קיימא (לבנים) ותאים מתים (כחול) נספרו באמצעות מיקרוסקופ אור והמוציטומטר.

ניתוח סטטיסטי.

כל ניסוי חזר על עצמו לפחות שלוש פעמים. התוצאות מבוטאות כממוצע±SEM. הם עברו ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן Bonferroni להשוואות מרובות. רמת המובהקות נקבעה ל-P פחות או שווה ל-0.05.

תוצאות

היפוקסיה גורמת למוות של תאי HK-2 פרוקסימלי צינורי.

היפוקסיההפחית את מספר תאי HK-2, כפי שהוערך על ידי בדיקת סגול קריסטל (איור la), וגם גרמו לעיגול וניתוק של תאים מהצלחת (איור lb, לוח עליון). כצפוי,היפוקסיההפעיל מודל של מוות תאי עם מאפיינים מורפולוגיים ברורים של אפופטוזיס (ראה צביעה גרעינית עם DAPI באיור lb, לוח תחתון, שמאל) כגון הצטמקות תאים עם עיבוי גרעיני משמעותי, פיצול ויצירת גופים דמויי אפופטוטיים.היפוקסיהאפופטוזיס המושרה אושרה עוד יותר על ידי העלייה בצביעת ה-Annexin V-FITC, כפי שהוערכה על ידי ציטומטריית זרימה, ומניעתה באמצעות מעכב pan-caspase Z-VAD-FMK (איור lc).היפוקסיהקבעה גם ירידה במספר התאים הקיימאים אך לא גרמה לשינויים מובהקים סטטיסטית במספר התאים הנמקיים (איור lc, inset).

איור 1. היפוקסיה גורמת למוות של תאי HK-2 פרוקסימלי צינורי.(א) ספירת תאים מופחתת (בדיקת סגול קריסטל). (ב) מאפיינים מורפולוגיים של אפופטוזיס. צילומי מיקרו ניגודיות פאזה מייצגים (פאנל עליון, הגדלה מקורית, 10×) צילומי מכתים DAPI (פאנל תחתון, הגדלה מקורית,40×). (ג) עלייה באפופטוזיס (מחקרי ציטומטריית זרימה). תאי אנקסין V פלוס כוללים תאי אנקסין V plus /propidium iodide (כלומר תאים אפופטוטיים מוקדמים עם שלמות ממברנת פלזמה משומרת) ו-Annexin V plus /propidium iodide plus (כלומר תאים אפופטוטיים מאוחרים). הוספה: סוגי אוכלוסיות תאים (Annexin V-/ propidium iodide פלוס תאים הם תאים נמקיים ו-annexin V-/ propidium iodide-are תאים חיים). התוצאות מבוטאות כאחוזים ביחס למספר הכולל של אירועים. מידע כללי:(1) תאים הודגרו במשך 24 שעות בתנאים נורמוקסיים (21 אחוז O2) או היפוקסיים (1 אחוז O,), כפי שמצוין ב"שיטות?. מעכב פאן-קספאז Z-VAD-FMK (25 מיקרומטר) היה נוסף שעה אחת לפני תחילת החשיפה להיפוקסיה. (2) צילומי מיקרו הם דוגמאות מייצגות של שלושה ניסויים עצמאיים. פסים ופסי שגיאה בגרפים: כל פס מייצג את הממוצע±SEM של 3 ניסויים שונים *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">היפוקסיה;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">היפוקסיהפלוס ZVAD.

COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)מסלול קולטן /iPGE,/EP מתווך מוות של תאי HK-2 פרוקסימלי צינורי הנגרם על ידי היפוקסיה.

על מנת להעריך את תפקיד ה-COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)מסלול קולטן /iPGE2/EP בהיפוקסיהמוות תאי HK-2, הדגמנו תחילה תאים עם celecoxib, COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)מעכב1; AH6809, אנטגוניסט של קולטני EP1, EP2 ו-EP3 או GW627368X, אנטגוניסט של קולטן EP433; או עם bromocresol green או bromosul-fophthale בשניהם מעכבי PGT435.PGT גם הופל באמצעות טרנספקציה עם siRNA.

איור 2. COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)מסלול הקולטן /iPGE,/EP מתווך מוות של תאי HK-2 הנגרמת על ידי היפוקסיה.(א) מניעת מוות תאי על ידי מעכבי המסלול. פאנל עליון; הפסים מציגים את אחוז המוות הכולל של התא (משמאל) או את אחוז האנקסין האפופטוטי V פלוס תאים (מימין). לפני שנחשפים אליוהיפוקסיה, תאים הודגרו מראש למשך שעה אחת עם 3 מיקרומטר celecoxib (COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)מעכב）; 10 μuM AH6809, (אנטגוניסט לקולטנים EP1-3), 10 מיקרומטר GW627368X (אנטגוניסט לקולטן EP4); או עם 50 μM bromocresol green (BG) או 25 μM bromosulfophthalein (BrS), שני מעכבי PGT. לוח תחתון: שמאל: מניעת מוות של תאים על ידי הפלת PGT באמצעות טרנספקציה עם siRNA (בדיקת אי-הכללת צלילה טריפאן כחולה). הוספה: היעילות של ביטול PGT (ניתוח כתם מערבי) מימין: תלות ריכוז של ההשפעה המונעת של ירוק ברומקרסול (BG). (ב) מניעת מוות תאי על ידי טרנספקציה עם וקטור ביטוי יונק המכיל אנזים משבית פרוסטגלנדין 15-hydroxy-prostaglandin dehydrogenase(15-PGDH) cDNA(בדיקת אי הכללת צבע טריפן כחול). הוספה: ביטוי של {{ 11}}PGDH (ניתוח כתם מערבי) בתאים שעברו טרנספקציה. (ג)היפוקסיהגורם לעלייה רגישה ל-PGT ב-iPGE, משמאל: PGE, תלוי אימונופלואורסצנטי לבד או בשילוב עם צביעה גרעינית עם DAPI מוצג (הגדלה מקורית, 40×) מימין: גישה כמותית לתמונות המוצגות בלוח השמאלי באמצעות תוכנת Image J. (ד) מעכב של הפעלת EGFR AG1478 אינו מונע EGFR של תאי HK-2. תאים הודגרו מראש למשך שעה אחת עם 1 מיקרומטר AG1478 לפני שהם נתוניםהיפוקסיה. （e） מעכב PGT BG אינו משנה את הביטוי של Bax ו-Bcl-2 בתאי HK-2 תחתהיפוקסיה(ניתוח כתם מערבי). (ו) מניעתהיפוקסיהמוות תאים המושרה על ידי חמצן מחדש על ידי מעכבי המסלול (בדיקת אי הכללת צבע טריפן כחול). תאים הודגרו מראש עם מעכבי המסלול והועברו אליהםהיפוקסיהכמו ב(א). לאחר מכן, תאים נחשפו לנורמוקסיה למשך 3 שעות. מידע כללי:(1) תאים הודגרו במשך 24 שעות בתנאים נורמוקסיים (21 אחוז O,) או היפוקסיות (1 אחוז O,), כפי שמצוין ב"שיטות". (2) צילומי מיקרו הם דוגמאות מייצגות של שלושה ניסויים עצמאיים. (3) ממיסים של המעכבים (בינוני luL/mL) לא שינו את ההשפעה שלהיפוקסיהעל מוות תאים (התוצאות אינן מוצגות). (4) ניתוח Western blot: חלבון שווה אושר על ידי בדיקה עם אנטי- -אקטין או נוגדן אנטי-GAPDH. (5) עמודות וסרגל שגיאות בגרפים: כל פס מייצג את הממוצע±SEM של 3 ניסויים שונים.*P<0.01><0.01>היפוקסיהאוֹהיפוקסיה/חמצן מחדש.

כפי שמוצג באיור 2א,היפוקסיהמוות של תאים צינוריים פרוקסימליים נמנע בכל המקרים. עיכוב של אפופטוזיס על ידי celecoxib הצביע על כך ש-COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)ממלא תפקיד רלוונטי בהיפוקסיהמוות תאים אפופטוטי המושרה (איור 2a, לוח עליון, ימין). ליתר דיוק, העובדה שאפופטוזיס נמנעה על ידי אנטגוניזם של קולטני EP מעידה על כך שהאפופטוזיס מתווכת על ידי COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)ייצור תלוי של PGE. מצד שני, סביר להניח ש-iPGE, תורםהיפוקסיהמוות תאי HK-2 גרם בגלל שהוא נמנע על ידי;(i) עיכוב של PGT(איור 2a) או(i) ביטוי יתר של 15-PGDH(איור 2b), אשר משבית את iPGE2 באמצעות oxidation25(לתשומת לבך, הליך ההעברה עצמו הגביר את הרגישות של תאי HK-2 להיפוקסיה: מוות תאים היה 45-55 אחוזים עבור טרנספקציה בתנאי בקרה בהשוואה ל-15-20 אחוזים בתאים שאינם עברו טרנספקציה). תמיכה נוספת לתרומת iPGE, להיפוקסיהמוות תאי HK-2, הם הממצאים הקודמים שלנוהיפוקסיהקובע עלייה בתכולת התאים של iPGE,1 וכי עלייה זו נמנעה על ידי מעכבי PGT (איור 2c).

מסלולי איתות MAPK עשויים לעורר אפופטוזיס, מכיוון שקולטני iEP מפעילים טרנסאקטיביות של קולטן גורם גדילה אפידרמיס (EGFR)36, מה שמוביל להפעלה של קינאז MAP ERK1/2 ו-p38 בתאי HK-20, שאלנו האם מראש -אינקובציה של תאי HK-2 עם מעכב הפעלת EGFR AG1478 מניעההיפוקסיה-מוות תאים המושרה. מצאנו תוצאות שליליות (איור 2ד) ולכן, אין זה סביר שטרנסאקטיבציה של EGFR מתווך מוות תאי HK-2 תחתהיפוקסיה.

במספר מודלים ניסויים, הפחתת ATP שמקורו במיטוכונדריה במהלךהיפוקסיהגורם לעלייה ביחס הביטוי של חלבון פרו-אפופטוטי Bax לחלבון אנטי-אפופטוטי Bcl-2, מה שמוביל לשחרור ציטוכרום C לציטוזול, הפעלה של קספאז 9, ולאחר מכן ביקוע והפעלה של האפקטור במורד הזרם. קספסות37,38. עם זאת, דגירה מראש עם מעכב PGT BG בתאי HK-2 מתחתהיפוקסיהלא הביא לשינויים התואמים לשינוי אנטי-אפופטוטי באיזון בין הביטוי של Bc-2 ו-Bax(איור 2e), שאינו תומך בתפקיד של חלבונים אלה בתא HK-2 מוות מתחתהיפוקסיה.

לאחר חשיפה להיפוקסית, אפיזודות של חימצון מחדש (פגיעה באיסכמיה/פרפוזיה חוזרת) יכולים לגרום לנזק נוסף לתאים. ניתן להבין את ה"פרדוקס" של פגיעה בחמצן חוזר תוך התחשבות בכך שתאים עוברים שינויים ספציפיים בפעילות האנזים, בתפקוד המיטוכונדריה, במבנה הציטו-שלד, בהובלת הממברנה ובהגנה נוגדת חמצון בתגובה להיפוקסיה, אשר לאחר מכן באופן קולקטיבי לפגיעה בחמצן חוזר39. Reoxy-genation תורם לפגיעה חריפה בכליות במהלך שבץ איסכמי, השתלת כליה, אי ספיקת מחזור הדם או ניתוחי כליות וקרדיווסקולריים. בהקשר זה, הערך הטיפולי הפוטנציאלי של העיכוב שלהיפוקסיה/מוות תאי צינורי פרוקסימלי המושרה על ידי חמצן מחדש באמצעות התערבות ב-COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)מסלול קולטן /iPGE,/iEP ברור. לכן, שאלנו אם iPGE מתווך ספציפיתהיפוקסיה-מושרה מוות של תאים או גם מתווךהיפוקסיה/מוות תאים המושרה בחמצן מחדש (מודל חוץ-גופני המחקה איסכמיה כלייתית/פציעה חוזרת של הכליות in vivo). כפי שמוצג באיור.2f, מוות תאים (כפי שהוערך על ידי בדיקת אי הכללת צלילה טריפן כחול) נמנע על ידי COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)מעכב celecoxib וכן על ידי אנטגוניסטים לקולטן EP AH6809 או GW627368X. בדומה לאיור 2a, תוצאות אלו מצביעות על כך ש-COX-2 ממלא תפקיד רלוונטי בהיפוקסיה/מוות תאי המושרה על ידי חמצן, וליתר דיוק, מוות תאי זה מתווך על ידי COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)ייצור תלוי של PGE, מכיוון שהוא נמנע על ידי אנטגוניזם של קולטני EP. עם זאת, מכיוון שמוות תאים לא נמנע על ידי מעכבי PGT bromocresol green או bro-mosulfopthalein (איור 2f ואיור משלים 2d), סביר יותר כיהיפוקסיהמוות תאי /reoxygenation-induced HK-2 מתווך אך ורק על ידי PGE חוץ תאי.

HIF-1 -תלוי תעתיק של COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)ביטוי גנים תורם לאהיפוקסיהעלייה הנגרמת ב-iPGE, בתאי HK-2 פרוקסימליים צינוריים. PGE, ביו-סינתזה כרוכה בשחרור מגליצרופוספוליפידים הממברניים של חומצה ארכידונית על ידי פוספוליפאז A, ואחריו ההמרה על ידי איזואנזימי COX של חומצה ארכידונית לפרוסטגלנדין H, ולבסוף, על ידי איזומריזציה של בלוטת הערמונית ב-H, ל-PGE, על ידי פרוסטגלנדין E על ידי פרוסטגלנדין. כגון סינתאז PGE מיקרוזומלי-1 (mPGES-1)19. מצאנו את זההיפוקסיה-אפופטוזיס המושרה בתאי HK-2 מתווכת ככל הנראה על ידי COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)עלייה תלויה בייצור PGE, (איור 2). בהתחשב בכך COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)הוא אנזים שהביטוי שלו עשוי להיגרם על ידיהיפוקסיה, שיערנו כי אהיפוקסיהעלייה הנגרמת ב-PGE, ייצור בתאי HK-2 עשוי להיות תוצאה של עלייה בביטוי של COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז). על מנת לאשש את ההשערה שלנו, למדנו (i) את ההשפעה שלהיפוקסיהעל הביטוי של COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)חלבון ו-mRNA ו-(ii) ההשפעה של COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)מעכב celecoxib עלהיפוקסיהעלייה הנגרמת ב-iPGE, התוצאות שלנו הצביעו על כךהיפוקסיהנקבע באופן חולף ויסות-על של תעתיק של COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)ביטוי(איור 3a,b)וה-COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)עיכוב הקהה את העלייה ב-iPGE, בתאי HK-2 מתחתהיפוקסיה(איור 3ג). מעניין,היפוקסיהקבע גם ויסות מעלה חולף של ביטוי חלבון mPGES-1 (איור, 3a, inset), אך לא השפיע על ביטוי mPGES-1 mRNA (איור, 3b. inset). תוצאות אלו הצביעו על ביטוי מוגבר של COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)ו-mPGES-1 אחראי עלהיפוקסיהעלייה נגרמת ב-iPGE.

איור 3. ויסות תעתיק תלוי HIF-la של COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)ביטוי גנים תורם לעלייה המושרה בהיפוקסיה ב-iPGE, בתאי HK-2 פרוקסימליים.(א) הביטוי של COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)חלבון מוגבר באופן זמני על ידיהיפוקסיה(ניתוח כתם מערבי). הוספה: חלבון ביטוי mPGES-1 גם מווסת עלייה זמנית על ידיהיפוקסיה. (ב) ביטוי COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)mRNA גדל זמנית על ידיהיפוקסיה. הוספה: ביטוי של mPGES-1 mRNA אינו מושפע מהיפוקסיה. (ג) מניעה על ידי celecoxib, COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)מעכב, של העלייה ב-iPGE, המושרה על ידיהיפוקסיה. תאים הודגרו מראש למשך שעה אחת עם 3 מיקרומטר סלקוקסיב. שמאל∶PGE, תלוי אימונופלואורסצנטי לבד או מוזג עם צביעה גרעינית עם DAPI מוצג (הגדלה מקורית, 40×). מימין: גישה כמותית לתמונות המוצגות בחלונית השמאלית באמצעות תוכנת Image J. (ד) תרומה של מנגנוני תעתיק. משמאל: מעכב תעתיק אקטינומיצין D(Act. D) מונע אהיפוקסיהעלייה הנגרמת ב-COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)ביטוי חלבון (ניתוח כתם מערבי). תאים טופלו מראש עבור lh עם 1 ug/ml Act. ד לפני שנחשף אליוהיפוקסיהלמשך 3 שעות. מימין: עלייה בפעילות של COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)בניית כתב. (ה) מעכב HIF-la YC-1 מונעהיפוקסיהCOX-תעתיק המושרה-2(ציקלו-אוקסיגנאז)העלאת רגולציה. תאים הודגרו מראש למשך שעה אחת עם 0.5 uM YC-1. משמאל: מניעת COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)העלאת רגולציה. תאים נחשפו להיפוקסיהלמשך 8 שעות. מרכז: מניעת עלייה בפעילות של COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)בניית כתב. מימין: עיכוב פעילות של מבנה כתב מונחה HRE. תאים נחשפו להיפוקסיהבמשך 8 שעות.(f) מעכב HIF-la YC-1 מגביר מוות של תאים אפופטוטיים (מחקרי ציטומטריית זרימה). לפני שנחשפים אליוהיפוקסיה, תאים הודגרו מראש למשך שעה אחת עם 0.5 מיקרומטר YC-1. Inset∶ YC-1 מעכב אתהיפוקסיהעלייה הנגרמת בביטוי HIF-1 (ניתוח כתם מערבי). מידע כללי:(1) תאים הודגרו במשך 24 שעות בתנאים נורמוקסיים (21 אחוז O,) או היפוקסיים (1 אחוז O,), כפי שמצוין ב"שיטות". (2) צילומי מיקרו הם דוגמאות מייצגות של שלושה ניסויים עצמאיים. (3) ניתוח כתם מערבי: חלבון שווה אושר על ידי בדיקה עם נוגדן אנטי- -אקטין (4) פסים ופסי שגיאה בגרפים: כל פס מייצג את הממוצע±SEM של 3 ניסויים שונים *P<0.01 vs.="" other="">

כדי לבחון עוד את התרומה של מנגנוני תמלול לעלייה ב-COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)ביטוי חלבון מתחתהיפוקסיה, ביטוי של COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)הוערך בתאי HK-2, אשר הודגרו מראש עם מעכב התעתוק אקטינומיצין D לפני שהם נתוניםהיפוקסיהלמשך 5 שעות. כפי שמוצג באיור 3d,היפוקסיהעלייה הנגרמת ב-COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)ביטוי חלבון נמנע על ידי אקטינומיצין D. יתר על כן,היפוקסיהקבע גם עלייה בפעילות של COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)מבנה מקדם שעבר העברה בעבר בתאי HK-2 (איור 3d מימין). ביחד, התוצאות המוצגות באיור 3d מצביעות על כך שמנגנוני תעתיק תורמים ל-aהיפוקסיהעלייה הנגרמת ב-COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)ביטוי חלבון. עם זאת, הייתה אי התאמה בין תזמון ההפעלה של מקדם COX-2 לבין התזמון של COX מקסימלי-2(ציקלו-אוקסיגנאז)ביטוי mRNA: בעוד העלייה החולפת ב-COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)ביטוי mRNA היה מקסימלי לאחר 2 שעות (איור 3b), מקדם ה-COX-2 הופעל לאחר 3 שעות (איור 3d), מה שמשקף כנראה את התרומה של מנגנונים פוסט-תעתיק לעלייה ב-COX{{6 }}(ציקלו-אוקסיגנאז)ביטוי 4. בהתאם לכך, אנו משערים ש-COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)mRNA מתייצב מתחתהיפוקסיה, דבר שיביא לעלייה ברמות של COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)ביטוי mRNA ללא כל תרומה (באותו רגע) של פעילות מוגברת של ה-COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)מְקַדֵם. עם זאת, יתכן גם שהפרש זמן בין הפעלת המקדם והצטברות של מצע מדיד עשוי לתרום גם לאי ההתאמה בין תזמון ההפעלה של מקדם ה-COX-2 לתזמון ה-COX המקסימלי{{1} }}(ציקלו-אוקסיגנאז)ביטוי mRNA.

HIF-1 הוא גורם שעתוק הטרודימרי המורכב מתת-היחידה התלויה בחמצן ומתת-היחידה המבוטאת באופן מכונן. תַחַתהיפוקסיה, HIF-l מצטבר ונכנס לגרעין, שם הוא מייצר את גורם התעתיק HIF-1 לאחר דימריזציה עם HIF-1. לאחר מכן HIF-1 מקדם את הביטוי של גני המטרה שלו על ידי קישור להיפוקסיה-אלמנטים מגיבים (HREs) הנמצאים באזור הרגולציה שלהם ובהמשך מתזמרים תגובות מסתגלות סלולריות ללחימההיפוקסיה 3. בהתחשב בכך שהיפוקסיהעשוי להפעיל את COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)בהיפוקסיהעלייה הנגרמת ב-COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)ביטוי. בדקנו גם את הפעילות של מבנה מקדם COX-2 שעבר טרנספקציה בתאי HK-2. כפי שמוצג באיור 3e, דגירה מראש עם HIF-1מעכב YC-1, שהקהההיפוקסיה-עלייה שנגרמה בביטוי HIF-la ובפעילות של מבנה כתב HRE, הובילה למניעת העלייה בשני הביטויים של COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)ופעילות ה-COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)מבנה מקדם ב-HK-2 נתוןהיפוקסיה. לסיכום, התוצאות מוצגות באיור,3a-e תומכות ברעיון ש-HIF-1 -תלוי וויסות-על של COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)אחראי עלהיפוקסיהעלייה נגרמת ב-iPGE2.

למרות ההשלכות של הפעלת HIF-1a onהיפוקסיה-אפופטוזיס המושרה שנויים במחלוקת (כנראה בגלל שהם עשויים להיות תלויי הקשר), ניתחנו (באופן ראשוני) את התפקיד של HIF-1a במערכת הניסויית שלנו. מכיוון שמצאנו בעבר התערבות זו ב-COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)/iPGE, מסלול קולטן EP מעכב את העלייה בביטוי HIF-la המופעל על ידיהיפוקסיה8,56 שאלנו האם עיכוב של HIF-la מביא למניעתהיפוקסיהאפופטוזיס של תאים HK-2. כפי שמוצג באיור 3f, קדם-דגירה עם YC-1, מעכב HIF-l, למעשה גדלהיפוקסיה-אפופטוזיס המושרה. לכן, אין זה סביר כי HlF-la

דִיוּן

רִקמָההיפוקסיהנחשב כרלוונטי באופן קריטי בפתופיזיולוגיה של מחלת כליות כרונית ושל פגיעה כלייתית חריפה, בהיותו PTC החלק הרגיש ביותר של אבובות הכליה נגדהיפוקסיה. כאן בדקנו את תפקידו של PGE, בנזק שנגרם על ידיהיפוקסיהל-PTC אנושי ומצא שייצור מוגבר של iPGE מקורו בוויסות-על תלוי HIF-la של COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)ביטוי גנים וביטוי מוגבר של mPGES-1, תורםהיפוקסיהמוות תאים אפופטוטי מושר בתאי HK-2. בהתחשב בכך שהיפוקסיה צינורית היא גורם רלוונטי הן למחלת כליות חריפה והן למחלת כליות כרונית-2, תוצאות אלו מצביעות על פרוסטגלנדין טרנספורטר PGT כיעד טיפולי חדש במחלות כליה.

היפוקסיהלא רק מגביר את iPGE אלא גם את שחרורו למדיום החוץ-תאי8, כך שמופרש (חוץ-תאי) PGE, עשוי גם למלא תפקיד בהיפוקסיהאפופטוזיס המושרה (לדוגמה, הפעלת מפלים אפופטוטיים באמצעות הפעלה קנונית של קולטני EP הממוקמים בקרום התא). שני מחקרים קודמים הראו כי מוות תאים מתחתהיפוקסיההיה גם בגלל COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)ייצור תלוי של PGE,1345. מצד שני, בסוגי תאים מסוימים (פיברובלסטים, מיקרוגליות, נוירונים וקווי תאים לימפובלסטיים חריפים), אפופטוזיס המושרה על ידי PGE מתווכת על ידי הפעלה תלויה PGE של קולטני EP46-48. מצאנו כאן את זההיפוקסיהאפופטוזיס של תאים HK-2 נמנע על ידי אנטגוניזם של קולטני EP גם כן (איור 2a, לוח עליון, מימין). אבל מכיוון שקולטני EP תוארו באופן קלאסי כקולטני ממברנות פלזמה - כך שהם אינם נגישים עבור iPGE2-, אנו משערים שקולטני ה-EP שמתווכים את ההשפעה האפופטוטית של iPGE, בתאי HK-2 היפוקסיים הם תת-קבוצה הממוקמת תוך תאית (כלומר קולטני iEP).

בניגוד לתפקיד של iPGE2 בהיפוקסיהאפופטוזיס המושרה בתאי HK-2, מצאנו שרק PGE חוץ-תאי מתווךהיפוקסיה/reoxygenation-induced מוות תאי HK-2 מכיוון שהוא לא נמנע על ידי מעכבי PGT (איור 2f). למרות המנגנונים הפתולוגיים של פגיעה תאית לאחרהיפוקסיה/החמצן מחדש אינם מובנים לחלוטין, מקובל שמוות תאים מתרחש בעיקר באמצעות ייצור של מיני חמצן תגובתיים מוגזם (ROS). זה נכון במיוחד עבור תאי HK-249,50. עם זאת, למרותהיפוקסיהעשוי גם להגביר את הייצור של ROS, למיטב ידיעתנו אין ראיות לכך ש-ROS משחק תפקיד רלוונטיהיפוקסיהמוות של תאי HK-2. זה מצביע על כך שההשפעות הקטלניות של היפוקסיה והיפוקסיה/חמצן מחדש בתאי HK-2 מתווכים על ידי מנגנונים שונים, מה שעשוי להסביר מדוע BG ו-BS מגינים מפניהיפוקסיהאבל לא נגדהיפוקסיה/חמצן מחדש. כתוצאה מכך, עיכוב של PGT עשוי לספק יתרונות טיפוליים ב-PTC נגד פגיעה בתאים הנגרמת היפוקסיה אך לא נגד ההשפעה המזיקה שלהיפוקסיה/חמצן מחדש.

HIF-1 -רגולציה עלייה של COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)היה אירוע קריטי עבורהיפוקסיהאפופטוזיס של תא HK-2 (איור 3ה). עם זאת, התצפית שלנו כי מעכב HIF YC-1 הגביר מוות של תאים אפופטוטיים (איור 3f) תמוהה, אם כי דיווחים קודמים כבר הראו תוצאות דומות1. הסבר אפשרי אחד הוא תרחיש היפותטי שבו HIF-la לא רק מתווך את הרגולציה הפרו-אפופטוטית של COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)אלא גם ויסות מעלה של מולקולות הגנה. אכן, HIF-1-הסדיר את הביטוי של מולקולות הגנה מפניהיפוקסיהכגון RNA ארוך שאינו מקודד DARS-AS1'ו-microRNA-2103 נמצאו ספציפית בתאי HK-2. עם זאת, למרות שהראיות הללו תומכות בתרחיש ההיפותטי שלנו, יש לבצע ניסויים ספציפיים כדי לאשר זאת.

חקירת תגובת תאי הכליה להיפוקסיהעשוי לשפר את הבנתנו את הפתולוגיה הכלייתית. חקרנו, אם כי באופן ראשוני, את התפקיד של עלייה ביחס הביטוי של חלבון פרו-אפופטוטי Bax לחלבון אנטי-אפופטוטי Bcl-2 בהיפוקסיהאפופטוזיס המושרה בתאי HK-2. התוצאות שלנו הצביעו על כך שעיכוב של PGL לא גרם לשינויים התואמים לשינוי אנטי-אפופטוטי באיזון בין הביטוי של Bcl-2 ו-Bax(איור 2e), שאינו תומך בתפקיד של חלבונים אלה ב מוות תאי HK-2 תלוי ב-iPGEהיפוקסיה. למיטב ידיעתנו, ישנם רק שני מחקרים על ההשלכה של ציר Bcl{{0}}/Bax באפופטוזיס הנגרמת על ידי היפוקסיה ב-PTC ושניהם היו מעורבים בריכוזי O, anoxic" או כמעט anoxic5. כאשר PTC נחשף ל-0.2 אחוז O., ביטוי Bax נותר ללא שינוי ואפופטוזיס נקשר לירידה בדרגת הביטוי Bcl-2. עם זאת, ביטוי Bcl-2 לא הושפע מ-1 אחוז O, למרות נוכחות של אפופטוזיס, אשר חופפת לתוצאות שלנו. לכן, יש לשקול מנגנונים אחרים שאינם בהכרח כרוכים בשינויים כמותיים בביטוי Bcl-2 או Bax: למשל, אינדוקציה של אפופטוזיס בתאי גליומה תרבותיים על ידי iPGE2 דורשת רק הקשר הפיזי שלו עם Bax, שמפעיל את הטרנסלוקציה של Bax למיטוכונדריה202. לפיכך, המנגנון שדרכו iPGE תורם לאפופטוזיס של תאי HK-2 ראוי למחקר נוסף.

הקבוצה שלנו גילתה ש-COX-2(ציקלו-אוקסיגנאז)-עלייה תלויה ב-iPGE, מתווך מוות אפופטוטי בתאי HK-2 שנחשפו ל-cisplatin', גופים אפופטוטיים7" והיפוקסיה(התוצאות הנוכחיות שלנו). מכיוון ש-PGE, משתחרר במהירות אל מחוץ לתא לאחר עיבוד 2, ההובלה פנימה שלו על ידי PGl ממלאת תפקיד קריטי באפופטוזיס המושרה ב-iPGE בתאי HK-2. לכן, בכל פעם שנזק PTC מתווך על ידי iPGE, טיפול במעכבי PGT עשוי להיות גישה טיפולית שימושית עם יישומים פוטנציאליים כגון מניעת נזק PTC המושרה על ידי ציספלטין, עיכוב התפשטות של פגיעה צינורית דרך גופים אפופטוטיים, או הגבלה של השפעה מזיקה שלהיפוקסיהעל PTC.