מיקוד לקטט דהידרוגנאז A עם קטכין גורם לרגישות מחדש של תאי סרטן הקיבה SNU620/5FU ל5-פלואוראורציל חלק 2

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

2.5. טיפול משותף CA ו-5Fu גורם לאפופטוזיס תלוי ROS מיטוכונדריאלי

מאחר שעיכוב LDHA מגביר ישירות את ה-ROS המיטוכונדריאלי ואובדן פוטנציאל הממברנה שלו, ובעקבות כך גורם לאפופטוזיס[16,29], נבדקו הגורמים הקשורים לאפופטוזיס בתיווך ROS המיטוכונדריאלי. טיפול יחיד מסוג CA או 5FU העלה מעט את רמת ה-ROSlevel המיטוכונדריאלית בתאי SNU620/5FU כאשר נמדד על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות MitoSOX. עם זאת, טיפול משותף עם CA ו-5FU שיפר משמעותית את ייצור ROS המיטוכונדריאלי. ייצור ROS מוגבר זה הפך על ידי Mito-TEMPO, נוגד חמצון ממוקד למיטוכונדריה (איור 5A-C). עיכוב גדילה בעקבות טיפול ב-CA ו-5FU התאושש גם לאחר טיפול ב-Mito-TEMPO בתאי SNU620/5FU (איור 5D). יתר על כן, אפופטוזיס הוערך באמצעות צביעה של Annexin V-FITC/PI בתאי SNU620/5FU. טיפול משותף עם CA ו-5FU הגדיל את מספר התאים האפופטוטיים בין תאי SNU620/5FU (איור 6A, B). פיצול מורפולוגי גרעיני מופיע במהלך אפופטוזיס, וניתן להבחין בו על ידי צביעה 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) [30,31]. נמצא כי פיצול DNA גדל באופן מובהק בקבוצת הטיפול המשותף, בהשוואה לזה בקבוצת הביקורת (איור 6C). לבסוף, נבדקו סמנים ביולוגיים של אפופטוזיס כולל Bcl-2, Bax, Caspase-9, Caspase-3 ו-PARP. המפל הפרופופטוטי גדל בעקבות טיפול משותף עם CA ו-5FU בתאי SNU620/5FU (איור 6D). ממצאים אלו מצביעים על כך שטיפול משותף עם CA ו-5FU גורם לאפופטוזיס בתאי SNU620/5FU.

איור 5. טיפול משותף עם קטצ'ין(CA) ו-5-fluorouracil(5FU) מגביר את הייצור של מיטוכונדריאלי ROS:(A)SNU620/5FU תאי טופלו בריכוזים המצוינים של CA,5FU (10 מיקרומטר) ומיטו -TEMPO（20 מיקרומטר） למשך 48 שעות. ROS המיטוכונדריאלי של התאים נמדד באמצעות ניתוח FACS באמצעות MitoSOXTM Red; (B) גרף העמודות מראה את שיעור התאים שהיו חיוביים לצביעה של MitoSOX; (C) תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנציה (X100) של תאי SNU620/5FU שנצבעו ב- MitoSOX הוצגו; (ד) הכדאיות של התאים נמדדה באמצעות מבחן MTT. התוצאות מוצגות כממוצע ± SEM.*p<><0.001, and=""><0.001, compared="" to="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

איור 6. עלייה באפופטוזיס על ידי טיפול משותף בקטצ'ין(CA) ו-5-fluorouracil(5FU); תאי SNU620/5FU טופלו ב-CA （10 uM） ו/או 5FU （10 μM） במשך 48 שעות∶（A） מספר התאים האפופטוטיים נותח באמצעות FACSanalysis באמצעות צביעת PI-Annexin V;(ב) אחוז התאים בשלבים אפופטוטיים מוקדמים ומאוחרים. התוצאות מוצגות כממוצע ± SEM.**p<0.001, compared="" to="" the="" control;(c)="" the="" nuclei="" of="" the="" cells="" were="" stained="" with="" dapl,="" and="" fluorescence="" microscopic="" images="" were="" taken="" (x200).="" the="" white="" arrowhead="" indicates="" apoptotic="" cells.="" scale="" bar,="" 10="" um;="" (d)the="" expression="" levels="" of="" proteins="" related="" to="" the="" apoptotic="" pathway="" were="" measured="" by="" western="" blot="" analysis.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

3. דיון

במחקר זה, כדי לאפיין ולהעריך עמידות כימית ל-5FU, השתמשנו בתאי SNU620/5FU, אשר נוצרו על ידי חשיפה ארוכת טווח ל-5FU עם עלייה סדרתית של ריכוז התרופה [32]. דווח כי תאי SNU620 ההורים מכילים מוטנט p53 עם מחיקה הומוזיגוטית באקסון 5[33]. בהתבסס על מיקרו-מערך של DNA, מספר גנים המעורבים בעמידות לכימו, כולל סינתטאז של תימידילאט, חלבון קושר DNA 2 ספציפי לנזק, clusterin ו-midkine, מוגברים בתאי SNU620/5FU [32]. מספר מחקרים קודמים השתמשו בקו SNU620/5FUcell כמודל להערכת יעילות חוץ-גופית של תרופות נגד עמידות ל-5FU באמצעות אנטי-מיטוזיס, הפעלת AMPK ואיתות קולטני קנבינואידים [34-36]. עם זאת, המאפיינים המטבוליים ורמות הביטוי של גנים הקשורים לחילוף החומרים בתאי SNU620/5FU ותפקידיהם בעמידות כימיות לא נחקרו במידה רבה.

כאן, הדגמנו כי לתאי SNU620/5FU יש פנוטיפים גליקוליטיים מתקדמים, כולל ייצור מוגבר של לקטט וביטוי של אנזימים הקשורים להמרה של פירובט ללקטט, כגון LDHA. הזרחון של PDHA1, המייצג את הפעילות המופחתת של PDH על ידי PDK2 ו-PDK3 מוגברים, גדל גם בתאים עמידים ל-SNU620/5FU, בהשוואה לזו שבתאי האב SNU620. עם זאת, OCR לא ירד באופן משמעותי בתאים עמידים. הסבר אפשרי לפער זה הוא הפלסטיות התזונתית של תאים סרטניים עבור מחזור ה-TCA, כלומר, חומצות אמינו או אצטיל-CoA שמקורו בחומצות שומן, לא רק אצטיל-CoA שמקורו בגלוקוז, יכולים לספק מצעים למחזור TCA [37] ].במתאם לכך, תאי סרטן קיבה עמידים ל-5FU מקדמים גזע באמצעות חמצון חומצות שומן מיטוכונדריות [38]. בנוסף, התנגדות 5FU קשורה לעלייה במסה ובפעילות המיטוכונדריה, כולל ביטוי של אנזימים של שרשרת הובלה אלקטרונית (ETC) וצריכת חמצן [39,40]. לפיכך, התמקדנו באפנון של LDHA כדי לעשות רגישות מחדש להתנגדות 5FU. בהתבסס על התוצאות שלנו, עיכוב פעילות LDHA עם oxamate או CA דיכא בהצלחה את הצמיחה של תאי SNU620/5FU עמידים ועשה אותם מחדש לטיפול ב-5FU. ממצאים אלו הראו מתאם טוב לאלו של מחקרים קודמים, שדיווחו כי עיכוב גנטי או תרופתי של LDHA הפחית בהצלחה את העמידות לכימותרפיה, כולל 5FU [19,41,42]. לפיכך, הנחנו שעיכוב LDHA עשוי להיות מספיק כדי לדכא את העמידות נגד 5FU בתאי SNU620/5FU.

Cistanche יכול לשפר חסינות

מספר מולקולות סינתטיות, כגון אוקסמט, FX11, PSTMB ו-GNE-140, הוגדרו כמעכבי LDHA בעלי מולקולה קטנה [11,43]. בין אלה, FX11 דווח כגורם רגיש לכימותרפיה בתאי גידול עמידים [44]. עם זאת, למרות שמעכבי LDHA רבים נמצאים בבדיקה לקבלת אישור כתרופות נוגדות סרטן חדשות, אף אחת מהן עדיין לא אושרה. לפיכך, נדרשים יותר מועמדים דמויי תרופה כדי ליצור מעכבי LDHA חדשים [45]. תרכובות טבעיות נתפסו כמשאבים פוטנציאליים לתרופות אנטי סרטניות, במיוחד בהתגברות על עמידות כימיות כטיפול משולב [46,47]. לכן, התמקדות במטבוליזם של סרטן, במיוחד מטבוליזם של גלוקוז עם מוצרים טבעיים שמקורם בצמחים היא מגמת מחקר מתפתחת לפיתוח תרופות חדשות לסרטן [48].

יתר על כן, מספר דיווחים העלו כי מוצרים טבעיים, כגון גוססיפול, גאלופלאבין, קרוציטין, מכונה A ו-EGCG, הם מעכבי LDHA חזקים [43,49,50]. למרות שבין אלה, לגוסיפול יש את הפעולה המעכבת החזקה ביותר על LDHA (IC50=9.8 uM), הוא גם מעכב את הפעילות של LDHB, אשר הופך לקטט לפירובט [51]. התוצאות שלנו הוכיחו ש-EGCG, מעכב LDHA מבוסס וגורם רגיש לכימותרפיה 5FU [22-25], מפעיל השפעות מעכבות על פעילויות LDHA ו-LDHB. בין מעכבי LDHA שמקורם במוצר טבעי המציגים פעילויות מעכבות ספציפיות ל-LDHA, כגון מכונה A(IC50 =84 μM), קרוצטין （IC50 =54.9 μM） ו-CA （IC{{13} }.69 μM）【49,50】, CA הראתה את ההשפעה המדכאת הטובה ביותר על פעילות LDHA ביחס לערך ICsn. למרות שהמבנים הכימיים של CA ו-EGCG דומים מאוד למעט חלק החומצה הגלית הנוספת, הסלקטיביות המעכבת שלהם הייתה לא אותו הדבר. בנוסף, למרות ש-CA היא התרכובת הפשוטה ביותר, בהשוואה לנגזרות שלה, היא הראתה את הפעולה המעכבת הטובה ביותר הן על ייצור לקטט והן על פעילות LDHA. לפיכך, יש לערוך מחקר מקיף על קשרי מבנה-פעילות כדי להדגים את CA כ- עמוד שדרה חדשני פוטנציאלי לפיתוח של מעכבי LDHA ספציפיים וחזקים.

ידוע כי EGCG הוא מעכב תחרותי של NADPH. בנוסף, EGCG מעכב את הטרנסלוקציה וההתרבות של NADPH אוקסידאז [52-54]. עם זאת, על פי תוצאות המודל המולקולרי, CA ו-EGCG ממוקמים מבנית במקומות שונים (איור 3A, B). בנוסף, הם לא הראו את המתאם בספציפיות בעיכוב פעילות LDHA ו-LDHB, המשתמשות ב-NADH ו-NAD פלוס כקופקטור, בהתאמה. מנתונים אלה, הנחנו של-CA אין מתאם ישיר עם EGCG במנגנון התחרות עם NAD(P)H. אגב, עיכוב של LDHA על ידי מספר מעכבים, כגון FX11, GSK 2837808A, NCI-737 ו-NCI-006, הפחית את ייצור NADt והגדיל את הצטברות NADH, ובכך הפחית את היחס של NAD plus /NADH[16,17,55]. אפופטוזיס המושרה על ידי מסלול נזק ל-DNA תלוי p53/NAD מועלה גם על ידי עיכוב LDHA באמצעות siRNA או מעכב כימי, NH-2 [56]. מסלול האיתות GCN2-ATF4 דווח גם כמנגנון נוסף האחראי למוות של תאים אפופטוטיים המושרה על ידי מעכב LDHA, GSK 2837808A [17]. מכיוון שיחס NAD/NADH ממלא תפקיד מפתח בהומאוסטזיס חיזור ובשגשוג תאים [5758], ה-CA כמעכב LDHA עשוי להשפיע על תאי הסרטן העמידים ל-5FU באמצעות אפנון של יחס NAD plus /NADH.

CA גרם למוות של תאים גם בתאי SNU620 של ההורים וגם בתאי SNU620/5FU העמידים ל-5FU. עם זאת, מוות תאי המושרה על ידי CA היה תלוי ב-LDHA באמצעות דלדול shRNA בתאי SNU620/5FU. בנוסף, הטיפול המשותף ב-CA ו-5FU הראה השפעות אנטי-סרטניות נוספות על תאים עמידים ל-5FU. כפי שדווח בעבר [16,59], עיכוב של LDHA מגביר את ה-ROS ועקב כך דיכא את הצמיחה של תאים סרטניים. כאשר LDHA עוכב, מטבוליזם האנרגיה הומר מגליקוליזה למחזור TCA וזרחון חמצוני מיטוכונדריאלי [60]. לפיכך, תאים סרטניים מייצרים יותר ייצור ROS, וכתוצאה מכך לנזק של קרום המיטוכונדריה ואפופטוזיס המושרה על ידי המיטוכונדריה [61,62]. בהסכמה טובה למחקרים קודמים, CA משרה מוות של תאים אפופטוטיים דרך מסלול תלוי ROS המיטוכונדריאלי. יכולת הגנה מוגברת של ROS והפחתת אותות אפופטוטיים הם מאפיינים נפוצים של תאים סרטניים עמידים לכימו, במיוחד בתאים עמידים ל-5FU 3,63]. יתר על כן, שינויים בחילוף החומרים של הסרטן, במיוחד במטבוליזם של גלוקוז, מובילים גם לעמידות לכימותרפיה באמצעות שינוי בפעילויות התאיות, כגון תיקון DNA חריג, אוטופגיה מוגברת, אפופטוזיס מופחת, הגנה מפני ROS והפרשה מוגברת של אקסוזומים [9,64,651 . לפיכך, מיקוד לאנזימים גליקוליטיים, כולל LDHA, עם CA עשויה להיות אסטרטגיה חלופית להתגברות על העמידות לכימו, במיוחד בסרטן קיבה עמיד ל-5FU. באופן כללי, גידולים ממאירים המתחלקים במהירות הם רגישים מאוד למעכבי סינתזת DNA כולל 5FU, בהשוואה לרקמה רגילה. עם זאת, תאים סרטניים מסוימים יכולים לפתח עמידות לטיפול באמצעות מספר מנגנונים, כפי שתואר בעבר [34-36]. לטיפול המשותף בתרכובות ביו-אקטיביות ובכימותרפיה קונבנציונלית יש השפעה גבוהה יותר, בהשוואה לתרכובת בודדת, על האטת התפתחות העמידות |66. לכן, ההשפעות הביולוגיות של פיטוכימיקלים ספציפיים עם השפעות ציטוטוקסיות מוכחות הניתנות עם כימותרפיה קונבנציונלית כדי להתמקד במגוון רחב יותר של מסלולי איתות בתאים סרטניים, כולל חילוף חומרים סרטני ותפקודים מיטוכונדריאליים, צריכות להיות עדיפות על תרכובות בודדות בטיפול בסרטן, שכן הן עלולות לעכב. התפתחות עמידות [67]. במחקר זה, השילוב של CA ו-5FU הראה עיכוב גבוה יותר על כדאיות התא, בהשוואה לזה של טיפול בודד. יתר על כן, הדגמנו שעיכוב פעילות LDHA ואפופטוזיס מתווכת ROS המיטוכונדריאלי לאחר מכן עשוי להיות המנגנון העומד בבסיס האפקט הרגיש של CA על תאים עמידים ל-5FU (איור 7).

בנוסף לעוצמה ולספציפיות של עיכוב LDHA, CA בטוח יותר ממעכבי LDH טבעיים שנגזרו ממוצרים טבעיים. יתרה מכך, CA הוא מרכיב כימי ידוע של תה ירוק, ותכונותיו הבטיחותיות והפרמקודינמיות אושרו במחקרים קודמים [68-70]. עם זאת, הערכת רעילות מדויקת של ניהול משותף של CA ו-5FU טרם נערכה. בנוסף, היעילות in vivo של CA בתאים סרטניים עמידים ל-5FU לא נבדקה במחקר זה. עם זאת, מחקרים קודמים מדווחים על היעילות האנטי-סרטנית in vivo של CA ונגזרותיו להתגבר על עמידות כימיות, כולל העמידות ל-5FU בסרטן קיבה וסרטן המעי הגס [71-77]. במחקר זה, התמקדנו בעיכוב LDHA כמנגנון מולקולרי מרכזי של CA להתגברות על העמידות ל-5FU. לכן, כדי לפתח CA כחומר אדג'ובנט חדש לתאים סרטניים עמידים לכימו, יש להעריך את היעילות והבטיחות של טיפול משותף CA ו-5FU באמצעות מחקרים מקיפים בבעלי חיים, כולל מודלים של xenograft והערכות רעילות טובות במעבדה.

4. חומרים ושיטות

4.1.חומרים

נוגדנים נגד poly(ADP-ribose)polymerase, caspase-3 ו-caspase-9 נרכשו מ-Cell Signaling Technology (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, ארה"ב). נוגדנים נגד LDHA, גליצרלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) ו-PDHA1 נרכשו מ-Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ארה"ב), ואלה נגד זרחן-PDHA1 ו-PDHA1 נרכשו מ- Abcam ( אבקם, קיימברידג', MA, ארה"ב). בנוסף, נוגדנים נגד PDK2 ו-PDK4 נרכשו מ-Signalway Antibody (Signalway Antibody, דאלאס, טקסס, ארה"ב), אלה נגד PDK1 התקבלו מ-Enzo Life Sciences (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, ארה"ב), ואלו נגד B-cell לימפומה-2(Bcl-2) וחלבון X הקשורים ל-Bcl-2- נרכשו מחברת Novus Biologicals (Novus Biologicals, Littleton, CO, ארה"ב). MitoSOX נרכשה מ-Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA, ארה"ב). כימיקלים וריאגנטים, כולל 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT),4',{{22} }diamidino-2-פנילינדול, אוקסמט, ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד, CA ונגזרות CA (EC GC, EGC ו-EGCG) נרכשו מ-Merck (Merck, Darmstadt, גרמניה). -ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד (צורה מחומצנת) נרכש מ-Tokyo Chemical Industry (Tokyo Chemical Industry, טוקיו, יפן).

4.2.תרבות התא

סרטן קיבה אנושי SNU620, SNU620/5FU ו-AGS, סרטן הלבלב Panic-1 ו-MIA PaCa-2 וסרטן המעי הגס LS174T ו-RKO התקבלו מהבנק הקוריאני Cell Line Bank (KCLB, סיאול, קוריאה) ). תאי SNU620, SNU620/5FU, AGS ו-LS174T תורבו במדיום Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)(Welgene, Daegu, קוריאה), בתוספת של 10% סרום בקר עוברי מושבת בחום (FBS) )(Gibco, ניו יורק, ניו יורק, ארה"ב) ו-1 אחוז פניצילין/סטרפטומיצין (אינוויטרוגן), ותאי Panc-1, MIA PaCa-2 ו-RKO תורבו במדיום של Dulbecco שונה של Eagle's (Welgene ) המכיל 10 אחוז FBS מושבת בחום ו-1 אחוז פניצילין/סטרפטומיצין. כל התאים תורבו ב-CO לחות, אינקובטור ב-37 מעלות ו-5 אחוז CO2.

4.3. בדיקת כדאיות תאים

רמות הציטוטוקסיות של CA ו-5FU בתאי SNU620 ו-SNU620/5FU נמדדו באמצעות מבחן MTT. תאים תורבו ב24-צלחות באר (2×104 תאים/באר) עם הריכוזים המצוינים של CA ו-5FU עבור היום הנקוב. לאחר מכן נוספה תמיסת MTT (2.0 מ"ג/מ"ל) לכל באר, ואחריה 3-4 שעות של דגירה ב-37 מעלות ו-5 אחוז CO, בחממה של תרבית תאים. מצע התרבות הוסר לאחר מכן, והספיגה של גבישי פורמזן נעשתה מתאי חיים. DMSO התווסף כדי להמיס את גבישי הפורמזן, והוא נמדד ב-540 ננומטר באמצעות Spectramax M2 Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ארה"ב).

4.4. קצב החמצה חוץ תאי (ECAR) ושיעור צריכת חמצן (OCR)

ECAR ו-OCR, המציינים את הקצבים התאיים של גליקוליזה וזרחון חמצוני, בהתאמה, נוטרו עם מנתח Seahorse XF (Agilent Technologies, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב), כפי שתואר קודם [78,79]. בקצרה, 60,000 תאי SNU620 או SNU620/5FU לבאר נזרעו בצלחות Seahorse XF שישה בארות במדיום RPMI בתוספת 1 אחוז פניצילין/סטרפטומיצין. לאחר דגירה של 30 דקות, המדיום מכל באר הוחלף ב-80 ul של המדיום ללא סרום שחומם מראש עם 5 mM oxamate, מעכב LDH סטנדרטי [11]. לאחר מכן הודגרו תאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר הדגירה, המדיום מכל באר הוחלף ב-180 μL של מדיום XFbase שחומם מראש (המכיל 10 מ"מ גלוקוז, 2 מ"מ גלוטמין ו-1 מ"מ נתרן פירובט; pH 7.4) למדידת ECAR ו-OCR. התוצאות נותחו באמצעות תוכנת Wave 2.6.0.31 (Agilent Technologies).

4.5. Quantitatioe תגובת שרשרת של תעתיק הפוך-פולימראז (qRT-PCR)

סך RNA הופץ באמצעות ערכת ה-RiboEx Total RNA Extraction Kit (GeneAll Biotechnology, סיאול, קוריאה), ו-cDNA סונתז באמצעות ערכת תמלול הפוך (Promega, Madison, WI, ארה"ב). בתעתיק הפוך, נעשה שימוש ב-1 ug של RNA הכולל , והכמות הכוללת של cDNA מסונתז היא 20 μL. נעשה שימוש בכל ערכה לפי הוראות היצרן. PCR כמותי בוצע באמצעות StepOneTM Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב), עם ה- Real HelixgPCR ערכה (NanoHelix, Daejeon, קוריאה), למשך 40 מחזורים המורכבים מ-15 שניות ב-95 מעלות Cand 1 דקה ב-60 מעלות. רמות mRNA יחסי נורמלו לרמות של 18S RNA ריבוזומי, ששימש כבקרה אנדוגנית. רצפים של הפריימרים המשמשים עבור qRT-PCR מפורטים בטבלה 1.

4.6.Wester" Blot Analysis

התאים נשטפו עם 1× PBS, והחלבונים הכוללים הופקו מתאי באמצעות חיץ RIPA ו-1 אחוז NP-40 חיץ תמוגה המכיל טבליות קוקטייל מעכבי פרוטאז (Roche, Basel, שוויץ). ריכוזי החלבונים נמדדו באמצעות מבחן החלבון Bio-Rad. כמויות שוות של חלבון חולקו מכל דגימה דרך 8-15 אחוז SDS-PAGE, ולאחר מכן הועברו החלבונים לממברנות ניטרוצלולוזה (GE Healthcare, מינכן, גרמניה) באמצעות אלקטרופורזה. הממברנות נחסמו בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות ) למשך שעה תוך שימוש בחלב יבש ללא שומן של 5 אחוזים והודגרו עם נוגדנים ראשוניים ב-4 מעלות למשך הלילה. לאחר מכן, הממברנות הללו נשטפו שלוש פעמים עם 1× Tris-buffer salts למשך 10 דקות. רצועות ספציפיות של חלבונים נמדדו עם מערכת הדמיה כימילומינסנציה (ImageQuant LAS 4000; GE Healthcare). הביטוי של חלבונים הותאם על ידי GAPDH. 4.7. מבחן ייצור לקטט

ייצור לקטט נמדד במדיית התרבות של תאי SNU620, SNU620/5FU, AGS, Panc-1, MIA PaCa-2, LS174T ו-RKO. תאים אלה הודגרו למשך 1 ד ב-37 מעלות, ואמצעי התרבות הוחלפו לאחר מכן במדיום ללא אדום פנול, ולאחר מכן דגירה למשך שעה אחת ב-37 מעלות. המדיום של כל תא הוערך לאחר מכן באמצעות ערכת בדיקות פלואומטרית לקטט מסחרית (BioVision, Milpitas, קליפורניה, ארה"ב).

4.8. מבחני פעילות LDHA ו-LDHB

כדי לזהות פעילות LDHA, הריכוזים המצוינים של CA הודגרו במשך 20 דקות במאגר המכיל 2 מ"מ פירובט, 20 מיקרומטר NADH ו-20 מ"מ HEPES-K פלוס （pH7.2）. עבור LDHBactivity, נעשה שימוש במאגר המכיל 1 M Tris-HCl (pH8.0), 25 mM NAD פלוס ו-2 M נתרן L-lactate. בקצרה, 10 ננוגרם של כל אחד מהחלבונים הרקומביננטיים LDHA ו-LDHB המטוהרים שימשו עבור מבחני פעילות LDHA ו-LDHB במבחנה. מיקרוגרם אחד של חלבון כולל מ-lysates של תאים שימש עבור מבחני פעילות LDHA ו-LDHB תוך תאיים כמקור אנזים. פלואורסצנציה של NADH באורך גל עירור של 340 ננומטר ואורך גל פליטה של ​​460 ננומטר זוהתה באמצעות ספקטרופלואורומטר (Spectramax M2; Molecular Devices), כפי שתואר בעבר [80]. פעילות LDHA נמדדה לפי הכמות המופחתת של NADH, בעוד שפעילות LDHIB הוערכה על ידי מדידת כמות ה-NADH שהומרה מ-NAD פלוס.

4.9. אינטראקציה בין חלבון למולקולה קטנה

האינטראקציה בין חלבון למולקולות קטנות נחזה באמצעות תוכנית Pyrex. ב-Pyrex נעשה שימוש במולקולות LDHA (PDB ID:1l10) ובמבנים הדו-ממדיים של CA ו-EGCG שהתקבלו ממסד הנתונים של תרכובות NCBI PubChem. המזהה של CA היה 9064 וזה של EGCG היה 65064. ההתפלגות היחסית של מטען פני השטח הוצגה כשהאזור החומצי באדום, האזור הבסיסי בכחול והאזור הנייטרלי בלבן. קשרי מימן בקומפלקסים של LDHA עם CA או EGCG, בהתאמה, הוצגו כקווים שחורים מנוקדים. רצפים התקבלו מ-UniProt (https://www.uniprot.org, ניגש אליו ב-9 בנובמבר 2020) עם מספרי גישה P00338(LDHA).

4.10.טרנספקציה של RNA קצר מסיכת שיער (shRNA)

נעשה שימוש ב-pLKO.1 ה-Mock-Vector ו-shRNA מיקוד LDHA, כפי שתואר בעבר [50]. תאים נזרעו בצלחות שש בארות (2 × 10 מעלות תאים/באר) והודגרו במשך הלילה. תאי SNU620/5FU הועברו באמצעות פוליאתילןאימין (PED)(Polyplus-transfection,llkirch, צרפת), גן ויחס PEI הוא 1:3. לאחר מכן, תאים שעברו טרנספקציה טופלו ב-1 ug/mL puromycin למשך שבוע. קו תאי הבקרה נוצר בעקבות הדבקה בפלסמיד מקושקש.

4.11.ביטוי יתר של LDHA

הפלסמיד pDEST27-LDHA נבנה על ידי תת שיבוט של LDHA cDNA (נרכש מ-Korea Human Gene Bank, Daejeon, קוריאה) לתוך וקטורים pDEST27(Invitrogen). נערכו שתי קבוצות של תת-משובטים עבור LDHA. לצורך שחזור של ה-LDHA, תאי SNU620/5FU-shLDHA הועברו עם pDEST27-LDHA ופלסמיד ריק pDEST27. בקצרה, התאים תורבו עד ל-70 אחוז ריכוז. לאחר מכן, התאים טופלו בתערובת הכוללת 3 אג' של DNA ו- Lipofectamine 2000 (Invitrogen) במשך 48 שעות. לאחר הדגירה, התאים נבחרו עם 200 ug/mL G418 למשך שבוע. לאחר מכן, כדי לאשר את יעילות ההעברה, ביצענו את בדיקת ה-Western blot.

4.12.ניתוח אפופטוזיס

תאים אפופטוטיים זוהו באמצעות ערכת זיהוי אפופטוזיס של Annexin V-FITC (BD Biosciences, סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב), על פי הוראת היצרן. בקצרה, תאים נזרעו בצלחות שש בארות (2×10 מעלות תאים/באר) וטופלו בריכוזים מסומנים של CA ו-5FU למשך יומיים. לאחר יומיים של טיפולים, התא נשטף עם 1× PBS. התאים הושעו ב-500 μL של חיץ מקשר וטופלו ב-5 μL של annexin V-FITC ו-5 μL של propidium iodide (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב), ולאחר מכן דגירה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ב- החושך. עוצמות הקרינה נבדקו באמצעות BD FACS CANTO ⅡI (BD Biosciences).

4.13. מבחן זיהוי מיני חמצן תגובתי מיטוכונדריאלי (ROS).

ייצור ROS מיטוכונדריאלי זוהה באמצעות MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator (Thermo Fisher Scientific). התאים נזרעו בצלחות שש בארות (2× 10 מעלות תאים/באר) ו- Mito-TEMPO (20 מיקרומטר; Sigma-Aldrich） טופל מוקדם במשך שעה אחת לפני הטיפול התרופתי. התאים הושעו מחדש ב-1 מ"ל של תמיסת מלח (PBS) 1× פוספט, ולאחר מכן נוספו 5 מיקרומטר של MitoSOX. לאחר מכן התאים הודגרו במשך 10 דקות ב-37 מעלות. עוצמת הקרינה נותחה באמצעות BD FACS CANTO II (BD Biosciences). תמונת פלואורסצנטי זוהתה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (הגדלה, 100×) (מיקרוסקופ Axioimager M1, Carl Zeiss, Oberkochen, גרמניה).

4.14.צביעת גרעין DAPI

SNU620/5FU נזרע בצלחת 24-באר (5×104 תאים/באר) וטופל בריכוזים המצוינים של CA ו-5FU במשך 48 שעות. לאחר כביסה עם 1× PBS, התאים הושעו מחדש ב-1-mL 1× PBS. לאחר מכן התאים נצבעו ב-4ug/mL DAPI למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ונבדקו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (הגדלה, 200×) (Carl Zeiss).

4.15. ניתוח סטטיסטי

התוצאות של קיימות תאים, ייצור לקטט, ECAR, OCR, qRT-PCR, LDHA, LDHB, אפופטוזיס ו-ROS של המיטוכונדריה צוינו ביחס לערכי הבקרה והובאו כממוצע ± שגיאה סטנדרטית של הממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים. הבדלים מעל הערך הממוצע של כל קבוצה נותחו על ידי מבחן t של Student, בעוד שההבדלים בין הקבוצות נותחו על ידי ניתוח חד כיווני של שונות עם מבחן הפוסט הוק של Tukey באמצעות GraphPad Prism (גרסה 5.0, GraphPad Software, San דייגו, קליפורניה, ארה"ב).

5. מסקנות

ביחד, לתאי סרטן קיבה עמידים SNU620/5FU יש פנוטיפים גליקוליטיים, כולל ייצור לקטט מוגבר וביטוי LDHA גבוה יותר מאלה שבתאי SNU620 הוריים. הגבלת הגליקוליזה עם CA, כמעכב ספציפי ל-LDHA, גורם לרגישות לתאי SNU620/5FU ל-5FU. בנוסף, טיפול משותף עם CA ו-5FU הגביר ROS מיטוכונדריאלי ומוות של תאים אפופטוטיים בתאים עמידים ל-5FU. הממצאים שלנו מצביעים על כך ש-CA עשוי להיות מועמד מבטיח לפיתוח תרופה משלימה המפחיתה עמידות לכימותרפיה מבוססת 5FU על ידי הגבלת פעילות LDHA.

חומרים משלימים: הדברים הבאים זמינים באינטרנט בכתובת https://www.mdpi.com/article/10 .3390/ijms22105406/s1, איור S1: השפעת 5FU על הכדאיות של SNU620/5FU clls, איור S2: הצמיחה של SNU620 ותאי SNU620/5FU שנמדדו על ידי ספירת תאים, איור S3: רמות ייצור לקטט של תאי SNU620 ו-SNU620/5FU, איור S4: ביטויים של איזוטיפים PDK בתאי SNU620 ו-SNU620/5FU, איור S5: השפעת אוקסמט על היכולות של SNU620 תאי SNU620/5FU, איור S6: השפעות EGCG על פעילויות LDHA ו-LDHB, איור S7: השפעות של קטצ'ין (CA) על רמות הביטוי של חלבוני p-PDHA1, PDHA1 ו-PDKs, איור S8: ניתוח קלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) של ה-LDHA וה-CA, איור S9: ביטוי LDHA בתאי SNU620/5FU שעברו טרנסfected עם shLDHA, איור S10: מדידת פנוטיפים גליקוליטיים וחיות תאים בתאי סרטן שונים, איור S11: הנתונים הגולמיים של בדיקת Western blot.

מאמר זה מופק מתוך Int. י.מול. Sci. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms