השראת חסינות מאומנת היקפית בלבלב מעוררת פעילות אנטי-גידולית כדי לשלוט בהתקדמות סרטן הלבלב חלק 2

דִיוּן

בעוד שהסחר של גלוקן אופיינה בעבר, הטרופיזם הספציפי של גלוקן ללבלב לא דווח בעבר37. אנו מראים שגלוקן חלקיקי יכול לעבור ישירות לתוך הלבלב ויכול גם להיות פגוציטוזה על ידי מקרופאגים אשר לאחר מכן עוברים לתוך הלבלב. הקשר בין חלל הצפק ללבלב לא הוגדר היטב, ומחקרים הקשורים לפתופיזיולוגיה של דלקת לבלב חריפה (AP) זיהו כי מקרופאגים פריטוניאליים הם תורמים עיקריים לתגובה הדלקתית ב-AP, ובכך תומכים בקשר בין הצפק. והלבלב38.

נתוני ההדמיה שלנו אכן מראים שמקרופאגים פריטוניאליים הפגוציטים ל-WGP המסומן באיזוטופים מעבירים בעיקר ללבלב. מחקרים על פגיעה בכבד תמכו עוד יותר במודל זה של החלפה דינמית של תאים בין חלל הצפק ואיברים מוצקים שאינו תלוי במחזור הדם. וחלל פריטוניאלי שניתן לנצל בסביבה של חלקיקי -גלוקן.

מקרופאגים הם חלק חשוב ממערכת החיסון המולדת של גוף האדם ויש להם תפקידים רבי עוצמה של זיהוי, פגוציזציה והסרה של חיידקים וחומרים זרים. דלקת חניכיים, מחלה זיהומית כרונית המאופיינת בדלקת חניכיים ואובדן עצם מכתשית, היא הגורם המוביל לאובדן שיניים במבוגרים. כעת ברור שהרס הרקמה של דלקת חניכיים נגרם מהתגובה החיסונית של הפונדקאי לזיהום, ולמקרופאגים, כחלק חשוב מהתגובה החיסונית של הפונדקאי, תפקיד חשוב בהתרחשות והתפתחות הדלקת.

לכן, עלינו לשפר את החסינות בחיי היומיום שלנו. במחקר שלנו, מצאנו ש-Cistanche יכול לשפר את החסינות. הוספת Cistanche למים רותחים להכנת תה Cistanche, ושתייתו 1-2 פעמים ביום יכולה לשפר את התפקוד החיסוני של הגוף מכיוון שהוא מכיל חומרים פעילים, כגון פוליסכרידים, פלבנואידים, אלקלואידים וכו', שיכולים לשפר את תפקוד חיסוני של הגוף. במקביל, הוספת Cistanche למרק או דייסה, פעם או פעמיים בשבוע, יכולה לשפר את החסינות.

לחץ כדי לדעת מוצר cistanche טהור

בעוד מחקר זה חקר חלקיקי -גלוקן WGP, עשוי להיות מעניין גם לחקור האם גלוקן מסיס שמקורו בשמרים מראה מנגנון טרופיות דומה ומנגנון איתות בתוך הלבלב. ידוע כי חלקיקי -גלוקנים מאותתים ישירות דרך דקטין-1, בעוד שגלוקנים מסיסים נחשבים לתפקד באמצעות מסלול תלוי CR3-כדי להפעיל את תכונותיהם האנטי-גידוליות40,41. מחקר אחד הראה כי מתן IP של גלוקן מסיס הביא לסחר לדם ההיקפי ול-APCs בצפק, בטחול ובמח העצם, מה שמצביע על כך שלמרות מנגנוני האיתות המולקולריים השונים, יכולת דומה להפעיל חסינות מאומנת עשויה להיות אפשרית42. עם זאת, בהתחשב בעובדה שהנתונים שלנו מצביעים על כך שהסחר הזה תלוי בדקטין-1, רק חלקיקי - גלוקן עשוי להציג סחר ישיר ללבלב דרך חלקיקים ומסיסים, עשוי ליזום מנגנונים של חסינות מאומנת.

יתר על כן, מחקרים קודמים המאפיינים את הסחר של גלוקן מסיס המוזרק תוך ורידי מראים סחר לטחול, לכליה ולכבד, אם כי אינם מזכירים טרופיזם ללבלב43. מכיוון שהלבלב לא נחשב בעבר כמטרה לסחר בגלוקנים, לא ברור אם הלבלב פשוט מעולם לא נחקר או שסחר בלבלב אינו מתרחש.

מחקרים עתידיים צריכים להתייחס להפצה ביולוגית של גלוקן מסיס וחלקיקי על פני נתיבי מתן שונים.

לסחר בגלוקנים ללבלב יש השפעה רב גורמית על האוכלוסיות החיסוניות הנמצאות בתוך הלבלב. ראשית, הגעת גלוקן ללבלב משפיעה ישירות על אוכלוסיות של מקרופאגים תושב M2 מדכא חיסון הנמצאים בתוך הלבלב, הידועים כחשובים בקידום גידולי הלבלב. נתוני CyTOF ו-scRNA-Seq הראו היעלמות כמעט מוחלטת של אוכלוסיית המקרופאגים המתגוררים 7 ימים לאחר מתן WGP. באופן מעניין, היעלמות אוכלוסיית המקרופאגים המקומיים עולה בקנה אחד עם הופעה הדדית של אוכלוסיית מקרופאגים Ly6Clo. אוכלוסיית מקרופאגים Ly6Clo נושאת סמנים פנוטיפיים דומים לאוכלוסיית התושבים, אם כי נוטה יותר לפנוטיפ M1.

לכן, סביר להניח שמקרופאגים תושבים באים במגע עם -גלוקאן שהעביר סחר ללבלב ותאים אלה הופכים לקוטב מחדש, ולכן מקבלים פנוטיפ תאי אחר שגורם להיווצרות של צביר ייחודי. שנית, הגעת -גלוקאן ללבלב גורמת לאיתות מוגבר של קולטן כימוקין/כימוקין אשר מגייס מקרופאגים מעוררי דלקת פרו-דלקתיים שמקורם במונוציטים מהפריפריה אל הלבלב. 24 שעות לאחר מתן WGP, נמצא כי רמות CCL2 בליזטים של הלבלב גדלו פי 30-. בהתאם לכך, אנו מראים שהזרימה הסלולרית התלויה ב--glucan ללבלב תלויה ב-CCR2.

בעוד שאנו מתמקדים בדינמיקה של תא המיאלואיד בשל החשיבות הנצפית של איתות CCR2/CCL2, היה שיפור ראשוני מעניין של אשכול 11 ביום 3 ולאחר מכן היעלמות ביום 7 לאחר טיפול ב-WGP. אשכול 11 אופיינו כ-ILC2s המבוססים על ביטוי של מספר סמנים כגון KLRG1, IL-5, IL-13 ו-ICOS. ידוע ש-ILC2s הם תאים ארוכי טווח של רקמות44. מחקרים אחרונים הראו שהפעלה של ILC2s מקומיים על ידי אלרמינים ספציפיים לרקמות גורמת לשגשוג שלהם, נדידת בלוטות הלימפה והפצת דם. הוכח כי ILC2s ממספר רקמות, כגון המעי והריאה, חודרות לדם באמצעות שחול מרקמות מופרעות אלו ונודדות לרקמות אחרות כגון הכבד44-46.

מנגנון כזה יכול להסביר את העלייה הראשונית ולאחר מכן את היעלמותם של ILC2s בלבלב. בהתחשב בכך ש-ILC2s היו מעורבים לאחרונה בתגובה של גידולי לבלב לאימונותרפיה47, יש צורך במחקר נוסף שחוקר את ההשפעה של WGP והתחלת חסינות מאומנת על אוכלוסיית ILC2 של הלבלב.

למרות שההתחלה של נהירה של תאי חיסון מעודדי דלקת ללבלב היא כשלעצמה חשובה, זה ה-CCR2 פלוס Ly6CHi החודר לאוכלוסיות מקרופאגים שמקורם במונוציטים מהפריפריה מציגות תכונות של חסינות מאומנת הנושאת את ההשלכות החשובות ביותר כמו השראת חסינות מאומנת היקפית בלבלב טרם אופיינה. חסינות מיומנת זו קשורה גם לתכנות מחדש מטבולי ואפיגנטי.

בעוד ש-CCR2 ידוע כקולטן חשוב בגיוס מונוציטים, זוהי גם האינדיקציה הראשונה לכך שאיתות CCR2 על מונוציטים הכרחי לביסוס חסינות מאומנת היקפית. יצוין כי CCR2 בתוספת מונוציטים/מקרופאגים נקשרו לגרורות והתקדמות הגידול48,49. עם זאת, הנתונים שלנו מצביעים על כך שהגיוס של CCR2 מתוכנת מחדש ומאומן בתוספת מונוציטים/מקרופאגים מפעילים השפעות אנטי-גידול חזקות.

זה מודגם ישירות על ידי ניסוי ה-Admix שלנו, שבו עכברים שקיבלו CCR2 פלוס תאים מיאלואידים מעכברים מאומנים ב-WGP הראו עומס גידול מופחת משמעותית בהשוואה לעכברים שקיבלו CCR2- תאים מיאלואידים מאותו עכבר מאומן.

מכיוון שאנו מראים שחסינות מאומנת היקפית הוקמה בלבלב, אנו שואלים האם ניתן להפעיל מחדש תאים אלה על ידי תאי גידול או הגורמים המופרשים שלהם. חשיפה חוזרת של תאי מיאלואיד לבלב מאומנים ב-WGP למדיה מותנית בגידול הוכחה כמעוררת תגובה מאומנת. Kalafati et al. לאחרונה הראה תפקיד לגרנולוציטים במנגנונים אנטי-גידוליים מונעי חסינות מאומנים21, אולם, לאור השימוש שלהם במודלים תת עוריים של סרטן, המחקר המדווח כעת הוא המקרה הראשון המצביע על כך שניתן לאמן תאים מיאלואידים באיבר ספציפי להגיב ישירות אליהם תאי גידול של אותו איבר.

הוכח היטב שתאי מיאלואיד מסוגלים להרוג ישירות תאי גידול באמצעות מנגנונים של פגוציטוזיס וייצור ROS50-54, וכאן אנו מראים כי אימון WGP מגביר באופן משמעותי את הפונקציות האנטי-גידוליות הישירות של פגוציטוזיס מוגברת של תאי גידול וציטוטוקסיות מתווכת ROS. תאי גידול.

יתר על כן, בעוד אנו מדגישים שמדיה מותנית בגידול יכולה להפעיל מחדש תאים מיאלואידים מאומנים, אנו מזהים גם גורם ספציפי, MIF, במדיה מותנית בגידול המעורב בהפעלה זו. נתונים אלה מצביעים על כך שהשראת חסינות מאומנת יכולה להשתתף במנגנונים של מעקב חיסוני של הגידול. לדוגמה, בשלבים המוקדמים של התפתחות הגידול, גידולים מפרישים גורמים מסיסים שיכולים לעורר מחדש תאים מולדים מאומנים המובילים לחיסול תאי הגידול הללו.

לאחר מכן אנו מתרגמים את ההבנה הזו של הפוטנציאל האנטי-גידולי של תאי המיאלואיד המולדים המאומנים הנכנסים ללבלב למודלים אורתוטופיים של PDAC, שם אנו רואים ירידה דרמטית בנטל הגידול ועלייה בהישרדות של עכברים שניתנו רק במתן אחד של WGP. אנו מדגימים עוד כי התאים האחראים לבקרת הגידול הם בעיקר CCR2 מאומן בתוספת תאים שמקורם במיאלואיד. בניגוד למודלים מוצעים אחרים של בקרת גידולים שנראים מונעים לחלוטין על ידי השראת חסינות מאומנת מרכזית ב-BM21, במקום זאת, במודל זה הוכשרו הסחר המוקדם של WGP ללבלב והייצור הנובע מכך של CCL2 במגויסי הלבלב. CCR2 פלוס תאים מיאלואידים מהפריפריה שאחראים בעיקר על ההשפעות האנטי-גידוליות. הסחר הישיר של WGP ללבלב גם מקטב מחדש M2-מקרופאגים תושבי רקמה לכיוון M1-כמו מקרופאגים שעשויים גם לרסן את התקדמות הגידול.

בעוד שהפחתת הגידול שנצפתה בעכברים שהושתלו בגידולי KPC שעורבבו עם CCR2 פלוס תאים מאומנים הייתה משמעותית, היא לא הייתה בולטת כמו בעכברים שקיבלו IP WGP. זה תומך בכך שההשפעות האנטי-גידוליות של IP WGP הן כפולות; הגיוס של CCR2 פלוס תאים מיאלואידים אנטי-גידוליים מאומנים ללבלב והקיטוב מחדש של מקרופאגים תושבי פרו-גידולים פועלים יחד כדי לעורר תגובות מולדות אנטי-גידוליות המובילות להפחתת עומס הגידול במודלים של PDAC.

אנו מציינים גם את הביטוי הגבוה של MHCII על מונוציטים/מקרופאגים מאומנים אלה, אשר כנראה ממלא תפקיד בעיבוד אנטיגן גידול ותקשורת עם תאי T כדי לעורר תגובות חיסוניות אדפטיביות נגד הגידול. מעניין לציין שבעוד שאישרנו שמנגנונים אנטי-גידוליים אלה אינם תלויים בתגובות חיסוניות אדפטיביות, ראינו עלייה משמעותית בתאי CD8 פלוס T הנמצאים בתוך CCR2 פלוס גידולים מעורבים. בנוסף, בהתחשב בכך שתאי מיאלואיד בגידולים נצפו כמציגים רמות גבוהות של PD-L1 וכי נוכחותם של תאי CCR2 פלוס מאומנים בלבלב נראה כי מגייסים תאי CD8 פלוס T, סברנו כי WGP עשוי להעצים את ההשפעות של אנטי. -טיפול PD-L1.

לפי הספרות, לטיפול ב-mAb נגד PD-L1 לבדו לא היה תועלת הישרדותית, בעוד שהשילוב של WGP ואנטי-PD-L1 עשה סינרגיה כדי לייצר תוצאות הישרדות טובות יותר מאשר WGP לבד55. זה מצביע על כך שתאי חיסון מולדים מאומנים עשויים להפעיל תאי חיסון אדפטיביים ב-TME, עם זאת, המיקרו-סביבה המדכאת החיסונית כנראה צריכה להתגבר עוד יותר על ידי ההשפעות הנלוות של אנטי-PD-L1. חשוב לציין, למרות שיפור ההישרדות, כל העכברים אכן נכנעו בסופו של דבר לגידול, ולכן יש צורך בחקירות עתידיות לגבי האופטימיזציה של טיפול זה מבחינת המינון ומספר הטיפולים.

תאים מיאלואידים מדכאים חיסוניים ממלאים תפקיד קריטי ביצירת TME המדכא את החיסון ב-PDAC. כאן, אנו מדגימים יכולת לערב את התאים המיאלואידים הללו בסביבה של PDAC באמצעות אינדוקציה של חסינות מולדת מאומנת בלבלב.

חשוב לציין, אנו גם מראים שהיכולת ליזום חסינות מאומנת בלבלב מעצימה את ההשפעות הטיפוליות של אימונותרפיה כגון טיפול חסימת חסימה חיסונית נגד PD-L1. בהענקת ישימות קלינית נוספת לממצאים אלה, אנו גם מראים שהשראת חסינות מאומנת בסביבה האדג'ובנטית יכולה להקטין את גודל הגידול ולהאריך את ההישרדות. ממצאים אלה מדגישים את הפוטנציאל של שימוש ב-glucan למיקוד טיפולי בתאי מיאלואיד בתוך ה-TME ומדגישים שהשראת חסינות מאומנת היקפית בלבלב יכולה למלא תפקיד תוצאתי בתכנות מחדש של ה-TME המדכא של PDAC, מה שעלול לגרום להארכת חיי החולים מאובחן עם ממאירות קטלנית זו.

שיטות

אמירה אתית.

כל הניסויים שכללו בעלי חיים נערכו על פי ההנחיות האתיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת לואיסוויל. הניסויים נערכו לפי הפרוטוקולים שאושרו 19471 ו-19536.

עכברים.

עכברים זכרים ונקבות בני שישה עד שמונה שבועות שימשו בכל הניסויים. עכברים מסוג Wild (WT) C57BL/6 J נרכשו ממעבדת ג'קסון (Bar Harbor, ME, ארה"ב) או גדלו במתקן ללא פתוגנים ספציפיים לאוניברסיטת לואיסוויל (SPF). עכברי C57BL/6 Dectin-1 נוקאאוט (Dectin-1-/−) תוארו בעבר56. עכברי נוקאאוט גלובליים CCR2 נרכשו ממעבדת ג'קסון. עכברי Albino C57BL/6 סופקו בחביבות על ידי ד"ר ג'ונתן וארווה מאוניברסיטת לואיסוויל. עכברי NOD/SCID/IL2r Null (NSG) נרכשו ממעבדת ג'קסון. גודל הגידול המרבי המותר על ידי IUCAC היה לא יותר מ-2000 מ"מ. עכברים נבדקו מדי יום על צמיחת הגידול והורדתם כאשר עומס הגידול עלה על הגודל המוגבל. עכברים נשמרו במחזור של 12-שעות כהה/בהיר בטמפרטורת החדר עם לחות מבוקרת (בסביבות 55 אחוז).

כל החיות שוכנו במתקן מחסום ורק עכברים בריאים שימשו לניסויים. כל העכברים היו בני 6 שבועות לפחות עלינו, וכל הניסויים שכללו בעלי חיים בוצעו בהתאם לכל החוקים הרלוונטיים וההנחיות המוסדיות שסופקו על ידי מתקן גידול מכרסמים (RRF) ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת לואיסוויל.

הכנה של -גלוקן.

גלוקן חלקיקי מטוהר מאוד בצורה של חלקיקי גלוקן מלאים (WGP) מבודדים מ-Saccharomyces cerevisiae סופק על ידי Biothera. לפני השימוש, WGP עבר צלילים עדינים למשך 15 שניות, פעמיים באמצעות Qsonica Q55-110 Q55 Sonicator (Cole-Parmer) כדי להבטיח שהאגרגטים נשברו.

הכנה ושימוש ב-DTAF-WGP.

DTAF (Sigma-Aldrich) ב-2 מ"ג/מ"ל מעורבב עם תרחיף של 20 מ"ג/מ"ל WGP במאגר בוראט (pH 10.8). זה הודגרה בטמפרטורת החדר למשך 8 שעות עם ערבוב מתמשך. לאחר הדגירה, ה-WGP עבר צנטריפוגה ונשטף עם DPBS סטרילי קר ללא אנדוטוקסין (Sigma-Aldrich) חמש פעמים או עד שהסופרנטנט לא הכיל עוד DTAF גלוי. הריכוז הותאם ל-10 מ"ג/מ"ל ב-DPBS ללא אנדוטוקסין לאחסון. כ-1 מ"ג מה-DTAF-WGP הזריק IP לתוך C57BL/6 ועכברים ואיברים Dectin-1-/- נקצרו 3 ימים לאחר מכן.

הכנת ה-89Zr-WGP.

WGP (100 מ"ג) ערבב עם DeferoxamineSCN (2.7 מ"ג, ב-0.8 מ"ל DMSO) והושעה ב-10 מ"ל חיץ נתרן קרבונט (0.1 M, pH 9.4) למשך הלילה בטמפרטורת החדר בחושך עם ניעור עדין. לאחר מכן ה-WGP המסומן Deferoxamine נשטף עם מים DI (10 × 40 מ"ל), ו-30 מ"ג של WGP המסומן Deferoxamine עורבבו עם 3 mCi של אוקסלט 89Zr ב-2 מ"ל חיץ Tris•HCl (0.5 M, pH 7.5), ו לאחר מכן דגירה ב-37 oC למשך 60 דקות עם ניעור. לאחר מכן ה-89Zr-WGP עבר צנטריפוגה ונשטף עם 3 מ"ל של PBS סטרילי. הרדיואקטיביות של 89Zr-WGP נמדדה על ידי מכייל מינון ושימשה למחקרים חוץ-גופיים ו-in vivo.

הפצה ביולוגית וסריקת PET/CT באמצעות 89Zr-WGP.

הדמיה של פליטת פוזיטרון (PET)/טומוגרפיה ממוחשבת (CT) נערכה בעכברי C57BL/6 ו-Dectin-1-/− 48 שעות לאחר הזרקת IP של 1 מ"ג של 89Zr-WGP טהור או הזרקה של 1 × 106 פריטונאלי. מקרופאגים שתורבו יחד עם 25 ug/ml של 89Zr-WGP למשך 2 שעות ולאחר מכן נשטפו בעדינות כדי להסיר עודפי 89Zr-WGP. העכברים נסרקו במשך 15 דקות עם סימנס R4 MicroPET ואחריו 10 דקות של סריקת CT. תוכנת סימנס IAW שימשה לרכישה ושחזור של אות PET, ותוכנת סימנס IRW שימשה למיזוג וניתוח נתוני ההדמיה.

בסוף מחקר ההדמיה, עכברים הורדמו, ואיברים מעניינים נקצרו. להפצה ביולוגית, נאספו 50 ul של דם היקפי באמצעות טכניקת דימום רטרו-בולברי. המוח, הלב, הריאות, הכבד, הטחול, הכליות, הלבלב, המעי הגס, המעי הדק, הקיבה, עצם הירך, פיסת עור מהצד של העכברים ושריר הירך הירך נקצרו, נשקלו והונחו ב מונה גמא אוטומטי 2470 Wizard (PerkinElmer) למדידת הרדיואקטיביות של כל רקמה. ערכי המחיר לאלף הופעות חושבו באמצעות תוכנת Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA).

עיבוד לבלב.

לאחר ההמתה, לבלב העכבר נקצר ונחתך בעדינות לחתיכות קטנות יותר באמצעות מספריים סטריליות. הם הושעו בשפופרת של 15 מ"ל במדיה מלאה (RPMI) עם 1X חיץ עיכול המורכב מ-300 U/ml collagenase I, 60 U/ml Hyaluronidase ו-80 U/ml DNase (Sigma). אלה הונחו באינקובטור מסתובב ב-37 מעלות עם 5 אחוז CO2 למשך 15-20 דקות. חיץ העיכול נכבה עם RPMI 1640 מלא קר כקרח ונשטף. תאים הועברו דרך מסנן סל סטרילי מניילון 40 מיקרומטר וחתיכות קטנות של רקמה לא מעוכלות נופצו באמצעות פקק מזרק סטרילי כדי ליצור תרחיף חד-תא. אם נראו מספר ניכר של תאי דם אדומים (RBCs) בדגימה, תמוגה RBC בוצעה על ידי הוספת 2 מ"ל של ACK 10x סטרילי (Thermo Fisher Scientific).

ניהול WGP in vivo.

לעכברים ניתנה מנה תוך-צפקית בודדת של 1 מ"ג של WGP עם צלילים עדינים, חרוזי פוליסטירן בגודל 3 מיקרומטר (Sigma-Aldrich), או מיקרוספירות פלורסנטיות של 3 מיקרומטר (פוליסיינס) (כולם 1 מ"ג ב-200 ul של PBS סטרילי) או 200 ul של PBS סטרילי ביום 0. עבור מחקרי חסינות מאומנים בדרך כלל, 7 ימים לאחר מינון ה-IP הראשוני, עכברים הורדמו באמצעות CO2, והלבלב יחד עם רקמות אחרות בעניין הוסר ועובד. עבור מחקרי טיטרציה של מינון, 0.5, 1 ו-2 מ"ג של WGP סופקו IP ב-200 ul של PBS סטרילי. למחקרי טיטרציה בזמן, לעכברים הוזרקו 1 מ"ג של WGP, והלבלב נקצר לאחר 24 שעות, 48 שעות, 3, 7, 10, 16 ו-30 ימים לאחר מכן.

גירוי Ex vivo.

כדי להעריך את הפנוטיפ המאומן של תאים חד-גרעיניים בעכברים שטופלו ב-WGP או PBS ex vivo, לאחר עיבוד הלבלב, תרחיפים של תאי לבלב צופו בצלחות של 24 באר וגוירו ב-LPS (10 ng/ml), הסופרנטנט מ-KPC ו-Pan02 בתרבית. תאים (40 אחוז), ו-MIF רקומביננטי (rMIF) (10 ננוגרם/מ"ל). MIF היה מתנה נדיבה מד"ר רוברט מיטשל מאוניברסיטת לואיסוויל והיה בעל ברית פרוקריוטי לידי ביטוי, מטוהר וקופל מחדש כפי שתואר קודם57. תאים תורבו ב-DMEM והודגרו ב-37 מעלות עם 5 אחוז CO2 למשך 5-6 שעות בנוכחות 1X brefeldin A (BioLegend). לאחר מכן, התאים נקצרו באמצעות מגרד תאים, נשטפו, נטפו, ולאחר מכן נצבעו לביטוי ציטוקינים תוך תאי.

בדיקת אימון חוץ גופית וגירוי מחדש.

מקרופאגים פריטוניאליים או תאי CD11b פלוס ממוינים מבולב עכבר צופו בצלחת 24-באר למשך שעתיים ב-37 מעלות ו-5 אחוז CO2 כדי לאפשר התקשרות של תאים לצלחות, ולאחר מכן התאים הצפים עברו בעדינות. שאפו. התאים המחוברים נשטפו בעדינות עם PBS סטרילי ולאחר מכן הושענו מחדש ב-1 מ"ל של DMEM המורכב מ-10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.

לאימון ראשוני של תאים, נוספו 25 ug/ml של WGP חלקיקי, 25 ug/ml של חרוזי מיקרו-חלקיקי פוליסטירן בגודל 3 מיקרומטר (Sigma-Aldrich), או 100 ul PBS לבאר המתאימה והודגרו במשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, בארות נשטפו בעדינות כדי להסיר את הגירוי הראשוני ונוספו DMEM טרי והתאים הודגרו עם 5 אחוז CO2 ב-37 מעלות למשך 7 ימים. לאחר 7 ימים, המדיה נשאבה והוחלפה במדיה טרייה, והתאים עברו גירוי מחודש עם LPS (100 ng/mL), הסופרנטנט של תאי KPC או Pan02 (40 אחוז), או PBS כבקרה. 24 שעות לאחר הגירוי, הסופרנטנטים נקצרו והשתמשו בהם ב-ELISA עבור TNF- ו-IL-6.

מדיה מותנית בגידול.

כ-1 × 106 תאי KPC או Pan02 תורבו בצלחת שש בארות ב-4 מ"ל של DMEM מלא ב-37 מעלות ו-5% CO2. לאחר 3 ימים הסופרנטנטים נקצרו ואוחסנו ב-80 מעלות במנות לשימוש כמדיום מותנה בגידול. כביקורת, הלבלב של עכבר C57BL/6 עבר עיבוד לתרחיף של תא בודד ו-1 × 106 מהתאים הללו תורבו בצלחת שש בארות ב-4 מ"ל של DMEM מלא וב-37 מעלות ו-5% CO2, ו סופרנטנטים נאספו גם לאחר 3 ימים. כביקורת, הלבלב של עכברים תמימים עבר עיבוד להשעיה חד-תאית ומצופה בצלחת שש בארות למשך יום אחד. תאים לא נצמדים נשטפו ואז תאים אלה התורבו במשך 3 ימים והסופרנטנט נקצר.

רכישת מקרופאגים פריטוניאליים.

עכברים הורדמו ו-5 מ"ל של RPMI סטרילי הוזרק לתוך הצפק באמצעות מזרק 25-מד. הבטן עבר עיסוי כדי לשחרר את המקרופאגים הצפקיים. בוצע חתך קטן ופיפטת העברה שימשה להסרת ההשעיה. לאחר מכן, חלל הצפק נשטף מספר פעמים עם RPMI קר ותאים נזרקו ב-458 × גרם.

ציטומטריית זרימה.

השעיות חד-תאיות ב-PBS עם 1 אחוז FBS נחסמו עם Fc Block (אנטי-CD16/CD32) ב-4 מעלות למשך 15 דקות. נוגדנים מסומנים עם פלואורכרום לקיום (APC/Cy7) ולסמני פני השטח CD45, CD11b, F4/80, Ly6G, Ly6C, MHCII, CD3, CD4, CD8, NK1.1, Ki67 (Biolegend) ו-CCR2 (מערכות מו"פ) בשימוש. המידע הקשור לכל זרימת Abs מסוכם בטבלה משלימה 3. לאחר 30 דקות של דגירה בחושך ב-4 מעלות, התאים נשטפו עם PBS קר וסוננו דרך מסנן רשת של 40 מיקרון. הדגימות נרכשו באמצעות ציטומטר FACSCanto II (BD Biosciences) ונותחו באמצעות תוכנת FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). תוכנת FACSDiva גרסה 6 שימשה ב- FACSCanto כדי לרכוש את כל הנתונים.

צביעה תוך תאית לביטוי ציטוקינים.

לאחר גירוי, תאים נצבעו עבור סמני השטח הרצויים כמתואר לעיל. לאחר מכן התאים נשטפו עם PBS קר, ו-500 ul של חיץ קיבוע (Biolegend) הוסיפו לצינורות, עברו מערבולת קצרה והודגרו בחושך בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר מכן נוספו בערך 1 מ"ל של חיץ פרמיביליזציה (Biolegend) ודגימות בוצעו בצנטריפוגה ב-458 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות ולאחר מכן כביסה אחת נוספת באמצעות 1 מ"ל של חיץ חלחול. תאים הושעו מחדש ב-200 ul של חיץ פרמיביליזציה והתאים נצבעו בנוגדנים נגד TNF-, Ki67, Granzyme-B, IL12, IL-6 ו-IFN או לבקרת איזוטיפ בהתאמה למשך הלילה ב-4 מעלות. לאחר מכן נשטפו התאים, סוננו ונתונים נרכשו באמצעות ציטומטר זרימה.

בידוד FACS של CD11b פלוס מקרופאגים לאימון במבחנה.

הלבלב עובד להשעיה חד-תאית כמתואר לעיל. התאים נשטפו עם 1 מ"ל של PBS, והודגרו עם בלוק Fc למשך 10 דקות ב-4 מעלות ולאחר מכן צביעה עם צבע כדאיות (APC-Cy7), CD45 (PerCPcy5) ו-CD11b פלוס (APC) למשך 30 דקות ב-4 מעלות. תאים נשטפו עם PBS והושעו מחדש במאגר קר MACS Running Buffer (Miltenyi Biotech). ViabilityCD45 פלוס CD11b פלוס תאים מוינו באמצעות FACS Aria III (BD Biosciences). תאים נאספו ב-50% FBS, 40% PBS ו-10% HEPES (Corning). לאחר מיון התאים נשטפו עם PBS ולאחר מכן מצופה לאימון במבחנה, כמתואר לעיל.

אליסה.

סופרנטנטים מתאי חוץ מאומנים יחד עם תקנים נותחו באמצעות ערכות TNF- ו-IL-6 ELISA של עכברים (BioLegend). הבדיקה בוצעה לפי הוראות היצרן וכל התנאים בוצעו בשלושה עותקים. ערכת ELISA עבור rMIF (מערכות R ו-D) שימשה גם על פי הוראות היצרן כדי לכמת rMIF במדיה מותנית בגידול Pan02 ו-KPC ואת הסופרנטנט מתאי לבלב לא מטופלים. כדי לכמת שינויים בהיסטון, נרכשו ערכות ELISA (ערכת כימות טרי-מתיל היסטון H3K4, ערכת כימות אצטיל-היסטון H3K27, ערכת כימות טרי-מתיל היסטון H3K27 וערכת כימות סך היסטון H3) מ- EpiGentek ובוצעו מבחני היצרן. הוראות. לקטט נמדד על ידי L-Lactate assay Kit I (Eton Bioscience).

ניתוח כתם מערבי.

תאים CD11b פלוס מעכברים שהוזרקו ב-PBS או ב-WGP (24 שעות) הופרדו באמצעות CD11b microbeads (Miltenyi Biotech). היסטון הופץ לפי הוראת היצרן (Active Motif, Inc.), וריכוז החלבון נקבע באמצעות כימות ברדפורד. חלבוני היסטון הופרדו על ידי SDS-PAGE 15% Tris-HCl ג'לים והועברו על גבי ממברנות PVDF (Millipore). הממברנה נחסמה עם 5 אחוזי BSA בטמפרטורת החדר למשך שעה והודגרה למשך הלילה ב-4 מעלות עם נוגדנים ראשוניים כולל טרי-מתיל-היסטון H3 (lys4) ארנב mAb, אצטיל-היסטון H3 (lys27) XP ארנב mAb, טרי-מתיל היסטון H3 (Lys27) ארנב mAb, והיסטון H3 XP ארנב mAb (טכנולוגיית איתות תאים), לאחר מכן הודגרה עם נוגדנים משניים מצומדים HRP (GE Healthcare) בטמפרטורת החדר למשך שעה. הממברנה פותחה עם Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare) וזוהתה באמצעות מעבד סרטים רפואיים (Konica Minolta Medical & Graphic). Precision Plus Protein Kaleidoscope Pretained Protein Standards שימשו כסמן חלבון סטנדרטי (Bio-Rad).

qRT-PCR.

לאחר בידוד תאי CD11b פלוס מהלבלב של העכבר בעכברים שטופלו ב-WGP ולא טופלו, התאים נשמרו ב-TRIzol. RNAs בודדו ושועתקו לאחור באמצעות הגברה של TaqMan Reverse Transcription Reagents (qRTPCR) באמצעות מערכת זיהוי Bio-Rad MyiQ בצבע יחיד RT-PCR. בקצרה, cDNA הוגבר בתערובת תגובה של 25 ul המורכבת מ-SYBR Green PCR super-mix (Bio-Rad), 100 ng של תבנית DNA משלימה, ופריימרים נבחרים (200 nM) תוך שימוש בתנאי הרכיבה המומלצים.

H פלוס E.

שבעה ימים לאחר הזרקה עם חרוזי PBS/מיקרו-חלקיקים או WGP, הלבלב נקצר וקבוע בפורמלין של 4 אחוזים למשך שבוע, ולאחר מכן הטמעה בפרפין לפי נהלים סטנדרטיים. רקמות משובצות פרפין נחתכו למקטעים בעובי 5 מ"מ והוצבעו בהמטוקסילין ואאוזין (H & E) לצורך ניתוח מורפולוגי.

מדידת עמילאז בסרום.

עמילאז בסרום Murine נמדד באמצעות ערכת ה-Amylase Activity Assay Kit (Millipore Sigma) והשתמשו בו לפי הוראות היצרן. בקיצור, לעכברים הוזרקו WGP ו-7 ימים לאחר מכן, דם נאסף מעכברים בטכניקת דימום רטרו-בולברי. דגימות אלו שימשו לבדיקת עמילאז בסרום.

דלדול תאי T in vivo.

תאי T התרוקנו באמצעות mAb anti-CD4 בלבד, antiCD8 mAb בלבד, או anti-CD4 ואנטי CD8 mAb יחד. נוגדנים נוצרו בבית. בהליך דלדול זה, עכברים הזריקו IP עם WGP ביום 1 וגם הוזרקו IP עם 200 מיקרוגרם של mAbs ביום 1 ויום 4 במהלך תקופת הטיפול. עכברים הורדמו ביום 7. (שיבוט CD4 GK1.5, שיבוט CD8 53-6.72). יעילות הדלדול אושרה ביום 7.

דלדול תאי NK in vivo.

תאי NK התרוקנו באמצעות הזרקה תוך צפקית של 100 מיקרוגרם של PK136 mAb (מיוצר במעבדה של ד"ר ג'ון יאן באוניברסיטת לואיסוויל) בימים -1 ו-5 במהלך תקופת הטיפול. WGP הוזרק ביום 0 וביום 7 החיות הומתמו ויעילות הדלדול של תאי NK הוערכה על ידי צביעת רקמות הלבלב עבור NK1.1.

דלדול Ly6G.

הנויטרופילים התרוקנו על ידי הזרקת 300 מיקרוגרם של anti-Ly6G mAb (Bio X Cell) או בקרה איזוטיפ עכברוש IgG2a (Bio X Cell) בימים -1, 2 ו-6 במהלך הטיפול. בערך 1 מ"ג של WGP הוזרק IP ביום 1. עכברים הורדמו ביום 7 והלבלב הוערך לגבי יעילות הדלדול. בגידול, לעכברי מודל הוזרקו 300 מיקרוגרם של anti-Ly6G mAb או איזוטיפ בקרה של עכברוש IgG2a בימים -2, 4, 10 ו-16. לעכברים ניתנו WGP ביום 0 והושתלו להם גידולי לבלב אורתוטופיים KPC ביום 7. עכברים הורדמו ביום 21 ורקמות הלבלב נצבעו ב-Ly6G כדי להעריך את יעילות דלדול הגרנולוציטים באותו זמן.

הכנת דגימת ציטומטריה מסה CyTOF.

נוגדנים לציטומטריה המונית נרכשו מ- Fluidigm או נוצרו בבית על ידי צימוד נוגדנים מטוהרים זמינים מסחרית לאיזוטופ המתכת המתאים באמצעות ערכות ה-MaxPar X8 Polymer או MCP9 Polymer (Fluidigm). דגימות לבלב משלושה עכברי PBS ושלושה 7-ימים של WGP עובדו לתמיסה חד-תאית ובוצע גירוי ex vivo כמתואר לעיל. תאים גורדו בעדינות מהצלחות באמצעות מגרד תאים סטרילי, נשטפו עם PBS והונחו לתוך צינור תרבית סטרילי. נעשה שימוש בכ-2 × 106 תאים לדגימה. תאים נצבעו לראשונה עבור כדאיות עם 5 uM cisplatin (Fluidigm) ב-RPMI 1640 נטול סרום למשך 5 דקות ב-RT. לאחר מכן התאים נשטפו עם RPMI 1640 המכיל 10 אחוז FBS למשך 5 דקות ב-300 × גרם. תאים נצבעו בנוגדנים על פני השטח למשך 30 דקות ב-RT ונשטפו פעמיים עם מאגר צביעה של Maxpar Cell (Fluidigm).

לצביעה על ציטוקינים תוך-תאיים, תאים נקבעו לאחר מכן עם 1 מ"ל של חיץ 1X Maxpar Fix I למשך 30 דקות ב-RT ולאחר מכן נשטפו פעמיים עם 2 מ"ל של חיץ 1X Maxpar Perm-S למשך 5 דקות ב-800 × גרם. לאחר מכן הוסיפו קוקטייל הנוגדנים הציטופלסמי/מופרש והודגרו עם התאים למשך 30 דקות ב-RT. לאחר הדגירה, התאים נשטפו עם 1 מ"ל של חיץ 1X Maxpar Perm-S למשך 5 דקות ב-800 × גרם ונסגרו בעדינות כדי להסיר את כל הנוזל מהצינור.

כדי לצבוע עבור אנטיגנים גרעיניים, התאים הושעו לאחר מכן ב-1 מ"ל של חיץ צביעה אנטיגן גרעיני Maxpar 1X למשך 30 דקות ב-RT. לאחר מכן הוסף קוקטייל נוגדני אנטיגן גרעיני והודגרה למשך 30 דקות ב-RT. תאים נשטפו פעמיים במשך 5 דקות ב-800 × גרם עם 2 מ"ל של חיץ חדירות צביעת אנטיגן גרעיני. לבסוף, תאים נקבעו עם 1.6 אחוז פורמלדהיד למשך 10 דקות ב-RT, ולאחר מכן הודגרו למשך הלילה ב-125 ננומטר של IntercalatorIridium (Fluidigm) ב-4 מעלות.

רכישת נתונים CyTOF.

ברגע שהתאים היו מוכנים לרכישה, דגימות נשטפו פעמיים עם מאגר מכתים תאים (Fluidigm) והוחזקו על קרח בזמן שהמתינו לרכישה. ישירות לפני הרכישה, התאים הושעו בתמיסה של 1:9 של Cell Acquisition Solution: EQ 4 element beads (Fluidigm). נעשה שימוש במערכת Helios CyTOF, ובעקבות הליכי אתחול וכיוונון נכונים, הדגימות בוצעו בקצב של פחות או שווה ל-500 אירועים לשנייה עד 300,000 אירועים. באמצעות תוכנת CyTOF, קובצי FCS נורמלו. קבצי FCS וקבצים אלה היו מוכנים לאחר מכן לניתוח נתונים.

ניתוח נתונים CyTOF.

נתוני CyTOF נותחו באמצעות FlowJo, חבילת התוכנה CytoBank58 וזרימת העבודה CyTOF59 הכוללת חבילה של חבילות הזמינות ב-R (r-project. org)60–63. לניתוח שנערך בתוך זרימת העבודה CyTOF, נעשה שימוש בקובצי סביבת העבודה של FlowJo שיוצאו מ-Flow Workspace ו-CytoML61.

רצף RNA: מיצוי ובידוד RNA.

שבעה ימים לאחר מתן PBS או WGP IP, הלבלב נקצר, עובד להשעיה של תא בודד, נצבע עבור כדאיות, CD45 ו-CD11b, ומיון באמצעות FACS Aria III. דגימות הוכנו בשלושה עותקים עבור כל קבוצת ניסוי. ברגע שהתאים המיאלואידים הללו בודדו, התאים נשטפו 2x עם PBS קר כקרח ולאחר מכן הוסרו עם Trizol (Invitrogen). RNAs חולצו באמצעות QIAGEN RNAeasy Kit (QIAGEN).

ה-RNA המבודד נבדק לגבי שלמות באמצעות מערכת Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) וכומת באמצעות בדיקה פלואומטרית של Qubit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). ספריות mRNA-Seq מועשרות ב-Poly-A הוכנו בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי של Universal Plus mRNASeq Kit (Tecan Genomics, Redwood City, CA) תוך שימוש ב-10 ננוגרם של RNA כולל.

כל הדגימות נקשרו עם מתאמי Illumina וקודדו בנפרד. היעדר דימרים מתאמים וגודל ספרייה עקבי של ~300 bp אושר באמצעות Agilent Bioanalyzer 2100. ריכוז הספרייה והתנהגות הרצף הוערכו לגבי ספייק-אין סטנדרטי של PhIX באמצעות תא זרימה של Nano MiSeq מ-Illumina. 1.8 אחה"צ מהספריות המאוגנות עם 1 אחוז ספייק-אין של PhiX הועמסו על מחזור אחד של NextSeq 500/550 75 מחזורי High Output Kit v2 רצף רצף ורצף ברצף של Illumina NextSeq 500 המכוון לקריאה של 60 M 1x75 bp לכל דגימה.

רצף RNA.

ספריות הוכנו באמצעות ערכת Universal Plus mRNA-seq עם כימות ספריית NuQuant® (NuGen). שש הדגימות התפזרו על פני ארבעה קווי רצף בריצה אחת. 24 קבצי הרצף הגולמי החד-קצה (.fastq)64 הורדו מ-BaseSpace65 של Illumina לשרת KBRIN לצורך ניתוח. בקרת האיכות (QC) של נתוני הרצף הגולמיים בוצעה באמצעות FastQC (גרסה 0.10.1)66. הרצפים היו מיושרים לגנום ההתייחסות של העכבר mm10 באמצעות STAR (גרסה 2.6)67, ויצרו קבצי יישור בפורמט bam. ביטוי דיפרנציאלי של תמלילים מקודדי חלבון ENSEMBL בוצע באמצעות DESeq268,69. ספירות גולמיות התקבלו מקבצי הפורמט Bam מיושרים ל-STAR באמצעות HTSeq (גרסה 0.10.0)70. הספירות הגולמיות נורמלו בשיטת Relative Log Expression (RLE) ולאחר מכן סוננו כדי לא לכלול גנים עם פחות מעשר ספירות על פני הדגימות71. נתוני RNA-seq הופקדו עם הצטרפות GEO GSE187464.

רצף RNA: ניתוח העשרה של סט גנים.

נעשה שימוש בניתוח מערך גנים (GSEA) כדי לאפיין עוד יותר את הביולוגיה של הגנים הכוללים את תנאי WGP לעומת PBS וההבדלים ביניהם72. ערכות גנים התקבלו ממאגר החתימות המולקולריות (MSigDB) לתהליכים ביולוגיים של Gene Ontology (GO) ומסלולי Reactome. עבור כל סט גנים, כל מיקומי הגנים שנבדקו בהשוואה של עכברי ביקורת שטופלו ב-WGP מול PBS מוינו מהמובהקות הגבוהה ביותר לנמוכה ביותר באמצעות ערכי p. גישה זו מאפשרת לכלול גנים בעלי ויסות מעלה והורדה משמעותיים ביותר בתוך כל סט גנים, גישה המשקפת בצורה מדויקת יותר את התנאים במסלול ביולוגי. עבור ניתוח זה, טבלה של הקבוצות המועשרות מלווה עלילת העשרה המציגה את הפרופיל של ציון ההעשרה (ES) ואת המיקום של חברי מערך הגנים ברשימה לפי הדרגה.

רצף תא בודד: בידוד תאים בודדים ורצף RNA.

תאי CD45 פלוס חיים מוינו מהלבלב של עכברים, נשטפו והוקפו מחדש ב-PBS 1x (ללא סידן ומגנזיום) המכילים 0.04 אחוז BSA. תאים בודדים נלכדו וספריות cDNA עם ברקוד נבנו באמצעות Chromium Next GEM Single-Cell 3ʹ Reagent Kit (v3.1, 10X Genomics) ובקר Chromium, בהתאם להוראות היצרן. ספריות אספו ורצפו באמצעות תצורה של 28 bp × 8 bp × 125 bp עבור read1 × i7 index x read2 ב-Illumina NextSeq 500 עם NextSeq 500/550 150 מחזור High Output Kit v2.5 (20024907).

מאז רצף תאים: פרופיל ביטוי גנים.

קובצי Bcl הועברו ל-demultiplexed לקבצי fastq באמצעות תוכנת CellRanger (10X Genomics, v3.1.{{10}}). המספר הכולל של קריאות ברצף היה 506,913,062. הקריאות היו באיכות טובה כפי שנקבע על ידי FastQC66. ספירת הגנים נמדדה באמצעות CellRanger "ספירה", תוך שימוש בגנום ההתייחסות של התא ranger-mm10-3.0.0 עבור עכברים. נוצרה מטריצת ספירות עבור כל מדגם ומדגם אחד מצטבר עם מספר התאים הצפוי מוגדר ל-5000.

נתוני הספירה הגולמית שנקבעו על ידי CellRanger שימשו כקלט לצינור ניתוח מותאם אישית ב-R המשתמש במגוון כלי ניתוח של תא בודד המבוסס על Seurat. עלילת הברך (איור משלים. 7b) מציגה גרף המציג את ספירות ה-UMI המדורגות עבור כל ברקוד תא עבור נתונים מצטברים על פני שלוש הקבוצות. תאים מעל נקודת הפיתול מייצגים כפילות אפשריות ואילו אלה מתחת לברך מייצגים תאי רקע. אמצעי בקרת איכות תאים נותחו באמצעות Seurat v373, וברקודים של תאים עם המאפיינים הבאים הוסרו מהניתוח: ספירות נמוכות (תאי רקע אפשריים) עם חתך FDR של 0.01 מהפונקציה DropletUtils74 "emptyDrops", ספירות גבוהות (תאים כפולים אפשריים) עם יותר ספירות מנקודת הפיתול של חלקת הברך, תכולת מיטוכונדריה גדולה מ-30 אחוז ותכולת ריבוזומלית גדולה מ-40 אחוז. גנים (תכונות) עברו סינון נוסף כדי להסיר מזהי גנים שפרשו וגנים שלא באו לידי ביטוי בשני תאים לפחות. ראה איור משלים. 7a, b למספר הראשוני והמסונן של ברקודים וגנים של תאים.

נתוני הביטוי נורמלו באמצעות SCTransform75 שבו גנים של מחזור התא, תוכן ריבוזומלי ותכולת מיטוכונדריה נסוגו. לאחר מכן קובצו התאים והקטנת מימד בוצעה באמצעות UMAP76. שמות אשכולות ראשוניים הוקצו באמצעות טכניקת ציון העשרה GSVA77,78 שונה. עבור כל אחד מהאשכולות הללו, זוהו הגנים של הסמן העליון. גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי המשווים כל צביר לכל אשכול אחר (כל ההשוואות בזוגות) נקבעו באמצעות Seurat73 ו- MAST79. נתוני scRNA-seq הופקדו עם הצטרפות GEO GSE187464.

זיהוי של אשכולות שנוצרו עם scRNA-Seq.

אשכולות שאינם נגזרים מיאלואידים סווגו באופן כללי כתאי B (MS4A1), תאי פלזמה (SDC1), CD8 פלוס תאי T (CD3e, C8a), CD4 פלוס תאי T (CD3e, CD4), תאי ויסות T (T) -regs) (CD3e, CD4, FoxP3), δ תאי T (CD3e, TRGC1, TRGC2,IL7Ra) ותאי חיסון מולדים מסוג 2 (ILC2s) (Alox5, KLRG1, Ly6a, Pparg,GATA3, IL-5 , IL-13, ICOS ו-Rxrg)80–82. נויטרופילים זוהו באמצעות ביטוי MMP9, Csf3r, S100A8, S100A8 ו-ADAM8, אם כי עשויים להיות מיוצגים בחסר בניתוחים אלה בשל תכולת ה-RNA הנמוכה שלהם ורמות גבוהות של RNases פנימיים83. תאים דנדריטיים קונבנציונליים (cDCs) זוהו באמצעות ביטוי ITGAX ו-ITGAE ו-plasmascytoid DCs (pDCs) זוהו על ידי ITGAX ו-Siglech.

סיווג של אשכולות מיאלואידים מ-scRNA-Seq.

אשכול 5 ביטא ITGAMIntADGRE1HiLyz2HiH2-Ab1HiLy6C2- ולא ביטא TNFAIP2, מה שמצביע על כך שתאים אלה הם מקרופאגים תושבי. Cluster10 ביטא ITGAM- HiADGRE1HiLyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2-. אשכולות 3 ו-4 ביטאו ITGAMInt ADGRE1Int Lyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2Hi, מה שמרמז על כך ששניהם הם תת-קבוצות של מונוציטים/מקרופאגים מסתננים, אם כי הגנים הדלקתיים המוגברים שהתבטאו באשכול 3 שימשו לזיהוי אשכול המסתנן/מסנן 3 כמונוציטים .

מבחני פגוציטוזיס.

הלבלב של עכברים שהוזרקו PBS/מיקרו-חלקיקים ועכברים מאומנים ב-WGP in vivo נקצרו 7 ימים לאחר ההזרקה ועובדו כמתואר קודם להשעיה של תא בודד. כ-2 × 106 נשטפו בדילול HEPES 50x ב-RPMI 1640 ולאחר מכן הודגרו ב-100 μL של תמיסה זו למשך שעה אחת ב-37 מעלות כדי להפעיל את התאים. ה-Invitrogen מקדם את Green S.

נעשה שימוש ב-Aureus BioParticlesTM Phagocytosis Kit for Flow cytometry (Thermo Fisher Scientific) לפי הוראות היצרן. כ-100 μL מהחלקיקים המחודשים או 1 × 106 GFP בתוספת תאי גידול KPC נוספו לתאי הלבלב המופעלים והודגרו במשך שעה אחת ב-37 מעלות. דגימות סובבו בעדינות כל 15 דקות. התגובה הופסקה על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS קר. דגימות הודגרו עם Fc Block למשך 10 דקות ב-4 מעלות, נצבעו עבור כדאיות, CD45, CD11b ו-F4/80 למשך 30 דקות ב-4 מעלות, ולאחר מכן נותחו באמצעות BD FACSCanto. לצורך ניתוח, לאחר שער על תאים חיים ו-CD45, נקבעו תאים שהפלירו בערוץ FITC כפגוציטים.

בדיקת ציטוטוקסיות.

הלבלב מעכברים שטופלו ב-WGP ו-PBS נקצר ואוכלוסיות ה-CD11b פלוס בודדו באמצעות CD11b בתוספת MicroBeads מגנטי (Miltenyi Biotec) ו-autoMACS Pro Separator (Miltenyi Biotec). לאחר מכן נשטפו תאי CD11b פלוס מטוהרים ונספרו, ואלה צופו ביחס של 1:20 גידול: תאי אפקטור בצלחת 96-באר. כל דגימות הניסוי הופעלו בשלושה עותקים. לאחר ציפוי תאי CD11b פלוס, נוספו מעכבי ROS N-acetyl-Lcysteine ​​(NAC) (1 mM, Sigma-Aldrich), Trolox (5 μM, Sigma-Aldrich) או DFO (50 μM, Pharmacopoeia European) סט של תאים שמקורם ב-PBS ו-WGP למשך שעה אחת לפני הוספת 5000 KPC המבטאים לוציפראז בתוספת תאי גידול לבלב לכל הבארות. לאחר 24 שעות של תרבית משותפת, הצלחות עברו צנטריפוגה ו-20 μL מהסופרנטנט מעורבב עם 100 μL של ריאגנט בדיקת Luciferase (Promega). פעילות לוציפראז שנמדדה בסופרנטנט הייתה בקורלציה עם תאי גידול שנהרגו על ידי תאי האפקטור ונמדדו באמצעות luminometer (Femtomaster FB 12, Zylux Corporation). האות הספונטני של luciferase מתאי גידול מצופים הופחת ממדידת הסופרנטנט. ערכי לוציפראז מיוצגים כיחידות אור יחסיות (RLUs).

מודלים של גידולים של סרטן הלבלב In vivo.

קו תאים KPC על רקע C57BL/6 הנגזר מה-LSL-KrasG12D/ plus; LSL-Trp53R172H/ plus ; דגם העכבר Pdx1-Cre (KPC) נרכש מ-Ximbio. תאים אלה ו-Pan02 שהיו מתנה נדיבה מד"ר יונג לו מאוניברסיטת ווייק פורסט שימשו במודל אורתוטופי של סרטן הלבלב. קו KPC שעבר transfected עם GFP ולוציפראז (KPCGFP פלוס Luc plus ) היו גם תרומה נדיבה של ד"ר מייקל דוינל בקולג' הרפואי של ויסקונסין. תאים אלה שימשו אך ורק בעכברי לבקן C57BL/6.

לצורך השתלת גידול, עכברים הורדמו באמצעות איזופלורן, והבטן של העכברים הוכנה עם בטדין ועטפה בצורה סטרילית. לפרוטומיה בקו האמצע של 2 ס"מ בוצעה בטכניקה אספטית עם מכשירים סטריליים. בעקבות לפרוטומיה, הלבלב והטחול הופצו. תאי גידול הושעו ב-PBS קר כקרח ועורבבו ביחס של 1:1 עם מטריקס של קרום בסיס Matrigel (Corning). 0.1 × 106 תאי גידול ב-50 ul מתמיסת PBS-matrigel הוזרקו לזנב הלבלב באמצעות מזרק אינסולין 30-. היווצרות של בועה קטנה העידה על השתלה מוצלחת. הצפק נסגר באמצעות תפר 5/0 קלוע חומצה פוליגליקולית מצופה, והעור נסגר באמצעות תפר 5/0 קלוע משי לא נספג. (CP Medical). Buprenorphine ניתן לטיפול בכאב עד 72 שעות לאחר הניתוח ועכברים היו במעקב.

הדמיה ב-vivo.

עכברים שהושתלו אורתוטופית עם GFP פלוס Luciferase פלוס תאי גידול KPC הוזרקו IP עם 150 מ"ג/ק"ג של משקל גוף ב-100 μL של XenoLight D-Luciferin-K פלוס מצע ביולוגי-אורני מלח (PerkinElmer). לאחר 10 דקות, עכברים הורדמו עם isoflurane והונחו בתוך Biospace Lab Photon Imager, שהוא רמה ייעודית של אור נמוך in vivo עבור הדמיה ביולוגית ופלורסנט. תמונות של עכברים צולמו ושימשו למדידת גודל וגדילה של הגידול.

מודל גידול תערובת.

עכברים אומנו עם 1 מ"ג של WGP ו-7 ימים לאחר מכן, אוכלוסיות CD11b פלוס CCR2 פלוס ו-CD11b פלוס CCR2- מוינו ועורבבו 1:1 עם תאי גידול KPC 1 × 105 תאי גידול. תאים הושתלו אורתוטופית לעכברי WT ו-3 שבועות לאחר מכן הורדמו עכברים וגודל הגידול הוערך.

טיפול משולב עם anti-PD-L1 mAb.

עכברי C57BL/6 טופלו ב-WGP ביום -7 והושתלו בגידולי לבלב אורתוטופיים של KPC ביום 0. עכברים טופלו ב-200 מיקרוגרם של אנטי-PD-L1 mAb נגד עכברים (Bio X Cell) או בקרת איזוטיפ IgG2b של עכברוש (Bio X Cell) בימים 3, 7 ו-11. לאחר מכן נערכו מעקב אחר הישרדות עכברים.

WGP כטיפול.

לעכברי C57BL/6 הושתלו גידולי לבלב אורתוטופיים KPC ביום 0 ובימים 4 ו-11 לעכברים קיבלו 1 מ"ג של IP WGP או PBS. לאחר מכן ניטרו עכברים להישרדות.

ניתוח סטטיסטי.

כל התוצאות חזרו על עצמו לפחות שלוש פעמים בלתי תלויות לאימות אלא אם צוין אחרת. מוצגות תוצאות מייצגות. התוצאות מיוצגות כממוצע ± SEM. הנתונים נותחו באמצעות מבחן t של סטודנט דו-זנבתי או מבחן U-Man-Witney. השוואות מרובות קבוצות בוצעו באמצעות ANOVA חד כיוונית או דו כיוונית ולאחריה מבחני ההשוואה המרובים של Tukey. ניתוחי מתאם בוצעו באמצעות מקדם המתאם של פירסון (התפלגות נורמלית). מובהקות סטטיסטית נקבעה ל-p < 0.05. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת GraphPad Prism גרסה 9 (GraphPad Inc., La Jolla, CA).

סיכום דיווח.

מידע נוסף על עיצוב מחקר זמין בסיכום דיווח חקר הטבע המקושר למאמר זה.

זמינות נתונים

נתוני מקור מסופקים במאמר זה. נתוני RNASeq זמינים תחת ההצטרפות ל-GEO GSE187464, ונתוני scRNA-Seq זמינים תחת ההצטרפות ל-GEO GSE187464 נתוני המקור מסופקים במאמר זה.

התקבל: 2 באפריל 2021; התקבל: 17 בינואר 2022.

הפניות

1. ACS. עובדות ומספרים על סרטן 2020.

2. Rahib, L. et al. חיזוי שכיחות סרטן ומקרי מוות עד 2030: הנטל הבלתי צפוי של סרטן בלוטת התריס, הכבד והלבלב בארצות הברית. Cancer Res. 74, 2913–2921 (2014).

3. Kommalapati, A., Tella, SH, Goyal, G., Ma, WW & Mahipal, A. ניהול עכשווי של סרטן לבלב כריתה מקומית. סרטן 10, 24 (2018).

4. Bliss, LA, Witkowski, ER, Yang, CJ & Tseng, JF תוצאות בניהול אופרטיבי של סרטן הלבלב. J. Surg. אונקול. 110, 592–598 (2014).

5. Schizas, D. et al. אימונותרפיה לסרטן הלבלב: עדכון לשנת 2020. טיפול בסרטן. Rev. 86, 102016 (2020).

6. Henriksen, A., Dyhl-Polk, A., Chen, I. & Nielsen, D. Checkpoint inhibitors בסרטן הלבלב. טיפול בסרטן. רפ' 78, 17–30 (2019).

7. Madden, K. & Kasler, MK מעכבי נקודת ביקורת חיסונית בסרטן ריאות ומלנומה. סמינר. אונקול. אחיות. 35, 150932 (2019).

8. Kao, HF & Lou, PJ מעכבי נקודת ביקורת חיסונית עבור קרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר: נוף נוכחי וכיוונים עתידיים. רֹאשׁ. צוואר 41, 4–18 (2019). 9. Leinwand, J. & Miller, G. ויסות ומודולציה של חסינות אנטי-גידולית בסרטן הלבלב. נאט. אימונול. 21, 1152–1159 (2020).

10. Royal, RE et al. ניסוי שלב 2 של סוכן יחיד Ipilimumab (אנטי-CTLA-4) עבור אדנוקרצינומה בלבלב מתקדמת מקומית או גרורתית. J. Immunother. 33, 828–833 (2010).

11. O'Reilly, EM et al. Durvalumab עם או בלי tremelimumab לחולים עם אדנוקרצינומה דוקטלי של הלבלב הגרורתי: ניסוי קליני אקראי שלב 2. JAMA Oncol. 5, 1431–1438 (2019).

12. וייס, GJ et al. מחקר שלב Ib/II של gemcitabine, nab-paclitaxel ו-pembrolizumab באדנוקרצינומה של הלבלב הגרורתי. להשקיע. New Drugs 36, 96–102 (2018). 13. Whatcott, CJ, Posner, RG, Von Hoff, DD & Han, H. in Cancer Pancreatic and Tumor Microenvironment (עורכים Grippo, PJ & Munshi, HG) Ch. 8 (Transworld Research Network, 2012).

14. Karamitopoulou, E. גידול מיקרו-סביבה של סרטן הלבלב: הנוף החיסוני מוכתב על ידי מאפיינים מולקולריים והיסטופתולוגיים. בר. J. Cancer 121, 5–14 (2019).

15. Daniel, SK, Sullivan, KM, Labadie, KP & Pilarisetty, VG Hypoxia כמחסום לאימונותרפיה באדנוקרצינומה של הלבלב. קלינ. תרגום Med. 8, 10–10 (2019).

16. Wang, W. et al. קינאז RIP1 מניע סובלנות חיסונית אדפטיבית בתיווך מקרופאגים בסרטן הלבלב. תא סרטן 38, 585–590 (2020).

17. Netea, MG et al. חסינות מאומנת: תוכנית של זיכרון חיסוני מולד בבריאות ובמחלות. מדע 352, aaf1098 (2016).

18. Bekkering, S. et al. אינדוקציה מטבולית של חסינות מאומנת דרך מסלול ה-mevalonate. תא 172, 135–146 e139 (2018).

19. van der Heijden, C. et al. אפיגנטיקה וחסינות מאומנת. נוגד חמצון. אות חיזור. 29, 1023–1040 (2018).

20. פרים, ב' ואח'. טיפול ננו-ביולוגי מעודד חסינות מיומן מדכא את צמיחת הגידול ומגביר את עיכוב המחסום. תא 183, 786–801 e719 (2020).

21. Kalafati, L. et al. אימון חיסוני מולד של גרנולופואזה מקדם פעילות אנטי-גידולית. תא 183, 771–785 e712 (2020).

22. Mitroulis, I. et al. מודולציה של אבות מיאלופוזיס היא מרכיב אינטגרלי של חסינות מאומנת. תא 172, 147–161.e112 (2018).

23. Bekkering, S., Dominguez-Andres, J., Joosten, LAB, Riksen, NP & Netea, MG חסינות מאומנת: תכנות מחדש של חסינות מולדת בבריאות ובמחלות. עננו כומר אימונול. 39, 667–693 (2021).

24. Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F. & Gomez Perdiguero, E. פיתוח ותפקוד של מקרופאגים תושבי רקמות בעכברים. סמינר. אימונול. 27, 369–378 (2015). 25. קלדרון, ב' ואח'. האנטומיה של הלבלב נותנת את מקורם ותכונותיהם של מקרופאגים גרים. J. Exp. Med. 212, 1497–1512 (2015).

26. Kim, H. גורם השעתוק MafB מקדם קיטוב M2 אנטי דלקתי ופליטת כולסטרול במקרופאגים. Sci. רפ' 7, 7591 (2017).

27. Kim, SY et al. השפעות אנטי דלקתיות של אפוצינין, מעכב של NADPH אוקסידאז, בדלקת בדרכי הנשימה. אימונול. Cell Biol. 90, 441–448 (2012).

28. Liu, M. et al. גורם שעתוק c-Maf הוא מחסום שמתכנת מקרופאגים בסרטן ריאות. ג'יי קלין. להשקיע. 130, 2081–2096 (2020).

29. צימרמן, ק"א ואח'. ריצוף RNA חד-תא מזהה חתימות מועמדות של ביטוי גנים של מקרופאג תושב הכליה על פני מינים. ריבה. Soc. נפרול. 30, 767–781 (2019).

30. Bakos, E. et al. CCR2 מווסת את התגובה החיסונית על ידי מווסת ההמרה ההדדית והתפקוד של תאי T משפיענים ומווסתים. J. Immunol. 198, 4659–4671 (2017).

31. Kurihara, T., Warr, G., Loy, J. & Bravo, R. פגמים בגיוס מקרופאגים והגנת מארח בעכברים חסרי הקולטן של כימוקין CCR2. J. Exp. Med. 186, 1757–1762 (1997).

32. Kuziel, WA et al. הפחתה חמורה בהיצמדות לויקוציטים ובהחמצת מונוציטים בעכברים הסובלים מחסר בקולטן CC כימוקין 2. פרוק. Natl Acad. Sci. ארה"ב 94, 12053–12058 (1997).

33. Kratofil, RM, Kubes, P. & Deniset, JF המרת מונוציטים במהלך דלקת ופציעה. עורקים. טרומב. Vasc. ביול. 37, 35–42 (2017).

34. Funamizu, N. et al. גורם מעכב נדידת מקרופאגים גורם למעבר אפיתל למזנכימלי, משפר את אגרסיביות הגידול ומנבא תוצאות קליניות באדנוקרצינומה של צינורית הלבלב כריתה. Int. J. Cancer 132, 785–794 (2013).

35. דנץ, א. ואח'. עיכוב של MIF מוביל לעצירת מחזור התא ואפופטוזיס בתאי סרטן הלבלב. J. Surg. מילון 160, 29–34 (2010).

36. Su, LJ et al. חמצן תגובתי המושרה על ידי מיני חמצן של שומנים באפופטוזיס, אוטופגיה ופרופטוזיס. חמצן. Med. תא לונגב. 2019, 5080843 (2019).

37. Geller, A., Shrestha, R. & Yan, J. Yeast-derived-glucan in cancer: uses new in a therapeutic tradition. Int. י.מול. Sci. 20, 3618 (2019).

38. Shrivastava, P. & Bhatia, M. תפקיד חיוני של מונוציטים ומקרופאגים בהתקדמות של דלקת לבלב חריפה. World J. Gastroenterol. 16, 3995–4002 (2010).

39. Wang, J. & Kubes, P. מאגר של מקרופאגים חללים בוגרים שיכולים לפלוש במהירות לאיברים קרביים כדי להשפיע על תיקון רקמות. תא 165, 668–678 (2016).

40. Qi, C. et al. מסלולים דיפרנציאליים המווסתים תגובות חיסוניות אנטי-גידוליות מולדות ואדפטיביות על ידי גלוקנים שמקורם בשמרים חלקיקים ומסיסים. דם 117, 6825–6836 (2011).

41. Goodridge, HS et al. הפעלת הקולטן החיסוני המולד דקטין-1 עם היווצרות 'סינפסה פגוציטית'. טבע 472, 471–475 (2011).

42. מסודה, י' ואח'. מתן אוראלי של גלוקנים מסיסים המופקים מ-Grifola frondosa גורם לתגובה חיסונית סיסטמית נגד גידולים ומפחית דיכוי חיסוני בעכברים נושאי גידול. Int. J. Cancer 133, 108–119 (2013).

43. רייס, PJ et al. פרמקוקינטיקה של פטרייתיים (1-3)-בטא-D-גלוקנים לאחר מתן תוך ורידי בחולדות. Int. Immunopharmacol. 4, 1209–1215 (2004).

44. Huang, Y. et al. סחר בין-איברים תלוי S1P של תאים לימפואידים מולדים מקבוצה 2 תומך בהגנה של המארח. מדע 359, 114–119 (2018).

45. Matha, L. et al. הגירה של תאי לימפה מולדים מקבוצת 2 תושב הריאות מקשרת בין דלקת ריאות אלרגית וחסינות כבד. חֲזִית. אימונול. 12, 67950 (2021).

46. ​​Ricardo-Gonzalez, RR et al. מסלולים ספציפיים לרקמות מוציאים ILC2s מופעלים כדי להפיץ חסינות מסוג 2. J. Exp. Med. 217, e2019117 (2020).

47. Mattiola, I. & Diefenbach, A. מתן חסינות נגד גידולים על ידי שחרור ILC2. Cell Res. 30, 461–462 (2020).

48. Qian, BZ & Pollard, JW Macrophage גיוון משפר את התקדמות הגידול וגרורות. תא 141, 39–51 (2010).

49. Qian, BZ et al. CCL2 מגייס מונוציטים דלקתיים כדי להקל על גרורות של גידולי שד. טבע 475, 222–225 (2011).

50. Munn, DH & Cheung, NK Phagocytosis של תאי גידול על ידי מונוציטים אנושיים בתרבית בגורם מגרה מושבה מקרופאגים רקומביננטי. J. Exp. Med. 172, 231–237 (1990).

51. Jadus, MR et al. מקרופאגים הורגים תאי גידול גליומה מסוג T9 הנושאים את האיזופורם הממברנה של גורם מגרה מושבה מקרופאג דרך מסלול תלוי פגוציטוזיס. J. Immunol. 160, 361–368 (1998).

52. Zhou, X., Liu, X. & Huang, L. Phagocytosis של תאי גידול בתיווך מקרופאג: הזדמנות להתערבות ננו-רפואה. עו"ד פונקציה. מאטר. 31, 2006220 (2021).

53. Lecoultre, M., Dutoit, V. & Walker, PR פונקציה פגוציטית של מקרופאגים הקשורים לגידול כגורם מרכזי לבקרת התקדמות הגידול: סקירה. J. Immunother. סרטן 8, e001408 (2020).

54. Cui, S., Reichner, JS, Mateo, RB & Albina, JE מקרופאגים עכברים מופעלים גורמים לאפופטוזיס בתאי גידול באמצעות מנגנונים תלויי תחמוצת חנקן או בלתי תלויים. Cancer Res. 54, 2462–2467 (1994).

55. Brahmer, JR et al. בטיחות ופעילות של נוגדן אנטי-PD-L1 בחולים עם סרטן מתקדם. N. Engl. J. Med. 366, 2455–2465 (2012).

56. Saijo, S. et al. דקטין-1 נדרש להגנה מארח מפני Pneumocystis carinii אך לא מפני קנדידה אלביקנס. נאט. אימונול. 8, 39–46 (2007).

57. Bernhagen, J. et al. טיהור, ביואקטיביות וניתוח מבנה משני של גורם מעכב נדידה של עכברים ומקרופאגים אנושיים (MIF). Biochemistry 33, 14144–14155 (1994).

58. Chen, TJ & Kotecha, N. Cytobank: מתן פלטפורמה אנליטית לניתוח נתוני ציטומטריה קהילתית ושיתוף פעולה. Curr. חלק עליון. מיקרוביול. אימונול. 377, 127–157 (2014).

59. Nowicka, M. et al. זרימת עבודה CyTOF: גילוי דיפרנציאלי במערך נתונים של ציטומטריה בעלת תפוקה גבוהה. F1000Res. 6, 748 (2017).

60. Wilkerson, MD & Hayes, DN ConsensusClusterPlus: כלי לגילוי כיתה עם הערכות אמון ומעקב אחר פריטים. ביואינפורמטיקה 26, 1572–1573 (2010). 61. Finak G., JM FlowWorkspace: תשתית לייצוג ואינטראקציה עם ערכות נתונים של ציטומטריה מגודרות ובלתי משולבות. גרסת הביולוגית (2019).

62. Finak, G., Jiang, W. & Gottardo, R. CytoML לשיתוף נתוני ציטומטריה בין פלטפורמות. ציטום. חלק א': J. Int. Soc. אנאלי. Cytol. 93, 1189–1196 (2018).

63. Crowell, HL, Zanotelli, VRT, Chevrier, S. & Robinson, MD CATALYST: כלי ניתוח נתונים של ציטומטריה. גרסה 1.10.3 של חבילת R. HelenaLC/CATALYST (2020).

64. Cock, PJ, Fields, CJ, Goto, N., Heuer, ML & Rice, PM פורמט הקובץ Sanger FASTQ לרצפים עם ציוני איכות, וגרסאות Solexa/Illumina FASTQ. Nucleic Acids Res. 38, 1767–1771 (2010).

65. אילומינה. מדריך למשתמש של BaseSpace. 2014.

66. Andrews, S. FastQC: כלי בקרת איכות לנתוני רצף תפוקה גבוהה.

67. דובין, א' ואח'. STAR: מיישר אוניברסלי RNA-seq מהיר במיוחד. ביואינפורמטיקה 29, 15–21 (2013).

68. Love, MI, Huber, W. & Anders, S. הערכה מתונה של שינוי קיפול ופיזור עבור נתוני RNA-seq עם DESeq2. גנום ביול. 15, 550 (2014).

69. Trapnell, C. et al. ניתוח ביטוי גנים ותמליל דיפרנציאלי של ניסויי RNAseq עם TopHat וחפתים. נאט. פרוטוק. 7, 562–578 (2012).

70. Anders, S., Pyl, PT & Huber, W. HTSeq – מסגרת Python לעבודה עם נתוני רצף בתפוקה גבוהה. ביואינפורמטיקה 31, 166–169 (2015).

71. Boyle, EI et al. GO::TermFinder–תוכנת קוד פתוח לגישה למידע Gene Ontology ומציאת מונחי Gene Ontology מועשרים משמעותית הקשורים לרשימת גנים. ביואינפורמטיקה 20, 3710–3715 (2004).

72. Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: אנציקלופדיה של קיוטו של גנים וגנומים. Nucleic Acids Res. 28, 27–30 (2000).

73. Stuart, T. et al. אינטגרציה מקיפה של נתונים תא בודד. תא 177, 1888–1902. e1821 (2019).

74. Lun, AT, Riesenfeld, S., Andrews, T., Gomes, T. & Marioni, JC EmptyDrops: הבחנה בין תאים מטיפות ריקות בנתוני רצף RNA של תא בודד המבוסס על טיפות. גנום ביול. 20, 1–9 (2019).

75. Hafemeister, C. & Satija, R. נורמליזציה וייצוב שונות של נתוני RNA-seq חד-תאיים באמצעות רגרסיה בינומיאלית שלילית מסודרת. גנום ביול. 20, 1–15 (2019).

76. Becht, E. et al. הפחתת מימדיות להמחשת נתונים של תא בודד באמצעות UMAP. נאט. ביוטכנולוגיה. 37, 38–44 (2019).

77. Diaz-Mejia, JJ et al. הערכה של שיטות להקצאת תוויות מסוג תאים לצבירי תאים מנתוני רצף RNA חד-תא. F1000Res. 8 ISCB Comm J-296 (2019). 78. Hänzelmann, S., Castelo, R. & Guinney, J. GSVA: ניתוח וריאציות של סט גנים לנתונים של microarray ו-RNA-seq. BMC Bioinforma. 14, 7 (2013).

79. פינאק, ג' ואח'. MAST: מסגרת סטטיסטית גמישה להערכת שינויים בתעתיק ואפיון הטרוגניות בנתוני רצף RNA חד-תא. גנום ביול. 16, 1–13 (2015).

80. Suffiotti, M., Carmona, SJ, Jandus, C. & Gfeller, D. זיהוי של תאים לימפואידים מולדים בנתוני RNA-Seq חד-תאיים. Immunogenetics 69, 439-450 (2017).

81. Entwistle, LJ et al. פנוטיפ תאי לימפה מולד מקבוצה ריאתית 2 הוא ספציפי להקשר: קביעת השפעת המתח, המיקום והגירויים. חֲזִית. אימונול. 10, 3114 (2020).

82. Ricardo-Gonzalez, RR et al. אותות רקמה מטביעים את זהות ILC2 עם פונקציה מקדימה. נאט. אימונול. 19, 1093–1099 (2018).

83. זיליוניס, ר' ואח'. תעתיקי תאי בודדים של סרטן ריאות של בני אדם ועכברים חושפים אוכלוסיות מיאלואידיות שמורות על פני פרטים ומינים. Immunity 50, 1317–1334.e1310 (2019).

תודות

המחברים מבקשים להודות לד"ר וולפגנג זכריאס, ד"ר מיי ז'אנג וסבין וויגל מהמתקן הגנומי של מרכז הסרטן בראון על עזרתם ב-RNA-Seq ו- scRNASeq. כמו כן, ברצוננו להודות לד"ר קלינט גלר על הגהה של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01CA213990 ו-R01AI128818 (JY). CD ו-CTW נתמכו בחלקם על ידי NIH P20GM135004. חלק מעבודה זו בוצע בסיוע מתקן UofL Genomics, אשר נתמך על ידי NIH P20GM103436 (KY IDeA Networks of Biomedical Research Excellence), מרכז הסרטן בראון ודמי משתמש. CyTOF בוצע ב-Functional Immunomics Core הנתמך על ידי NIH P20GM135004 (יוני יאן/ג'ייסון צ'סני, MPI). תמיכה ברצף וביואינפורמטיקה לעבודה זו ניתנה על ידי NIH P20GM103436 (Nigel Cooper, PI) ו-NIH P20GM106396 (Donald Miller, PI). התוכן של עבודה זו הוא באחריות הכותבים בלבד ואינו מייצג את הדעות הרשמיות של ה-NIH או המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים (NIGMS).

תרומות מחבר

AEG עיצב וביצע את הניסויים ניתח נתונים, פירש תוצאות וכתב את כתב היד. RS, CD ו-HG תרמו לתכנון ניסוי, רכישת נתונים וניתוח נתונים. MRW, XH ו-MZ סייעו ברכישת נתונים והכנת חומרים. KA ו-ECR תרמו לניתוח ולפרשנות החישובית של ניתוחי RNA-Seq ו-JHC ו-ECR תרמו לניתוח ולפרשנות החישובית של ניתוחי ScRNA-Seq. DT ו-CTW תרמו לניתוח נתוני CyTOF. RAM, H.-gZ ו-YL תרמו חומרים והנחו את הפרויקט. RAM ביצע סקירה קריטית. JY ניהל את התכנון הניסוי ואת המחקר הכולל, פירש נתונים, פיקח על מחקר וסייע בכתיבה ובסקירה של כתב היד.

אינטרסים מתחרים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

מידע נוסף

מידע משלים הגרסה המקוונת מכילה חומר משלים הזמין בכתובת https://doi.org/10.1038/s41467-022-28407-4.

התכתבות ובקשות לחומרים יש להפנות ל-Jun Yan.

מידע על ביקורת עמיתים

Nature Communications מודה לג'ורג' מילר ולסוקרים האחרים, האנונימיים, על תרומתם לביקורת עמיתים של עבודה זו. דוחות בודקים עמיתים זמינים.

הדפסות חוזרות ומידע על הרשאות זמינים בכתובת http://www.nature.com/reprints

הערת המוציא לאור, Springer Nature נותר ניטרלי לגבי תביעות שיפוט במפות שפורסמו ובשיוכים מוסדיים.

גישה פתוחה מאמר זה מורשה תחת רישיון Creative Commons Attribution 4.0 בינלאומי, המאפשר שימוש, שיתוף, התאמה, הפצה ושכפול בכל מדיום או פורמט, כל עוד אתה נותן קרדיט מתאים למחבר המקורי (ים) והמקור, מספקים קישור לרישיון Creative Commons, ומציינים אם בוצעו שינויים.

התמונות או חומר צד שלישי אחר במאמר זה כלולים ברישיון Creative Commons של המאמר אלא אם צוין אחרת בקו אשראי לחומר. אם החומר אינו כלול ברישיון Creative Commons של המאמר והשימוש המיועד שלך אינו מותר על פי תקנה סטטוטורית או חורג מהשימוש המותר, תצטרך לקבל אישור ישירות מבעל זכויות היוצרים. לצפייה בעותק של רישיון זה.

For more information:1950477648nn@gmail.com