מחקר של המנגנון הדומה לאסטרוגני של גליקוזידים של Cistanche באמצעות מטבולומי

מבוא

אסטרוגנים ממלאים תפקיד חשוב בתהליכים התפתחותיים, פיזיולוגיים וקשורים רבים, כולל התפתחות הרחם.1–3 עם זאת, לשימוש ארוך טווח באסטרוגן יכולות להיות תופעות לוואי רבות, כמו הגברת הסיכון לסרטן השד, סרטן רירית הרחם וגידולים גינקולוגיים אחרים.4,5 לכן, חוקרים התחייבו לחפש תחליפי אסטרוגן שיוכלו להימנע מתופעות הלוואי הללו, הידועות כמאפננים קולטן אסטרוגן סלקטיבי, שפיטואסטרוגנים מהווים קטגוריה חשובה.6 תרכובות פיטואסטרוגן מופיעות באופן טבעי בצמחים בעלי עוצמה אסטרוגנית ויכולות להיקשר לקולטני אסטרוגן כדי להפעיל את פעילותם. לכן, פיטואסטרוגנים יכולים לעורר את צמיחת הרחם על ידי שילוב עם קולטני האסטרוגן השופע ברחם, כלומר ניתן להשתמש במבחן הרחם להקרנה מקדימה והערכת פיטואסטרוגנים.

Cistanchedeserticola (CD), הידוע בשם Rou Cong-Rong בסין, יעיל לכאורה לתפקודי רבייה, התפתחות ופוריות, והוא שימש כחומר מחזק במשך יותר מ-1800 שנה.8,9 לאחרונה, מחקרים פרמקולוגיים הוכיחו כי זה לטוניק פונקציות רפואיות רחבות, כגוןויסות הורמונים, אפרינט, אימונומודולטורי, אנטי-אוקסידטיבי, אנטי-אפופטוטי, נוירו-פרוטקטיבי, אנטי-נוציספטיבי, אנטי-דלקתי, אנטי-עייפות ואסטרוגניות.10 גליקוזידים של ציסטאנצ'י (GCs) המופקים מ-CD הם בין המרכיבים הפעילים העיקריים ומפגינים פעילויות ביולוגיות שונות.11 למרות שהמרכיבים הפעילים של CD הובהרו בעבר,12 המנגנון הדומה לאסטרוגני של GCs מעולם לא נחקר.

סיטנשה טבעית למניעת אוסטאופורוזיס PHGS75% ECH 30% ACT 12%

במחקר מתמשך זה, מטרתנו לאשר את השימוש האפשרי ב-GCs כפיטואסטרוגנים ולבצע ניתוח מטבולומי כדי לחקור את המנגנון הדומה לאסטרוגני של GCs. ראשית, נעשה שימוש בבדיקה רחמית וניתוח היסטולוגי כדי לאשר את הפעילות האסטרוגנית של GCs. והכי חשוב, התמקדנו בשינויים המטבוליים בסרום ובשתן של חולדות באמצעות ניתוח מטבולומי מבוסס UPLC-MS/MS. בשל החסרים של מטבולומיקה לא ממוקדת, כגון חזרתיות והשפעה מסובכת של מטריקס, נעשה שימוש בשיטת פסאודו מבוססת מצב MRM לניטור ספציפי של המטבוליטים והמדדים (כולל חילוף חומרים אנרגטי, עקה חמצונית, חילוף חומרים שומנים ומטבוליזם אמינו) הקשורים להשפעות אסטרוגניות, צמיחה והתפתחות נבחרו כסמנים ביולוגיים לגילוי. התוצאות שלנו שופכות אור על המנגנון הדומה לאסטרוגני של GCs, שיסייע בפיתוח וניצול של GCs.

נִסיוֹנִי

ריאגנטים

L-Leucine, L-kynurenine, L-Tryptophan, 5-HTP, חומצה כולית, Nphenylacetylglycine, 5-HT, גלוטתיון (GSH) ו-2,4-dinitrophenylhydrazine ($99.{{ 8}}%, HPLC) נרכשו מ- Dalian Melone Biology Technology Co. (Dalian, סין). N-Ethylmaleimide ($98%, HPLC), L-Glutathione מחומצן (GSSG, $98%, HPLC) ו-1,1,3,3-tetraethoxypropane (TEP) נרכשו מסיגמא (מדריד, ספרד). L-Phenylalanine (Ring-D5, 98%, DLM-1258-5) נרכש ממעבדות האיזוטופים של קיימברידג' (MA, ארה"ב). מתנול ואצטוניטריל בדרגת MS נרכשו מ-ACS (יוסטון, ארה"ב). Diethylstilbestrol (טוהר, $99.0%), חומצה פורמית, חומצה קרחונית, והמטוקסילין ואאוזין (H&E) נרכשו מ-Sigma-Aldrich (Sigma Chemical Co., St. Louis, ארה"ב). Naringenin (טוהר, $98% (HPLC)) נרכש משנגחאי Jingchun Aladdin Reagent Co. (שנחאי, סין). GCs הוכנו במעבדה שלנו, והטוהר שלהם נקבע להיות 60% על ידי ספקטרופוטומטריה אולטרה סגולה תוך שימוש באקטאוזיד כסמן לקביעה.

הכנת GCs

בריי,אבקת cistanche(100 גרם) הושרו באתנול 75% (1000 מ"ל) למשך שעה אחת, ולאחר מכן חולץ מחדש למשך 2.5 שעות שלוש פעמים. הסופרנטנט רוכז תחת ואקום כדי להשיגתמצית cistanche(23.3 גרם). התמצית דוללה במים לריכוז של 0.5 גרם מ"ל- 1 (המסיסות נקבעה עם תרופה גולמית). לאחר ספיחה עם שרף מאקרו נקבובי AB-8 במשך 8 שעות, העמוד נחלץ ברצף עם מים ו-85% אתנול. חומר הניקוי של 85% אתנול רוכז לקבלת תמצית אתנול (8.4 גרם). תמצית אתנול (0.02 גרם) נשקללה במדויק והומסה ב-50% מתנול (10 מ"ל). מנה של 1 מ"ל מהתמיסה דולל ל-100 מ"ל עם מתנול בשאלון נפחי. לבסוף, התמיסה המדוללת נמדדה ב-330 ננומטר על ידי ספקטרופוטומטריה אולטרה סגולה. הספיגה האולטרה סגולה הייתה 0.341, והקשר הליניארי לאקטאוזיד על ידי UV היה y ¼ 24.905X + 0.0426 (R2 ¼ 0.9982). כאשר מכיל 5.04 גרם של GCs, שיעור הטיהור היה 60% (אקטאוזיד שימש כסמן לקביעת GC). הערכת טביעת אצבע של GCs מוצגת באיור ESI. S1.

ניסויים בבעלי חיים ואיסוף דגימות

חולדות SD נקבות של חוסר בגרות מינית (45-60 גרם) ובגרות מינית (320-380 גרם) סופקו על ידי מרכז החיות של האוניברסיטה הרפואית של חרבין, רישיון חיות מעבדה, SCXK- (צבא): 2013-001. החיות אוכסנו בתנאי מעבדה SPF וסופקו עם מי ברז סטנדרטיים שהשתנו בדיאטה מעבדתית באופן חופשי. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי ההנחיות לרווחת וטיפול בבעלי חיים במחוז Heilongjiang, ובוצעו על פי הנחיות המכון הלאומי לבריאות לגבי עקרונות הטיפול בבעלי חיים (2004). כל החולדות ששימשו בניסוי זה התאקלמו לסביבה הנ"ל במשך שבוע.

חולדות SD לא בוגרות מינית חולקו באופן אקראי לשלוש קבוצות של 10 חולדות: קבוצה ריקה, קבוצת diethylstilbestrol וקבוצת GC. בינתיים, 10 חולדות SD של בגרות מינית נבחרו כקבוצת הביקורת. קבוצת הדיאתילסטילבסטרול ניתנה עם דיאתילסטילבסטרול (0.35 מ"ג ק"ג- 1, 1 מ"ל/100 גרם), קבוצת ה-GC ניתנה עם תמיסת ה-GC (30 גרם ק"ג- 1, 1 מ"ל/100 גרם ), והקבוצה הריקה וקבוצת הביקורת קיבלו מים מזוקקים באותו נפח פעמיים ביום (בוקר וערב) במשך 3 ימים. ביום השלישי, החולדות שוכנו בכלובים מטבוליים לאחר המתן, ודגימות שתן נאספו ברציפות במשך 24 שעות. החולדות הורדמו באמצעות pentobarbital ודגימות דם התקבלו ונאספו מאבי העורקים הבטן ועברו צנטריפוגה ב-3000 × גרם (15 דקות, 4. C) כדי לקבל סרום. כל הדוגמאות אוחסנו ב-- 20. ג. יתר על כן, הרחם הופרד, נשקל ונבדק באמצעות 10% פורמלין.

ניתוח היסטולוגי

רקמות סדרתיות בעובי 5 מ"מ נחתכו מהרחם. קטעי הרקמה הוטבעו לאחר מכן בפרפין, נצבעו ב-H&E בשיטות שגרתיות, ונצפו במיקרוסקופ אופטי (BZ-9000; Keyence, אוסקה, יפן). גובה תאי אפיתל הרחם נמדד במיקרומטר מתחת למיקרוסקופ.

CISTANCHE TUBULOSA טבעי לקידום צמיחת חזה PHGS75% ECH 30% ACT 12%

מטבולומי

הכנת סרום מפושט פחם פעיל

סרום ריק מיוחד הוכן מסרום חולדות שהופשט מחומרים אנדוגניים באמצעות אבקת פחם פעיל. אבקת פחם פעיל (6 גרם) נוספה לסרום החולדות (100 מ"ל) שנוער במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר וצנטריפוגה ב-4 מעלות. C ו-13 500 סל"ד למשך 20 דקות. הסופרנטנט שונה באמצעות ממברנות Millipore express PES (Merck Millipore, Ltd.) המחוברות למזרק של 20 מ"ל ברצף הבא: 5 מ"מ, 1.2 מ"מ ו-0.45 מ"מ. הסרום ה"חסיר" אושר כי הוא נקי מסמנים ביולוגיים על ידי LC-MS/MS.

הכנת פתרונות סטנדרטיים

L-Tryptophan (Try), L-kynurenine (Kyn), GSSG, N-phenylacetylglycine (N-Phe), 5- HTP, L-leucine (Leu), 5-HT, וחומצה כולית ( CA) תמיסות מניות (1 מ"ג מ"ל- 1) ​​הוכנו באמצעות 100% מתנול. GSH הוכן ב-0.5 מ"ג מ"ל- 1 במאגר 10 מ"מ NEM PBS ונשמר ב-- 40. C בבקבוקים חומים. מכיילים נוצרו תוך שימוש בשילוב L-טריפטופן, L-kynurenine, GSSG, N-phenylacetylglycine, 5-HTP, L-leucine, 5-HT, חומצה כולית ו-GSH-NEM שדוללו באופן סדרתי עם מזוקק מים. תמיסת ה-IS של L-phenylalanine-d5 (d5-Phe) הוכנה ב-100% מתנול, ותמיסת העבודה של d5-Phe (10 ng mL- 1) הוכנה ב-100% מתנול ומאוחסן ב-- 40. ג.

במהלך הניתוח, שלב נגזרת היה הכרחי כדי למנוע פירוק GSH, מה ששיפר את היציבות לזיהוי וכימות של GSH. GSH נקבע לאחר תגובה עם NEM.15,16 לפי הדוח הקודם, 50 mM NEM נבחר עבור GSH.

הכנה לדוגמא

עבור דגימות סרום, נוספו 10 מ"ל NEM (200 מ"ל) לדגימה (200 מ"ל), ואחריה מתנול (1000 מ"ל המכילים IS Phe-d5 ב-10 ננוגרם מ"ל- 1), והודגרו במשך 20 דקות ב-{ {9}}. ג. לאחר צנטריפוגה ב-4.C ו-12 000 סל"ד למשך 10 דקות, הסופרנטנטים (1000 מ"ל) הועברו לצנטריטובות של 2 מ"ל והתאיידו ליובש. השאריות המיובשות שוחזרו במים מזוקקים (100 מ"ל) לאחר צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-4. C ו-13 500 סל"ד, ומנה של 10 מ"ל מהסופרנטנט הוזרק לניתוח.

עבור דגימות שתן, 100 מ"ל של דגימה הונחו בשפופרת של 2 מ"ל, ולכל דגימת שתן נוספה נפח אחד של PBS (m/v) המכיל 50 מ"מ NEM. לאחר מכן, נוספו מתנול (1000 מ"ל המכיל IS ב-10 ננוגרם מ"ל- 1), והדגימה הודגרה ב-- 20. C למשך 20 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-12 000 סל"ד למשך 10 דקות ב-4 . ג. הסופרנטנט (1000 מ"ל) התאדה ליובש תחת זרם עדין של חנקן בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הומס השאריות ב-60 מ"ל של פאזה ניידת וסובב במשך דקה אחת לפני צנטריפוגה ב-13 500 סל"ד ו-4 . C למשך 15 דקות. סופרנטנט של 10 מ"ל הוזרק לניתוח.

אימות מתודולוגיה

אימות המבחן בוצע על פי "הנחיות לתעשייה: אימות שיטה ביואנליטית" (מנהל המזון והתרופות, ספטמבר 2013). המכיילים נוצרו באמצעות מטריצת פונדקאית עבור Trp, Kyn, GSH, GSSG, 5-HT, 5-HTP, N-Phe ו-CA מפתרונות עבודה סטנדרטיים בסרום ה"מופשט". כל מכייל ריכוז שוכפל. העקומה הסטנדרטית חושבה על ידי רגרסיה ליניארית של 1/X משוקלל של ריבועים קטנים של ריכוזי כיול עקומה סטנדרטית ויחסי שטח השיא של האנליט ל-IS.

בדיקת דיוק ודיוק

דיוק המבחן של דגימות QC מאוחדות ודגימות QC בסרום/שתן של חולדות שלא טופלו הוערכו באמצעות ריצה אנליטית אחת תוך יום ושלוש ריצות בין ימים. דגימות QC עם שלושה ריכוזים שונים נוצרו על ידי הוספת L-טריפטופן, L-kynurenine, GSSG, N-phenylacetylglycine, 5-HTP, L-leucine, 5-HT, חומצה כולית ו-GSH-NEM פתרונות סטנדרטיים לסרום/PBS "מופשט", שעובדו לאחר מכן באותו אופן כמו דגימות in vivo. Try, Kyn, GSSG, N-Phe, 5-HTP, 5-HT, Leu ו-CA פתרונות סטנדרטיים (1 מ"ג מ"ל- 1) הוכנו ב-10 0% מתנול, מלבד זה של GSH, שהוכן ב-0.5 מ"ג מ"ל - 1 במאגר 10 מ"מ NEM PBS. עקומות סטנדרטיות בשמונה ריכוזים שונים נוצרו באותו אופן כמו דגימות QC, ונותחו על ידי רגרסיה לינארית של 1/X משוקלל של הריבועים הקטנים ביותר. עבור מחקר אימות השיטה, שיטת QC נוספת בוצעה בו-זמנית תוך שימוש בסרום/שתן מאוחד (50 מ"ל) מכל דגימה של קבוצת הביקורת או המודל להשגת דגימת QC ולאחר מכן עובדה כמו דגימות in vivo. סדרה של דגימות QC ועיקומות סטנדרטיות בוצעה עבור כל 50 דגימות של בעלי חיים.

אפקטים של מטריקס

וריאציה של המטריצה, המוגדרת כשוני בדיוק הבדיקה עבור חלקים שונים של מטריקס, הוערכה באמצעות שש חלקות שונות של סרום/שתן של חולדות עם ספיקים לצורך ניתוח והערכת ההתאוששות המוגברת.17 הערכה של השפעת המטריצה ​​כולה עבור בדיקת תרכובת אנדוגנית היא מאתגרת . אחת הדרכים לבדוק אם לבדיקה יש אפקט מטריצת (כולל) כלשהו היא להעריך את ההתאוששות המואצת. בדיקת ההתאוששות המותרת כוללת ספייק של האנליט לתוך דגימות טרום מיצוי, השונה מבדיקת גורמי המטריצה ​​(MF), הכוללת ספייק של האנליט לתוך דגימות לאחר חילוץ.18 ה-MF חושב כשטח השיא של האנליט ב נוכחות של מטריצה ​​ביולוגית לעומת זו שבהעדר מטריצה ​​ביולוגית. נעשה שימוש ב-MF המנורמל: MF ¼ שיא שטח/IS יחס בנוכחות מטריצה ​​לעומת יחס שיא שטח/IS בהיעדר מטריצה.

ניתוח UPLC-MS/MS

ציוד MS מצויד בעמודה אנליטית של Waters X BridgeTM BEH C18 XP (2.5 מ"מ, 3.0 × 100 מ"מ; Waters, Torrance, CA) שימש עבור LC-MS ניתוח /MS. שלב נייד שיפוע ליניארי Q המורכב מ-0.1% מים חומצת פורמית (ממס A) ומתנול (ממס B) שימש לפי תוכנית הגרדיאנט הבאה: 0–3.0 min (0–1% B); 3.0–10.0 דקות (1-3% B); 10.0–14.0 דקות (3–50% B); 14.0–18.0 דקות (50–95% B); 18.0–22.0 דקות (95–0% B), זמן העצירה הוא 25 דקות. נפח ההזרקה היה 10 מ"ל והקצב היה 0.6 מ"ל דקות- 1. השיטה הסופית השתמשה בפרמטרים הבאים: סוג סריקה, MRM; מצב יונים, יינון אלקטרוספריי (ESI) במצבי יונים חיוביים ושליליים; מתח ריסוס יונים, ± 4500 וולט; גז וילון, 20; טמפרטורה, 450. C; גז מקור יונים 1, 40; גז מקור יונים 2, 40. כל נתוני UPLC-MS הושגו באמצעות תוכנת AB Analyst (גרסה 1.6.2), וה-m/z 171.1–125.2 עבור תקן פנימי d5-Phe (DP, 63 V; CE , 8 V; CXP, 21 V; 24 V) ותנאי MS מפורטים מוצגים בטבלה S1.

ניתוח סטטיסטי

כל הערכים הובאו כממוצע ± SD. המשמעות של ההבדלים בין הקבוצות הושוו באמצעות מבחן ANOVA חד כיווני ואחריו המבחן של דאנט באמצעות התוכנית Statistical Package for Social Sciences (SPSS 20.0, Chicago, IL, USA). סף המובהקות נקבע על p < 0.05 בבדיקה זו.

תוצאות ודיון

השפעת GCs על הרחם

משקל רחם וניתוח היסטולוגי שימשו להערכת ההשפעה של GCs על הרחם. משקל הרחם עלה באופן משמעותי בקבוצות הדיאטילסטילבסטרול, GC וביקורת ביחס לקבוצה הריקה (P < {{0}}.01). בקבוצה הריקה, אפיתל רירית הרחם היה נמוך עמודי עם בלוטות קטנות, אפיתל בלוטתי בצורת קובייה, וללא תאי דלקת בין-תאי. בקבוצת diethylstilbestrol, האפיתל הבלוטתי והאנדומטריום היו גבוהים עמודים והראו היפרפלזיה, עם הרבה תאים דלקתיים אינטרסטיציאליים. בקבוצת GC, האפיתל הבלוטתי והאנדומטריום היו משוננים מאוד עמודים והראו היפרפלזיה עם הרבה תאים דלקתיים אינטרסטיציאליים ועיבוי אינטימי. בקבוצת הביקורת, רירית הרחם הייתה עמודת גבוהה והאפיתל הבלוטתי היה עמודי נמוך, עם מעט תאים דלקתיים אינטרסטיציאליים. בהשוואה לקבוצה הריקה, גובה תאי האפיתל ברחם גדל באופן משמעותי בקבוצות האחרות (P <0.01) (איור 1).

אימות שיטה של ​​סמן ביולוגי שזוהה על ידי UPLC-MS/MS

ליניאריות וטווח כיול

עבור כל מדידה, נבנתה עקומת כיול ליניארית עם מקדם שקלול של 1/X במטריצה ​​הנחקרת. עקומות הכיול לניתוחים בסרום נותחו בימים שונים. טווחי הכיול של הניתוחים הופצו לאורך שבע נקודות כיול, כפי שמוצג בטבלה 1.

דיוק ודיוק. השיטה הוכחה כמתאימה, מבחינת דיוק ודיוק, הן בין יום והן תוך יום, עבור כל הדגימות שנחקרו. הערכים של פרמטרים אלו היו פחות מ-5% בריכוזים שנקבעו עבור GSH, GSSG, Leu, Trp, Kyn, 5-HTP, חומצה כולית, 5-HT ו-N-phenylacetylglycine, עם שלושה שכפולים מכל ריכוז מנותח. הנתונים התואמים לערכי הדיוק והדיוק בין-יומי ותוך-יום מוצגים בטבלה ESI S2.

אפקטים של מטריקס

כפי שמוצג בטבלת ESI S3,† ההתאוששות הגבוהות היו 92.5-118.1% בהוספת 1000 ng mL - 1 של GSH, 2000 ng mL- 1 של GSSG, 1000 ng mL- 1 של Leu , 6000 ng mL- 1 של Trp, 50 ng mL- 1 של Kyn, 2 ng mL- 1 של 5-HTP, 400 ng mL- 1 של חומצה כולית , 8 ng מ"ל- 1 של 5-HT, ו-2500 ng מ"ל- 1 של N-phenylacetylglycine לשלוש חלקות שונות של סרום חולדות, וכאשר מוסיפים 100 ng מ"ל- 1 של GSH, 200 ng mL- 1 של GSSG, 1000 ng mL- 1 של Leu, 6000 ng mL- 1 של Trp, 50 ng mL- 1 של Kyn, 2 ng mL{ {37}} של 5-HTP, 400 ng mL- 1 של חומצה כולית, 8 ng mL- 1 של 5-HT, 2500 ng mL- 1 של N -פנילאצטילגליצין לשלוש חלקות שונות של שתן חולדות עם רמות בסיס שונות. קורות החיים של ריכוזי Trp ו-Kyn שנמדדו מהחלקות הללו היו #10% (n ¼ 5). תוצאות אלו הצביעו על כך שמטריצות שונות לא השפיעו באופן משמעותי על הבדיקה.

סיטנשה טבעית למניעת סרטן הרחם PHGS75% ECH 30% ACT 12%

ניתוח של פרופיל מטבוליטים בשיטת פסאודו-מיקוד

השיטה ממוקדת פסאודו נוצלה כדי לחקור את מטבוליט השתן MRM proling של ארבע קבוצות (ריק, diethylstilbestrol, בקרה ו-GC).

ראשית, מודל PCA נבנה כדי להציג את ההבחנה המטבולית של ארבע הקבוצות. מניתוח רב-משתני, היו הבדלים מטבוליים ברורים בין קבוצות ה-GC (כולל דיאטילסטילבסטרול וקבוצות ביקורת) לבין הקבוצה הריקה. דגימות ה-QC התקבצו יחדיו היטב בתרשים הניקוד של PCA, מה שהצביע על כך שיציבות המערכת הייתה מתאימה למחקר המטבולומי הזה (איור 2).

לאחר מכן, ערך ה-P הקריטי נקבע ל-0.05 עבור מטבוליטים דיפרנציאליים משמעותיים במחקר זה. בהתאם לכך, כפי שמוצג בטבלה 2, מטבוליטים דיפרנציאליים בהשוואה לקבוצה הריקה זוהו באופן טנטטיבי באופן הבא: 17 בדגימות סרום ו

12 בדגימות שתן לקבוצת GC, 15 בדגימות נסיוב ו-9 בדגימות שתן לקבוצת דיאתילסטילבסטרול, 12 בדגימות נסיוב ו-11 בדגימות שתן לקבוצת הביקורת, ו-11 בדגימות נסיוב ו-7 בדגימות שתן שהיו בו זמנית קיים בקבוצות GC, diethylstilbestrol וביקורת. כדי להבין יותר את ההבדלים המטבוליים בין קבוצות שונות, נוצרה מפת חום מקבצת עבור כל המטבוליטים הדיפרנציאליים, המדגימה את העלייה היחסית (אדום) או הירידה (ירוק) (איור 3).

18 מטבוליטים דיפרנציאליים הקיימים בו-זמנית בקבוצות GC, diethylstilbestrol והביקורת תוארו כ

להלן: גלוקוז, חומצת לימון, פרולין, בטאין, אורניתין, N-פנילאצטילגליצין, חומצה פניל ​​פירובית, אינוזין, C16:0LPC, קריאטינין וקסנתוזין בסרום, ובנזן אצטיל גליצין, חומצה פירוגלוטמית, ואצטילקרניטין נצפתה ירידה משמעותית ב-N6-אצטיל ליזין בשתן (P <0.05); בעוד טאורין, אורניתין, חומצה a-ketoglutaric ו-spermidine בשתן עלו באופן משמעותי (P < 0.05). בנוסף, הטאורין (סרום) גדל באופן משמעותי, בעוד חומצה a-ketoglutaric (סרום), C18:0LPC (סרום), ובטאין (שתן) ירדו באופן משמעותי בקבוצות דיאתיל סטילבסטרול ו-GC (P < {{ 19}}.05); L-kynurenine (סרום) היה מווסת עלייה בקבוצת diethylstilbestrol, אך הוסדרה למטה בקבוצת GC (P <0.05); חומצה פירוגלוטמית (סרום) ופרולין (שתן) הוגדרו, וחומצת לימון (שתן) וניקוטינמיד (שתן) עלו בצורה ניכרת בקבוצת הביקורת וה-GC (P < 0.05); ו-phenylalanine היה מווסת למטה בקבוצת GC (P <0.05).

במחקר זה נחקרו ההשפעות של GCs על הרחם של חולדות לא בוגרות. הרחם הוא האיבר הרגיש ביותר לבדיקת ההשפעות התלויות ב-ER של כימיקלים.הרבה ציסטנצ'סדווח כגורם לעלייה במשקל הרחם על ידי שיפור התפקוד משחרר לוטרופין של ההיפותלמוס-יותרת המוח-שחלה,20 אשר נצפתה גם עבור GCs במחקר זה. זה הצביע על כך של-GCs יש פעילות דמוית אסטרוגנית. לאחרונה, הדיווחים התמקדו בעיקר במנגנון השולט שבאמצעותו באות לידי ביטוי השפעות אסטרוגניות באמצעות קישור ל-ERs,21-23 אך המנגנון המטבולי לא נחקר לעומק. במחקר זה, נעשה שימוש בשיטת pseudometabolomics כדי לחקור את המנגנון הדומה לאסטרוגני של GCs.

תוצרי ביניים מטבוליים של סדרה רציפה של תגובות השתנו בצורה בולטת יותר מאשר קינטיקה אנזימטית או מותאמת אישית.24 שבעה עשר מטבוליטים בסרום, כולל גלוקוז, חומצת לימון, טאורין, פרולין, בטאין, אורניתין, חומצה פירוגלוטמית, חומצה א-קטוגלוטרית, N- phenylacetylglycine, phenylpyruvate acid, inosine, C18:0LPC, C16:0LPC,

קריאטינין, פנילאלנין, L-kynורנין וקסנתוזין, ו-12 מטבוליטים בשתן, כולל בנזן אצטיל גליצין, בטאין, טאורין, חומצת לימון, אורניתין, חומצה פירוגלוטמית, אצטילקרניטין, N6-אצטיל ליזין, ניקוטינאמיד א-קטוגלוטרי, חומצה, spermidine ופרולין, נמצאו מעורבים במנגנון דמוי אסטרוגני של GCs. מספר מטבוליטים שהשתנו היו בעלי עניין מיוחד מכיוון שהם היו נוכחים הן בסרום והן בשתן. לדוגמה, חומצת לימון, שנוצרה על ידי עיבוי של אצטיל קו-אנזים A וחומצה אוקסלואצטית ומשחקת תפקיד חשוב במחזור חומצת לימון הקשור לחילוף החומרים האנרגטי, 25 הייתה מווסתת מטה בסרום של קבוצת GC אך הווסטה עלייה בשתן . יתר על כן, חומצה א-קטוגלוטרית עם מסגרת פחמן גלוטמין, שיכולה לשמור על איזון חנקן מלא ולקדם סינתזת חלבון, ומהווה את החומר המרכזי של מחזור חומצת הלימון, הייתה מווסתת מטה בסרום של קבוצת GC, אך הוסדרה למעלה בשתן.26 מחזור חומצת הלימון הוא לא רק המסלול המטבולי הסופי של שלושה חומרים מזינים עיקריים (פחמימות, שומנים וחומצות אמינו), אלא גם הקשר בין חילוף החומרים של סוכר, שומנים וחומצות אמינו, והדרך העיקרית להשגת אנרגיה. עבור הגוף.27,28 זה הראה שהמנגנון הדומה לאסטרוגני של GCs היה קשור לחילוף חומרים אנרגטי, שזהה ל-diethylstilbestrol. לכן, היה קשר ברור בין מחזור חומצת לימון לעלייה במשקל הרחם בחולדות לא בוגרות שטופלו ב-GCs. כתורם מתיל חשוב, בטאין ממלא תפקיד חשוב בצמיחת העובר ובהתפתחותו, מה שמעיד על כך שבטאין מעורב בעלייה במשקל הרחם. 29 מעניין לציין כי הטאורין עבר וויסות גבוה הן בסרום והן בשתן, מה שעשוי לקדם עיכול וספיגת שומנים. , וספיגה וניצול של גלוקוז בתאים על ידי קידום מטבוליזם של גלוקוז. כמו כן, דווח כי מחסור בטאורין מוביל לירידה במשקל אצל בעלי חיים צעירים, מה שמצביע על כך שלטאורין תפקיד חשוב בגדילה והתפתחות.30 יתרה מכך, השפעת הוויסות של בטאין וטאורין על ידי GCs עקבה אחר אותה מגמה באמצעות דיאתילסטילבסטרול, אך עם שיפור השפעה בהשוואה ל-diethylstilbestrol.

יתר על כן, חומצות אמינו רבות שונו באופן משמעותי. התוצאות שלנו העלו ש-GCs גרמו להפרעות מטבוליות בחומצות אמינו. מטבוליזם של חומצות אמינו יכול לשמש לסינתזה של חלבונים, פפטידים ותרכובות חנקניות אחרות, או דקרבוקסילציה על ידי דמינציה, טרנסאמינציה, בשילוב עם פירוק אמוניה, או לשחרור אנרגיה דרך מחזור חומצת לימון.31,32 לכן, שינויים אלה תרכובות עשויות להיות מעורבות באירועי האיתות החשובים המעוררים את העלייה במשקל הרחם.

יתרה מכך, לצורך ניתוח מסלול מפורט, המטבוליטים הדיפרנציאליים סווגו למספר מסלולים עיקריים כולל מחזור ציטראט (מחזור TCA), חילוף החומרים של גלוטתיון,

מטבוליזם של ארגינין ופרולין, מטבוליזם של D-גלוטמין ו-D-גלוטמט, ביוסינתזה של פנילאלנין, טירוזין וטריפטופן, חילוף חומרים של פנילאלנין ומסלולים אחרים באמצעות Pathway Analysis of MetaboAnalyst software (http://www.metaboanalyst.ca), כפי שמוצג. באיור 4. המסלול הקשור לחילוף החומרים באנרגיה, כולל מחזור TCA ומטבוליזם של גלוטתיון (הן בסרום והן בשתן), היה אחד היעדים העיקריים להשפעות אסטרוגניות. התפקיד הקריטי של כימיקלים אסטרוגנים במטבוליזם האנרגיה אומת על ידי ERs המסדירים את הגנים הנדרשים לתפקוד המיטוכונדריאלי, מחזור TCA ועוד, על פי מחקרים קודמים.33,34 ניתן להסיק שהמנגנון הדומה לאסטרוגני של GCs היה דומה לזה של diethylstilbestrol, כאשר שניהם קשורים, במידה מסוימת, למחזור TCA ולמטבוליזם של גלוטתיון, אבל עם GCs בביצועים טובים יותר מאשר diethylstilbestrol.

למרות שלא ניתן היה להבהיר את המנגנונים האפשריים במחקר זה, נבחרו כמה מטבוליטים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור מנגנונים אסטרוגניים אחרים של GCs ברחם בעתיד. לכן, כדי לחקור טוב יותר את המנגנון, טכנולוגיות אחרות, כגון פרוטאומיקה, יושמו במחקר עתידי.

מסקנות

לסיכום, הוקמה שיטת מטבולומיקה פסאודו-מיקודת בסרום ושתן המבוססת על UPLC-QTRAP MS לבחינת המנגנונים דמויי האסטרוגן של GCs, אשר סיפקה תוצאות חזקות ומהימנות. באמצעות הגישה הממוקדת הפסאודו-מיקודית, נחשפה ראייה הוליסטית של השינויים בחילוף החומרים בסרום ובשתן של המנגנון הדומה לאסטרוגני (GCs).

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA לשיפור התפקוד המיני PHGS75% ECH 30% ACT 12%