תַקצִיר
לחקור את ההשפעות המעכבות הסינרגיסטיות שלCistanche Deserticolaglycosides phenylethanoid (PHGS) ו- Glabridin (GLA) על פיגמנטציה של העור, יחס המסה האופטימלי של PHGs ל- GLA הוקרן מראש דרךבַּמַבחֵנָהמבחני עיכוב פעילות טירוזינאז, 1, 1- Diphenyl -2- Picrylhydrazyl (DPPH) Scavenging רדיקלי, ו- 2,2'-Azino-bis ({} חומצה) (7} ethylbenziazoline {{8} scavent}. הערכות נוספות נערכו באמצעות שלושה מודלים סלולריים:

מודל B16F10 Melanogenesis הנגרם על ידי UVB להערכת עיכוב סינתזת מלנין באמצעות פעילות טירוזינאז ותכולת מלנין;

מודל דלקתי של ליפופוליסכריד (LPS) הנגרם על ידי HACAT כדי להעריך השפעות אנטי-דלקתיות על ידי מדידת אינטרלוקין -6 (IL -6) וגורם נמק הגידול- (TNF-) דיכוי;

AAPH (2,2'-AZOBIS (2- amidinopropane) דיהידרוכלוריד הנגרם על ידי מודל לחץ חמצוני הנגרם על ידי HACAT כדי לקבוע פעילות נוגדת חמצון באמצעות שיפור Distutase (SOD) (CAT) (CAT).

יחס ה- PHGS/GLA האופטימלי זוהה באמצעות דגמים אלה. התוצאות הראו כי תמיסות PHGS/GLA (שהוכנו במי מלח עם פוספט, PBS, pH 6.8) ביחס המוני של 1: 1, 5: 1 ו- 10: 1 הציגו עיכוב משמעותי של טירוזינאז והשפעות נוגדות חמצון סינרגיסטיות. שיעורי העיכוב של טירוזינאז היו 94.37%, 92.93%ו- 88.06%בהתאמה; שיעורי ניקוי רדיקלים של DPPH הגיעו ל 89.44%, 88.72%ו- 88.10%; שיעורי הניקוי של ABTS⁺ היו 100.13%, 100.01%ו- 99.87%. ב 25 ug/ml ב- DMEM, PHGS/GLA (1: 1, 5: 1, 10: 1) לא הראו ציטוטוקסיות כלפי B16F10 או HACAT. PHGS/GLA (1: 1) מוצג פתרון DMEMעיכוב טירוזינאז מעולה(23.80% פעילות שיורית), באופן משמעותיהפחתת תוכן מלנין(30.90%), והביאו ביחסים אחרים של יחסי ומונותרפיות בדיכוי IL -6/TNF- שחרור ושיפור פעילות SOD/CAT. השילוב הסינרגיסטי של PHGs ו- GLA הקלה למעשה על Sהיפר -פיגמנטציה של קרובי משפחה על ידי עיכוב מלנוגנזההפחתת דלקת, ושיפור יכולת נוגד חמצון.

מילות מפתח
CISTANCHEDeserticola גליקוזידים פנילנואידים; Glabridin; השפעה סינרגיסטית; אנטי-מלנוגנזה; נוגד חמצון; אנטי דלקתית; חומרי גלם תרופות

 

 

 

CISTANCHEDeserticola לחלץ עםברמה גבוההגליקוזידים פנילנואידים להלבנת עור

WhatsApp אותנו לפרטים נוספים

 

קטע ניסיוני

1.1 חומרים, ריאגנטים ומכשירים

תאי מלנומה של עכברB16F10 (קטלוג מס ': STCC20013G -1), Wuhan ServiceBio Technology Co., Ltd.

קרטינוציטים מונצחים אנושייםHACAT (קטלוג מס ': ICELL-H066), ICELL BIOSCIENCE Inc., שנחאי, סין.

Cistanche phenylethanoid glycosides (phgs)וכןGlabridin (GLA), Shaanxi Tianxingjian Biological Technology Technology Co., Ltd.

טירוזינאז, Hefei BASF Biotechnology Co., Ltd.

Arbutin (ARB)וכןL-tyrosine, Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., שנחאי, סין.

1, 1- diphenyl -2- picrylhydrazyl (dpph), Tokyo Chemical Co. Co., יפן.

2,2′-Azino-bis (3- ethylbenzothiazoline -6- חומצה סולפונית) מלח דיאמוניום (ABTS), שנחאי יואניה ביו-טכנולוגיה ושות 'בע"מ.

חומצה אסקורבית (VC), מפעל המגיבים הכימיים של טיאנג'ין דמאו.

אשלגן פרסולפטוכןאתנול נטול מים, Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd.

נתרן הידרוקסיד, Chengdu Huayi Pharmaceutical Manufacturing Co., Ltd.

Dipotassium phosphate, שנחאי Sanpu Chemical Co., בע"מ.

L-DOPA, שנחאי יואניה ביו-טכנולוגיה ושות 'בע"מ.

ערכת ספירת תאים -8 (CCK8), Beijing Sinoinvitrogen Biotechnology Co., Ltd.

Triton x -100, דימתיל סולפוקסיד (DMSO), 2,2′-AZOBIS (2- Methylpropionamidine) dihydrochloride (aaph), וליפופוליסכריד (LPS), בייג'ינג סולארביו מדע וטכנולוגיה ושות 'בע"מ.

DMEM מדיום גלוקוז גבוה, Thermo Fisher Scientific (סין).

סרום שור עוברי (FBS), Sigma-Aldrich (שנחאי) Trading Co., Ltd.

תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, שנחאי דשייר ביו-טכנולוגיה ושות 'בע"מ.

אנושי IL -6 ערכת ELISA, ערכת TNF- ELISA אנושית, וערכת אליסה חתול אנושי, Wuhan Fine Biotech Co. בע"מ.

ערכת בדיקה סה"כ סופר -אוקסיד (SOD), מכון הנדסה ביולוגית של נאנג'ינג ג'יאנצ'נג. כל הריאגנטים היו בדרגה אנליטית.

מכשירים המשמשים:

Multiskan FC קורא מיקרו-פלייט אורך גל מלאוכןחממת הרקל 371 CO2, Thermo Fisher Scientific, ארה"ב.

Kq -200 vdb מנקה קולי, Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.

DVKW-D -2 אמבט מים תרמוסטטי דיגיטלי, בייג'ינג יונגגנגמינג מפעל למכשירים רפואיים.

DHG -9246 תנור ייבוש פיצוץ תרמוסטטי חשמלי, שנגחאי ג'ינג'ונג ציוד ניסוי ושות 'בע"מ.

KN4006B מכשיר קרינה אולטרה סגול UVB(עוצמת הקרנה: 8 מגה -וואט/ס"מ²), Xuzhou Kenuo ציוד מכשירים רפואיים ושות 'בע"מ.

1.2 שיטות

ראשית, PHGS ו- GLA מומסו במי מלח עם חצץ פוספט (PBS, pH =6. 8) או 50% תמיסת אתנול להכנת פתרונות עם ריכוזי המונים של{{0}}. 0 0 1, 0. {{1 0}} 05, 0.025, 0.1, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, ו- 2.0 g/lו ואז, PHGS ו- GLA היו מעורבבים ביחס שלm (phgs): m (gla)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, ו- 1:40, כדי להכין פתרונות PHGS/GLA עם ריכוז המוני כולל של0.4 g/L, מתויג כPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), בהתאמה.

 

1.3 ניסויים ביוכימיים

1.3.1 בדיקת עיכוב פעילות טירוזינאז

בצלחת באר 96-,50 μl של תמיסת מדגם הבדיקה, 50 μl של PBS (pH =6. 8), ו50 μl של תמיסת L-tyrosine (1 גרם/L)נוספו ברצף. הצלחת הודגרה באמבט מים של 37 מעלות למשך 10 דקות. אָז,5 0 μl של תמיסת טירוזינאז (0.4 גרם לליטר, שווה ערך ל 200 u/ml)נוספה והצלחת הודגרה שוב באמבטיית המים של 37 מעלות למשך 10 דקות נוספות.

Arbutin (ARB)שימש כבקרה החיובית, וPBS (pH =6. 8)שימש כבקרה הריקה.

ספיגת הפיתרון ב490 ננומטרנמדד באמצעות קורא מיקרו -פלטות, ושיעור העיכוב של טירוזינאז חוץ -גופני (%) חושב באמצעות משוואה (1).

 

 

בנוסחה:

תגובה _הוא ספיגת תמיסת הדגימה המכילה תמיסת L-tyrosine, PBS ותמיסת טירוזינאז.

בקרת תגובה _הוא ספיגת תמיסת הדגימה המכילה תמיסת L-tyrosine ו- PBS ללא תמיסת טירוזינאז.

A _ ריקהוא ספיגת הפתרון המכיל תמיסת L-tyrosine, PBS ותמיסת טירוזינאז ללא המדגם.

A _ שליטה ריקההוא ספיגת הפיתרון המכיל תמיסת L-tyrosine ו- PBS ללא תמיסת הדגימה והטירוזינאז.

1.3.2 קביעת פעילות ניקוי רדיקלית ללא DPPH

ראשית, {{0}}. 0197 גרם (0.05 מ"מ) של DPPH נשקלו במדויק והומס ב -250 מ"ל אתנול נטול מים כדי להכין פיתרון עובד DPPH עם ריכוז של0. 2 mmol/l.

ואז, PHGS ו- GLA מומסו באתנול של 50% כדי להכין פתרונות אתנול של PHGs ו- GLA עם ריכוזי המונים של{{0}}. 0 0 1, 0. 0 1, 0.1, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6 ו- 2.0 גרם/Lו פתרונות אתנול של VC הוכנו באותה צורה.

בהמשך, פתרונות האתנול של PHGs ו- GLA היו מעורבים ביחס שלM (פתרון PHGS): M (פתרון GLA)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40להשיג 9 פתרונות אתנול של PHGS/GLA עם יחסי המונים שונים, המתויגים כ-PHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40).

לְבָסוֹף,100 μl מכל תמיסת מדגםוכן100 μl של פתרון העבודה של DPPHנוספו לצלחת באר {0}}, מעורבת באופן שווה, ודגרה בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות. הספיגה ב517 ננומטרנמדד באמצעות קורא מיקרו -פלייט. VC שימש כבקרה החיובית, וכל ניסוי חזר על עצמו שלוש פעמים.

שיעור ההילוך הרדיקלי החופשי של DPPH (%) חושב באמצעות משוואה (2).

 

בנוסחה:

A1הוא הספיגה של פתרון הדגימה + פתרון עבודה של DPPH.

A2הוא הספיגה של 50% אתנול + DPPH פתרון עבודה.

A3הוא ספיגת פתרון הדגימה + 50% אתנול.

 

1.3.3 קביעת ABTS⁺ פעילות ניקוי רדיקלית חופשית

רֵאשִׁית,1 גרם (1.82 מ"מול) של ABTמומס במים מיובשים להכנת תמיסת עבודה של ABTS עם ריכוז סופי של7.4 מ"מ/ל. 0. 5 גרם של אשלגן פרסולפטמומס במים מיונים כדי להכין תמיסת עבודה של אשלגן עם אשלגן עם ריכוז סופי של2.6 מ"מ/לו נפחים שווים של תמיסת העבודה של ABTS ופתרון עבודה של אשלגן פרסולפט היו מעורבים והורשו להגיב בחושך למשך 12 שעות כדי להכין את פיתרון העבודה של ABTS⁺.

לאחר מכן, פתרונות אתנול של PHGS, GLA ו- VC, כמו גם פתרונות אתנול PHGS/GLA עם יחסיPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), הוכנו על פי השיטה המתוארת בסעיף 1.3.2.

לְבָסוֹף,40 μl מכל תמיסת מדגםוכן160 μL של פתרון העבודה ABTS⁺נוספו לצלחת באר {0}}, מעורבת באופן שווה, והגיבה בחושך בטמפרטורת החדר למשך 6 דקות. ספיגת הפיתרון ב734 ננומטרנמדד באמצעות קורא מיקרו -פלייט.

שיעור ההילוך הרדיקלי החופשי של ABTS⁺ חושב באמצעות משוואה (3).

 

 

בנוסחה:

A1הוא ספיגת פתרון הדגימה + ABTS⁺ פתרון עבודה.

A2הוא ספיגת מים מיובשים + ABTS⁺ פתרון עבודה.

A3הוא ספיגת תמיסת הדגימה + מים מיוניזים.

1.4 ניסויים בתאים

1.4.1 תרבית תאים

לאחר החייאת תאי B16F10 ו- HACAT, הם נזרעו למדיום DMEM גלוקוז גבוה (המכיל 10% סרום שור עוברי ותמיסת 1% פניצילין-סטרפטומיצין) ותרבותם בכתובת37 תואר, 5% CO2, ולחות של 70%בחממה במשך 24 שעות. מצב צמיחת התאים נצפה תחת מיקרוסקופ, ושינויים בינוניים או מעבר בוצעו לפי הצורך על סמך מצב צמיחת התא.

1.4.2 קיבוץ ניסיוני

תאי Logrithmic-Phase B16F10 ותאי HACAT נזרעו לצלחות באר 96- בצפיפות תאים מתאימה וטופחו למשך 24 שעות כדי לאפשר דבקות בתאים. פתרונות לדוגמא עם ריכוזים שונים הוכנו באמצעות Medium dmem.

קבוצות הניסוי היו כדלקמן:

קבוצה רגילה

קבוצת מודלים

קבוצת PHGS במינון נמוך(125 א '/מ"ל)

קבוצת מינון בינוני של PHGS(250 ug/ml)

קבוצת מינון גבוה של PHGS(500 אוג/מ"ל)

קבוצת מינון נמוך של GLA(6.25 ug/ml)

קבוצת מינון בינוני של GLA(12.5 א.ג./מ"ל)

קבוצת מינון גבוה של GLA(25 ug/ml)

קבוצת PHGS/GLA (1: 1)(25 ug/ml)

קבוצת PHGS/GLA (5: 1)

קבוצת PHGS/GLA (10: 1)

עבורמודל פיגמנטציה הנגרם על ידי UVB בתאי B16F10, תאי קבוצת המודל טופלו בהם30 μl של PBS (pH =7. 4)ומוקרן תחת מכשיר קרינה אולטרה סגול UVB3 ס"מ מתחת למכשירעֲבוּר110 שניותו קבוצות הניסוי טופלו מראש100 μl של פתרונות מדגם שוניםלמשך שעה לפני הוספת30 μl של PBSוהקרנה מתחת למכשיר ה- UVB למשך 110 שניות. הקבוצה הרגילה טופלה ברציפות במדיום DMEM גלוקוז גבוה, והקבוצה הריקה לא הכילה תאים אך הוחלפה בכמות שווה של מדיום.

עבורמודל דלקת הנגרם על ידי LPS בתאי HACAT, קבוצת הדגם טופלה בה20 ug/ml LPS PBS פתרוןלמשך 24 שעות. קבוצות הניסוי טופלו מראש100 μl של פתרונות מדגם שוניםלמשך 24 שעות לפני הוספתפתרון 20 ug/ml LPSעוד 24 שעות. הקבוצה הרגילה טופלה ברציפות במדיום DMEM גלוקוז גבוה, והקבוצה הריקה לא הכילה תאים אך הוחלפה בכמות שווה של מדיום.

עבורמודל לחץ חמצוני הנגרם על ידי AAPH בתאי HACAT, קבוצת הדגם טופלה בהפתרון AAPH של 25 מ"מ/ל 'למשך 24 שעות. קבוצות הניסוי טופלו מראש100 μl של פתרונות מדגם שוניםלמשך 24 שעות לפני הוספתפתרון AAPH של 25 מ"מ/ל 'עוד 24 שעות. הקבוצה הרגילה טופלה ברציפות במדיום DMEM גלוקוז גבוה, והקבוצה הריקה לא הכילה תאים אך הוחלפה בכמות שווה של מדיום.

כל קבוצה הוקמה עם3 בארות משוכפלותותרבותי ב37 תואר, 5% CO2, ולחות של 70%בחממה.

1.4.3 בדיקת ציטוטוקסיות

הציטוטוקסיות נמדדה באמצעותשיטת CCK8ו תאי Logrithmic-Phase B16F10 ותאי HACAT עוכלו עם0. 25% טריפסיןלמשך 3 דקות. לאחר הופסק העיכול עם המדיום, התאים הוטלו שוב ושוב כדי להכין השעיית תאים עם צפיפות של1 × 10⁴ תאים/מ"לו התאים נזרעו באופן שווה ל 96- צלחות היטב100 μl לבאר, ו- PBS התווסף לבארות ההיקפיות. לאחר דבקות בתאים נוספו ריכוזים שונים של פתרונות מדגם, עם3 משכפלים בארות בקבוצה, והתאים טופחו ב37 תואר, 5% CO2, ולחות של 70%עֲבוּר24, 48 ו- 72 שעותלפני השלכת המדיום.

לכל הקבוצות,100 μl של מדיום גלוקוז גבוה של CCK8 DMEM (המכיל 10% CCK8)נוספה והודגרה עבור60 דקותו ספיגת הפיתרון ב450 ננומטרנמדד באמצעות קורא מיקרו -פלייט.

כדאיות התא (%) חושבה באמצעות משוואה (4).

 

בנוסחה:

טיפול _ מטופלהוא ספיגת התאים המכילים היטב, תמיסת CCK8 ותמיסת הדגימה.

A _ ריקהוא ספיגת הפתרון המכיל הבאר המכירה את הפתרון CCK8 אך ללא תאים.

A0הוא ספיגת התאים המכילים היטב ותמיסת CCK8 אך ללא תמיסת הדגימה.

1.4.4 בדיקת פעילות טירוזינאז

שיטת L-DOPA שימשה למדידת פעילות טירוזינאז. לאחר טיפול בתאים עבור48 שעותכמתואר בסעיף 1.4.2, הסופר -נפט הושלך, והבארות נשטפו פעמיים עם PBS (ph =7. 4). אָז,50 μl של 1% Triton x -100 פתרוןנוסף לכל באר ומיד הונח במקפיא של –80 מעלות עבור30 דקותו התאים הופשרו בטמפרטורת החדר כדי לגרום לתמוגה.

לאחר התחממות מראש37 תוארעֲבוּר5 דקות, 10 μL של תמיסת 10 מ"מ/L-L-DOPAהתווסף לכל באר ודגור37 מעלות, 5% CO2 ו- 70% לחותעֲבוּרשעה אחתו הספיגה ב475 ננומטרנמדד באמצעות קורא מיקרו -פלייט. כל ניסוי חזר על עצמושלוש פעמיםופעילות הטירוזינאז (%) חושבה באמצעות משוואה (5).

בנוסחה:

ניסוי _הוא ספיגת התאים המכילים היטב ותמיסת הדגימה תחת הקרנת UVB.

A _ נורמליהיא ספיגת התאים המכילים היטב ותמיסת הדגימה ללא הקרנת UVB.

A _ ריקהוא ספיגת המדיום המכיל הבאר אך ללא תאים.

 

1.4.5 מדידת תוכן מלנין

שיטת הליזה של NaOH שימשה למדידת תוכן מלנין. לאחר טיפול בתאים עבור72 שעותכמתואר בסעיף 1.4.2, הסופר -נפט הושלך והבארות נשטפו פעמיים עם PBS.100 μl של תמיסה מימית NaOH המכילה 10% DMSO (1 mol/L)התווסף לכל באר, והצלחת הונחה בתנור 90 מעלותעֲבוּרשעה אחתו הספיגה ב490 ננומטרנמדד באמצעות קורא מיקרו -פלייט. כל ניסוי חזר על עצמושלוש פעמיםותכולת המלנין (%) חושבה באמצעות משוואה (5).

 

1.5 מדידת גורמים דלקתיים ומדדי לחץ חמצוני

לאחר טיפול בתאים עבור48 שעותכמתואר בסעיף 1.4.2,תאי חקטמכל קבוצה נאספה באמצעות מגרד תאים, צנטריפוג, והסופר -נפט נאסף. ריכוזי IL -6 ו- TNF- נמדדו על פי הוראות ערכות ELISA.

לאחר טיפול בתאים עבור48 שעות, תאי HACAT נאספו באמצעות מגרד תאים, היו נתונים למחזורי הפשרה קפואים חוזרים ונשנים כדי לגרום לתמוגה של תאים, וצנטריפוג12, 000 סל"ד למשך 10 דקות ב -4 מעלותו הסופר -נפט נאסף ופעילותם שלטִפֵּשׁוריכוזים שלחָתוּלנמדדו באמצעות הוראות ערכת ELISA.

 

1.6 מדידת אינדקס שילוב

THEשיטת אינדקס שילוב (CI)[20] שימש כדי להעריך האם השילוב של PHGS ו- GLA ביחס מסה שונה הציג השפעות סינרגיסטיות בעיכוב פעילות טירוזינאז ואנטי -חמצון. מדד השילוב חושב באמצעות משוואה (6).

 

בנוסחה:

D1וכןD2מייצגים את הריכוזים המתאימים (G/L) של שתי התרופות בטיפול המשולב הדרוש להשגהפעילות x%.

DXמייצג את הריכוז (g/l) של כל חומר בודד כאשר משתמשים בו לבד כדי להשיגפעילות x%.

THEתוכנת Compusynשימש לחישובים:

CI> 1מציין השפעה אנטגוניסטית.

Ci=1מציין אפקט תוסף.

Ci <1מציין השפעה סינרגיסטית.

 

1.7 ניתוח נתונים

כל הנתונים באו לידי ביטוי כ"ממוצע ± סטיית תקן (x̄ ± S)", והדיונים התבססו על הערכים הממוצעים.

ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעותPRISM GRAPHPAD 9.5. 0ו ANOVA חד כיווני (ניתוח שונות) שימש להשוואה בין קבוצות מרובות. אP-value <0. 05נחשב למובהק סטטיסטית.