פולימורפים ברורים מבחינה מבנית של אגרגטים טאו שנחשפו על ידי ספקטרוסקופיה אינפרא אדום ננומטרית

תַקצִיר

אגרגציה של חלבון הטאו ממלאת תפקיד מרכזי במספר מחלות נוירודגנרטיביות הידועות ביחד כטאאופתיות, כולל אלצהיימר ופרקינסון. טאו מתקפל בצורה שגויה למבנים של גיליונות בטא פיברילריים המהווים את החוטים הסליליים המזווגים המצויים בסבכים נוירו-פיברילריים. ידוע שיכולות להיות הטרוגניות מבניות משמעותיות בצברי טאו הקשורים למחלות שונות.

עם זאת, בעוד מבנים של סיבים בוגרים נחקרו, ההתפלגויות המבניות בצברי טאו בשלב מוקדם אינן מובנות היטב. במחקר הנוכחי, אנו משתמשים ב-AFM-IR כדי לחקור ספקטרום ננומטרי של סיני טאו בודדים בשלבים שונים של צבירה ולהדגים נוכחות של פולימורפים פיבריריים מרובים המציגים מבנים משניים שונים. אנו מראים עוד שסיבים בוגרים מכילים כמויות משמעותיות של דפי בטא אנטי מקבילים. התוצאות שלנו הן היישום הראשון של ספקטרוסקופיה אינפרא אדום בקנה מידה ננומטרי על אגרגטים טאו ומדגישים את ההבטחה של ספקטרוסקופיה אינפרא אדום פתורה מרחבית לחקירת צבירת חלבונים.

מחלת אלצהיימר היא מחלה נוירודגנרטיבית בשכיחות גבוהה, ומאפייניה הפתולוגיים העיקריים הם אובדן חמור של נוירונים וסינפסות והצטברות -עמילואיד (-עמילואיד) וחלבון טאו (חלבון הקשור למיקרוטובוליה) במוח. חלבונים אלה יוצרים מבני סיבים בוגרים במהלך התקדמות המחלה, וסיבי החלבון של מבנה זה עלולים להוביל למוות נוירוני ולירידה קוגניטיבית. סיבים בוגרים ממלאים תפקיד חמור יותר בהיווצרות מחלה מאשר חלבוני עמילואיד ו-Tau. הסיבה לכך היא שיצירת סיבים בוגרים היא הנקודה הסופית של המנגנון הפתוגני, אשר מחמיר עוד יותר את אובדן הנוירונים והסינפסות במהלך התקדמות המחלה ומאיץ את התקדמות המחלה. לכן, לצורך המחקר והפיתוח של הטיפול במחלת האלצהיימר, הפכו גם המחקר והחקירה של סיבים בוגרים למוקד מחקר. במחקר שלנו, מצאנו ש-Cistanche יעיל בטיפול במחלת אלצהיימר. Cistanche מכיל כמות גדולה של אנתוציאנינים ופלבונואידים, בעלי השפעה נוגדת חמצון חזקה. מרכיבים אלו יכולים לסייע בהפחתת ייצור הרדיקלים החופשיים ולהגן על תאי המוח מפני נזק חמצוני, ובכך להפחית את האפשרות של ניוון עצבי.

תוסף לחץ cistanche deserticola

מילות מפתח

טאו; צבירה; מחלת אלצהיימר; AFM-IR; ספקטרוסקופיה IR בקנה מידה ננו; AFM; מבנה סיבים; גיליונות בטא אנטי מקבילים.

הקיפול השגוי וההצטברות של חלבוני טאו לצברים פיברילרים הם סימן ההיכר הפתולוגי של מחלות נוירודגנרטיביות רבות הנקראות טאואופתיות, כולל אלצהיימר ופרקינסון1-5. טאו הוא חלבון הקשור למיקרו-צינוריות (MT) שמתקפל בצורה לא נכונה למשקעים תאיים בלתי מסיסים הנקראים סבכים נוירו-פיברילריים (NFTs)1-2, 5-6.

בעוד שראיות מוקדמות הצביעו על נוירוטוקסיות פוטנציאלית של NFTs, כיום מאמינים שמכלולים אוליגומרים פרה-פיברילריים הם המינים הנוירוטוקסיים העיקריים3, 5-6. הבהרה של מסלולי פרפור טאו ספציפיים עשויה לספק תובנות לגבי מנגנוני המחלה ולחשוף יעדים טיפוליים פוטנציאליים לגילוי תרופות. מאמצים משמעותיים הושקעו כדי להבין את הצבירה של טאו ואת תפקידם של גורמים שונים המווסתים את הצבירה1-2, 7-18. התפקיד של חלבוני עמילואיד אחרים, למשל, עמילואיד בטא בשינוי קונפורמציה של טאו נחקר גם הוא19-21. ידוע שלחוטי טאו ב-NFT יש מבנה צולב בטא הדומה לפלאקים עמילואידים. עם זאת, בירור מקיף של האבולוציה המבנית של טאו שמביאה להיווצרות סיבים נותר אתגר.

במוח האנושי, זוהו שישה איזופורמים שונים של טאו הנבדלים זה מזה בכל הנוגע למספר שיירי חומצות אמינו2, 5, 22. המבנה האיזופורמי והפיברילרי הדומיננטיים יכולים להשתנות עם מחלה2, 22. כל האיזופורמים של הטאו הם פוליפפטידים גדולים ולכן מציגים מבנה מבני. גְמִישׁוּת. מכאן שכמות משמעותית של עניין מחקר התמקדה בפפטידים קצרים המייצגים את התחומים המקושרים למיקרו-צינוריות, שהם קריטיים לצבירה של טאו23-25 במקום החלבונים באורך מלא. יתר על כן, טאו והאיזופורמים שלו מפגינים פולימורפיזם: בעצם אותו פפטיד מתקבץ למבנים פיברילרים שונים, שנבדלים זה מזה לא רק לגבי מורפולוגיה אלא גם לגבי סידור מולקולרי8-9, 26-27. כל הגורמים לעיל הופכים את הבידוד והניתוח המבני של אגרגטים טאו ספציפיים שנוצרו בשלבים שונים של הצבירה למשימה קשה. האופי של צבירה עמילואיד באופן כללי הוא כזה שהוא יוצר שפע של מינים מצטברים שהם ארעיים ונמצאים בשיווי משקל זה עם זה. לאחרונה cryo-EM יושם בהצלחה לפתרון מבנים fibrillar tau; עם זאת, היישומים שלו נשארים מוגבלים לסיבים בוגרים בעצם שהם נקודת הסיום של צבירה, ולא חומרי ביניים9-10.

בפרט, ההיבטים המבניים של חומרי ביניים טאו בשלב מוקדם אינם מובנים היטב. תקן הזהב לקביעת המבנה המשני של אגרגטים דמויי עמילואיד, באופן כללי, הן טכניקות ספקטרוסקופיות כמו תהודה מגנטית גרעינית במצב מוצק (ssNMR) ו-Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR)15, 28-31. עם זאת, אף אחת מהטכניקות הללו לא מסוגלת לספק רזולוציה מרחבית בקנה מידה של אגרגטים בודדים, וללא רזולוציה מרחבית, קשה לייחס באופן חד משמעי תכונות ספקטרליות לצברים או מורפולוגיות ספציפיות או לקבוע אילו מינים חולפים מתפתחים למורפולוגיה מסוימת. בעיקרו של דבר לא ניתן לקבוע אם תכונות ספקטרליות שנצפו נובעות ממצב צבירה מסוים או מתערובת סטטיסטית של קונפורמציות שונות.

כתוצאה מכך, ידועים רק מבנים ממוצעים של אוליגומרים וסיבים, וההטרוגניות של וריאציות מבניות בכל מצב, אם בכלל, אינן מובנות היטב. כדי לקדם את הידע שלנו על צבירה של טאו וחלבונים עמילואידוגניים אחרים בתנאים שונים, הכרחי להבין את המבנה של כל חבר במכלול הקונפורמטיבי בשלבים שונים של צבירה. בעשור האחרון התפתחו גישות חדשות לשיפור הרזולוציה המרחבית של ספקטרוסקופיה רטט המשלבות ספקטרוסקופיה אינפרא אדום עם AFM להשגת רזולוציה בקנה מידה ננומטרי.

אחת מהגישות המבוססות על AFM שפותחו לאחרונה מנצלת את היתרון של תהודה מושרה פוטותרמית (PTIR), שבה ההתפשטות התרמית המקומית הנובעת מספיגת אינפרא אדום על ידי דגימה מורגשת על ידי קצה AFM 32-35. AFM-IR פוטותרמית עוקפת אפוא את מגבלות הרזולוציה במיקרוסקופיה IR קונבנציונלית על ידי שימוש בקצה של בדיקה AFM למדידת ספיגת אינפרא אדום. ספיגת קרינה באמצעות עירור תהודה של מצב אינפרא אדום מובילה להתרחבות תרמית של המדגם, מייצרת כוח אימפולסיבי על שלוחת AFM. תגובת בדיקה AFM המתקבלת היא פרופורציונלית לספיגת האינפרא אדום, וסריקת אורך הגל מניבה ספקטרום בליעת אינפרא אדום התואם לאזור ננומטרי של המדגם (איור 1).

לפיכך, בניגוד לטכניקות אופטיות קונבנציונליות, AFM-IR יכול לבחון מבנים בקנה מידה ננומטרי בפרטים כימיים חסרי תקדים ומשלב את הטוב משני העולמות: הרזולוציה המרחבית של AFM והרזולוציה הכימית של אינפרא אדום. בעוד AFM-IR הופעל כדי לחקור אגרגטים של פפטידים עמילואידוגניים כמו בטא-עמילואיד ואלפא סינקלאין35-38, הוא מעולם לא יושם לחקר הצטברות של טאו. במחקר זה, אנו ממנפים את היכולות של AFM-IR וחוקרים סיבים של איזומר tau-441 בשלבי צבירה שונים כדי להראות שבשלבים מוקדמים של צבירה, יש הטרוגניות משמעותית במבנה הפיברילרי גם ללא שינויים משמעותיים. במורפולוגיה. התוצאות שלנו מוכיחות בפעם הראשונה שיכולים להיות הבדלים בסיסיים במבנה המשני של סיבים שמציגים את אותה מורפולוגיה. נצפים מספר רב של פולימורפים פיברילים שונים מבניים; אחד מסודר מבנית יותר מהאחרים, שגם הוא חולף ואינו נמצא בסיבים בוגרים. יתר על כן, אנו גם מדגימים שסיבי טאו יכולים להכיל גליונות בטא אנטי מקבילים, אשר בדרך כלל אינם קשורים למורפולוגיות פיברילריות.

כדי להבין את ההתפתחות המבנית של פיברילים עם הזמן, חקרנו פיברילים בנקודות זמן שונות של צבירה, כלומר לאחר 3, 5, 10 ו-15 ימים של צבירה. עבור כל מדידה, מנות הופקדו על מצעי זהב ויובשו תחת חנקן. תמונות טופוגרפיות AFM של סיבים טאו לאחר 3 ימי דגירה ב-37 מעלות מוצגות באיור 2. איור 2A מציג אשכול סיבים מייצג. תמונות AFM נוספות של סיבים בודדים בכל שלבי הצבירה השונים מוצגות באיור S1-S5. כדי לקבל את התפלגות הגובה הכוללת של השריבים במדגם, ערכי הגובה של השריבים הבודדים נמדדו ושורטטו כהיסטוגרמה (איור 2B). הנתונים הותאמו עם גאוס כדי לקבוע את ערך הגובה הממוצע של 6.3±0.7 ננומטר. תמונות AFM של 5-ספירולי יום וניתוח גובה מתאים מוצגות באיור 2C-D. נצפים סיבים בודדים יחד עם אשכולות סיבים. גובה הפיברילים הוא 6.5±0.9 ננומטר שנותר קרוב לזה של מדגם הפיבריל של 3-יום.

לאחר מכן, נבדקו סיבים של טאו עם דגירה של {{0}} יום (איור 2E-F). סיבים בודדים נצפו על פני הזהב (איור 2E). הגובה הממוצע של סיבי 10-יום הוא 7.2±1.0 ננומטר. שרירי טאו בוגרים, שנוצרו לאחר 15 ימים של צבירה, מוצגים באיור 2G. סיבי היום 15-ארוכים ומסתבכים זה בזה ומייצרים מורפולוגיה דמוית רשת. בשלב זה של צבירה, סיבים נפרדים אינם נראים עוד. גובה הפיברילים הממוצע הוא 42.5±40.5 ננומטר (איור 2H) שהוא גבוה משמעותית בהשוואה לסיבים האחרים אלו שנוצרו בנקודות הזמן המוקדמות יותר. ההתפלגות הרחבה של גובה הפיברילים מצביעה על כך שלסיבים בוגרים יש ערכי גובה מגוונים, בניגוד להתפלגות הצרה של סיבים קודמים. המבנים הפיברילרים שנצפו כאן תואמים לדיווחים קודמים של AFM על צבירת טאו11, 39-40. תצפית חשובה נוספת ממדידות AFM היא שסיבי הטאו שנוצרו בתמיסה הם הומוגניים במורפולוגיה שלהם.

הם ישרים, חסרים כל סוג של הסתעפות או קונפורמציות מעוותות, עם שינויי גובה מינימליים בתוך סיב אחד. עם הבשלת סיבים, אנו רואים עלייה בגובה הפיבריל, אך לא מתפתחות מורפולוגיות חדשות. ניתן להמחיש זאת באיור S5, שם מוצגות מורפולוגיות פיבריל של 3-יום ו10-יום במפת צבעי קשת בענן, מה שמוכיח שיש להן שינויי גובה מינימליים בתוך פיבריל אחד. בעוד שהסיבים אינם מציגים הבדלים מורפולוגיים משמעותיים, ספקטרום ה-IR בקנה מידה ננומטרי של סיבים מכילים הבדלים משמעותיים.

באופן ספציפי, עבור שרירי היום 3-אנו צופים בשלושה פולימורפים שונים של פיברילים עם ספקטרים ​​ברורים. במשך 5-יום, 10-יום, ו15-יום בוגר, אנו רואים רק קונפורמציה אחת. אנו מציינים שבדרך כלל נעשה שימוש בפולימורפיזם כדי לסמן פיברילים מופרדים מופרדים שיכולים להיות שונים גם לגבי מבנה מולקולרי2, 26; במקרה שלנו המורפולוגיה היא בלתי משתנה, אך ניתן לסווג את הפיברילים לשלושה תת-סוגים נפרדים על סמך הספקטרום שלהם. למען הבהירות, אנו מתייחסים למבנים/פולימורפים אלה כאל סוג 1, סוג 2 וסוג 3 בהתאמה להמשך מאמר זה. ספקטרום אינפרא אדום מייצג בתחום ה-amide-I מוצגות באיור 3. הספקטרום הם הממוצע של מדידות מרובות שנלקחו לאורך הפיברילים. ספקטרום נוסף מסופק במידע התומך (איור S6). הספקטרום של 3-סוג פיבריל יום-1 מכיל פסגה בולטת ב-~1628cm−1 וכתף קטנה יותר ב-~1670cm−1.

בנוסף, ניתן לראות פס חלש ב-~1740 ס"מ-1. הספקטרום של סוג פיבריל-2 שונה באופן משמעותי ומכיל פס amid-I א-סימטרי מורחב שבמרכזו ~1650 ס"מ-1. לא נצפתה עוצמה משמעותית מעל 1700cm−1. עבור סוג פיבריל-3, אנו רואים ספקטרום אמיד-I הדומה מאוד לסוג-2, למעט חריג אחד מרכזי: נוכחות של פס בולט ב-~1738 ס"מ-1. מעניין לציין שספקטרום הפיבריל, למעט הפולימורף מסוג-1, אינו מכיל שיא חד בתדרים טיפוסיים של גיליון בטא של ~1630 ס"מ-1, למרות שידוע כי אגרגטים פיברילרים הם בטא מקבילית בתוך הרישום. גיליונות. רוחב הקו הרחב יותר שנצפה עבור סיבים מסוג 2 וסוג 3, בנוסף להיעדר שיא חד בתדרים של גיליון בטא יצביע על נוכחות של הפרעה מבנית.

מעניין לציין שלא מצאנו שום שונות גדולה בספקטרום לאורך סיב בודד (איור S5), מה שמעיד על כך שהסיבים הם מבנים מוגדרים היטב, ויש להם הפרעות מבניות פנימיות. יש לציין בהקשר זה כי יש וריאציות בספקטרים ​​לאורך פיברילים, במיוחד עבור סוג-3 סיבים כפי שמעידה סטיית התקן הספקטרלית הגדולה יותר (איור 3). עם זאת, ההבדל העיקרי בין שלושת תת-הסוגים הפיברילים הוא במונחים של עוצמות של פסים ב-1628 ס"מ-1 ו-1738 ס"מ-1. הווריאציות שצוינו לעיל אינן משפיעות על סיווג הפיברילים לתת-סוג זה או אחר.

הפיברילים הבוגרים של 5-יום, 10-יום ו-15-יום אינם מציגים הטרוגניות ספקטרלית כלשהי, ונצפה פולימורף בודד עבור כל מקרה (איור 3). ספקטרום הפיברילים של 5-יום מוסט מעט (~6 ס"מ-1) למספרי גל גבוהים יותר בהשוואה לסיבים מסוג 2 וסוג 3 ומציג גם רוחב קו מוגבר. לפיברילים שהתבגרו ב-10-יום ו15-יום יש ספקטרים ​​הדומים לזו של הסיבים מסוג 2, כשהאחרונים הוזזו למספרי גל גבוהים יותר בכ-4 ס"מ-1. לכל הפיברילים של 5-יום, 10-יום ו15-יום חסר שיא ברור מעל 1700 ס"מ-1.

התובנה המרכזית מספקטרום הפיברילים היא שבשלבי ההבשלה המוקדמים יכולה להיות הטרוגניות משמעותית במבנה הפיבריל, ועם ההבשלה, הפיברילים מתפתחים למבנה יחיד. עם זאת, קשה להבין במדויק את השינויים המבניים המדויקים מבדיקת הספקטרום בלבד. לכן, כדי לקבל תובנות נוספות לגבי הווריאציות הספקטרליות והמבניות בין הפולימורפים שנצפו, הספקטרים ​​הופקו דרך ההתאמה הספקטרלית. ספקטרות חלבונים של amid I מכילות בדרך כלל תרומות ממבנים משניים שונים41-42.

מכיוון שהמבנה המשני התורם לכל אחת מהספקטרום הנצפות אינו ידוע בדיוק אפריורי, פנינו לספקטרום הנגזרת השנייה כדי לקבוע את מספר הפסגות (איור S8). שימוש בנגזרת השנייה של נתונים ספקטרליים כדי לקבוע את הפסגות הבסיסיות הוא פרקטיקה ידועה בספקטרוסקופיה43-44. השתמשנו במספר הפסגות בספקטרום הנגזרת השנייה ובתדרים התואמים שלהן כנקודת מוצא להתאמת ספקטרלית. תוצאות ההתאמה של הספקטרום הממוצע של השריבים הבוגרים של 3-יום, 5-יום, 10- ו-15-יום מוצגות באיור 4A-F. אחוז התרומות של הפסגות המותאמות לספקטרום הכולל מוצג באיור 4G-L. הספקטרום מנורמל לעוצמה מרבית, אך זה מקנה קנה מידה של כל תת-פס באופן שווה עבור ספקטרום נתון. מכאן שהאוכלוסיות היחסיות של הלהקות, כפי שמוצג באיורים 4G-L, אינן מושפעות מנורמליזציה. פרמטרי ההתאמה מסופקים בטבלה התומכת 1.

עבור סוג-1 3-סיבולי היום, שלוש רצועות גאוס מתאימות לשני הספקטרים ​​בנאמנות גבוהה, עם תדרי מרכז ב-1628 ס"מ-1, 1659 ס"מ-1 ו-1670 ס"מ-1. ספקטרום הפיבריל הסוג-2 3-מתאים לחמש פסים בסיסיים, עם תדרים 1626cm−1, 1642cm−1, 1662cm−1, 1680cm−1 ו-1694cm−1. כצפוי מהדמיון הספקטרלי, סוג-3 הפיבריל מתאים לאותן חמש פסים אבל גם דורש שיא נוסף ב-1736 ס"מ-1. אם נרחיב את ניתוח הדקונבולציה הספקטרלית שלנו לסיבים בוגרים יותר, אנו רואים שסיבי 5-יום, 10-יום ו15-יום כולם מכילים בעצם את אותה התפלגות של מבנים משניים. ספקטרום הפיברילים של 5-יום, 10-יום ו-15-יום דורשים כולם שש פסים להתאמה אופטימלית, שבהן שיא מספר הגל הגבוה עובר ל-~1725cm−1, וחמשת הפסגות האחרות הן דומה לסוג-2 הסיבים.

ניתן לייחס את השיא של 1626-1628cm−1 בכל ההתאמות לגיליונות בטא, מה שמצביע על כך שכל הפולימורפים הפיברילריים מכילים את מבנה גיליון בטא28, 30, 41-42. השיא של 1642 ס"מ-1 נובע בדרך כלל מסלילים אקראיים, בעוד שהפסגות ב-~1660 ס"מ-1 ו-1682 ס"מ-1 מוקצות בדרך כלל לסיבובי בטא 41-42. ביחד, הדקונבולציה הספקטרלית מצביעה על כך שעם ההבשלה, יש יותר אי סדר במבנה הפיבריל, כפי שמעידה עלייה בשיא הסליל האקראי ביחס לשיא גיליון הבטא. נוכחותם של סיבובי בטא והעלייה היחסית שלהם, המעידה על עוצמת הפסגה המותאמת 1660 ס"מ-1, תואמת את המבנה הצולב בטא הצפוי של הפיברילים. הנוכחות של רצועות ב-~1694cm−1 ו~1725cm−1, לעומת זאת, היא מעט בלתי צפויה. הראשון יוחס בדרך כלל לגליונות בטא אנטי-מקבילים41-42, 45 ונצפה באוליגומרים בטא עמילואיד45-46 ובאלפא-סינוקלאין38. בעוד שמבנים אנטי-מקבילים של גיליונות ביתא ידועים במכלולי עמילואידים אוליגומריים, קיומם בסיבים נצפה לעתים רחוקות. מחקרים דו-ממדיים IR זיהו חתימות אנטי-מקבילות של גיליונות בטא בסיבי סינוקליין47; מוטנטים ספציפיים של בטא עמילואיד מציגים גם מבנה גיליון ביתא אנטי מקביל47. התוצאות שלנו, למיטב ידיעתנו, הן התצפית הראשונה ביותר של גיליונות בטא אנטי מקבילים עבור אגרגטים טאו. שיא גיליון ביתא אנטי מקביל נעדר באופן בולט בפולימורף מסוג-1. זה מצביע על כך שסיבים יכולים לאמץ מבנה נוקשה מסודר היטב (סוג פולימורפי-1) שהוא בעיקר גליונות בטא מקבילים, אך גמישות מבנית ו/או אי-סדר מוגברים יכולים להוביל להיווצרות של גליונות בטא אנטי-מקבילים.

עם זאת, חשוב לציין שהשיא של ~1626 ס"מ-1 אינו עובר בדרך כלל באופן משמעותי בין גליונות בטא מקבילים ואנטי-מקבילים. התוצאות שלנו, אם כן, אינן מונעות את האפשרות של גליונות בטא מקבילים בכל אחד מהסיביים שבהם נצפה השיא של ~1694cm-1. לא ניתן לייחס את השיא ב-~1725cm−1 לרטט של עמוד השדרה של אמיד, וככל הנראה נובע ממתח ה-COOH של חומצות קרבוקסיליות של שרשרת הצד 41-42. עבודה אחרונה של פינטו ועמיתים לעבודה הדגימה אסטרטגיות לחישוב ספקטרום ה-IR של פס הקרבוניל של קבוצת COOH של חומצה אספרטית תוך שימוש בשיטות חישוב היברידיות קוונטיות/קלאסיות48. הממצאים שלהם הראו ששרשרת הצדדית המופרוטונית מופיעה באזור של 1700-1780 cm−1 ושינוי תדירות של 5-10 cm−1 יכול לשמש כבדיקה לאינטראקציה בין השרשרת הצדדית ל- עמוד שדרה. לרצף הפפטידים Tau 441 יש חומצות קרבוקסיליות מרובות, כולל בתחומים החוזרים של מיקרוטובוליות, אשר הוכחו כבעלי נטייה גבוהה ליצירת גליונות בטא5-6.

מדידות AFM-IR של אגרגטים עמילואידים אחרים זיהו פסגות דומות36, אשר יוחסו לחומצות קרבוקסיליות. עם זאת, פס חומצה קרבוקסילית זו בולטת יותר בחלק מהסיבים מאחרים: תרומתה לשיא הכללי היא המשמעותית ביותר רק עבור סוג-3 3-סיב היום ו5-סיב היום, כפי שניתן לראות ב איור 4. בספקטרוסקופיה אינפרא אדום, יישור דו-קוטבי במבנים מסודרים מוביל לעתים קרובות לעוצמה מוגברת של פסי ספיגה; דוגמה רלוונטית היא היווצרות של דפי בטא מסודרים מפפטידים לא מסודרים, מה שמוביל לרצועות אינטנסיביות חדות ב-~1625cm−1. לפיכך, הנוכחות של רצועות חומצה קרבוקסיליות אינטנסיביות נובעת אולי מהסדר המבני של שרשראות צד של חומצה גלוטמית ואספרטית. עם זאת, ישנן שרשראות צד קרבוקסילטים מרובות בטאו-446, והאינטראקציות והכיוון המולקולריים הספציפיים שלהן אינם ידועים במדויק עבור המבנים שנצפו כאן.

יתר על כן, העוצמה בספקטרום AFM-IR היא פרופורציונלית ל-FTIR32-33, אך גורם המתאם המספרי בין AFM-IR ו-FTIR לא דווח עבור רעידות חומצה קרבוקסילית. לפיכך, התאמה בין עוצמת השיא לשרשראות צד קרבוקסיליות ספציפיות תצריך חישובים/שיקולים תיאורטיים של תגובת AFM-IR שהם מעבר להיקף של עבודה זו. חשוב גם לציין בהקשר זה שמדידות AFM-IR שונות מספקטרות אינפרא אדום איזוטרופיות הנרכשות בתמיסה, והספקטרום הנמדד ב-AFM-IR הן קונבולוציה של קיטוב לייזר ותצורת הארה49-50. לכן, קשה לזהות במדויק את היסודות המבניים של פסגה זו, ויש צורך במחקר נוסף כדי לקבוע את מקורם המדויק. אנו שואפים לטפל בכך בעבודה עתידית.

הצבירה של איזומרים טאו במבחנה נחקרה בפירוט; עם זאת, המבנה של תוצרי ביניים מוקדמים ו/או חולפים אינו ידוע במיוחד. מינים אוליגומריים בצבירה של חלבון עמילואיד זוהו כעל או מחוץ למסלול לקראת היווצרות סיבים. מאחר שמאמינים שסיבים הם נקודת הקצה של צבירה, מבני פיברילים, לרבות פולימורפים שונים שלהם, אינם נחשבים בדרך כלל כחולפים או מחוץ למסלול. ידוע שקיימת הטרוגניות במבנה הפיברילרי, אך ידוע כי היא מציגה את עצמה במקביל לווריאציות מורפולוגיות2, 8, 26, 51. התוצאות שלנו ייחודיות בכך שהן מצביעות על שינויים במבנה המשני של פיברילים גם כאשר אין הבדלים מורפולוגיים מורגשים. . אנו מציינים שלמעט סוג הפיבריל-1, כל הספקטרום הפיברילרי מכיל את אותה קבוצה של פסים בסיסיים, מה שמצביע על כך שהסיב מסוג-1 הוא תוצר ביניים חולף שבסופו של דבר עובר ארגון מחדש מבני עם הבשלה. אפשרות נוספת היא שפולימורפים מקבילים מסודרים של גיליון ביתא אלה מייצגים מבנה 'לא-נתיב', עליו להתפרק לצברים מונומריים או פרה-פיבריריים כדי להשתלב מחדש לתוך שרירי 'על-מסלול'. לא מצאנו כל נוכחות משמעותית של משקעים שאינם פיברילרים בדגימות שנחקרו; עם זאת, לאלו הנוכחים היה ספקטרום שדומה יותר לסיבים הפרועים (איור S9). זה עולה בקנה אחד עם ההשערה מחוץ למסלול ולפיכך יציע שניתן לראות את הפולימורפים האחרים של 3-יום שנצפו כמצטברים על המסלול.

עם זאת, יש לציין שספקטרום הפיבריל המדווח כאן לא בהכרח לוכד את כל הקונפורמציה השוררת במהלך צבירת הטאו. כדי להבהיר במדויק את האבולוציה המבנית של אגרגטים בשלבים מוקדמים לסיבים בוגרים, יש צורך בניתוח מפורט יותר של קינטיקה צבירה, אשר אנו שואפים לטפל בו בעתיד. התצפית המסקרנת הנוספת שמאפשרת AFM-IR היא זיהוי גיליונות בטא אנטי מקבילים בסיבים בוגרים. מקובל להאמין, והוכח על ידי מחקרים רבים, כי אגרגטים עמילואידים בשלב מוקדם יכולים להכיל מבנה אנטי-מקביל, אשר הופך ל-Secbeta-Sheet-Sheet-Sheet של ביתא מקביל באגרגטים בוגרים. אנו רואים מגמה הפוכה: אגרגטים בשלב מוקדם יכולים להכיל גליונות בטא מקבילים מסודרים בעוד שריבים בוגרים יותר מכילים גיליונות ביתא של גיליון ביתא אנטי מקבילים, המעידים על האוכלוסיות היחסיות של השיא המקביל (איורים 4G-L).

לסיכום, הוכחנו באמצעות ספקטרוסקופיה AFM-IR בקנה מידה ננוכי שלסיבי טאו יכולים להיות שינויים מבניים משמעותיים, במיוחד בשלבים המוקדמים של הצבירה. ההטרוגניות באה לידי ביטוי בצורה של פולימורפים שונים מבחינה מבנית, המציגים מורפולוגיה דומה אך מבנה משני שונה. באופן ספציפי, אנו מזהים יריעת בטא-שי-ביתא מקבילה מסודרת חולפת בסיבים בשלבים מוקדמים, אשר עם התבגרות מתפתחת למבנה פיבריל לא מסודר יותר המכיל גליונות בטא אנטי-מקבילים. תוצאות אלו מדגישות את הצורך בשילוב ספקטרוסקופיה עם טכניקה פתורה מרחבית כמו AFM, מכיוון שלא ניתן לקבוע באופן חד משמעי את הטכניקות בממוצע מרחבי כמו FTIR. תוצאות הניסוי המתוארות במחקר זה מראות שהאגרגטים הפיברילריים של הטאו הם הטרוגניים ועבודה עתידית תתייחס האם פולימורפים אלו נמשכים בתנאי צבירה שונים ובצבירת זרעים מ-lysates של המוח כדי להבין את משמעותם בהקשר של טאואופתיות שונות.

חומר משלים

עיין בגרסת האינטרנט ב-PubMed Central לחומר משלים.

הכרה

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (פרס 1 R35 GM138162 ל-AG).

הפניות

1. Šimić G; Babić Leko M; Wray S; הרינגטון C; דלל I; Jovanov-Milosević N; Bažadona D; Buée L; דה סילבה ר; די ג'ובאני ג'י; ווישיק ג; Hof PR Tau Hyperphosphorylation ו-Aggregation של חלבון במחלת אלצהיימר וטאופתיות אחרות, ואסטרטגיות נוירו-הגנה אפשריות. ביומולקולות 2016, 6 (1), 6–6. [PubMed: 26751493]

2. לי ד; Liu C קביעה כימית היררכית של פולימורפים עמילואידים במחלה נוירודגנרטיבית. Nature Chemical Biology 2021, 17 (3), 237–245. [PubMed: 33432239]

3. Kametani F; Hasegawa M בדיקה מחדש של השערת עמילואיד והשערת טאו במחלת אלצהיימר. Frontiers in Neuroscience 2018, 12 (25).

4. Iadanza MG; חבר פרלמנט ג'קסון; יואיט EW; רנסון נ.א.; Radford SE עידן חדש להבנת מבני עמילואיד ומחלות. סקירות טבע Molecular Cell Biology 2018, 19 (12), 755–773. [PubMed: 30237470]

5. Ballatore C; לי VMY; Trojanowski JQ Tau בתיווך ניוון עצבי במחלת אלצהיימר והפרעות נלוות. Nature Reviews Neuroscience 2007, 8 (9), 663–672. [PubMed: 17684513]

6. Kolarova M; גארק; #00ED; א-סיירה פ; ברטוס א; ריקני ג'יי; Ripova D מבנה ופתולוגיה של חלבון טאו במחלת אלצהיימר. כתב העת הבינלאומי למחלת אלצהיימר 2012, 2012, 13.

7. טפיולה ט; אלאפוזוף הראשון; חרוקה סק; פרקקין ל; Hartikainen P; סוינינן ח; Pirttilä T Cerebrospinal Fluid -Amyloid 42 ו-Tau Proteins כסמנים ביולוגיים של שינויים פתולוגיים מסוג אלצהיימר במוח. JAMA Neurology 2009, 66 (3), 382–389.

8. מוקראש MD; Bibow S; קורוקוטו י; Jeganathan S; בירנת י; גריזינגר ג; Mandelkow E; Zweckstetter M Structural Polymorphism של 441-Residue Tau ברזולוציה של שארית בודדת. PLOS Biology 2009, 7 (2), e1000034.

9. Scheres SHW; Zhang W; פלקון ב'; Goedert M Cryo-EM מבנים של חוטי טאו. חוות דעת נוכחית בביולוגיה מבנית 2020, 64, 17–25. [PubMed: 32603876]

10. פיצפטריק AWP; פלקון ב'; הוא ס; Murzin AG; מורשודוב ג; Garringer HJ; קראוטר RA; גטי ב'; Goedert M; מבני Scheres SHW Cryo-EM של חוטי טאו ממחלת אלצהיימר. טבע 2017, 547 (7662), 185–190. [PubMed: 28678775]

11. מאקי א; בוסט ל; מדיונה ק; Melki R מיקרוסקופיית כוח אטומי הדמיה ומאפיינים ננו-מכאניים של שישה מכלולי טאו איזופורמים. Biophysical Journal 2020, 119 (12), 2497–2507. [PubMed: 33217380]

12. מטריק מ.א.; Ferreira NDC; Saijo E; קראוס א; Newell K; Zanusso G; ונדרוסקולו M; גטי ב'; Caughey BA מבחן רגיש במיוחד לזיהוי והבחנה של אגרגטים טאו של מחלות אלצהיימר ו-Pick. Acta Neuropathologica Communications 2020, 8 (1), 22. [PubMed: 32087764]

13. היילי ז; מנג SR; מאוורר JB; חן ג'יי; פרפור Liang Y של טאו אנושי מואץ על ידי חשיפה לעופרת באמצעות אינטראקציה עם שלו-330 ושלו-362. PloS one 2011, 6, e25020. [PubMed: 21966400]

14. פון ברגן מ; Barghorn S; לי ל; מרקס א; בירנת י; מוטציות EM של Mandelkow של חלבון טאו בדמנציה פרונטו-טמפורלית מקדמות הצטברות של חוטים סליליים מזווגים על ידי שיפור המבנה המקומי. כתב העת לכימיה ביולוגית 2002, 276, 48165–74.

15. פרוסט ב'; Ollesch J; וויל ה; Diamond MI מגוון קונפורמציוני של סיבים טאו מסוג פראי המצוין לפי שינוי קונפורמציה בתבנית. Journal of Biological Chemistry 2009, 284 (6), 3546–3551.

16. ליו וו; Hu X; ג'ואו ל; טו י; שי ס; פרספקטיבה בהשראת Yao T על מעכב מולקולרי של צבירה טאו על ידי כורכומין מצומד עם פיגום מורכב של Ruthenium(II). The Journal of Physical Chemistry B 2020, 124 (12), 2343–2353. [PubMed: 32130010]

17. Prokopovich DV; Whittaker JW; Muthee MM; אחמד א; Larini L ההשפעה של זרחון ופסאודו-זרחון על השלבים המוקדמים של צבירה של חלבון טאו הקשור למיקרוטובולה. The Journal of Physical Chemistry B 2017, 121 (9), 2095–2103. [PubMed: 28218850]

18. אריה ס; Ganguly P; ארסיקיו א; קלוד SL; טראפ ב'; שונפלד GE; ליו X; לזר קנטרל ק; שיאה JE; כיסוי מסוף של Bowers MT של שבר טאו עמילואידגני מווסת את נטיית הפרפור שלו. The Journal of Physical Chemistry B 2020, 124 (40), 8772–8783. [PubMed: 32816481]

19. Rojas AV; Maisuradze GG; Scheraga HA תלות של היווצרות של אגרגטים מעורבים טאו ו-A פפטיד על המבנה המשני של אזור ה-N-Terminal של A. The Journal of Physical Chemistry B 2018, 122 (28), 7049–7056. [PubMed: 29940109]

20. צ'י ר; Luo Y; ווי ג'י; נוסינוב ר; Ma BA "מתיחה ואריזה" מנגנון זריעה צולבת יכול לעורר צבירת חלבון טאו. The Journal of Physical Chemistry Letters 2015, 6 (16), 3276–3282.

21. עשה TD; Economou NJ; חמס א; Buratto SK; שיאה JE; אינטראקציות של Bowers MT בין שברי עמילואיד ו-Tau מקדמות אגרגטים חריגים: השלכות על רעילות עמילואיד. The Journal of Physical Chemistry B 2014, 118 (38), 11220–11230. [PubMed: 25153942]

22. Buée L; Bussière T; Buée-Scherrer V; דלאקורט א; איזופורמי חלבון Hof PR Tau, זרחון, ותפקיד בהפרעות ניווניות. Brain Research Reviews 2000, 33 (1), 95–130. [PubMed: 10967355]

23. לואו י; מא ב; נוסינוב ר; תובנה מבנית של Wei G לגבי הפרדוקס של Tau Protein של התנהגות מופרעת מהותית, פעילות אצטילציה עצמית ואגרגציה. The Journal of Physical Chemistry Letters 2014, 5 (17), 3026–3031. [PubMed: 25206938]

24. דונג X; ברה ס; Qiao Q; טאנג י; לאו ז; Luo Y; גזית ה; הפרדת שלב נוזל-נוזל Wei G של חלבון טאו מקודדת ברמה המונומרית. The Journal of Physical Chemistry Letters 2021, 12 (10), 2576–2586. [PubMed: 33686854]

25. Goux WJ; קופלין ל; Nguyen AD; דליפה ק; רוטקופסקי מ; שנמוגנאנדם VD; שארמה ד; Inouye H; Kirschner DA היווצרות חוטים ישרים ומפותלים מ-Tau Peptides קצרים. Journal of Biological Chemistry 2004, 279 (26), 26868–26875.

26. פנדריך מ; Nyström S; Nilsson KPR; בוקמן א; LeVine H 3rd; Hammarström P פולימורפיזם פיבריל עמילואיד: אתגר להדמיה וטיפול מולקולרי. J Intern Med 2018, 283 (3), 218–237. [PubMed: 29360284]

27. Härd T Fibrils עמילואיד: היווצרות, פולימורפיזם ועיכוב. The Journal of Physical Chemistry Letters 2014, 5 (3), 607–614. [PubMed: 26276617]

28. מרטיאל ב'; Lefèvre T; Auger M הבנת היווצרות ספירלי עמילואיד באמצעות שברי חלבון: חקירות מבניות באמצעות ספקטרוסקופיה רטט ו-NMR במצב מוצק. Biophys Rev 2018, 10 (4), 1133–1149. [PubMed: 29855812]

29. אייזנברג ד.ס.; Sawaya MR מחקרים מבניים של חלבוני עמילואיד ברמה המולקולרית. סקירה שנתית של ביוכימיה 2017, 86 (1), 69–95.

30. מורן ס"ד; Zanni MT כיצד לקבל תובנה על מבנה והיווצרות עמילואיד מספקטרוסקופיה אינפרא אדום. The Journal of Physical Chemistry Letters 2014, 5 (11), 1984–1993. [PubMed: 24932380]

31. Tycko R מחקרי NMR במצב מוצק של מבנה סיב עמילואיד. סקירה שנתית של כימיה פיזיקלית 2011, 62 (1), 279–299.

32. דאזי א; Prater CB AFM-IR: טכנולוגיה ויישומים בספקטרוסקופיה אינפרא אדום ננומטרית והדמיה כימית. Chemical Reviews 2017, 117 (7), 5146–5173. [PubMed: 27958707]

33. דאצי א; פראטר CB; Hu Q; צ'ייס DB; Rabolt JF; מרקוט C AFM-IR: שילוב של מיקרוסקופיה של כוח אטומי וספקטרוסקופיה אינפרא אדום לאפיון כימי בקנה מידה ננומטרי. יישום ספקטרוסק. 2012, 66 (12), 1365. [PubMed: 23231899]

For more information:1950477648nn@gmail.com