המאפיינים הפונקציונליים של חלבונים עשויים להיות משופרים באמצעות הידרוליזה על ידי פרוטאזות מסוימות

אנא צור קשרosar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

תַקצִיר:כדי לחקור שיטות לשיפור העיבוד של פסולת חזירים, עור החזיר עבר הידרוליזה באמצעות פרוטאזות זמינות מסחריות שונות (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Bromelain, Protamex ו- Papain) בכמה תנאים אופטימליים. לאחר הידרוליזה אנזימטית, הידרוליזטים של הקולגן (CHs) חולקו לפי משקל מולקולרי (3 kDa) באמצעות סינון אולטרה ממברנה. ה-CHS נותחו עבור תכונות פיזיקליות (pH, התאוששות חלבון, תכולת קבוצות אמינו חופשיות, התפלגות משקל מולקולרית והרכב אמינו) וכן עבור תכונות פונקציונליות (פעילויות נוגדות חמצון ופעילויות אנטי-אייג'ינג). מבין ה-CHs, CHs שעבר הידרוליזה על ידי Alcalase (CH-Alcalase) הפגינו את דרגת ההידרוליזה הגבוהה ביותר בהשוואה ל-CHs אחרים. גם"CH-Alcalase" וגם"CH-Alcalase<3 kda"="" fractions="" showed="" a="" considerably="" high="" antioxidant="" activity="" and="" collagenase="" inhibition="" activity.="" therefore,="" resulting="" bioactive="" have="" the="" potential="" for="" development="" as="" antioxidants="" and="" anti-aging="" ingredients="" in="" the="" food,="" cosmetics,="" and="" pharmaceuticals,="" from="" animal="">

מילות מפתח:הִידרוֹלִיזָה; פרוטאזות מסחריות; הידרוליזט של קולגן; נוגד חמצון; נוגד הזדקנות

KSL01

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

1. הקדמה

עם הגדלת תוחלת החיים, הליכי אנטי אייג'ינג של העור זוכים לתשומת לב רבה. קולגן, המשמש במוצרי טיפוח כמרכיב קוסמטי לאנטי אייג'ינג, נמצא בשימוש נרחב בשוק הקוסמטיקה. קולגן הוא חלבון סיבי במשקל מולקולרי גבוה ממקור מן החי, המצוי בשפע ברקמות חיבור, עור, גידים, סחוס, רצועות, שיניים, ציפורניים ושיער של בני אדם ובעלי חיים. בעלי חיים נותרו המקור העיקרי לקולגן תעשייתי [1l. מדי שנה, כמויות גדולות של תוצרי לוואי של בעלי חיים נזרקות ברחבי העולם, כפסולת, על ידי תעשיות המזון והבשר. עם זאת, ניתן להשתמש בהם כמשאבי חלבון חשובים לחומרי מזון חדשים או להמיר אותם למוצרים בעלי ערך מוסף באמצעות הידרוליזה, אשר מיושמת באופן נרחב כדי לשפר ולשדרג את התכונות התפקודיות והתזונתיות של חלבונים [2,3].cistanche genghis khanקולגן גם נחשב יותר ויותר למקור לפפטידים ביו-אקטיביים, אשר הראו הבטחה כתרכובות מועילות לשימוש ביישומים תזונתיים או פרמצבטיים. לכן, הידרוליזה של קולגן עשויה למלא תפקיד חשוב בשיפור הזמינות הביולוגית שלו והתאמתו לשימוש בתהליכים מסחריים שונים.

פעילויות פיזיולוגיות של פפטידים ביו-אקטיביים, המכילים בדרך כלל 2-20 שאריות חומצות אמינו (<6000 da),="" are="" based="" on="" the="" composition="" and="" sequence="" of="" their="" amino="" acids="" [2,4].="" due="" to="" their="" structural="" properties="" such="" as="" molecular="" weight,="" bioactive="" peptides="" may="" possess="" specific="" characteristics="" that="" affect="" numerous="" physiological="" processes="" related="" to="" antimicrobial,="" antioxidant,="" emulsifying,="" antihypertensive,="" antidiabetic,="" and="" immunomodulatory="" functions="" in="" organisms="" [1,5,6].="" generally,="" low="" molecular="" weight="" hydrolysates="" display="" lower="" viscosity,="" better="" dispersion,="" higher="" hydrophobicity,="" and="" smaller="" particle="" size="" [7].="" the="" degree="" of="" hydrolysis="" directly="" affects="" the="" molecular="" weight="" and="" amino="" acid="" composition="" of="" the="" hydrolysates="" [8].="" therefore,="" the="" hydrolysis="" process="" may="" be="" necessary="" for="" producing="" novel="" bioactive="">

KSL02

Cistanche יכול אנטי אייג'ינג

הידרוליזה של חלבון, המובילה לפירוק של קשרי פפטידים, עשויה להתבצע באמצעות תהליכים אנזימטיים או כימיים [9]. תהליכים כימיים, כולל הידרוליזה אלקלית או חומצית באמצעות מיצוי ממסים, מזיקים לא רק לסביבה אלא גם לבני אדם שצורכים את המוצרים המתקבלים [4,10]. תהליכים כימיים, שקשה לשלוט בהם, מניבים מוצרים המכילים חומצות אמינו מותאמות [9]. לעומת זאת, הידרוליזה אנזימטית עשויה להתבצע בתנאים קלים, ובכך להימנע מסביבות קיצוניות הנדרשות על ידי טיפולים כימיים.הארכת חיי cistancheיתרה מכך, התהליכים אינם מייצרים תגובות לוואי ואינם מורידים את הערך התזונתי של מקור החלבון [8]. מספר פרוטאזות, כולל Alcalase, Pepsin, Protamex, Trypsin ו- Neutrase, משמשים בדרך כלל להידרוליזה של חלבונים, וכתוצאה מכך נוצרים סוגים שונים של הידרוליזטים ופפטידים של חלבונים עם מגוון פעילויות ביו-פונקציונליות. מחקר אחד דיווח על ייצור הידרוליזטים של קולגן עם פעילות נוגדת חמצון מג'לטין של עור חזיר באמצעות הידרוליזה אנזימטית על ידי פפסין ופנקריאטין [11]. תוצרי לוואי של סלמון עברו הידרוליזה לייצור הידרוליזטים פפטיים באמצעות פרוטאזות שונות, כאשר הפפטידים הסופיים הראו תכונות נוגדות חמצון ואנטי דלקתיות מצוינות [12].

מטרת המחקר הייתה: (א) לזהות את ההידרוליזטים הפעילים ביותר של קולגן המיוצרים על ידי הידרוליזה אנזימטית באמצעות פרוטאזות זמינות מסחריות שונות (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Protamex, Bromelain ו- Papain); (ב) לאשר את השפעת הפרקציה של הידרוליזטים של קולגן המתקבלים מהידרוליזה אנזימטית, ו-(ג) כדי לקבוע את פעולות נוגדי החמצון והאנטי-אייג'ינג שלהם במבחנה.

2. תוצאות ודיון

2.1. השפעת הידרוליזה אנזימטית על קולגן הידרוליזטים

2.1.1.pH

התכונות התפקודיות של חלבונים עשויות להשתפר באמצעות הידרוליזה על ידי פרוטאזות מסוימות. במחקר זה, שש פרוטאזות שונות (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Bromelain, Protamex ו- Papain) שימשו להידרוליזה של קולגן מעור חזיר על מנת להשיג הידרוליזטים של קולגן פעילים בעלי משקל מולקולרי נמוך. השינוי ב-pH בהידרוליזטים של קולגן (CH) מוצג באיור 1. ה-pH של תרחיף הקולגן (5% תערובת עור חזיר) היה בתחילה 6.39-6.55 (ב-0h). CH-Alcalase ו-CH-Flavorzyme הגיעו ל-pH אופטימלי (pH 8.0) ב-12 שעות של דגירה. CH-Protamex, CH-Bromelain ו-CH-Papain הגיעו ל-pH אופטימלי (pH 7.0) ב-6 שעות של דגירה, בעוד CH-Flavorzyme המשיך לרדת מ-pH6.39 ל-pH 5.69 במשך 24 דגירה (איור 1 ). ה-pH של הידרוליזט חלבוני הוא גורם חשוב המווסת תגובות הידרוליזה אנזימטיות [13].cistanche nzלכן, יצירת הידרוליזטים של קולגן בתנאים של pH שונה עשויה לנבוע משינויים תלויי pH בקונפורמציה של האנזים, מה שעלול להשפיע על ההפעלה הביולוגית ועל התכונות הפיזיקוכימיות שלהם.

2.1.2. Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)

מוצגים פרופילי ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) של סודיום דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד של CHs שטופלו בפרוטאזות שונות במשך 24 שעות (איור 2). פרופיל הפפטידים של תרחיף הקולגן (בשעה 0 שעה) הראה פס גלוי בטווח משקל מולקולרי נמוך עד גבוה. התוצאות הצביעו על הידרוליזה מהירה ב-CH-Alcalase, CH-Neutrase, CH-Bromelain ו-CH-Protamex, מכיוון שלא היו פסים לאחר דגירה של 3 שעות. פסי טווח המשקל המולקולרי הגבוה של CH-Alcalase, CH-Neutrase ו-CH-Protamex ירדו באופן דגירה תלוי זמן. עם זאת, CH-Bromeline לא השתנה עם זמן הדגירה מכיוון שהוא עבר הידרוליזה מלאה לאחר שעה אחת בלבד של דגירה. מעניין לציין שה-CH נעלמו לחלוטין כאשר הדגימה הגיבה עם Alcalase או Neutrase במשך 6 שעות, מה שמעיד על כך שקולגן פעל כמצע מתאים לכמה מהאנזימים האחרים שנבדקו. עם זאת, רצועות של CH-Flavorzyme ו-CH-Papain הופיעו בטווח משקל מולקולרי נמוך עד גבוה לאחר 24 שעות. חלבונים יכולים לעבור הידרוליזה חלקית לפפטידים או חומצות אמינו על ידי הידרוליזה אנזימטית, בהתאם לסוג הפרוטאז, זמן הדגירה ויחס הפרוטאז למצע (כמות החלבון) [14]. תהליך ההידרוליזה האנזימטי נקבע בעיקר על ידי האם סוג הפרוטאז המעורב הוא אנדופפטידאז או אקסופפטידאז [15,16]. מכיוון ש-Alcalase, Neutrase ו-Protamex הם אנדופפטידאזים, ניתן לצפות שתהליכי ההידרוליזה שלהם ישברו את קשרי הפפטיד מחומצות אמינו לא סופניות באופן אקראי, ובכך יאפשרו הידרוליזה נוספת של חלבונים. מצד שני, Flavorzyme הוא גם אנדו-ואקסופפטידאז, אשר שובר את ה-non-או N-terminal של שרשראות פפטידים. במחקר זה, חלבון הקולגן הכיל אתרי קישור, שהיו רגישים יותר לפעילות אקסופפטידאז מאשר לפעילות אנדופפטידאז של Flavorzyme. לפיכך, עקב פעילות אקסופפטידאז, הידרוליזה של חלבוני קולגן על ידי Flavorzyme כללה שבירה שלב אחר שלב של קשרים פפטידים מקצה N של חומצות אמינו, מה שהאט את הידרוליזה של חלבון.

2.1.3. שחזור חלבון ותוכן קבוצת אמינו חינם

שחזור חלבון של CHs המתקבל באמצעות פרוטאזות מסחריות שונות מוצג (איור 3A). לבקרה (תרחיף קולגן) הייתה תכולת החלמה של חלבון של 1.19 מ"ג/מ"ל. שחזור חלבון הוא פרמטר ליעילות של הידרוליזה אנזימטית. תכולת התאוששות החלבון הנמוכה של CH מעידה על פירוק חלבון מוגבר. יתר על כן, התאוששות חלבון מתאמת היטב עם מסיסות חלבון. פעילות הידרוליטית גבוהה יותר עלולה להיגרם על ידי עלייה בשרשראות צד הידרופוביות חשופות, מה שמוביל לאינטראקציות הידרופוביות מוגברות בין חלבונים ו/או פפטידים.גודל הפין cistancheשרשראות צד הידרופוביות אלו עשויות להוביל לירידה במסיסות החלבון, ובכך לגרום להגברת התאוששות החלבון של הידרוליזטים. במחקר שלנו, תכולת התאוששות החלבון הייתה בקורלציה טובה עם שינויים בדפוסי SDS-PAGE. רמות תכולת החלבון הנמוכות והגבוהות ביותר נרשמו עבור הידרוליזה של Alcalase ו- Flavorzyme, בהתאמה. עבור יעילות הידרוליזה הקשורה לזמן הדגירה, CH-Alcalase, CH-Bromelain ו-CH-Protamex ירדו באופן דרסטי תוך שעה אחת מהדגירה בהשוואה לביקורת. הירידה בתכולת התאוששות החלבון כתוצאה מהידרוליזה של חלבון הראתה קשר הפוך עם תכולת קבוצת האמינו. יתר על כן, רוב ה-CHs, למעט CH-Neutrase, הפגינו תכולת חלבון נמוכה בין 3 שעות ל-12 שעות. לאחר דגירה של 24 שעות, תכולת החלבון שלהם עלתה שוב ב-CH-Alcalase, CH-Flavorzyme, CH-Neutrase, CH-Bromeline, CH-Protamex ו-CH-Papain באופן הבא:0.83 mg/mL, 1.29 מ"ג/מ"ל,0.75 מ"ג/מ"ל,0.97 מ"ג/מ"ל, 0.77 מ"ג/מ"ל ו-1.11 מ"ג/מ"ל, בהתאמה. חלק מהדיווחים מצביעים על כך שזמן ההידרוליזה האופטימלי תלוי במספר גורמים כגון המין שנבחר, חומר הגלם, האנזים המשמש, קצב חומר הגלם/האנזים, ריכוז האנזים ומידת ההידרוליזה הנמשכת וכו' [16] ]. חלק מהדיווחים מצביעים על כך שהידרוליזה אנזימטית ממושכת (מעל 24 שעות) עשויה להוביל להפחתה בפעילות הפרוטאזות; לפיכך, הידרוליזה אנזימטית צריכה להתבצע תוך 24 שעות מההידרוליזה האנזימטית [17,18].

KSL03

The free amino group content of CH, which is an indicator of enzymatic hydrolysis efficiency, was estimated (Figure 3B). The expected outcome of protein breakdown is that protein may be hydrolyzed into shorter peptide products. The free amino group content of the control was initially 0.14 mg/mL. The free amino group content of all CHs dramatically increased with increasing incubation time. After 24 h incubation, the free amino group content by descending order was: CH-Alcalase(1.00 mg/mL)> CH-Protamex(0.70 mg/mL)> CH-Neutrase(0.68 mg/mL)>CH-Bromeline (0.67 mg/mL)>CH-Flavorzyme(0.53mg/mL)>CH-Papain (0.40mg/mL). בדרך כלל, הבדלים בתכולת החלבון הכולל או קבוצת אמינו חופשית של דגימות שעברו הידרוליזה אנזימטית עשויים להיות קשורים לסגוליות האנזים. זה תלוי בתכונות של אנזים במהלך תהליך ההידרוליזה האנזימטית [16,17].אבקת cistanche,לדוגמה, פרוטאזות אלקליין (כגון Alcalase) מציגות פעילות הידרוליטית גבוהה יותר בהשוואה לפרוטאזות חומציות או ניטרליות.

איור 3. שינוי בהתאוששות חלבון (A) וקבוצות אמינו חופשיות (B) של הידרוליזטים של קולגן (CH) בהתאם לזמן הדגירה. הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן (SD). נתונים המסומנים באותיות שונות (מודעה) מראים הבדלים מובהקים סטטיסטית בהתאם לזמן הדגירה (עמ'<>

KSL04