זיהוי שיטתי והשוואה של הפרופילים המובעים של MiRNAs אקזומליים בחזירים הנגועים ב-NADC30-כמו זן PRRSV

סיכום פשוט:אקסוזומים ממלאים תפקיד ייחודי בזיהום בנגיף, הצגת אנטיגן ודיכוי/קידום חסינות הגוף. וירוס רבייה ותסמונת החזיר (PRRSV) הוא אחד הפתוגנים המזיקים ביותר בתעשיית החזירים. כאן, השתמשנו בזן PRRSV NADC30-כמו CHsx1401 כדי להדביק באופן מלאכותי 42-חזירים בני יום, לבודד אקסוזומים בסרום ולזהות 33 מירנאים אקזוזומליים בעלי ביטוי דיפרנציאלי (DE) בין קבוצות זיהום וביקורת, וכן 18 DE miRNAs הקשורים לזיהום וחסינות PRRSV נבדקו כמולקולות פונקציונליות פוטנציאליות המעורבות בוויסות של זיהום בנגיף PRRSV על ידי אקסוזומים.

תַקצִיר:אקסוזומים הם שלפוחיות ביולוגיות המופרשות ומשתחררות על ידי תאים הפועלים כמתווכים של תקשורת בין-תאית וממלאים תפקיד ייחודי בזיהום בנגיף, הצגת אנטיגן ודיכוי/קידום חסינות הגוף. וירוס רבייה ותסמונת החזיר (PRRSV) הוא אחד הפתוגנים המזיקים ביותר בתעשיית החזירים ועלול לגרום להפרעות רבייה בחזירים, מחלות נשימה בחזירים, ביצועי גדילה מופחתים ומחלות אחרות המובילות לתמותת חזירים. במחקר זה, השתמשנו בזן PRRSV NADC30-כמו CHsx1401 כדי להדביק באופן מלאכותי 42-חזירים בני יום ולבודד אקסוזומים בסרום. בהתבסס על טכנולוגיית רצף תפוקה גבוהה, זוהו 305 miRNAs ב-exosomes בסרום לפני ואחרי ההדבקה, ביניהם 33 miRNAs באו לידי ביטוי באופן משמעותי בין קבוצות (13 עם ויסות גבוה יחסית ו-20 עם ויסות נמוך יחסית). ניתוח שימור רצף של הגנום CHsx1401 זיהה 8 אזורים משומרים, מתוכם סה"כ 16 מירנאים בעלי ביטוי דיפרנציאלי (DE) חזוי להיקשר לאזור השמור הקרוב ביותר ל-30 UTR של הגנום CHsx1401, כולל 5 DE miRNAs המסוגלים להיקשר ל-CHsx1401 30 UTR (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486, ssc-miR-6529). ניתוח נוסף העלה כי גני המטרה של miRNAs בעלי ביטוי דיפרנציאלי היו מעורבים באופן נרחב בנתיבי איתות הקשורים לתפקוד אקזומלי ובנתיבי איתות הקשורים לחסינות, ו-18 DE miRNAs (ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 נבדקו , ssc-miR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128 וכו') הקשורים לזיהום וחסינות ב-PRRSV כמולקולות פונקציונליות פוטנציאליות המעורבות בוויסות של זיהום בנגיף PRRSV על ידי אקסוזומים.

מערכת חיסון מגבירה צמח cistanche

מילות מפתח:PRRSV; אקסוזום בסרום; מירנאים

1. הקדמה

וירוס רבייה ותסמונת נשימה של חזיר (PRRSV) הוא וירוס RNA חיובי-גדילי חד-גדילי בעל מבנה מעטפת השייך לסדר Nidovirales, משפחת Arteriviridae, סוג Betaarterivirus [1,2]. הוא כדורי או אליפסואידי בקוטר של 50-65 ננומטר תחת מיקרוסקופ אלקטרונים מקפיא [3,4]. גנום ה-PRRSV הוא באורך של כ-15 קילו-בייט עם כובע של 50 וזנב של 30 polyA ומכיל לפחות 10 מסגרות קריאה פתוחות (ORFs) שבצדן אזורים לא מתורגמים (UTRs) הן בקצה 50 והן ב-30 [5,6] ו עטוף בחלבון נוקלאוקפסיד, עם ציפוי שומני דו-שכבתי ליצירת חלקיקי וירוס. אקסוזומים שייכים לשלפוחיות בעלות מבני ממברנה חד-שכבתית ובעלות מבנה טופולוגי זהה לתאים [7]. הצורה היא "בצורת גביע" או "צורת דיסק" במיקרוסקופ אלקטרוני [8,9]. אקסוזומים יכולים להתקיים במערכת הדם לאורך זמן, וחומרים באקסוזומים יכולים להיספג על ידי תאים סמוכים או תאי קולטן מרוחקים ולאחר מכן לווסת את תאי הקולטן להשתתף בחילופי חומרים גנטיים בין תאים [10,11]. הם מורכבים בעיקר מחומרים משטחי הממברנה ותוכן נישא, לרבות קולטנים משטח התא, חלבוני ממברנה, חלבונים מסיסים, שומנים, RNA (mRNA, miRNA, lncRNA ו-RNA ויראלי וכו'), DNA גנומי, DNA מיטוכונדריאלי [12-14] ]. MicroRNAs (miRNAs) הם מחלקה של 18-25 נוקלאוטידים (nt) שנשמרו אבולוציונית אנדוגניים, שאינם מקודדים, RNAs קטנים חד-גדיליים, המעכבים את תהליך התרגום על ידי גרימת הפירוק של mRNA המטרה או על ידי קשירה ל-30 UTR של mRNA המטרה, המובילה להשתיקת גנים שלאחר שעתוק, ואז ויסות את ביטוי הגנים ברמה שלאחר התמלול [15-17]. ההערכה היא ש-miRNA מווסתים יותר מ-60% מהגנים של יונקים לאחר שעתוק [18,19]. MiRNAs ממלאים תפקיד חשוב בתקשורת בין תאית ויכולים לשמש גם כמולקולה פונקציונלית פוטנציאלית לזיהום, העברה והגנה של מחלות ווירוסים [20]. מספר גדל והולך של מחקרים הראו ש-miRNAs יכולים להיות נוכחים בנוזלי גוף, כגון רוק, שתן, חלב אם ודם, ולפעול דרך מערכת הדם של הנוזלים בגוף [21,22]. מיRNAs אקזומליים נחשבים לוויסות אנדוגניים של ביטוי גנים ומטבוליזם ויכולים להצביע על מצבים פתולוגיים שונים [23,24].

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

במהלך שני העשורים האחרונים, הוכח של-miRNA יש תפקידים מכריעים בוויסות התפתחות תאי החיסון, תגובות חיסוניות מולדות ותגובות חיסוניות נרכשות. כמה miRNAs אחרים מדווחים כפוגעים בזיהום PRRSV בדרכים הבאות, מכוונים ישירות לגנום PRRSV או לקולטן PRRSV, או ממלאים תפקיד על ידי ויסות התגובה החיסונית המולדת של המארח. משפחת miR-26 עלולה להזיק משמעותית לשכפול וירוסים, ו-miR-26a יכולה לעכב את השכפול של זני PRRSV מסוג 1 וסוג 2 במקרופאגים מכתשי חזירים (PAMs) על ידי ויסות האינטרפרון מסוג I (IFN) מסלול, שהוא יעיל יותר מ-miR-26b [25,26]. miR-30c ו-miR-125b מזוהים כדי לווסת את התגובה החיסונית המולדת של המארח על ידי מיקוד למסלול IFN מסוג I ומסלול NF-κB, בהתאמה [27-29]. MiR-23, miR-378 ו-miR-505 הם גורמי מארח אנטי-ויראליים הממקדים ל-PRRSV ויש להם אתרי יעד שמרניים בזני PRRSV מסוג 2 [30]. במקביל, המארח miR-506 זוהה לעכב את שכפול PRRSV על ידי מיקוד ישיר לקולטן PRRSV CD151 בתאי MARC-145 [31]. miR-181 יכול גם לעכב בעקיפין את שכפול ה-PRRSV על ידי ויסות מטה של ​​קולטן PRRSV CD163 במונוציטים בדם וב-PAMs [32]. בנוסף, miRNAs יכול לקדם שכפול PRRSV על ידי הפרעה לפיזיולוגיה בסיסית של התא. MiR-24-3p ו-miR-22 מכוונים ישירות ל-30 UTR של HO-1 במהלך זיהום PRRSV כדי לברוח מהעיכוב של heme oxygenase-1 (HO-1), א חלבון הלם חום (הידוע גם בשם HSP32) על PRRSV [33,34]. ידוע כי חזירים רגישים יותר ל-PRRSV ופחות מסוגלים להגן על עצמם מפני כניסת הפתוגן הזה לאורגניזם [35]. במחקר הנוכחי, החסינות המולדת והחסינות הנרכשת של חזירים שנדבקו בנגיף זה נחקרו ברמה המולקולרית באמצעות זן הנפוץ בשטח. ערכת בידוד אקסוזום בסרום, מיקרוסקופיה אלקטרונית העברה (TEM), ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA) ו-Western blot (WB) שימשו לבידוד וזיהוי אקסוזומים בנסיוב לפני ואחרי הדבקה ב-PRRSV, ולאחר מכן ניתוח רצף RNA קטן, זיהוי, וניתוח של תוצאות ביטוי דיפרנציאליות באמצעות שיטות ביואינפורמטיקה להשגת מספר MIRNAs אקסוזומי סרום הקשורים ל-PRRSV, ולאחר מכן זיהוי של תוצאות נתונים באמצעות PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR).

2. חומרים ושיטות

2.1. ניסויים בבעלי חיים

שישה אנטיגן PRRSV ונוגדנים דו-שליליים בריאים 42-בני יום הוצבו במערכת האכלה נקייה לחזירים לצורך בידוד, טיפול רפואי והתאמה סביבתית. כל החזירים היו חופשיים לאכול ולשתות ללא הגבלות. כשהם הכירו את התנאים במבודד, החזירים חוסנו באף עם 2 מ"ל 105 TCID50/mL PRRSV NADC 30-כמו CHsx1401, שהוזכר על ידי קודמים [36,37]. הדם של החזירים לפני (קבוצת ביקורת, n=6) ו-7 ימים לאחר (קבוצת טיפול, n=6) חיסון הנגיף נאסף מהווריד הנבוב הקדמי לצורך בידוד בסרום. הפסולת הסלולרית בסרום הוסרה בצנטריפוגה ב-3000 גרם למשך 15 דקות. כל הניסויים בבעלי חיים במחקר שלנו אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של המכון למדעי בעלי החיים, האקדמיה הסינית למדעי החקלאות (CAAS) (בייג'ינג, סין), IAS2022-130.

2.2. בידוד וטיהור של אקסוזומים בסרום

בידוד וטיהור של אקסוזומים בוצעו באמצעות ערכת exoEasy Maxi (QIAGEN, Hilden, גרמניה, קטלוג מס' 76064) לפי פרוטוקול היצרן.

2.3. מיקרוסקופיה אלקטרונית שידור (TEM)

השעיות אקסוזום שחולצו זוהו על גבי רשת הנחושת המצופה בפחמימות, והאקסוזומים נשטפו עם PBS והועברו לצביעה סטנדרטית של אורניל אצטט למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ייבוש במשך מספר דקות בטמפרטורת החדר, הרשת הוצגה וצולמה ב-100 קילו וולט על ידי מיקרוסקופ אלקטרוני תמסורת (HT-7700, Hitachi-High Tech, טוקיו, יפן).

2.4. ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA)

אקסוזומים שחולצו היו מדוללים ב-1 × PBS על ידי שינוי הנפח מ-10 ל-30 μL. לאחר בדיקת הדגימה, נותחו הריכוז והגודל של אקסוזומים בסרום על ידי מנתח ננו זרימה N30E בהתאם להוראות היצרן (NanoFCM, שיאמן, סין).

2.5. כתם מערבי

דגימות האקסוזום שחולצו נוספו ל- RIPA lysate מעורבב עם מעכב פרוטאז (Invitrogen, Waltham, MA, ארה"ב) ו-phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) כדי לחלץ את החלבון ה-exosome, אשר הועבר על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, על פי ההוראות של ערכת ברדפורד, כימתנו את ריכוז החלבון האקסוזום בסרום. חלבוני אקסוזום עברו דנטורציה תרמית. אותה כמות חלבון הופרדה על ג'ל 12% SDS-PAGE ולאחר מכן הועברה לממברנת פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) (Millipore, Burlington, MA, ארה"ב). הוא הושרה ב-TBST המכיל 5% אבקת חלב רזה ונאטם למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. השרינו את הממברנה בנוגדן הראשוני המדולל (נוגדן אנטי-CD9, Abcam, Boston, MA, ארה"ב, #ab92726; נוגדן אנטי-CD81, Abcam, Boston, MA, ארה"ב, #ab109201) למשך הלילה ב-4 ◦C, והתאוששנו הנוגדן העיקרי. השרינו את הממברנה בנוגדן המשני המדולל, הדגמנו אותו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, ושחזרנו את הנוגדן המשני. הנחנו את הסרט השטוף של PBST על הסרט השומר על טרי, הוספנו פתרון כרומוגני מעורבב של ECL a/b בנפח שווה, והנחנו אותו בדימוי הכימילומינסצנטי.

יתרונות cistanche לגברים - מחזקים את המערכת החיסונית

לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Enhance Immunity

【בקש עוד】 דוא"ל:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.6. רצף RNA קטן אקזומלי וניתוח נתונים

סך RNA מהאקסוסומים הופץ עם Trizol לפי הוראות היצרן. לאחר מכן זיהינו את ריכוז ה-RNA ואת ערך הצפיפות האופטית (OD) וזיהינו את השפלה והטוהר של ה-RNA עם אלקטרופורזה של 1% אגרוז ג'ל. בינתיים, נעשה שימוש ב-Agilent Bioanalyzer 2100 כדי לזהות את שלמות ה-RNA. השתמשנו ב-RNA הכולל של אקסוזומים לאחר בדיקת איכות. על פי הוראות היצרן, השתמשנו בערכת הכנה לספריית RNA קטנה של NEB NEXT עבור Illumina® (Illumina, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב). הערכה הכינה ספריית cDNA קטנה של RNA ורצפה אותה כדי לייצר 50 nt קריאה חד-קצה על ידי פלטפורמת Illumina Novaseq 6000. כל ההליכים להכנת ספריית RNA קטנה הושגו על ידי Novogene (בייג'ינג, סין). הנתונים לאחר בקרת האיכות היו מיושרים לגנום הייחוס החזירי (Sus scrofa 11.1) באמצעות פפיון. miRNAs ידועים זוהו על ידי מסד הנתונים miRbase (v22.0) [38] (https://www.mirbase.org, הגישה אליו ב-14 בינואר 2022), miRdeep2 (v0.0.5) [39] ו-miRevo (v1.1 ) [40] ושימשו לניבוי miRNAs חדשים. במקביל, ניתוח הביטוי הדיפרנציאלי עבור miRNAs בוצע על ידי DESeq (v1.24.0) [41], הדורש שינוי|> 1.6 ו-p < 0.05. היישור בוצע באמצעות MEGA (V11) [42] ואחריו ניקוד בסיס יחיד באמצעות PHAST (v1.6.9) [43] והערכה של האזורים השמורים ביותר של 10 גנים של וירוסים, כולל WUH3 (מספר הצטרפות ל-GenBank HM853973), VR2332 ( מספר הצטרפות ל-GenBank U87392), JXA1 (מספר הצטרפות ל-GenBank EF112445), CH-1a (מספר הצטרפות ל-GenBank AY032626), NADC30 (מספר הצטרפות ל-GenBank HN654459), HUN4 (מספר הצטרפות ל-GenBank EF635000D6), 22-1812 (מספר הצטרפות ל-GenBank MN648450), SC/DJY (מספר הצטרפות ל-GenBank MT075480), ולליסטאד (מספר הצטרפות ל-GenBank M96262.2). נעשה שימוש ב-RNAhybrid (V2.0) [44] כדי לחזות את הקישור של רצף ה-miRNA המזוהה ל-3 0 UTR של גנום הנגיף CHsx1401. Miranda (v3.3a) ו-RNAhybrid שימשו למטרת חיזוי גנים. חבילת ה-Cluster profile [45] R שימשה לניתוח העשרה תפקודית של GO (Gene Ontology) של גני מטרה וניתוח העשרה של מסלולי KEGG (קיוטו אנציקלופדיה של גנים וגנומים).

2.7. אימות של ביטוי miRNA על ידי RT-qPCR

סך ה-RNA בודד מאקסוזומים בסרום באמצעות Trizol (Invitrogen, שנחאי, סין) לפי פרוטוקול היצרן. ה-RNA המבודד אומת על ידי RT-qPCR על דגימות (n=6 לכל קבוצה). cDNA סונתז לפי ההוראות של סינתזת cDNA גדיל 1 של miRNA (על ידי לולאת גזע) (Vazyme, נאנג'ינג, סין), וכימות הקרינה בוצעה באמצעות ABI 7500 לפי הוראות של מירנה אוניברסלי SYBR qPCR מיקס מאסטר (Vazyme, נאנג'ינג, סין). הפרמטרים של המחזור התרמי ששימשו היו כדלקמן: השלב הראשון: 95 ◦C למשך 30 שניות; שלב 2: 95 ◦C למשך 5 שניות, 60 ◦C למשך 34 שניות ו-40 מחזורים; שלב 3: 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ו-95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות. רצפי פריימר של miRNAs, הגן U6, שימשו כאסמכתא [46] ונרשמו בטבלה משלימה S1. כל אימותי ה-qRT-PCR בוצעו באמצעות שלושה שכפולים ביולוגיים ועם שלושה שכפולים לכל דגימה. השפע היחסי של תמלילים חושב בשיטת 2-Ct, ו-SPSS (v22.0) ו-GraphPad Prism (v8.0) שימשו לניתוח ומיפוי נתונים, בהתאמה. p < 0.05 אומר שההבדל מובהק סטטיסטית.

3. תוצאות

3.1. ערך יחסי של אנטיגן ונוגדנים לאחר חיסון נגיפים

התוצאות של בדיקות אנטיגן ונוגדנים PRRSV לפני (יום 0) ואחרי (יום 7) האתגר מוצגות בטבלה 1. הזיהוי הסרולוגי של האנטיגן והנוגדן PRRSV לפני האתגר היה שלילי, והאנטיגן היה חיובי לאחר האתגר, מה שמצביע על כך שהחזירים נדבקו בהצלחה ב-CHsx1401.

3.2. בידוד וזיהוי של אקסוזומים בסרום

השלפוחיות שבודדו מסרום התגלו על ידי TEM. רוב השלפוחיות יכולות לראות את האקסוזומים הקעורים בצורת צלוחית או דיסק באמצע. קצה הממברנה של אקסוזומים גלוי, והמורפולוגיה מלאה יחסית (איור 1A, B). ניתוח מעקב ננו-חלקיקים הראה של-95.73% מהאקסוזומים היה קוטר של 30-150 ננומטר, בעיקר סביב 72.25 ננומטר, עם קוטר ממוצע של 76.22 ננומטר, מה שעולה בקנה אחד עם מאפייני הגודל של אקסוזומים (איור 1C). טווח גודל זה היה דומה לזה שזוהה על ידי TEM ואישר עוד יותר את הזהות של שלפוחיות אלה כאקסוזומים. ניתוח הכתם המערבי הראה שהשלפוחיות שבודדו מדגימות הסרום היו חיוביות לחלבוני CD9 ו-CD81 (איור 1D). המאפיינים שלעיל תואמים את תקני הזיהוי האקסוזומיים שנוסחו על ידי האגודה הבינלאומית לשלפוחית ​​חוץ (ISEV) ב-MISEV2018 [47].

טבלה 1. אנטיגן ונוגדן של (יום 0) ו-(יום 7) עם וירוס אתגר.

איור 1. מאפיינים עיקריים של אקסוזומים בסרום. (A, B) מציגים את המאפיינים המורפולוגיים של שלפוחיות על ידי TEM. פסי קנה מידה הם 500 ננומטר ו-100 ננומטר, בהתאמה. (ג) NTA מציג את הקוטר והריכוז של רוב השלפוחיות. (ד) הכתם המערבי הראה נוכחות של סמני אקסוזום CD81 ו-CD9 באקסוזומים בסרום. הערה: ערבוב בתוצאות WB הוא התרחיף המעורב לדוגמה שבודד על ידי ערכת exoEasy Maxi

3.3. רצף RNA קטן של אקסוזומים בסרום

עבור כל מדגם, הנתונים הנקיים הגיעו ל-0.5 Gb, ואחוז הבסיס של Q30 היה מעל 96.20%. הקריאות הנקיות של כל דגימה היו מיושרות עם הגנום הייחוס של החזיר. מבין 12 הדגימות, קבוצת הביקורת השיגה 10,920,887, 10,248,696, 10,109,117, 10,655,494, 9,217,285 ו-9,782,523 קריאות, בהתאמה. קבוצת הטיפול השיגה 11,889,518, 10,593,504, 10,593,504, 12,846,080, 10,105,325, 11,729,451 ו-9,789,542 קריאות, בהתאמה. בממוצע, 77.96% מסך הקריאות הנקיות כללו 19-22 נוקלאוטידים (nt) באורך (איור 2A). הקריאות לאחר בקרת איכות היוו יותר מ-92.59% מסך הקריאות. הקריאות הנקיות המעובדות היו מיושרות לגנום הייחוס של החזיר, והשיעור הממופות של 12 ספריות בגנום היה יותר מ-92.30%, והשיעור הממוף היה 94.98% (איור 2B). זה הצביע על כך שספריית ה-miRNA האקסוזומלית שנבנתה בסרום הייתה באיכות גבוהה ומתאימה לניתוח נוסף. פרטים מפורטים בטבלה משלימה S2.

איור 2. סקירה כללית של נתוני תעתיק ה-RNA הקטן. (א) התפלגות אורך של ספירות קריאה של דגימות אקסוזום בסרום (נוקלאוטידים nt =); (ב) שיעור של 12 דגימות שמופו לגנום הייחוס

3.4. ניתוח ביטוי דיפרנציאלי של miRNAs

לאחר ניתוח כמותי של ביטוי ה-miRNA שזוהה, נבדקו ה-miRNA לפי הספים שתוארו קודם לכן בסעיף 2.6. סך של 305 miRNAs הושגו לפני ואחרי חיסון של זן CHsx1401 (ביקורת, n=6; טיפול, n=6). בסך הכל זוהו 33 miRNAs בעלי ביטוי דיפרנציאלי (DE) בין שתי הקבוצות, 13 DE miRNAs היו מווסתים, ו-20 DE miRNAs היו מטה בקבוצת הטיפול (איור 3 וטבלה משלימה S3).

3.5. ניתוח העשרה פונקציונלי של גנים מטרת מירנה

סך של 7283 גני מטרה נחזו על ידי 33 DE miRNA, והתפקידים של גנים מטרה התרכזו בעיקר בוויסות החיובי של מפל MAPK, תהליך חילוף החומרים של שומנים, ויסות של העברת אותות תוך תאית, מפל ERK1 ו-ERK2 וכו' (איור 4A ). במונחים של תפקודים מולקולריים, גני היעד של miRNA המבוטאים בצורה דיפרנציאלית מתמקדים בעיקר בפעילות מווסתת של אנזים GTP, פעילות קינאז, פעילות מווסתת של נוקלאוזיד טריפוספטאז ותפקודים אחרים הקשורים להולכת אותות ומטבוליזם אנרגיה (איור 4B). בנוסף, בין מרכיבי התא, גנים היעד משתתפים בעיקר בתפקודים הביולוגיים של פולימרים על-מולקולריים, גולגי, אוטופגוזומים, פני התא, אנדוזומים מוקדמים וכו' (איור 4C). הפונקציות של רכיבים אלה קשורות קשר הדוק להיווצרות של אקסוזומים, מה שמסביר גם את הדיוק של הרצף. ניתוח העשרה של מסלולי KEGG הראה שגני המטרה הועשרו באופן משמעותי באנדוציטוזיס, מסלול האיתות MAPK, מסלול האיתות Rap1, מסלול האיתות ספינגוליפיד ומסלול האיתות PI3K Akt (p < 0.05) (איור 5A) ). במקביל, המסלולים המועשרים סווגו ונותחו. התוצאות הראו שמסלול ה-KEGG של גן המטרה היה מועשר בעיקר בעיבוד מידע סביבתי, מחלות אנושיות ומערכות ביולוגיות (איור 5B).

איור 3. ביטוי דיפרנציאלי של מירנאים באקסוזומים. (א) חלקת הר געש של miRNAs בין קבוצות בקרה וטיפול; (ב) מפת חום מקבץ היררכית של DE miRNAs בין קבוצות בקרה וטיפול.

איור 4. ניתוח העשרה של תפקוד GO של גני יעד של DE miRNAs. (א) תהליך ביולוגי של גני מטרה של DE miRNAs; (ב) פונקציות מולקולריות של DE miRNAs מטרה גנים; (ג) רכיבים תאיים של גני יעד של DE miRNAs

איור 5. ניתוח העשרה של מסלולי KEGG של גני מטרה. (א) מסלול KEGG מועשר באופן משמעותי עם גנים מטרה של DE miRNAs; (ב) סיווג של מסלולי KEGG מועשרים משמעותית.

3.6. חיזוי מיקוד של מירנה אקזומלית בסרום וגנום PRRSV CHsx1401

על פי ציון ה-phastCons של בסיס בודד לאחר יישור על ידי PHAST, בסך הכל התקבלו שמונה מקטעים שמורים ביותר (רצועות שחורות מעל מפת השיא) מבין הגנומים הנגיפיים (איור 6). סה"כ 31 DE miRNAs נמצאו נקשרים למקטע השמור על ידי חיזוי ה-miRNAs הקשורים למקטע השמור. ביניהם, באזור השמור (14,644–15,020 nt) הקרוב ביותר ל-30 UTR (14,870–15,020) של הגנום CHsx1401, צפויים להיקשר אליו 16 DE miRNA, כולל 5 miRNA (ssc-miR}{{15} c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 ו-ssc-miR-6529) שיכולים להיקשר ל-30 UTR של CHsx1401. בין ה-miRNAs הללו, רק ssc-miR-223 הוסרה מעלה לאחר זיהום, ו-miRNAs אחרים הוסרו מטה לאחר הדבקה. ראה טבלה משלימה S4 לפרטים.

איור 6. מקטעים שמורים בגנום של זן CHsx1401 שנחזה על ידי PHAST

3.7. סקר DE miRNAs הקשורים לתפקוד Exosome ו-PRRSV

נמצאו מגוון של miRNAs בעלי ביטוי דיפרנציאלי הקשור לתפקוד של אקסוזומים ו-PRRSV על ידי ניתוח העשרה תפקודית של גני מטרה. ביניהם, 11 DE miRNAs כגון ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 ו-ssc-miR-320 מעורבים בספיגת אקסוזום, וגני המטרה שלהם מרוכזים בעיקר ב משפחת הגנים Ras, משפחת האנקסינים ומשפחת הגנים לריבוזילציה ADP. 18 DE miRNAs, כולל sscmiR-10b, ssc-miR-124a ו-ssc-miR-128, משתתפים במסלולים הקשורים למערכת החיסון, וגני המטרה שלהם מרוכזים בעיקר ב-MAPK משפחת הגנים, משפחת הגנים PIK3 ומשפחת הגנים של חלבון פוספטאז. בעוד ש-11 DE miRNAs מעורבים בפלישת וירוסים, גני המטרה הקשורים מרוכזים בעיקר במשפחת הגנים MAPK ובמשפחת הגנים של חלבון פוספטאז. יתר על כן, מירנאים מרובים בעלי ביטוי דיפרנציאלי, כגון חדש_102. שישה מיRNA של DE, כולל ssc-miR-320, ssc-miR-423-5p, ssc-miR-4331-3p,ssc-miR-7137-3p ו-ssc-miR{{ 25}}, באים לידי ביטוי בתפקוד אקסוזום, פלישת וירוס PRRSV ומסלולים הקשורים למערכת החיסון, כפי שמוצג באיור 7. פרטים מוצגים בטבלה משלימה S5.

איור 7. DE miRNAs הקשורים לקליטת אקסוזומים, פלישת PRRSV וחסינות

3.8. QRT-PCR Assay של DE miRNAs בין שתי הקבוצות

חמישה DE miRNAs נבחרו באופן אקראי לאימות. לפי תוצאות qRT-PCR, הביטוי של ssc-miR-19a ו-ssc-miR-32 גדל בקבוצת הטיפול, בעוד ש-ssc-miR-124a, ssc-miR{ {8}} ו-ssc-miR-34c הראו ביטוי גבוה יותר בקבוצת הביקורת, בהתאם לנתוני הרצף (איור 8).

איור 8. חמישה DE miRNAs מאומתים על ידי qRT-PCR

4. דיון

PRRSV הוא עדיין פתוגן עיקש בתעשיית החזירים העולמית, הגורם להפסדים כלכליים עצומים בעולם. כיום, החיסון משמש בעיקר למניעה ובקרה של PRRSV, בין היתר החיסון נגד וירוס חי (MLV) הוא הנפוץ ביותר בשימוש [48]. למרות שחיסון זה היה יעיל בהפחתת התפרצויות ושכיחות PRRS, הוא גם הגביר מאוד את השונות הגנטית והמגוון של הנגיף והוביל לרקומבינציה ויראלית בין וירוסי חיסון פראיים וחיים בשטח [49,50]. בשנים האחרונות, התפשטות ושכיחות הנגיף הרקומביננטי NADC30-כמו זן PRRSV גרמו להתפרצויות מרובות של תסמונת הרבייה והנשימה של חזיר בסין. הדמיון בין CHsx1401 ל-NADC30 בשימוש במחקר זה נשאר על 92.2-99.1%. מאז, זה הפך לזן מגיפה בסין. אקסוזומים, כמתווכים של תקשורת תאים, מצויים באופן נרחב בנוזלי גוף שונים ויש להם יתרונות ייחודיים באבחון וטיפול במחלה [51,52]. על פי דיווחים קודמים, אקסוזומים ממלאים תפקיד תקשורתי חשוב בהצגת אנטיגן [53], תגובה חיסונית [53,54], שכפול וירוס [54], סרטן [55], מחלות ניווניות [56], אנגיוגנזה [57], תא גידול הגירה [58] ופלישה [59], ובעלי ערך מחקרי גבוה.

במחקר זה, נעשה שימוש בטכנולוגיית רצף תפוקה גבוהה לבניית פרופיל ביטוי ה-miRNA של אקסוזומים בסרום, ו-33 DE miRNAs זוהו. כפי שכולנו יודעים, ה-miRNA המקודד המארח יכול להיקשר לגנום הנגיפי ולאחר מכן לווסת את השכפול, הסינתזה והשחרור של הנגיף כדי להגביל את הזיהום ולהשפיע על התהליך הפתולוגי [15]. מחקרים של miRNA המכוונים לגנום הנגיפי דווחו שוב ושוב בבעלי חיים. gga-miR-454 ו-gga-miR-130b במחלת בורסאית זיהומית של עוף יכולים למקד את הגנום הנגיפי כדי לעכב שכפול ויראלי, בעוד ש-gga-miR-21 מכוון ישירות לחלבון הנגיפי VP1 כדי לעכב תרגום חלבון ויראלי [60,61]. במחקרי PRRSV, ssc-miR-181 נקשר באופן ספציפי לאזור שמור מאוד במורד הגנום הנגיפי ORF4 ומעכב מאוד את שכפול PRRSV [62]. במחקר זה, הפרש הביטוי של ssc-miR-181 בין שתי הקבוצות לא הגיע לרמה משמעותית. במחקר שלנו, הגנום של תשעה נגיפי PRRSV שונים הושוו לאלו של זן CHsx1401, ושמונה המקטעים השמורים ביותר זוהו. צפו כי 31 DE miRNAs יכולים להיקשר ל-8 המקטעים השמורים ביותר של CHsx1401, ו-16 DE miRNAs יכולים להיקשר לרצפים השמורים הקרובים ל-30 UTR של CHsx1401. ביניהם, 5 DE miRNAs (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 ו-ssc-miR{{ 36}}) יכול להתחבר בו-זמנית ל-CHsx1401 30 UTR. בנוסף, הביטוי המווסת מעלה של ssc-miR-223 ניבא להיקשר ליעד 30 UTR של הגנום PRRSV. התוצאות הראו כי לרצפים השמורים של גנום הנגיף עשוי להיות תפקיד מפתח בפתוגניות שלו, ול-miRNAs שיכולים להיקשר לרצפים המשמרים בין הגנום של זני PRRSV שונים עשויה להיות משמעות חשובה בשליטה על הפתוגניות של הנגיף. כמה miRNAs בעלי ביטוי דיפרנציאלי הוכחו כקשורים ל-PRRSV על ידי מחקרים קודמים ואף מעורבים ישירות בוויסות של PRRSV, כולל ssc-miR-10b [63], ssc-miR-378 [30] , ssc-miR-124a [64], let-7f-5p [65], ssc-miR-744 [66], ו-ssc-miR{{57 }}א [67].

PRRSV יכול להתחמק מהגנת המארח על ידי התערבות בתגובה חיסונית מולדת. תהליך זה מווסת על ידי מסלולי איתות רבים, כולל מסלול איתות MAPK, מסלול איתות PI3K Akt, אוטופגיה, כימוקין ומסלול איתות TNF. נכון לעכשיו, מסלול האיתות MAPK כולל שלושה מסלולים עיקריים: ERK1/2, JNK ו-p38 מסלול. הפעלה של מפל ה-MAPK יכולה לקדם אפופטוזיס של תאי מארח, לסייע לנגיף להימלט מתגובת ההגנה החיסונית של המארח ולקדם שכפול PRRSV [68]. יתרה מכך, ההפעלה של c-Jun N-terminal kinases (JNKs) ו-p38 יכולה גם לקדם את שחרור הגורם הדלקתי IL -10 [68-70] ולשפר את ההשפעה הדלקתית. בנוסף להשראת אפופטוזיס, PRRSV יכול גם לעורר אוטופגיה, שיכולה לקדם שכפול PRRSV. ההפעלה של PI3K/Akt נחוצה לכניסת וירוסים וקידום שכפול וירוסים, ואקט המופעל על ידי PRRSV מעכב אפופטוזיס של תאי מארח על ידי ויסות שלילי של מסלול JNK [71]. TNF זה יכול למלא תפקיד חשוב בהשראה ובוויסות של תגובה דלקתית יחד עם גורמים דלקתיים אחרים, אך ביטוי TNF מושפע מהוויסות השלילי של שכפול PRRSV [72]. במחקר הנוכחי, miRNAs (ssc-miR-10b, ssc-miR-122-5p, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, ssc-miR{ {24}}a-5p, וכו') המועשרים במסלולים אלה מעורבים באפופטוזיס המושרה על ידי PRRSV, אוטופגיה ודלקת וקשורים קשר הדוק לתגובה חיסונית ויראלית, התחמקות חיסונית ושכפול.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

קרום הפלזמה של התא עשיר במגוון רפסודות שומנים, וספינגוליפידים עשירים בספינגוליפידים וכולסטרול (ספינגומילין וגליקוספינגוליפידים) הם מולקולות מפתח של רפסודות שומנים. זיהוי שומנים על ידי חלק מהחלבונים של הנגיף עשוי להיות תנאי הכרחי לכניסת הנגיף [73]. וירוסי מעטפת מחדירים גליקופרוטאין מעטפת ויראלית לרפסודות שומנים בשלב כניסת הנגיף, מקיימים אינטראקציה עם קולטנים הנמצאים ברפסודות שומנים, או משתנים ממצבם הטבעי לצורה פעילה כדי ליזום או לקדם הפנמה/איחוי ויראלי, כגון HSV, SARS וירוס קורונה, ו וירוס שלשול מגפת חזרזירים [73,74]. מחקרים קודמים מצאו כי הסרת כולסטרול מפני השטח של תאי MARC-145 הפחיתה באופן משמעותי את הזיהום ב-PRRSV, מה שהוכיח כי עיכוב זיהום ב-PRRSV תיווך באופן ספציפי על ידי הסרת הכולסטרול הסלולרי. דלדול של כולסטרול בקרום התא עיכב משמעותית את כניסת הנגיפים, במיוחד הצמדות ושחרור הנגיפים [75]. חילוף החומרים של ספינגוליפידים יכול לווסת את מבנה הממברנה וההיצמדות, שהיא בעלת משמעות רבה בפלישת וירוס PRRSV. אנדוציטוזיס הייתה ההעשרה המשמעותית ביותר במחקר זה. אנדוציטוזיס הוא מנגנון חשוב של ספיגת אקסוזום על ידי תאי מטרה. מחקרים קודמים הראו כי ספיגת אקזוזום היא תהליך תובע אנרגיה ותלוי שלד ציטוני, אשר מדגיש את התפקיד הפוטנציאלי של אנדוציטוזיס בתהליך זה [76]. הוכח שמספר מסלולים יכולים לתווך תהליך זה, כולל פגוציטוזיס, מקרופינוציטוזיס, קלתרין וכו' [77,78], מה שהוביל לסיווגים ותפקידים שונים של חומרים שעברו אנדוציטוזיס. ההעשרה של miRNAs אקסוזומליים המובעים בצורה דיפרנציאלית במסלול זה מצביעה על כך שאקסוזומים ממלאים תפקיד חשוב בהדבקה ב-PRRSV, וויסות הובלת התוכן והקליטה באקסוזומים עשוי להוביל לשינויים פתופיזיולוגיים בתאי המטרה ובאיברי המטרה.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

5. מסקנות

באמצעות זיהוי וניתוח ביואינפורמטיקה של miRNAs אקסזומליים בסרום מחזירים נגועים ב-PRRSV, הושגו מגוון מסלולים הקשורים ל-PRRSV ו-miRNAs בעלי ביטוי דיפרנציאלי במחקר זה, כגון ssc-miR-4331-3p, ssc-miR{{ 5}}, sscmiR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128 וכו', הממלאים תפקידים פונקציונליים פוטנציאליים ב-PRRSV -תגובה חיסונית המושרה, פלישה וספיגת אקסוזום. בנוסף, מכיוון ש-miRNA בודד יכול לכוון לגנים מרובים וגן בודד מוסדר גם על ידי מספר מירנ"א, מספר מירנאים מבצעים מספר פונקציות במסלולים הנ"ל. כמה miRNAs אומתו כדי לווסת זיהום PRRSV על ידי פעולה על קולטני מפתח או מיקוד ישיר לגנום הנגיף, כגון ssc-miR-10b, ssc-miR-378, miR-124a, let-7f-5p, ssc-miR-744, ssc-miR-19a וכו'. בינתיים, המחקר הנוכחי גם חזה מגוון של miRNAs שיכולים להיקשר ל הפרגמנט השמור ביותר של 30 UTR של גנום נגיף CHX1401, כולל ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR{{34} }, ו-ssc-miR-6529, שעשויים להיות חשובים לוויסות פתוגניות ויראלית.

הפניות

1. Snijder, EJ; קיקרט, מ.; Fang, Y. Arterivirus ביולוגיה מולקולרית ופתוגנזה. ג'נרל וירול. 2013, 94 Pt 10, 2141–2163. [CrossRef] [PubMed]

2. לו, י.; ג'אנג, י.; שיאנג, X.; שארמה, מ.; ליו, ק.; ווי, ג'; שאו, ד.; לי, ב.; טונג, ג.; אולשבסקי, מ.א.; et al. איתות חריצים תורם לביטוי של ציטוקינים דלקתיים הנגרמים על ידי זיהום של וירוס רבייה ותסמונת נשימה של חזיר פתוגניים ביותר (HP-PRRSV) במקרופאגים מכתשי חזיריים. Dev. Comp. אימונול. 2020, 108, 103690. [CrossRef] [PubMed]

3. דיה, ש.; סוייר, נ.; אלן, ר.; Athanassius, R. מאפיינים אולטרה-סטרוקטורליים ומורפוגנזה של וירוס רבייה ותסמונת נשימה של חזיר המופצים בשיבוט תאי MARC-145 המתירני ביותר. עו"ד Exp. Med. ביול. 1995, 380, 95–98. [PubMed]

4. Dokland, T. הביולוגיה המבנית של PRRSV. Res. 2010, 154, 86–97. [CrossRef] [PubMed]

5. ג'ונסון, CR; גריגס, TF; Gnanandarajah, J.; Murtaugh, MP חלבון מבני חדש בנגיף רבייה ותסמונת נשימה של חזיר המקודד על ידי ORF5 חלופי הקיים בכל נגיפי העורקים. ג'נרל וירול. 2011, 92 Pt 5, 1107–1116. [CrossRef] [PubMed]

6. לי, SC; לי, ש; יו, GW; צ'וי, HW; נו, י"ה; פארק, CE; שין, י"ה; Yoon, IJ; קאנג, סי; Lee, C. ניתוחים פנוטיפיים וגנוטיפיים של זן וירוס רבייה ותסמונת נשימה של חזיר מוחלש לאחר מעברים סדרתיים במקרופאגים מכתשי חזיר תרבותיים. J. Vet. Sci. 2018, 19, 358–367. [CrossRef] [PubMed]

7. זברובסקה, א.; סקוברונק, א.; ווג'קובסקה, א. וידלק, פ.; Pietrowska, M. Metabolome of exosomes: התמקדות בשלפוחיות המשתחררות על ידי תאים סרטניים ונוכחות בנוזלי גוף האדם. Int. י.מול. Sci. 2019, 20, 3461. [CrossRef]

8. בבלמן, חבר פרלמנט; סמיט, MJ; פטל, DM; Baglio, SR ביוגנזה ותפקוד שלפוחיות חוץ תאיות בסרטן. פרמקול. ת'ר. 2018, 188, 1–11. [CrossRef]

9. זבורובסקי, MP; באלאג', ל. ברייקפילד, XO; Lai, CP שלפוחיות חוץ-תאיות: הרכב, רלוונטיות ביולוגית ושיטות מחקר. Bioscience 2015, 65, 783–797. [CrossRef]

10. Almughliq, FB; קו, YQ; Peiris, HN; ואסואני, ק.; הולנד, או.; מאייר, ש.; Roche, JR; בורק, CR; Crookenden, MA; Arachchige, BJ; et al. אקסוזומים במחזור עשויים לזהות סמנים ביולוגיים עבור פרות בסיכון לתפקוד מטבולי לקוי. Sci. Rep. 2019, 9, 13879. [CrossRef]

11. Zhang, RC; דו, WQ; Zhang, JY; יו, SX; לו, FZ; דינג, ח"מ; צ'נג, י"ב; רן, ג; Geng, DQ טיפול בתאי גזע Mesenchymal עבור פגיעה עצבית היקפית: סקירה נרטיבית. ריגן עצבי. מילון 2021, 16, 2170–2176. [PubMed]

12. Bryzgunova, OE; זאריפוב, מ"מ; Skvortsova, TE; לקצ'נוב, EA; Grigor'eva, AE; זפורוז'צ'נקו, IA; מורוזקין, ES; Ryabchikova, EI; ירצ'נקו, י.ב; Voitsitskiy, VE; et al. מחקר השוואתי של שלפוחיות חוץ-תאיות מהשתן של אנשים בריאים וחולי סרטן הערמונית. PLoS ONE 2016, 11, e0157566. [CrossRef] [PubMed]

13. קאמי, ג.; דרגיבוס, MC; ברונו, ש.; גראנג', סי; פונסטו, ו'; Tetta, C. Exosome/microvesicle-תיווך אפיגנטי מחדש של תאים. אמ. J. Cancer Res. 2011, 1, 98–110. [PubMed]

14. טמקוביץ', SN; Tutanov, OS; Laktionov, PP Exosomes: יצירה, מבנה, הובלה, פעילות ביולוגית ויישום אבחון. Biochem. Mosc. Suppl. סר. חבר. Cell Biol. 2016, 10, 163–173. [CrossRef]

15. ברטל, DP MicroRNAs: גנומיקה, ביוגנזה, מנגנון ותפקוד. תא 2004, 116, 281–297. [CrossRef]

16. גורדינו, ג.; Costa-Pereira, S.; Corredeira, P.; אלבס, פ.; קוסטה, ל.; גומס, AQ; סילבה-סנטוס, ב.; Ribot, JC MicroRNA-181a מגביל את ההתמיינות של תאי δ T אנושיים על ידי מיקוד ל- Map3k2 ו- Notch2. נציג EMBO 2022, 23, e52234. [CrossRef]

17. ליו, ב.; יאן, ל.; צ'י, י.; שמש, י.; Yang, X. Long non-coding RNA AFAP1-AS1 מקל על התקדמות סרטן השחלות על ידי ויסות ציר miR-107/PDK4. J. Ovarian Res. 2021, 14, 60. [CrossRef]

18. קים, י.; לי, ד"ה; פארק, ש.ש; ג'ון, TI; יונג, CH משחק הגומלין של microRNAs וגורמי שעתוק בוויסות אוטופגיה במחלת כבד שומני לא אלכוהולי. Exp. מול. Med. 2021, 53, 548–559. [CrossRef]

19. קזמירצ'ק, ד.; יופק, ק.; סטרזינסקה, ק. נוביצקי, מ.; רוסינסקי, מ.; Januchowski, R. הפרופיל של ביטוי מיקרו-RNA ותפקיד פוטנציאלי בוויסות של גנים עמידים לתרופות בשורות תאים סרטן שחלות עמידים ל-cisplatin ו-paclitaxel. Int. י.מול. Sci. 2022, 23, 526. [CrossRef]

20. גונג, י.; ווי, X.; Sun, W.; רן, X.; חן, ג'; Aweya, JJ; מא, ח; צ'אן, ק"ג; ג'אנג, י.; Li, S. Exosomal miR-224 תורם להומיאוסטזיס של מיקרוביוטה המולימפה במהלך זיהום חיידקי בסרטנים. PLoS Pathog. 2021, 17, e1009837. [CrossRef]

21. צ'נג, י.; קו, ו.; ז'ו, ד.; יו, X.; Zhu, Y. כיוונים עתידיים באבחון, פרוגנוזה וניטור מחלות של קרצינומה של האדרנוקורטיקלית: סמנים ביולוגיים לא פולשניים חדשים. חֲזִית. אנדוקרינול. 2022, 12, 811293. [CrossRef] [PubMed]

22. גאלו, א.; טנדון, מ.; אלביסוס, א.; Illei, GG רוב המיקרו-RNA הניתנים לזיהוי בסרום וברוק מרוכזים באקסוזומים. PLoS ONE 2012, 7, e30679. [CrossRef] [PubMed]

23. אוהד, ב.; צ'ופ, מ.; Zhang, ZG; Liu, XS תפקידים מתפתחים של microRNA כסמנים ביולוגיים ומטרות טיפוליות לנוירופתיה סוכרתית. חֲזִית. נוירול. 2020, 11, 558758. [CrossRef] [PubMed]

24. ווי, ה.; חן, ש; לין, ל.; שא, ג; לי, ט.; ליו, י.; יין, X.; שו, י.; חן, ל. גאו, ו.; et al. ויסות ייצור אקסוזום ומיון מטענים. Int. ג'יי ביול. Sci. 2021, 17, 163–177. [CrossRef]

25. ג'יה, X.; בי, י.; לי, ג'; Xie, Q.; יאנג, ה.; Liu, W. Cellular microRNA miR-26a מדכא שכפול של וירוס רבייה ותסמונת נשימה של חזיר על ידי הפעלת חסינות אנטי-ויראלית מולדת. Sci. Rep. 2015, 5, 10651. [CrossRef]

26. לי, ל.; ווי, ז; ג'ואו, י.; ג'יאנג, י.; יו, ל.; ז'נג, ה.; טונג, ו.; יאנג, ש.; ז'נג, ה.; שאן, ט.; et al. Host miR-26a מדכא שכפול של וירוס רבייה ותסמונת נשימה של חזיר על ידי העלאת ויסות אינטרפרונים מסוג I. Res. 2015, 195, 86–94. [CrossRef]

27. ליו, פ.; וואנג, ה.; דו, ל.; ווי, ז; ג'אנג, ש; Feng, WH MicroRNA-30c ממקד את שרשרת הבטא של קולטן אינטרפרון-אלפא/ביתא כדי לקדם זיהום מסוג PRRSV מסוג 2. ג'נרל וירול. 2018, 99, 1671–1680. [CrossRef]

28. ג'אנג, ש.; Huang, C.; יאנג, ש; גאו, ל.; ליו, HC; טאנג, ג'; Feng, WH MicroRNA-30c מווסת תגובות IFN מסוג I כדי להקל על זיהום בנגיף הרבייה ותסמונת הנשימה על ידי מיקוד ל-JAK1. J. Immunol. 2016, 196, 2272–2282. [CrossRef]

29. וואנג, ד.; קאו, ל.; שו, ז; פאנג, ל.; ז'ונג, י.; חן, ש; לואו, ר.; חן, ח.; לי, ק.; Xiao, S. MiR-125b מפחית את שכפול נגיף הרבייה ותסמונת הנשימה על ידי ויסות שלילי של מסלול ה-NF-κB. PLoS ONE 2013, 8, e55838. [CrossRef]

30. ג'אנג, ש; גואו, XK; גאו, ל.; Huang, C.; לי, נ.; ג'יה, X.; ליו, ו.; Feng, WH MicroRNA-23 מעכב את שכפול PRRSV על ידי מיקוד ישיר ל-PRRSV RNA ואולי על ידי הגברת אינטרפרונים מסוג I. וירולוגיה 2014, 450–451, 182–195. [CrossRef]

31. וו, ג'; פנג, X.; ג'ואו, א.; Qiao, M.; וו, ה.; שיאו, ה.; ליו, ג'; ג'נג, X.; ג'אנג, ש.; Mei, S. MiR-506 מעכב שכפול PRRSV בתאי MARC-145 באמצעות CD151. מול. תָא. Biochem. 2014, 394, 275–281. [CrossRef]

32. גאו, ל.; גואו, XK; וואנג, ל.; ג'אנג, ש; לי, נ.; חן, XX; וואנג, י.; Feng, WH MicroRNA 181 מדכא זיהום של וירוס רבייה ותסמונת נשימה (PRRSV) על ידי מיקוד לקולטן PRRSV CD163. J. Virol. 2013, 87, 8808–8812. [CrossRef]

33. שיאו, ש.; דו, ט.; וואנג, X.; ני, ח.; יאן, י.; לי, נ.; ג'אנג, סי; ג'אנג, א.; גאו, ג'; ליו, ה.; et al. MiR-22 מקדם שכפול וירוסי רבייה ותסמונת נשימה על ידי מיקוד לגורם המארח HO-1. וטרינר. מיקרוביול. 2016, 192, 226–230. [CrossRef]

34. שיאו, ש.; וואנג, X.; ני, ח.; לי, נ.; ג'אנג, א.; ליו, ה.; פו, פ.; שו, ל.; גאו, ג'; Zhao, Q.; et al. MicroRNA miR-24-3p מקדם שכפול וירוס רבייה ותסמונת נשימה באמצעות דיכוי של ביטוי heme oxygenase-1. J. Virol. 2015, 89, 4494–4503. [CrossRef]

35. באטלר, JE; סינקורה, מ.; וואנג, ג'; סטפנובה, ק.; לי, י.; Cai, X. הפרעה של התפתחות תימוציטים עומדת בבסיס מגיפת PRRS: השערה הניתנת לבדיקה. חֲזִית. אימונול. 2019, 10, 1077. [CrossRef]

36. ג'ואו, ל. וואנג, ז.; דינג, י.; סטפנובה, ק.; לי, י.; Cai, X. NADC30-כמו זן של וירוס רבייה ותסמונת נשימה, סין. Emerg. לְהַדבִּיק. Dis. 2015, 21, 2256–2257. [CrossRef]

37. ג'ואו, ל. יאנג, ב.; שו, ל.; ג'ין, ח.; Ge, X.; גואו, X.; האן, ג'; Yang, H. הערכת יעילות של שלושה חיסונים נגד וירוסים חיים נגד זן של נגיף רבייה ותסמונת נשימה NADC30-דומה. וטרינר. מיקרוביול. 2017, 207, 108–116. [CrossRef]

38. וונג, נ.; Wang, X. miRDB: משאב מקוון לחיזוי יעדי microRNA והערות פונקציונליות. Nucleic Acids Res. 2015, 43, D146–D152. [CrossRef]

39. פרידלנדר, מר; Mackowiak, SD; לי, נ.; חן, ו.; Rajewsky, N. miRDeep2 מזהה במדויק מאות גנים ידועים ומאות גנים של מיקרו-RNA חדשניים בשבעה קלידים של בעלי חיים. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 37–52. [CrossRef]

40. וון, מ.; שן, י.; שי, ש; Tang, T. miREvo: פלטפורמת ניתוח אבולוציונית אינטגרטיבית של מיקרו-RNA לניסויי רצף מהדור הבא. BMC Bioinform. 2012, 13, 140. [CrossRef]

41. אנדרס, ש.; Huber, W. ניתוח ביטוי דיפרנציאלי עבור נתוני ספירת רצף. גנום ביול. 2010, 11, R106. [CrossRef] [PubMed]

42. תמורה, ק.; סטכר, ג.; Kumar, S. MEGA11: ניתוח גנטיקה אבולוציונית מולקולרית גרסה 11. Mol. ביול. Evol. 2021, 38, 3022–3027. [CrossRef] [PubMed]

43. Hubisz, MJ; פולארד, ק"ש; Siepel, A. PHAST ו- RPHAST: ניתוח פילוגנטי עם מודלים של מרחב/זמן. קָצָר. ביואינפורמציה. 2011, 12, 41–51. [CrossRef] [PubMed]

44. קרוגר, י.; Rehmsmeier, M. RNAhybrid: חיזוי יעד מיקרו-RNA קל, מהיר וגמיש. Nucleic Acids Res. 2006, 34, W451–W454. [CrossRef]

45. יו, ג.; וואנג, LG; האן, י.; הוא, QY clusterProfiler: חבילת R להשוואת נושאים ביולוגיים בין צבירי גנים. OMICS 2012, 16, 284–287. [CrossRef]

46. ​​קו, ר.; דינג, ג.; חן, ג'; Cao, L. ניתוח של מיקרו-RNA אקזומליים בסרום ומאפיינים קלינקופתולוגיים של חולים עם אדנוקרצינומה של הלבלב. World J. Surg. אונקול. 2013, 11, 219. [CrossRef]

47. ת'רי, סי; Witwer, KW; Aikawa, E.; Alcaraz, MJ; אנדרסון, JD; Andriantsitohaina, R.; אנטוניו, א.; ערב, ת.; ארצ'ר, פ.; אטקין-סמית', ג'ק; et al. מידע מינימלי למחקרים של שלפוחיות חוץ-תאיות 2018 (MISEV2018): הצהרת עמדה של האגודה הבינלאומית לשלפוחיות חוץ-תאיות ועדכון של הנחיות MISEV2014. J. Extracell. Vesicles 2018, 7, 1535750. [CrossRef]

48. Lyoo, K.-S.; Choi, JY; האן, TW; פארק, ק"ט; Kim, HK השפעת חיסון עם חיסון נגד וירוס רבייה ותסמונת נשימה של חזיר חי על ביצועי גדילה בחזירים משמימים בתנאי שדה. J. Vet. Med. Sci. 2016, 78, 1533–1536. [CrossRef]

49. ביאן, ט.; שמש, י.; האו, מ.; ג'ואו, ל. Ge, X.; גואו, X.; האן, ג'; Yang, H. וירוס רקומביננטי מסוג 2 של רבייה ותסמונת נשימה של חזיר בין NADC30-לדומה ל-MLV: אפיון גנטי ופתוגניות לחזרזירים. לְהַדבִּיק. ג'נט. Evol. 2017, 54, 279–286. [CrossRef]

50. לי, י.; ג'י, ג'; וואנג, ג'; טאן, פ.; ג'ואנג, ג'; לי, X.; Tian, ​​K. רצף גנום שלם של NADC30-כמו וירוס רבייה ותסמונת נשימה של חזיר המאופיין בריקומבינציה עם זנים אחרים. הכרזת הגנום 2016, 4, ה00330-16. [CrossRef]

51. קאלורי, ר.; Lebleu, VS הביולוגיה, התפקוד והיישומים הביו-רפואיים של אקסוזומים. מדע 2020, 367, eaau6977. [CrossRef] [PubMed]

52. Miao, XY התקדמות אחרונה בהבנת התפקיד של miRNAs באקסוזומים והפוטנציאל הטיפולי שלהם. J. Integr. Agric. 2017, 16, 753–761. [CrossRef]

53. שנודה, ב"ב; Ajit, SK מודולציה של תגובות חיסוניות על ידי אקסוזומים שמקורם בתאים המציגים אנטיגן. קלינ. Med. תובנות פאתול. 2016, 9 (תוסף S1), CPath-S39925. [CrossRef] [PubMed]

54. לי, ש.; לי, ש; וו, ש.; Chen, L. Exosomes מווסתים את השכפול הנגיפי ומארח את התגובות החיסוניות בזיהום HBV. BioMed Res. Int. 2019, 2019, 2103943. [CrossRef]

55. Greening, DW; גופאל, סק; שו, ר.; סימפסון, RJ; Chen, W. Exosomes ותפקידיהם ברגולציה חיסונית וסרטן. בסמינרים בביולוגיה של התא וההתפתחות; עיתונות אקדמית: קיימברידג', MA, ארה"ב, 2015; כרך 40, עמ' 72–81.

56. Howitt, J.; היל, AF Exosomes בפתולוגיה של מחלות נוירודגנרטיביות. ג'יי ביול. Chem. 2016, 291, 26589–26597. [CrossRef]

57. Ribeiro, MF; ז'ו, ח.; Millard, RW; Fan, G. Exosomes מתפקדים בפרו ואנטי אנגיוגנזה. Curr. אנגיוגנזה 2013, 2, 54–59. [CrossRef]

58. לאן, י. שמש, ל.; שו, פ.; ליו, ל.; הו, פ.; שיר, ד; הו, ז; וו, ו.; לואו, X.; וואנג, ג'; et al. אקסוזומים שמקורם במקרופאגים M2 מעודדים נדידת תאים ופלישה בסרטן המעי הגס. Cancer Res. 2019, 79, 146–158. [CrossRef]

59. אגא, מ.; בנץ, GL; רפא, ש.; טוריסי, MR; קונדו, ש.; וואקיסאקה, נ.; יושיזאקי, ט.; Pagano, JS; Shackelford, J. Exosomal HIF1 תומך בפוטנציאל פולשני של LMP1-חיוביים הקשורים לקרצינומה של האף-לוע. Oncogene 2014, 33, 4613–4622. [CrossRef]

60. פו, מ.; וואנג, ב.; חן, X.; הוא, ז.; וואנג, י.; לי, X.; קאו, ה.; Zheng, SJ gga-miR-454 מדכא את שכפול נגיף המחלה זיהומית (IBDV) באמצעות מיקוד ישיר של IBDV גנומי מקטע B ומדכאים סלולריים של ציטוקין איתות 6 (SOCS6). Res. 2018, 252, 29–40. [CrossRef]

61. פו, מ.; וואנג, ב.; חן, X.; הוא, ז.; וואנג, י.; לי, X.; קאו, ה.; Zheng, SJ MicroRNA gga-miR-130b מדכא את שכפול וירוסי המחלה זיהומית באמצעות מיקוד של הגנום הנגיפי ומדכאים תאיים של איתות ציטוקינים 5. J. Virol. 2018, 92, ה01646-17. [CrossRef]

62. גואו, XK; ג'אנג, ש; גאו, ל.; לי, נ.; חן, XX; Feng, WH הגברת הביטוי של microRNA 181 מעכבת את שכפול נגיף הרבייה ותסמונת הנשימה ויש לה השלכות על שליטה בזיהום בנגיף. J. Virol. 2013, 87, 1159–1171. [CrossRef] [PubMed]

63. קונג, פ.; Xiao, S.; חן, י.; וואנג, ל.; גאו, ג'; לי, מ.; הוא, ז.; גואו, י.; ז'או, ג'; ג'אנג, X.; et al. תעתיקי miRNA ו-mRNA משולבים של מקרופאגים מכתשי חזיר (PAM) מזהים חתימות מולקולריות של מירנה ספציפיות לזן הקשורות לזיהום H-PRRSV ו-N-PRRSV. מול. ביול. נציג 2014, 41, 5863–5875. [CrossRef] [PubMed]

64. לי, נ.; הואנג, ק.; חן, י.; הואנג, ז'; ג'אנג, י.; לנג, ג; ליו, י.; שי, ג'; Xiao, S.; Yao, L. MicroRNA ssc-miR-124a מציג פעילות אנטי-ויראלית נגד וירוס רבייה ותסמונת נשימה של חזיר באמצעות דיכוי של הגנים המארח CD163. וטרינר. מיקרוביול. 2021, 261, 109216. [CrossRef] [PubMed]

65. לי, נ.; דו, ט.; יאן, י.; ג'אנג, א.; גאו, ג'; הו, ג.; Xiao, S.; Zhou, EM MicroRNA מאפשרת-7f-5p לעכב את וירוס הרבייה ותסמונת הנשימה על ידי מיקוד ל-MYH9. Sci. Rep. 2016, 6, 34332. [CrossRef]

66. ז'ן, י. וואנג, פ.; ליאנג, ו.; ליו, ג'. גאו, ג.; וואנג, י.; שו, X.; סו, ש; ג'אנג, ש; Liu, B. זיהוי של RNA שאינו מקודד בצורה דיפרנציאלית במקרופאגים מכתשי חזירים מ-Tongcheng וחזירים לבנים גדולים הגיבו ל-PRRSV. Sci. נציג 2018, 8, 15621. [CrossRef]

67. ג'ואו, X.; מיכל, ג'יי ג'יי; ג'יאנג, ז'; Liu, B. פרופיל ביטוי של MicroRNA במקרופאגים מכתשית של חזירי טונגצ'נג סיניים ילידים שנדבקו ב-PRRSV in vivo. J. Appl. ג'נט. 2017, 58, 539–544. [CrossRef]

68. לי, YJ; Lee, C. שכפול וירוס רבייה ותסמונת הנשימה מדוכאת על ידי עיכוב של מסלול האיתות החוץ-תאי מוסדר קינאז (ERK). Res. 2010, 152, 50–58. [CrossRef]

69. שיר, ש; בי, י.; וואנג, ד.; פאנג, ל.; ג'אנג, ל.; לי, פ.; חן, ח.; Xiao, S. זיהום בנגיף רבייה ותסמונת נשימה חזיר מפעיל ייצור IL-10 דרך מסלולי NF-κB ו-p38 MAPK במקרופאגים מכתשי חזיריים. Dev. Comp. אימונול. 2013, 39, 265–272. [CrossRef]

70. יין, ש; Huo, Y.; דונג, י.; מניפה, ל.; יאנג, ה.; וואנג, ל.; נינג, י.; Hu, H. הפעלה של c-Jun NH (2)-terminal kinase נדרשת עבור אפופטוזיס המושרה על ידי נגיף רבייה ותסמונת נשימה של חזיר, אך לא עבור שכפול וירוס. Res. 2012, 166, 103–108. [CrossRef]

71. Fan, L. מסלולי איתות המעורבים בוויסות השראת אפופטוזיס בתאי מארח לאחר זיהום PRRSV. גנים של וירוסים 2019, 55, 433–439. [CrossRef]

72. לופז-פוארטס, ל. קמפוס, ע.; דומנך, נ.; אזקרה, א.; קסטרו, JM; דומינגז, י. Alonso, F. וירוס רבייה ונשימה חזירי (PRRS) מווסת את ייצור TNF- במקרופאגים נגועים. Res. 2000, 69, 41–46. [CrossRef]

73. Teissier, É.; Pécheur, EI ליפידים כמאפננים של היתוך ממברנה בתיווך חלבוני היתוך ויראלי. יורו ביופיס. י' 2007, 36, 887–899. [CrossRef]

74. Jeon, JH; Lee, C. כולסטרול תאי נדרש לזיהום נידו-וירוס חזירי. קֶשֶׁת. וירול. 2017, 162, 3753–3767. [CrossRef]

75. שמש, י.; Xiao, S.; וואנג, ד.; לואו, ר.; לי, ב.; חן, ח.; Fang, L. כולסטרול קרום תאי נדרש לכניסה ושחרור של וירוס רבייה ותסמונת הנשימה בתאי MARC-145. Sci. China Life Sci. 2011, 54, 1011–1018. [CrossRef]

76. טיאן, ט.; ג'ו, י"ל; ג'ואו, YY; ליאנג, GF; וואנג, YY; הו, FH; Xiao, ZD קליטת אקסוזום באמצעות אנדוציטוזיס ומקרופינוציטוזיס בתיווך קלטרין ותיווך מסירת miR-21. ג'יי ביול. Chem. 2014, 289, 22258–22267. [CrossRef]

77. Mulcahy, לוס אנג'לס; ורוד, RC; קרטר, DRF מסלולים ומנגנונים של קליטת שלפוחית ​​חוץ תאית. J. Extracell. Vesicles 2014, 3, 24641. [CrossRef]

78. ג'אנג, מ.; זאנג, X.; וואנג, מ.; לי, ז; Qiao, M.; הא.; Chen, D. ננו-נשאים מבוססי אקזוזום ככלי השראה ביו ורסטיליים להעברת תרופות: התקדמות ואתגרים אחרונים. ג'יי מאטר. Chem. B 2019, 7, 2421–2433. [CrossRef]