תַקצִיר

רקע: הכליה היא איבר מורכב ביותר עם תפקודים מרובים החיוניים לבריאות. מחלת כליות מתרחשת כאשר הכליות נפגעות ואינן מתפקדות כראוי. ניתוח תא בודד הוא טכניקה רבת עוצמה המספקת תובנה חסרת תקדים לגבי סוגי תאי כליה תקינים וחריגים ותשנה את ההבנה שלנו לגבי המנגנונים של מחלות כליה נפוצות.

סיכום: הבנתנו את הפתוגנזה של מחלת כליות מוגבלת על ידי אפיון מולקולרי לא שלם של סוגי התאים האחראים לתפקוד הכליות. היישום של טכנולוגיה חד-תאית בחקר הכליות חשף הטרוגניות תאית, פרופילי ביטוי גנים ודינמיקה מולקולרית בהתפתחות והתקדמות של מחלת כליות. ניתוח תא בודד של רקמות אורגנואידיות וכליות שתל סיפק תובנות חדשות לגבי אורגנוגנזה כלייתית, מנגנוני מחלה ותוצאות טיפוליות. בסך הכל, הבנה טובה יותר של ההטרוגניות של תאי הכליה והדינמיקה המולקולרית של מחלת כליות תשפר את דיוק האבחון ותעזור לזהות אסטרטגיות טיפוליות חדשות בנפרולוגיה.

מסר מפתח: במאמר סקירה זה, אנו מסכמים מחקר חד-תא עדכני על מחלת כליות ודנים בהשפעה של טכנולוגיה חד-תאית על מחקר כליות בסיסי וקליני.

מילות מפתח

טכנולוגיית תא בודד; מחלת כליות; תא חיסון; אורגנואיד של הכליה; אלוגרפט;יתרונות Cistanche.

מבוא

הכליות הן שני איברים בצורת שעועית האחראים על סינון פסולת, עודפי מים וזיהומים אחרים בדם וייצור שתן. הכליות גם מווסתות את רמות ה-pH, המלח והאשלגן ואת לחץ הדם; לשלוט בייצור של תאי דם אדומים; ולהפעיל צורה של ויטמין D שעוזר לגוף לספוג סידן. עד כה, כ-850 מיליון אנשים ברחבי העולם סובלים ממחלת כליות, כולל מחלת כליות כרונית (CKD), פגיעה חריפה בכליות, אי ספיקת כליות ומצבים רבים אחרים. מחלת כליות מתרחשת כאשר הכליות נפגעות ואינן מסוגלות לבצע את תפקידיהן. נזק יכול להיגרם על ידי סוכרת, לחץ דם גבוה ומגוון מצבים כרוניים (ארוכי טווח) אחרים. מחלת כליות יכולה להוביל לבעיות בריאות אחרות, כולל אוסטאופורוזיס, נזק עצבי, תת תזונה ומחלות לב. אסטרטגיות הטיפול הנוכחיות לחולים נשארות השתלות כליה או דיאליזה, שהן יקרות.

מגוון תאים בכליה, כולל תאים אפיתל, thylakoid, אנדותל ותאי עצב, כמו גם רשתות תאים חיסוניות, מקיימים אינטראקציה כדי לשמור על תפקוד כליות תקין. הבנה מעמיקה יותר של ההטרוגניות של כליות בריאות ושל התהליכים העומדים בבסיס מחלת כליות תחדד את ההגדרה הפנוטיפית המולקולרית וההיסטופתולוגית של הכליה ותתמוך בפיתוח סיווגי מחלות חדשים. טכנולוגיית תא בודד היא בעלת פוטנציאל יתרון בזיהוי תת-סוגים, מצבים ותדירות תאיים במהלך הופעתה והתקדמותה של מחלת כליות. בשנים האחרונות, עם ההתפתחות המהירה של טכנולוגיית ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) בעלת תפוקה גבוהה, נבנה אטלס סלולרי מקיף של הכליה הרגילה למחקר רפואת דיוק כליות. פרויקט רפואת הדיוק של הכליות (KPMP) פותח ברחבי העולם כדי להשיג ביופסיות של כליות אנושיות, ליצור אטלסים של רקמות כליות, להגדיר תת-אוכלוסיות של מחלות, ובסופו של דבר לזהות תאי מפתח, מסלולים ומטרות לטיפולים חדשים. בהתבסס על מערך התעתוק של תא בודד הקשור לכליות, החוקרים ניתחו גם את פרופילי ביטוי הגנים של ACE2, TMPRSS2 ו-SLC6A19 בתתי-סוגים של תאי כליה, דבר שהוא קריטי להבנת הפתוגנזה של וירוס קורונה תסמונת נשימתית חריפה 2. בסקירה זו, נתמקד ב(1) פיתוח ויישום של טכנולוגיה חד-תאית, (2) שימוש ב-scRNA-seq לחקר התפתחות והתקדמות של מחלות כליה, (3) מיפוי מולקולרי של תאי מערכת החיסון במחלות כליה, ( 4) היישום של scRNA-seq על איברים דמויי כליה, ו- (5) השימוש ב-scRNA-seq כדי לחקור לעומק השתלות כליות (איור 1).

לחץ כאן כדי לקבלההשפעות של Cistanche על הכליות

פיתוח ויישום של טכנולוגיית Transcriptomic חד-תאית

תא בודד הוא יחידת החיים הבסיסית. טכניקות ניתוח של תא בודד חוללו מהפכה ביכולת שלנו לזהות את הרכב התא, לעקוב אחר דינמיקה מולקולרית ולחשוף מנגנונים פתולוגיים. אנליזה מוקדמת של ביטוי גנים חד-תאיים גלובליים בוצעה באמצעות טכניקות microarray ו-qPCR. Tietjen et al. השתמשו במיקרו-מערכים חד-תאיים כדי לנטר את פרופילי הביטוי המולקולריים של נוירונים בודדים ותאי אבות וכדי להגדיר מסלולי איתות בשלבי התפתחות שונים. בנוסף, ניתוח ביטוי של תא בודד זיהה מספר תת-סוגי תאים מתפתחים שיש להם גנים חדשים של הלבלב, המספקים תובנות חדשות לגבי התפתחות הלבלב. כיתה זו פיתחה טכניקות qPCR חד-תאיות ויישמה אותן לחקר גנים רגולטוריים מרכזיים בפיתוח בלסטוציסט עכברים ובהתמיינות השושלת ההמטופואטית.

עם הופעת טכנולוגיות רצף הדור הבא, scRNA-seq הראתה יתרונות ברורים בהבחנה בין איזופורמים שונים, ביטוי אללי ותמלילים חדשים בתאים בודדים בעלות נמוכה יותר. בשנת 2009, Tang et al. דיווח על רצף ה-mRNA השלם של התעתיק הראשון של תא יחיד, המדגים את המורכבות של וריאנטים תעתיקים בביציות או ביציות של עכבר בודד. smart-seq was 2012 פותחה כדי לזהות תעתיקים באורך מלא בתאים בודדים, ועל ידי יישום זה על תאים נדירים, חוקרים זיהו סמנים ביולוגיים מועמדים לתאי גידול במחזור מלנומה. שנה לאחר מכן, הוצג Smart-seq2 עם תעתיק משופר לאחור, כיסוי קריאה, הטיה ודיוק. ההתפתחויות האחרונות ב-Smart-seq3 שיפרו מאוד את הרגישות שלו באיתור אלפי תמלול תא בודד ברזולוציה אללית ואיזופורמית. שלא כמו שיטות הגברה מבוססות PCR, CEL-seq לוכד תעתיקים יעילים של תא בודד על ידי הגברה ליניארית מרובה. מחקר באמצעות CEL-seq לחקר התפתחות עוברית מוקדמת של Cryptobacterium hidradenoma חשף את התוצאות הניתנות לשחזור והרגישות שלו ברזולוציה של תא בודד. הפלטפורמה האוטומטית הראשונה של scRNA-seq היא Fluidigm C1, המשתמשת במערכת מיקרופלואידית ללכידת תאים בודדים ב-96 או 384 תאים, ולאחר מכן תמוגה תאים, שעתוק הפוך והגברת PCR.

מאז 2015, מחקר תא בודד נכנס במלואו לעידן של תפוקה גבוהה, עלות נמוכה ואוטומציה עם הזמינות המתמשכת של Drop-seq, inDrop, 10× Genomics, Seq-well, Microwell-seq ו-SPLiTseq. Drop-seq ו-inDrop מפרידים תאים בודדים לטיפות בגודל ננוליטר ומערבבים אותם עם ברקוד ייחודי כדי לתייג כל תא. מצד שני, Cyto-seq, Seq-well ו-Microwell-seq מאפשרים רצף mRNA של תא בודד בתפוקה גבוהה על ידי לכידת תא וחרוז ברקוד במיקרו-באר. הקבוצה שלנו בנתה את אטלס תאי העכבר הראשון ונוף התא האנושי ברמת התא הבודד באמצעות Microwell-seq. לאחרונה, תפוקה גבוהה יותר ושיטות פשוטות יותר נקראות SPLiT-seq ו-sci-RNA-seq עבור scRNA-seq. שיטות אלה משתמשות בתא או בגרעין עצמו כתא התגובה לתאים המסומנים בברקוד באמצעות מספר סבבים של חלוקת הבריכה. כל התאים נתונים לאחר מכן להגברת cDNA PCR ורצף. Cao et al. השתמש ב-sci-RNA-seq3 כדי לנתח את התעתיקים של כ-2 מיליון תאים אורגניים של עכבר ו-4 מיליון תאים עובריים אנושיים, מה שמספק תצוגה גלובלית של תהליכי התפתחות יונקים. טכנולוגיות אחרות של תא בודד המכסות ניתוחים גנומיים, פרוטאומיים ואפיגנומיים שגשגו אף הן; עם זאת, הם מעבר לתחום של מאמר זה.

התרחשות והתקדמות של מחלת כליות

הכליה יכולה להיות מושפעת ממחלות נפוצות ורציניות רבות, כולל פגיעה כלייתית חריפה, גלומרולונפריטיס, זיהומים עולים (פיאלונפריטיס) וסרטן. בסך הכל, ההבנה שלנו לגבי הפתוגנזה של מחלת כליות מוגבלת על ידי אפיון מולקולרי לא שלם של סוגי התאים האחראים לתפקודים ספציפיים לאיברים. כדי לסגור את פער הידע הזה, הקבוצה שלנו ופארק וחב'. בנה אטלס תעתיק של כליית העכבר הבריאה באמצעות scRNA-seq. תת-הסוגים העיקריים של תאי אפיתל של יחידת הכליה כללו תאי פדונקל, תאי אפיתל צינוריים פרוקסימליים, טבעת הנלה, צינוריות דיסטליות ותאי צינור איסוף. המחקר זיהה סוג תאים נודדים חדש לאיסוף אוכלוסיות תאי צינוריות, המאשר ממצאים קודמים של המרה הדדית בין תאים משולבים ותאים עיקריים במחקרי scRNA-seq. בנוסף, Ransick et al. ניתח כליות בוגרות של זכר ונקבה ויצר אטלס אנטומי של אלמנטים של כליות עכבר ברמת תא בודד. הקבוצה שלנו ביצעה גם ניתוח Microwell-seq של רקמת כליות עוברית אנושית ובוגרת. בנוסף לתאי אפיתל, תאי אנדותל, תאי סטרומה ותאי חיסון בתוך הרקמה, זיהינו סוגי תאים סומטיים מסוג s שלא תוארו בעבר בכליה העוברית וסוג תאים נודדים חדש בכליה הבוגרת. פרופיל מולקולרי חד תאי של מערכת כלי הדם הכלייתית חשף פרופילי ביטוי מיוחדים של הנפרונים הבניינים וחשף את הפתוגנזה של מחלת כליות. יתר על כן, כל סוגי התאים הגלומרולריים זוהו מעכברים בריאים וממודלים שונים של מחלות על ידי ניתוח מקבצי תעתיקים חד-תאיים, וגנים חדשים הקשורים למחלה ומסלולי רגולציה זוהו במודלים של מחלות, כגון מסלול ההיפופוטם שהופעל בפודוציטים לאחר חיסון נפרוטוקסי. פציעה.

פיברוזיס כליות הוא סימן היכר של CKD ומשפיע על יותר מ-10 אחוזים מאוכלוסיית העולם. במודל דו-קיום הטרוגני של פיברוזיס בכליות, Kramann et al. השתמש ב-scRNA-seq כדי לאשר שמונוציטים תרמו חלק קטן מהמיופיברובלסטים, אך שרוב המיופיברובלסטים נגזרו מתאי מזנכימליים. לאחר מכן, Kuppe et al. [37] ניתח את התעתיק של כ-135,000 תאים מאבוביות פרוקסימליות ולא פרוקסימליות ואימת עוד יותר כי איזופורמים שונים של MSCs הם התורמים העיקריים לפיברוזיס כלייתי אנושי. יתר על כן, בניתוח השוואתי של מונוציטים כליות בריאים ופיברוטיים, זוהה גן ספציפי למיופיברובלסט, הומלוג קרטינוציטים עירומים 2 (NKD2), כמטרה טיפולית פוטנציאלית לפיברוזיס כלייתי אנושי. בהתבסס על 402 ביופסיות של כליה, פיברינוגן בשתן נחזה כסמן ביולוגי לא פולשני בחולים עם CKD.

Cistanche סטנדרטי

נפרופתיה סוכרתית (DN) מאופיינת בנזק בו-זמני לגלומרולי ולאינטרסטיטיום הצינורי. עם זאת, מעט יחסית ידוע על האופן שבו המצב והתדירות התאיים משתנים עם הופעת המחלה והתקדמות ביטוי הגנים. כדי להבהיר שינויים בביטוי הגנים של תאים גלומרולריים ב-DN של עכבר, Fu et al. ביצע ניתוח scRNA-seq וזיהה מספר סמנים פוטנציאליים חדשים של תאים גלומרולריים, כולל Magi2, Robo2, Ramp3 ו-Fabp4. בנפרופתיה סוכרתית (DKDs), הוויסות של מסלולים אנגיוגניים ונדידה משתנה בתאי האנדותל, בעוד שמסלולי ויסות יציבים בחלבון מועשרים מאוד בתאי thylakoid. בסך הכל, שינויים בדינמיקה המולקולרית של תאי אנדותל ותילקואידים יסייעו לזהות גורמים פתופיזיולוגיים חשובים התורמים להתקדמות ה-DN. Chung et al. תיאר את התעתיק החד-תא של גלומרולי במודל עכבר של סוכרת. ביטוי הגנים השתנה ב-thylakoid וב-podocytes של עכברי ob/ob בהשוואה לביקורות. מסלולי שגשוג נרשמו בתאי תילקואיד ומסלולים הקשורים למוות תאי הונגרו בפודוציטים, בהתאם לשינויים ביחסי מספר התאים. ניתוח מקיף של מערכי נתונים שפורסמו של DKD scRNA-seq זיהה 17 גנים מרכזיים, והעשיר את ההבנה שלנו לגבי המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הפתוגנזה של DKDs. בנוסף, ריצוף RNA חד-גרעיני (snRNA-seq) ללא משוא פנים של דגימות כליות סוכרתיות אנושיות שנשמרו בהקפאה הניב 23,980 תעתיקים משלוש דגימות ביקורת ושלוש דגימות DN מוקדמות. התוצאות הראו שינויים ספציפיים לסוג תא בביטוי הגנים המצביעים על הפרשת אשלגן מוגברת ב-DN אנושי. מחקר קודם שהשווה בין scRNA-seq לבין snRNA-seq בכליות עכברים בוגרים הראה שלאחרונים יש יכולת לכידה יעילה יותר. לדוגמה, פודוציטים גלומרולריים, תאי thylakoid ותאי אנדותל נלכדו על ידי snRNA-seq ולא על-ידי scRNA-seq. היישום של snRNA-seq ממזער את ההשפעות הפסאודו של עיכול אנזימטי וניתן לבצעו על דגימות קפואות, מה שצפוי להוביל ליישום רחב יותר להאצת חקר המנגנונים הפתולוגיים במחלות כליה שונות.

תעתיק תאי מדויק יכול לחשוף את מקורם של תאי גידול כליה ואת מסלולי התמלול התומכים בטרנספורמציה ממאירה. צעיר וחב'. הגדירו סוגי תאי כליה אנושיים נורמליים וסרטניים מתוך קטלוג של 72,501 תעתיקים חד-תאיים. על ידי זיהוי מתאמים תאיים תקינים ספציפיים של תאי סרטן הכליה (RCCs), מחקר סיפק הוכחה להשערה שתאי הגידול של ווילמס הם תאים עובריים חריגים וכי ייתכן ש-RCCs נובעים מתת-סוג לא ידוע של תאים צינוריים פרוקסימליים. לפיכך, scRNA-seq מספקת אסטרטגיה ניסיונית ניתנת להרחבה לאפיון תאי סרטן כליה אנושיים ברזולוציה מולקולרית תאית כמותית מדויקת.

אטלס מולקולרי של תאי חיסון במחלת כליות

תאי חיסון הם מרכיב בסיסי ברקמות אנושיות וממלאים תפקיד חשוב במטבוליזם פיזיולוגי ופתולוגי. אכן, היכולת של מערכת החיסון לזהות אותות פתוגניים או סכנה או תאים ממאירים היא קריטית. היישום של טכנולוגיה חד-תאית לחקר תאי מערכת החיסון הכלייתיים יש לו פוטנציאל להקל על הבנה טובה יותר של תפקידה של מערכת החיסון בפתוגנזה של כליות בריאות ומחלות, כמו גם לזהות אסטרטגיות טיפוליות חדשות. מאמצים אלה מתחילים למפות את הנוף החיסוני המורכב בתוך הכליה ולחשוף את הקשר בין תאי חיסון השוכנים ברקמות לבין שכניהם המופעלים הדדית.

בשנת 2018, היישום של scRNA-seq ברקמת כליה של עכבר סיפק נוף מקיף של תאי חיסון הכולל מקרופאגים תושבים, נויטרופילים, לימפוציטים B ו-T ותאי NK. שנה לאחר מכן, הוקם מחקר חסר תקדים בתאי יחיד של הארגון המרחבי-טמפורלי של תאי חיסון של כליה אנושית. רשתות של תאי חיסון מיאלואידים ולימפואידים תושבות רקמות זוהו בכליות העובר והבוגר, ומחקרים זיהו תוכניות שעתוק שנרכשו לאחר הלידה המקדמות הגנה מפני זיהום. בנוסף, ניבוי דיבור צולב בין תאי אפיתל כליות בוגרים ותאי חיסון לגייס מקרופאגים ונויטרופילים אנטיבקטריאליים לאזורים הרגישים ביותר של הכליה. בסך הכל, הנוף החיסוני המקיף של הכליה תורם לחקר מנגנונים פתוגניים וזיהוי מטרות טיפוליות במחלות כליה חיסוניות ומדבקות.

לופוס נפריטיס (LN) היא מחלה אוטואימונית שעלולה להיות קטלנית שהטיפולים הנוכחיים לה אינם יעילים ולעיתים רעילים. התהליכים המולקולריים והתאיים המובילים לנזק כלייתי וההטרוגניות של LN נותרו לא ברורים. scRNA-seq שימש על ידי Arazi et al. לזהות 21 תת-אוכלוסיות ספציפיות למחלה של תאי מיאלואיד, T, רוצח טבעי ותאי B בחולי LN. באופן דומה, Der et al. החיל scRNA-seq על רקמות ביופסיה של הכליות והעור מחולי LN. ציוני תגובת אינטרפרון מסוג I של תאי אפיתל צינורי דווחו כגבוהים יותר בחולי LN מאשר בביקורות בריאים. בנוסף, מאפיינים דלקתיים ופיברוטיים של תאים צינוריים היו קשורים לחוסר יעילות הטיפול. ב-DKD, ניתוח scRNA-seq הראה מספרים גבוהים משמעותית של תאי חיסון בגלומרולי סוכרתיים מאשר בביקורת. מחקרים אלה מצביעים על כך שפרופילי ביטוי הגנים של תאי מערכת החיסון בשתן, בעור ובכליות נמצאים בקורלציה גבוהה, מה שמצביע על כך שביופסיות שתן וביופסיות עור עשויות להיות מקור פוטנציאלי לסמנים אבחנתיים ופרוגנוסטיים למחלת כליות.

מחקרים אחרונים הוכיחו את תפקידם של תאי מערכת החיסון במודלים של מחלת כליות עם רזולוציה של תא בודד. מודלים של חסימה חד-צדדית של השופכה נמצאים בשימוש נרחב עבור פיברוזיס אינטרסטיציאלי כלייתי, שבו מקרופאגים ותאי דלקת חודרים לאינטרסטיטיום הכלייתי, מה שמוביל לשינויים ניכרים בהמודינמיקה הכלייתית ובמטבוליזם. scRNA-seq שימש במודלים הפיכים של חסימת השופכה החד-צדדית כדי לנתח את נוף התא המיאלואידי במהלך התקדמות הפיברוזיס ורגרסיה. Conway et al. גילה הטרוגניות בתאים מיאלואידים, עם שינויים דינמיים בפרופורציות היחסיות של תת-אוכלוסיות, מונוציטים מגוייסים בשלב מוקדם של הפציעה, Ccr2 פלוס מקרופאגים מצטברים מאוחר בפציעה, ומקבץ חדש של Mmp12 פלוס מקרופאגים ממלא תפקיד בתהליך התיקון. במחלות כליה ובהשתלות, פגיעת איסכמיה-פרפוזיה (IRI) קשורה לדלקת ולגיוס לויקוציטים. מודלים ניסיוניים של IRI שימשו להערכת התפקיד התפקודי של 2 קבוצות של תאים דמויי לימפה מולדים בכליה, והנתונים מצביעים על כך שלתאים אלו יש תפקודים מיותרים בפגיעה כלייתית. על ידי יישום scRNA-seq על מודל IRI של השתלת כליה, Kremann et al. מצא שחדירת CXCR5 בתוספת לויקוציטים לאחר מכן הביאה לרמות גבוהות של CXCL13 מערכתית. knRNA-seq הוחל גם על מודל עכבר IRI על ידי Kirita et al. לאפיין תגובות תאיות מפורטות לאחר פציעה ולזהות מצב תאי אבובתי פרוקסימלי פרו-דלקתי ופרו-פיברוטי. חומצת שתן, תוצר החמצון הסופי של חילוף החומרים בפורין, קשורה קשר הדוק לדלקת כלייתית במספר מודלים של מחלות. לדוגמה, NLRP3 (תחום מבני המכיל NOD, LRR ו-pyrin 3) חש באותות של עודף חומצת שתן, ושלפוחיות דלקתיות מופעלות בנפרופתיה היפר-אוריצמית. עם זאת, המנגנונים החיסונים הספציפיים העומדים בבסיס פגיעה בכליות הנגרמת על ידי היפר-אוריצמיה אינם ידועים. בניית נוף גוף דלקתי ברמת תא בודד במודל של פגיעה בכליות הנגרמת על ידי היפר-אוריצמיה צפויה להתממש בעתיד הקרוב.

הסתננות חיסונית קיימת בתוך גידולי כליה ומושפעת מהמיקרו-סביבה של הגידול. מחקר קודם הראה שאוכלוסיות מקרופאגים חודרות גידול מבטאות גורם גדילה אנדותל וסקולרי A ומעורבות במסלול האיתות המורכב של VEGF ברקמת RCC. המחקר הנוכחי מדגים ש-scRNA-seq יכול לתת מענה לגידולים ולזהות מנגנונים פתופיזיולוגיים משוערים ורשתות איתות סלולריות שעשויות לשמש מטרות לטיפול תרופתי. בסך הכל, המחקר מדגיש התקדמות ב- scRNAseq המספקת תובנות לגבי מערכת החיסון והרשתות הסלולריות הפועלות בכליות בריאות וחולות.

ציסטאנצ'י צמחים

יישום של scRNA-seq לאורגנואידים בכליות

בנוסף לחקר רקמות כליות חולות, אורגנואידים כלייתי הפכו לכלי מפתח לחקר אורגנוגנזה ומנגנוני מחלות, ויש להם פוטנציאל להאיץ את התפתחות הטיפולים כמקור לרקמות חלופיות. במקביל, התקדמות ב-scRNA-seq הובילה לניתוח מפורט יותר של תת-אוכלוסיות תאיות שונות ושינויים בביטוי גנים באיברים דמויי כליה.

בסך הכל, יש צורך בהבנה טובה יותר של התפתחות עוברית כליה ברמת תא בודד כדי להנחות את הבשלת איברים דמויי כליה. מחקרים של תעתיקי תאי בודדים של כליית העובר האנושית זיהו 22 סוגי תאים וגנים מתאימים לסמן.

ההשוואה בין שלבי התפתחות שונים מראה את המשכיות הדינמיקה המולקולרית של תאי כף הרגל. ניתוח נוסף של תא בודד בוצע על כליה עוברית אנושית ואיברים דמויי כליה שמקורם בתאי גזע עובריים. ניתוח השוואתי של מסלולי התפתחות של תא בודד בכליה גילה פרופילי ביטוי גנים דומים in vivo ו-in vitro, למעט פודוציטים בשלב מאוחר, מה שמצביע על תהליך התבגרות לא שלם של איברים דמויי פודוקיטים. ניסויי השתלה מצביעים עוד על כך שניתן לייעל את לומן התילקואיד וכלי הדם באמצעות מודלים אורגנואידים. מחקר שנערך לאחרונה בשימוש בתאים דמויי ניצנים כלייתי אחוריים וניצנים לשופכה ליצירת אורגנואידים כלייתי הראה ש-scRNA-seq שיפר את הבשלת האבובות הפרוקסימלית והפחית אוכלוסיות תאים מחוץ למטרה. ניתוח scRNA-seq של תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSC) הנגזרים של אורגנואידים כלייתי בוצע על ידי Subramanian et al. ו- Wu et al. בהשוואה למערכי נתונים של כליה בודדת של עוברים ושל כליה בוגרים, האיברים השונים דמויי הכליה הראו סוגי תאים ניתנים לשחזור במידה רבה, אך עם פרופורציות תאים שונות בשל נוכחותם של תאים מחוץ למטרה. בנוסף, ניתוח רשת גורמי שעתוק חשף מסלולי התמיינות אורגנואידיים בכליות, המדגישים את כוחה של טכנולוגיית תא בודד באפיון והנחיית ההתמיינות האורגנואידית.

לסיכום, איברים דמויי כליות אנושיים הם משאב שימושי לכריית מודלים של מחלות, מנגנוני רגולציה פוטנציאליים, בדיקת תרופות בתפוקה גבוהה, ובסופו של דבר טיפולים רגנרטיביים. מחקרים אלו מדגישים את השימוש הפוטנציאלי של scRNA-seq במערכות מודל כליות כדי להבהיר תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים in vivo ולספק הדרכה למחקר עתידי באבחון וטיפול במחלות כליה.

תובנה לתוך Allografts של כליות על ידי scRNA-seq

השתלת כליה אלוגנית היא אחד הטיפולים הקליניים היעילים ביותר למחלת כליות סופנית. טכנולוגיה חד-תאית מציעה את ההזדמנות לאפיין בצורה מדויקת ומדויקת סוגי תאי כליה וסטטוס באמצעות דגימות ביופסיה אנושיות לאחר השתלה אלוגניית. הדו"ח הראשון שפורסם על דגימות ביופסיה של השתלת כליה ניתח 8746 תעתיקים חד-תאיים והגדיר תגובות דלקתיות ברורות. מונוציטים יצרו את קבוצת CD16 plus הלא-קלאסית ואת קבוצת CD16- הקלאסית; תאי אנדותל הציגו מצב מנוחה ו-2 מצבי דחייה בתיווך נוגדנים. ממצאים אלו תורמים להבנה טובה יותר של דחייה חיסונית בהשתלת כליה. במחקר השוואתי של מונוציטים כלייתיים ממקורות מקבל ותורם, דגימות ביופסיה של הכליה הראו ביטוי גנים תעתיק שונה באופן משמעותי. אצל המקבלים נצפו מקרופאגים המופעלים על ידי דלקת ותאי T המובעים בצורה ציטוטוקסית. באופן דומה, Liu et al. ניתחו תאים מדחיית השתלת כליה כרונית והתאימו כליות בוגרות בריאות ברמת תא בודד. ניתוח אשכולות ללא פיקוח גילה שמספר מוגבר של תאי חיסון ומיופיברובלסטים בקבוצת דחיית השתלות כליה כרוניות עשוי לתרום לדחיית כליות ולפיברוזיס. יש לציין, מחקר שנערך לאחרונה תיאר את האטלס החד-תאי הראשון של שתן מבוגרים וזיהה אוכלוסיות של SOX9 בתוספת תאי גזע/אבי כליות בשתן. תאי האב התרבו והתמיינו בהצלחה in vivo, רכשו חלק מהמאפיינים של תאים צינוריים ומספקים משאב שימושי פוטנציאלי לטיפול בהשתלות כליה עתידיות. בסך הכל, טכנולוגיית scRNA-seq מספקת תובנות חדשות ומלאות תובנות לגבי דחיית השתלת כליה אנושית, בסופו של דבר משפרת את דיוק האבחון ומאיצה את האימוץ של פרשנות ביופסיה מולקולרית.

תוספי Cistanche

סיכום

בעשור האחרון, scRNA-seq הפך לכלי הכרחי לניתוח ביטויי גנים דיפרנציאליים רחבי תעתיק ללימוד ביולוגיה פיזיולוגית וזיהוי הפרעות רגולטוריות מולקולריות במחלה. בניגוד לפנוטיפים בדידים מסורתיים, אפיון מולקולרי ברמת תא בודד יכול לספק סטנדרט שיטתי לאפיון פנוטיפים של מחלת כליות. היישום של טכנולוגיה חד-תאית ברקמת כליה בריאה או דגימות ביופסיה קליניות של כליה מספק אטלס מולקולרי מקיף של הכליה ומרחיב את ההבנה שלנו בנפרולוגיה. אטלס תא כליות יהווה חלק בלתי נפרד מהעבודה הבינלאומית של אטלס תא אנושי, שמטרתו לייצר מפת התייחסות מקיפה ושיטתית של גוף האדם. במחקרים עתידיים, ניתוח תפוקה אולטרה-גבוה של תא בודד וניתוחי תעתיקים מרחביים צפויים להרחיב את ההבנה שלנו לגבי הכליה. השילוב של נתוני מולטי-omics ישפר עוד יותר את האבחון והטיפול המותאם אישית של מחלות כליה.

הפניות

1. Kriz W, Bankir L. מינוח סטנדרטי למבנים של הכליה. ועדת הכליות של האיגוד הבינלאומי למדעי הפיזיולוגיה (IUPS). כליות אינט. 1988 ינואר; 33(1):1–7.

2. Kurts C, Panzer U, Anders HJ, Rees AJ. מערכת החיסון ומחלת כליות: מושגי יסוד והשלכות קליניות. Nat Rev Immunol. אוקטובר 2013;13(10):738–53.

3. Luyckx VA, Al-Aly Z, Bello AK, Bellorin Font E, Carlini RG, Fabian J, et al. יעדי פיתוח בר קיימא רלוונטיים לבריאות הכליות: עדכון על ההתקדמות. נט ר' נפרול. ינואר 2021;17(1):15–32.

4. Clark AR, Greka A. כוחו של אחד: התקדמות בגנומיקה של תא בודד בכליה. נט ר' נפרול. 2020 פברואר; 16(2):73–4.

5. Han X, Wang R, Zhou Y, Fei L, Sun H, Lai S, et al. מיפוי אטלס תאי העכבר על ידי microwell-seq. תָא. 2018 פברואר;172(5):1091–107.e17.

6. Park J, Shrestha R, Qiu C, Kondo A, Huang S, Werth M, et al. תעתוק תאי בודד של כליית העכבר חושפת מטרות תאיות פוטנציאליות למחלת כליות. מַדָע. 2018 מאי; 360(6390):758–63.

7. Hochane M, van den Berg PR, Fan X, Bérenger-Currias N, Adegeest E, Bialecka M, et al. תעתוק תאי בודד חושפת את הדינמיקה של ביטוי גנים של התפתחות כליות עובר אנושיים. PLoS Biol. 2019 בפברואר; 17(2): e3000152.

8. Han X, Zhou Z, Fei L, Sun H, Wang R, Chen Y, et al. בניית נוף תא אנושי ברמת תא בודד. טֶבַע. מאי 2020; 581(7808):303–9.

9. Liao J, Yu Z, Chen Y, Bao M, Zou C, Zhang H, et al. רצף RNA חד תאי של הכליה האנושית. Sci Data. ינואר 2020;7(1):4.

10. רפואה מדויקת בנפרולוגיה. נט ר' נפרול. 2020 Nov;16(11):615.

11. Chen QL, Li JQ, Xiang ZD, Lang Y, Guo GJ, Liu ZH. לוקליזציה של גנים הקשורים לקולטני התא של SARS-CoV-2 בכליה באמצעות ניתוח תעתיקי תאי בודד. כליות דיס. 2020 יולי;6(4):258–70.

12. Tietjen I, Rihel JM, Cao Y, Koentges G, Zakhary L, Dulac C. ניתוח שעתוק תאי יחיד של אבות עצבים. עֲצָבוֹן. 2003 אפריל;38(2):161–75.

13. חבר כנסת של צ'יאנג, מלטון DA. ניתוח תמלול תא בודד של התפתחות הלבלב. Dev Cell. 2003 Mar;4(3):383–93.

14. Guo G, Huss M, Tong GQ, Wang C, Li Sun L, Clarke ND, et al. פתרון החלטות גורל התא מתגלה על ידי ניתוח ביטוי גנים חד-תא מזיגוטה לבלסטוציסט. Dev Cell. 2010 אפריל;18(4):675–85.

15. Guo G, Luc S, Marco E, Lin TW, Peng C, Kerenyi MA, et al. מיפוי היררכיה סלולרית על ידי ניתוח תא בודד של רפרטואר פני התא. תא גזע של תא. אוקטובר 2013; 13(4):492– 505.

16. Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: כלי מהפכני עבור transcriptomics. נאט ר' ג'נט. 2009 ינואר;10(1):57–63.

17. Tang F, Barbacioru C, Wang Y, Nordman E, Lee C, Xu N, et al. ניתוח mRNA-Seq שלם-transcriptome של תא בודד. שיטות נאט. מאי 2009;6(5):377–82.

18. Ramsköld D, Luo S, Wang YC, Li R, Deng Q, Faridani OR, et al. mRNA-seq באורך מלא מרמות תא בודד של RNA ותאי גידול בודדים במחזור. Nat Biotechnol. 2012 אוגוסט;30(8):777–82.

19. Picelli S, Björklund ÅK, Faridani OR, Sagasser S, Winberg G, Sandberg R. Smart-seq2 עבור פרופיל תעתיק רגיש באורך מלא בתאים בודדים. שיטות נאט. 2013 Nov;10(11): 1096–8.

20. Hagemann-Jensen M, Ziegenhain C, Chen P, Ramsköld D, Hendriks GJ, Larsson AJM, et al. ספירת RNA חד-תא ברזולוציית אללים ואיזופורמים באמצעות Smart-seq3. Nat Biotechnol. 2020 יוני;38(6):708–14.

21. Hashimshony T, Wagner F, Sher N, Yanai I. CEL-seq:single-cell RNA-seq על ידי הגברה ליניארית מרובה. Cell Rep. 2012 Sep;2(3): 666–73.

22. Yanai I, Hashimshony T. CEL-seq2-ריצוף RNA חד-תא על ידי הגברה ליניארית מרובה. שיטות מול ביול. 2019;1979: 45–56.

23. Streets AM, Zhang X, Cao C, Pang Y, Wu X, Xiong L, et al. רצף תעתיק שלם של תא יחיד מיקרופלואידי. Proc Natl Acad Sci US A. 2014 May;111(19):7048–53.

24. קליין AM, Mazutis L, Akartuna I, Tallapragada N, Veres A, Li V, et al. ברקוד טיפה עבור תעתיק תא בודד המיושם על תאי גזע עובריים. תָא. מאי 2015;161(5): 1187–201.

25. Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M, et al. פרופיל ביטוי של תאים בודדים מקביל מאוד בכל רחבי הגנום באמצעות טיפות ננוליטר. תָא. מאי 2015;161(5):1202–14.

26. Fan HC, Fu GK, Fodor SP. פרופיל ביטוי. תיוג קומבינטורי של תאים בודדים לציטומטריית ביטוי גנים. מַדָע. 2015 פברואר; 347(6222):1258367.

27. Gierahn TM, Wadsworth MH, Hughes TK, Bryson BD, Butler A, Satija R, et al. Seq-well: רצף RNA נייד בעלות נמוכה של תאים בודדים בתפוקה גבוהה. שיטות נאט. 2017 אפריל;14(4):395–8.

28. Cao J, Packer JS, Ramani V, Cusanovich DA, Huynh C, Daza R, et al. פרופיל תעתוק מקיף של תא בודד של אורגניזם רב תאי. מַדָע. 2017 אוגוסט;357(6352): 661–7.

29. Rosenberg AB, Roco CM, Muscat RA, Kuchina A, Sample P, Yao Z, et al. פרופיל של תאים בודדים של מוח העכבר המתפתח וחוט השדרה עם ברקוד של בריכה מפוצלת. מַדָע. 2018 אפריל;360(6385):176–82.

30. Cao J, Spielmann M, Qiu X, Huang X, Ibrahim DM, Hill AJ, et al. נוף התעתיק החד-תא של אורגנוגנזה של יונקים. טֶבַע. 2019 פברואר;566(7745):496–502.

31. Cao J, O'Day DR, Pliner HA, Kingsley PD, Deng M, Daza RM, et al. אטלס תאים אנושיים של ביטוי גנים עובריים. מַדָע. 2020; 370(6518):370.

32. Chen L, Lee JW, Chou CL, Nair AV, Battistone MA, Păunescu TG, et al. תעתיקים של סוגי תאי צינור איסוף כליות מרכזיים בעכברים שזוהו על ידי RNA-seq חד-תא. Proc Natl Acad Sci US A. 2017 Nov;114(46): E9989–98.

33. Ransick A, Lindström NO, Liu J, Zhu Q, Guo JJ, Alvarado GF, et al. פרופיל תא בודד חושף מין, שושלת ומגוון אזורי בכליות העכבר. Dev Cell. 2019 Nov;51(3):399– 413.e7.

34. בארי DM, McMillan EA, Kunar B, Lis R, Zhang T, Lu T, et al. גורמים מולקולריים של התמחות כלי דם נפרוניים בכליה. נאט קומון. 2019 Dec;10(1):5705.

35. Chung JJ, Goldstein L, Chen YJ, Lee J, Webster JD, Roose-Girma M, et al. פרופיל תעתיק תאי יחיד של גלומרולוס הכליה מזהה סוגי תאים מרכזיים ותגובות לפציעה. J Am Soc Nephrol. אוקטובר 2020; 31(10): 2341–54.

36. Kramann R, Machado F, Wu H, Kusaba T, Hoeft K, Schneider RK, et al. פרביוזיס ורצף RNA חד-תא חושפים תרומה מוגבלת של מונוציטים למיופיברובלסטים בפיברוזיס בכליות. JCI Insight. מאי 2018;3(9): e99561.

37. Kuppe C, Ibrahim MM, Kranz J, Zhang X, Ziegler S, Perales-Patón J, et al. פענוח מקורות מיופיברובלסט בפיברוזיס של כליות אנושיות. טֶבַע. 2021 ינואר;589(7841):281–6.

38. Wang H, Zheng C, Lu Y, Jiang Q, Yin R, Zhu P, et al. פיברינוגן בשתן כמנבא להתקדמות של CKD. Clin J Am Soc Nephrol. דצמבר 2017; 12(12):1922–9.

39. Fu J, Akat KM, Sun Z, Zhang W, Schlondorff D, Liu Z, et al. פרופיל RNA חד-תא של תאים גלומרולריים מראה שינויים דינמיים במחלת כליות סוכרתית ניסיונית. J Am Soc Nephrol. 2019 אפריל;30(4):533–45.

40. Zhang Y, Li W, Zhou Y. זיהוי של גנים מרכזיים במחלת כליות סוכרתית באמצעות ניתוח מיקרו-מערכים מרובים. אן טרנסל מד. אוגוסט 2020;8(16):997.

41. Wilson PC, Wu H, Kirita Y, Uchimura K, Ledru N, Rennke HG, et al. הנוף התעתיק החד-תאי של נפרופתיה סוכרתית אנושית מוקדמת. Proc Natl Acad Sci US A. 2019 Sep;116(39):19619–25.

42. Wu H, Kirita Y, Donnelly EL, Humphreys BD. יתרונות של גרעין בודד על פני רצף RNA חד-תא של הכליה הבוגרת: סוגי תאים נדירים ומצבי תאים חדשים שהתגלו בפיברוזיס. J Am Soc Nephrol. ינואר 2019;30(1):23–32.

43. Young MD, Mitchell TJ, Vieira Braga FA, Tran MGB, Stewart BJ, Ferdinand JR, et al. תעתיקים חד-תאיים מכליות אנושיות חושפים את הזהות התאית של גידולי כליה. מַדָע. 2018 אוגוסט;361(6402):594–9.

44. Stewart BJ, Ferdinand JR, Young MD, Mitchell TJ, Loudon KW, Riding AM, et al. אזור חיסון מרחבי-זמני של הכליה האנושית. מַדָע. 2019 Sep;365(6460):1461–6.

45. Arazi A, Rao DA, Berthier CC, Davidson A, Liu Y, Hoover PJ, et al. נוף תאי החיסון בכליות של חולים עם זאבת נפריטיס. נאט אימונול. 2019 יולי;20(7):902–14.

46. ​​Der E, Ranabothu S, Suryawanshi H, Akat KM, Clancy R, Morozov P, et al. רצף RNA חד-תא לנתח ההטרוגניות המולקולרית בזאבת נפריטיס. JCI Insight. מאי 2017;2(9):e93009.

47. Der E, Suryawanshi H, Morozov P, Kustagi M, Goilav B, Ranabothu S, et al. תעתיקי תאי צינוריים וקרטינוציטים חד-תאיים המיושמים על לופוס נפריטיס חושפים IFN מסוג I ומסלולים רלוונטיים לפיברוזיס. נאט אימונול. 2019 יולי;20(7):915–27.

48. Conway BR, O'Sullivan ED, Cairns C, O'Sullivan J, Simpson DJ, Salzano A, et al. אטלס חד-תאי של הכליה חושף הטרוגניות מיאלואידית בהתקדמות ובנסיגה של מחלת כליות. J Am Soc Nephrol. דצמבר 2020; 31(12):2833–54.

49. Cameron GJM, Cautivo KM, Loering S, Jiang SH, Deshpande AV, Foster PS, et al. תאים לימפואידים מולדים מקבוצה 2 מיותרים בפגיעת איסכמיה כלייתית-רפרפוזיה ניסיונית. אימונול קדמי. 2019;10:826.

50. Kreimann K, Jang MS, Rong S, Greite R, von Vietinghoff S, Schmitt R, et al. פציעת איסכמיה-פרפוזיה מעוררת שחרור CXCL13 וגיוס תאי B לאחר השתלת כליה אלוגני. אימונול קדמי. 2020;11:1204.

51. Kirita Y, Wu H, Uchimura K, Wilson PC, Humphreys BD. פרופיל תאים של פגיעה חריפה בכליות עכבר חושף תגובות סלולריות משומרות לפציעה. Proc Natl Acad Sci US A. 2020 Jul;117(27):15874–83.

52. Wen L, Yang H, Ma L, Fu P. התפקידים של מסלולי איתות בתיווך דלקת של NLRP3 בנפרופתיה היפר-אוריצמית. Mol Cell Biochem. 2021 Mar;476(3):1377–86.

53. Nishinakamura R. אורגנואידים של הכליה האנושית: התקדמות והאתגרים הנותרים. נט ר' נפרול. אוקטובר 2019; 15(10):613–24.

54. Tran T, Lindström NO, Ransick A, De Sena Brandine G, Guo Q, Kim AD, et al. מסלולי התפתחות ב-vivo של פודוקיטים אנושיים מודיעים על התמיינות במבחנה של פודוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים. Dev Cell. 2019 יולי;50(1):102–e6.

55. Uchimura K, Wu H, Yoshimura Y, Humphreys BD. אורגנואידי כליה שמקורם בתאי גזע אנושיים עם התבגרות משופרת של צינורות איסוף ומודלים לפציעה. Cell Rep. 2020 Dec;33(11):108514.

56. Subramanian A, Sidhom EH, Emani M, Vernon K, Sahakian N, Zhou Y, et al. מפקד תאים בודדים של אורגנואידים של כליה אנושית מראה יכולת שחזור וירידה בתאים מחוץ למטרה לאחר ההשתלה. נאט קומון. 2019 Nov;10(1):5462.

57. Wu H, Uchimura K, Donnelly EL, Kirita Y, Morris SA, Humphreys BD. ניתוח וחידוד השוואתי של התמיינות אורגנואידית של הכליה הנובעת מ-PSC אנושי עם תעתיקי תא בודד. תא גזע של תא. 2018 Dec;23(6):869–e8.

58. Czerniecki SM, Cruz NM, Harder JL, Menon R, Annis J, Otto EA, et al. סקר בתפוקה גבוהה משפר את ההתמיינות האורגנואידית של הכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ומאפשרת פנוטייפ רב מימדי אוטומטי. תא גזע של תא. 2018 יוני;22(6): 929–e4.

59. Dvela-Levitt M, Kost-Alimova M, Emani M, Kohnert E, Thompson R, Sidhom EH, et al. המולקולה הקטנה מתמקדת ב-TMED9 ומעודדת פירוק ליזוזומלי לפרוטאופתיה הפוכה. תָא. 2019 יולי;178(3):521–e23.

60. Wu H, Malone AF, Donnelly EL, Kirita Y, Uchimura K, Ramakrishnan SM, et al. תעתיקי תאי בודדים של דגימת ביופסיה של כליה אנושית מגדירה תגובה דלקתית מגוונת. J Am Soc Nephrol. 2018 אוגוסט;29(8):2069–80.

61. Malone AF, Wu H, Fronick C, Fulton R, Gaut JP, Humphreys BD. רתימת וריאציה של נוקלאוטידים בודדים וריצוף RNA חד-תא להגדרת כימריזם של תאים חיסוניים בהשתלת הכליה הדוחה. J Am Soc Nephrol. 2020 Sep;31(9):1977–86.

62. Liu Y, Hu J, Liu D, Zhou S, Liao J, Liao G, et al. ניתוח תא בודד חושף את הנוף החיסוני בכליות של חולים עם דחיית השתלה כרונית. תרנוסטיקה. 2020; 10(19):8851–62.

63. Wang Y, Zhao Y, Zhao Z, Li D, Nie H, Sun Y, et al. ניתוח RNA-Seq חד-תא זיהה תאי אבות כליה משתן אנושי. תא חלבון. 2021 אפריל;12(4):305–12.

64. Stark R, Grzelak M, Hadfield J. רצף RNA: שנות העשרה. נאט ר' ג'נט. 2019 Nov;20(11):631–56. 65 רגב א, טייכמן SA, Lander ES, עמית I, Benoist C, Birney E, et al. אטלס התא האנושי. אלייף. 2017;12:6.

מנגמנג ג'יאנג^a,b; היידה חן^{b, c}; גווג'י גואו^{a, b, c, d, e}

א: מעבדת ליאנגז'ו, המרכז הרפואי של אוניברסיטת ג'ג'יאנג, האנגג'ואו, סין;

ב: המרכז לרפואה של תאי גזע ורפואה מתחדשת, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ג'יאנג, האנגג'ואו, סין;

ג: מעבדת מפתח פרובינציאלית של Zhejiang להנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, ד"ר Li Dak Sum & Yip Yio Chin, המרכז לתאי גזע ורפואה רגנרטיבית, Hangzhou, סין;

ד: מרכז השתלות מח עצם, בית החולים הראשון, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ג'יאנג, האנגג'ואו, סין;

ה: המכון להמטולוגיה, אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג, האנגג'ואו, סין