תמצית מתנולית של תרד מחלישה את ניוון הרשתית בחולדות סוכרתיות

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

תַקצִיר:הוצע כי תמצית מתנולית של תרד (SME) מעכבת את היווצרותם של תוצרי קצה של גליקציה מתקדמים (AGEs), המוגברים במהלך התקדמות הסוכרת, ולכן חשוב לדעת אם ל-SME יש השפעות מועילות על הרשתית הסוכרתית. במחקר זה, מבחני מבחנה הראו כי SME מעכב גליקציה, יצירת קבוצות קרבוניל ודלדול קבוצת תיול מופחת בסרום אלבומין של בקר שהודגרה בסוכרים מפחיתים או במתילגליוקסל. השפעת ה-SME ברשתית של חולדות סוכרתיות הנגרמות על ידי סטרפטוזוטוצין (STZ2) נחקרה גם (n=10) בקבוצה הנורמוגליקמית, STZ, חולדות STZ שטופלו ב-SME, וחולדות STZ שטופלו באמינגואנידין (התייחסות נגד AGEs). קבוצה) במהלך 12 שבועות. הרשתית נחתכה ונצבעה חיסונית עבור Ne-carboxymethyl lysine (CML), קולטן RAGE, NADPH-Nox4, סינתאז תחמוצת חנקן מושרה (iNOS),3-ניטרוטירוזין (NT), NF-kB גרעיני, גורם גדילה אנדותל כלי דם ( VEGF), חלבון חומצי גליאלי (GFAP), חלבון S100B ומבחן TUNEL. חמצון שומנים נקבע בכל הרשתית לפי רמות מלונדאלדהיד (MDA). התוצאות הראו שברשתית הסוכרתית, SME הפחיתה את שיתוף ה-CML-RAGE, מתח חמצוני (NOX4,iNOS,NT,MDA), דלקת (NF-B,VEGF,S10B, GFAP) ואפופטוזיס (p<0.05).therefore, smes="" could="" attenuate="" retinal="" degeneration="" by="" inhibiting="" cml-rage="">

מילות מפתח:תרד; רטינופתיה סוכרתית; מוצרי קצה מתקדמים של גליקציה; מתח חמצוני; דַלֶקֶת; זעם; carboxymethyl L-Lysine

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

1. הקדמה

דיאטות צמחיות נקשרו עם סיכון נמוך יותר לפתח מחלות כרוניות כמו השמנת יתר, סוכרת מסוג 2 ומחלות לב כלילית. תרד (Spinacia oleracea L.) הוא ירק עלים אכיל הנצרך בכל העולם בשל אספקת כמות ניכרת של סיבים, ויטמינים ומינרלים [1,2]. כמה מהפיטוכימיקלים שלו זוהו, כולל כלורופילים, קרוטנואידים (לוטאין וזאקסנטין) [3], ותרכובות פנוליות (פלבונים, פלבנואידים, קומארינים) [4-8] (ראה תוספת 1). דווח כי תרד, כאשר הוא נבלע כמזון, תמצית מסיסת במים, או בצורה מיובשת בהקפאה, ולתילקואידים שלו יש תכונות אנטי-סרטניות, נוגדות השמנה והיפוגליקמיה [9]. ההשפעה האנטי דלקתית של תרד הוכחה במודלים של אנדוטוקסמיה בבעלי חיים, בבעלי חיים שמנים ובני אדם בריאים [9]. השפעתו נוגדת החמצון נחקרה בתאי קרצינומה של הערמונית האנושית, מודלים של בעלי חיים עם השמנת יתר, עכברים מוקרנים ב-UV ואדנוקרצינומה של ערמונית העכבר הטרנסגניה [9,10]. ההשפעות האנטי-גליקציות והאנטי דלקתיות של תמצית מתנולית תרד (SME) נחקרו במודל של סוכרת הנגרמת על ידי גלוקוז בדגי זברה ונמק שריר הלב המושרה על ידי איזופרוטרנול בחולדות, בהתאמה [11,12]. SME הפחית את רמות ההמוגלובין והפרוקטוזאמין המסוכר, כולל רמות החלבון המסוכרר, על ידי הפחתת פעילות אלדוזה רדוקטאז בעין העדשה [11]. הממצאים לעיל מצביעים על כך שלחברות קטנות ובינוניות עשויה להיות השפעה מונעת על התקדמות סיבוכי סוכרת כגון רטינופתיה סוכרתית (DR).

DR מוביל בהדרגה לאובדן חדות הראייה או עיוורון שהיה קשור לדלקת, עקה חמצונית והצטברות של תוצרי קצה של גליקציה מתקדמים (AGEs) [13,14]. ה-AGEs מעוררים חיבור חלבון, משנים את המבנה/תפקוד ואת התחלופה/פינוי שלו. AGEs יכולים להיות מיוצרים על ידי תגובה לא-אנזמית בין הגלוקוז עם קבוצת חלבונים אמינו חופשית, ויוצרות תוצרי ביניים הפיכים כגון בסיסים של שיף ומוצרי Amadori (פרוקטוזאמין)[15]. מנגנונים אחרים להיווצרות AGEs כוללים את מסלול "הלחץ הקרבונילי", שבו חמצון של סוכרים ושומנים יוצרים תרכובות ביניים דיקרבוניל כגון גליוקסל ומתילגליוקסל (MGO), אשר מובילים להיווצרות AGEs כמו N:-carboxymethyl lysine (CML)[ 16]. עלייה ברמות CML בסרום ובזגוגית יכולה להיות סמן ביוכימי הן להופעה והן להתקדמות של DR [17,18]. ברשתית, ההפעלה של קולטן RAGE על ידי AGEs(AGEs-RAGE) גורמת לביטוי יתר של חלבון חומצי גליאלי פיברילרי (GFAP) וגורמים מעודדי דלקת, המווסתים על ידי הגורם הגרעיני kappa-light-chain-enhancer של B משופעל. cells(NF-kB)[19]. NF-kB מווסת באופן חיובי את ביטוי RAGE על ידי פעולה כמנגנון משוב חיובי [20].מה זה cistancheמצד שני, ריכוזים גבוהים של S100B, חלבון קושר סידן, עשויים גם להפעיל את NF-kB, לעורר דלקת עצבית והפעלת תאי גליה [21]. ביטוי היתר של S100B באסטרוציטים מעורר השפעות נוירוטוקסיות המתבטאות באסטרוגליוזיס ברשתית [22].

Cistanche יכול אנטי אייג'ינג

אסטרטגיות פותחו בניסוי למניעת נזק לרשתית. כמה פיטוכימיקלים של תרד שבודדו מצמחים אחרים נקשרו לעיכוב של AGEs ולחץ חמצוני [8,23-26]. לוטאין, אסטקסנטין וקאמפרול הגנו על תאי אפיתל פיגמנט ברשתית (ARPE-19) שמקורם באדם מפני נזק באמצעות תכונות האנטי-AGE, נוגדי החמצון והאנטי-אפופטוזיס שלהם [26-28]. תוצאות אלו מצביעות על כך שלפיטוכימיקלים של תרד יש תפקיד רלוונטי במניעת ניוון רשתית כמו DR. אסטרטגיה נוספת הייתה שימוש באמינגואנידין (AG) כמעכב חזק של פעילות גליקציה ו-iNOS, מחליש את הצטברות ה-CML והיווצרות מבשרי די-קרבוניליים תגובתיים בחולדות [29]. עם זאת, בניסוי קליני רב-צנטרי ואקראי עם 690 חולי סוכרת, ההשפעה המיטיבה לא הוכחה בבירור [30].

השינויים בניוון הרשתית בתנאים היפרגליקמיים כמעט ולא נחקרו. לכן, מעניין לדעת אם SME מגן על שכבות הרשתית מפני נזקים הקשורים לתכונות האנטי-AGE, נוגדות החמצון והאנטי דלקתיות שלה ברשתית של חולדות סוכרתיות הנגרמות על ידי סטרפטוזוטוצין.

2. חומרים ושיטות

2.1. הכנת התמצית המתנולית של תרד (SME)

העלים הטריים של התרד (S.oleracea L.) נקצרו בעונת הסתיו-חורף בשדה חקלאי של מחוז פואבלה, מקסיקו, וזוהו על ידי בוטנאי בצמח הצמח של המכון הפוליטכני הלאומי (IPN, מקסיקו סיטי, מקסיקו). דגימת שובר מספר 4532 הופקדה בעשב של בית הספר הלאומי למדעי הביולוגיה של IPN.

העלים היו מיובשים וטחונים דק. העלים היבשים נמחקו עם מתנול בטמפרטורת החדר, סוננו דרך מסנני תאית (Whatman, Maidstone, בריטניה), ויובשו באמצעות מאייד ואקום סיבובי (BUCHI Rotavapor R{{0}}, שוויץ) ב-45 מעלות עד תניב מסטיק ירוק (95.0 גרם/ק"ג עלים יבשים).אנטי אייג'ינג cistancheה-SME אוחסן בחושך ב-4 מעלות עד לשימוש. עבור כל המבחנים, התמצית שוחזרה במים מזוקקים[11].

2.2. מבחני במבחנה של פעילות אנטי-גלייקציית SME

2.2.1. היווצרות מוצרי קצה מתקדמים של גליקציה המופקים מאלבומין בסרום בקר (BSA-AGEs)

בדיקת BSA-AGEs בוצעה, כפי שתואר קודם [31]. בקצרה, 10 מ"ג/מ"ל BSA(שבריר V; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב) נוספה ב-D-גלוקוז 0.5 M, D-פרוקטוז {{12 }}.5 M, או methylglyoxal 2.5 mM, ויוצרו בתמיסה 0.1 M PBS (pH 7.4) ו-0.02 אחוז נתרן אזיד. ריכוזי SME (5, 10,25, 50, 100 ו-200 מ"ג/מ"ל) נוספו לכל תערובת ולאחר מכן הודגרו ב-37 מעלות למשך 4 שבועות. לאחר מכן, הסוכרים שלא הגיבו הוסרו בדיאליזה נגד מים מזוקקים למשך יומיים ב-4 מעלות. רמות BSA-AGE נקבעו באמצעות ספקטרופוטומטריית פלואורסצנציה (Ex370/Em 440 ננומטר; דגם LS 30, PerkinElmer LAS Ltd., Buckinghamshire, UK)[32]. הגליקציה של חלבון BSA על ידי הפחתת סוכרים ו-MGO היו בקרה חיובית (BSA glycated), בעוד שהדגירה של BSA מסוכרר עם aminoguanidine (1 מ"ג/מ"ל) שימשה כביקורת שלילית (BSA glycated-AG). המבחנים בוצעו בשלושה עותקים.

2.2.2. בדיקת פרוקטוזאמין

רמת הפרוקטוזאמין נקבעה על ידי מבחן nitro blue tetrazolium (NBT) [33], המבוסס על יכולתו של פרוקטוזאמין להפחית את ה-NBT, ויוצר פורמאזן, תוצר סופי צבעוני בתנאים אלקליים. עשרה מיקרוליטר של אחת מהבקרות או ריכוזי SME מסוכררים (BSA-SME) נוספו ל-90 μL של NBT ב-2.5 mM, שהוכן במאגר קרבונט (0.1 M; pH 10.3); כולם הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הספיגה ב-530 ננומטר נמדדה. ריכוזי פרוקטוזאמין (nmol/mg) חושבו על פי עקומה סטנדרטית של פורמאזן.

2.2.3. קביעת היווצרות קבוצות קרבוניל ודלדול קבוצות תיול ב-BSA-AGEs

ריכוז קבוצת קרבוניל נמדד בדגימות BSA-SME ובקרה, על פי Levine וחב'. [34]. תמיסה של 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH;10 mM) ב-400 μL של 2.5 M HCl נוספה ל-100 μL כל דגימה והודגרה בחושך למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.cistanche benefíciosלאחר מכן, נוספו 500 μL של חומצה טריכלורואצטית (20 אחוזים w/v) ונשמרו על קרח למשך 5 דקות. הדגימות עברו צנטריפוגה ב-4000 סל"ד למשך 15 דקות, וכדורית החלבון נשטפה שלוש פעמים עם אתיל אצטט/אתנול (1:1 v/v). לאחר מכן, הדגימות הושעו ב-250μL גואנידין הידרוכלוריד עד 6M. ריכוז קבוצות הקרבוניל (nmol/mg חלבון) חושב על ידי ספקטרופוטומטריה בספיגה של 370 ננומטר (EON, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, ארה"ב) באמצעות מקדם ספיגה של DNPH (22,000 M-1 ס"מ-1).

לפי שיטת אלמן, בוצעה קביעת דלדול קבוצת התיול בדגימות BSA-SME וביקורת. בקצרה, 10 μL של 5,5'-Disulfanediylbis（2-nitrobenzoic acid）（DNTB;10 mM, שהוכן ב-PBS） עם 50 μL של דגימות מסוכררות הודגרה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, לאחר מכן נמדדה הספיגה ב-410 ננומטר. רמת קבוצות התיול החופשיות חושבה באמצעות עקומה סטנדרטית של L-cysteine ​​(0.4-11 μM) ומבוטאת ב-nmol/mg חלבון [34].

2.3. השפעת SME על הרשתית של חולדות סוכרתיות 2.3.1. השראת סוכרת בחולדות

נעשה שימוש בחולדות זכרים מסוג Wistar במשקל 250±10 גרם(N=40) בצום במשך 8 שעות. ניתנה מנה תוך צפקית של סטרפטוזוטוצין (60 מ"ג/ק"ג) במאגר ציטראט (10 מ"מ, pH 4.5) (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, ארה"ב) [35]. שלושה ימים לאחר מכן, רמת הגלוקוז נמדדה (גלוקומטר; ACCU-CHEK פעיל; Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, גרמניה) על ידי איסוף טיפה של דגימת דם מהזנב. בעלי חיים עם רמות גליקמיות גבוהות מ-350 מ"ג/ד"ל גויסו למחקר. הגלוקוז בדם נמדד מדי שבוע במשך 12 שבועות.

2.3.2. עיצוב נסיוני

החולדות הסוכרתיות הנגרמות על ידי סטרפטוזוטוצין (STZ) חולקו באופן אקראי לקבוצות הבאות (n =10): STZ שטופלה תוך קיבה עם 2 מ"ל מי שתייה (STZ); STZ שטופל ב-SME ב-400 מ"ג/ק"ג (STZ-SME); חולדות נורמוגליקמיות (NG); ו-STZ שטופלו ב-50 מ"ג/ק"ג אמינוגואנידין (AG; Sigma-Aldrich, Inc.)(STZ-AG). STZ-AG שימש כקבוצת התייחסות נגד AGE. המינונים שהוקצו ניתנו כל 24 שעות (9:00 בבוקר) במשך 12 שבועות. הרמה הגליקמית בכל הקבוצות הייתה במעקב שבועי. משטר המינון של SME ב-400 מ"ג/ק"ג התבסס על הדברים הבאים: 7 גרם של SME מתקבלים מ-100 גרם של תרד טרי (לא מוצגים נתונים). כמות זו מקבילה לצריכה היומית של אדם ממוצע של 70 ק"ג בתזונה האמריקאית [36], התואמת ל-100 מ"ג תמצית/ק"ג משקל גוף.Cistanche Extract Anti Radiationמצד שני, בשל ההבדל בחילוף החומרים המואץ של חולדות, מומלץ להגביר את הצריכה של כל תמצית טבעית עד פי 6.4 לצורך השוואה עם בני אדם [37]. המינון של 400 מ"ג/ק"ג בו השתמשנו התבסס בעיקר על התוצאות שהתקבלו במודל של נמק שריר הלב המושרה בחולדות Wistar, שהראה כי ההשפעה האנטי-דלקתית של SME משמעותית יותר ב-300 מ"ג/ק"ג [12].

2.3.3. הערכות היסטולוגיות ואימונוהיסטוכימיה

עיניים עם גרעין נקבעו בפורמלין ניטרלי ולאחר מכן התייבשו באלכוהולים מדורגים והוטמעו בפרפין. קטעים היסטולוגיים של 2 מיקרומטר הורכבו על שקופיות מוטענות חשמליות, הוסרו מהשעווה והוסרו מחדש עד לתמיסת שחזור אנטיגן (K035; 10× מאגר ציטראט, pH6; Diagnostic BioSystems, Pleasanton, קליפורניה, ארה"ב). נעשה שימוש במערכת איתור חיסונית מבוססת פולימרים (מערכת זיהוי DAB של PolyVuemuse/ארנב, Diagnostic BioSystems). נעשה שימוש בנוגדנים העיקריים הבאים: חלבון חומצי גליאלי (אנטי-GFAP;MAB360; Chemicon International, Inc., Temecula, CA, ארה"ב); גורם גדל אנדותל כלי דם (anti-VEGF;sc-7269; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, ארה"ב), S100 חלבון קושר סידן B (anti-S100B; ab52642; Abcam PLC, קיימברידג', בריטניה) , וגורם גרעיני kappa-light-chain-enhancer של תאי B משופעלים (anti-NF-kB p65;sc-8008). כל הדילולים היו ב-1:200 והודגרו למשך הלילה ב-4 מעלות. נוגדן משני (Mouse/Rabbit PolyVueTM) נוסף לפי הוראות הספק.cistanche herbaהחתכים נצבעו במצע DAB פלוס/כרומוגן והמטוקסילין. תצפיות היסטולוגיות ולכידת תמונות בוצעו במיקרוסקופ של Carl Zeiss (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, גרמניה).

עבור צביעה אימונופלואורסצנטית, השקופיות הודגרו למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם הנוגדנים העיקריים הבאים: קרבוקסימטיל ליזין (אנטי-CML; ab124145; Abcam PLC, קיימברידג', בריטניה), קולטן AGE (אנטי-RAGE; sc-365154), NADPH אוקסידאז 4 (אנטי-Nox4;ab133303), 3-ניטרוטירוזין (אנטי-NT; ab110282), וסינתאז תחמוצת החנקן (ניתן להשרה) (אנטי-iNOS; A00368-1;Boster Bio, Pleasanton, CA , ארה"ב). לאחר מכן, נעשה שימוש בנוגדנים המשניים הבאים: עבור anti-RAGE, עז נגד עכבר lgG(FITC)-conjugated (1:200; Santa Cruz, Biotechnology, Inc.); עבור אנטי-CML ואנטי-NT, IgG-PE של עכבר נגד ארנב (SC-3753); ועבור anti-iNOS ואנטי-Nox4, m-IgGkBP-PE (Sc-516141). כולם הודגרו בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות. לאחר מכן, חלקים הורכבו בתווך המכיל 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride (DAPI). נוגדנים אנטי-CML ואנטי-RAGE עברו הכלאה יחד באותה שקף. תחנת הדמיה תא FLoidTM (טכנולוגיות חיים קרלסבד, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב) שימשה לתמונות פלואורסצנטיות.

2.3.4.הערכת אפופטוזיס

האפופטוזיס של תאי רשתית זוהה על פי המדריך המתואר על ידי בדיקת Deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick-end (TUNEL) בתיווך דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז (TdT) באמצעות ערכת In Situ Cell Death Detection Kit, TMR(tetramethyl-rhodamine{{) 3}}dUTP) אדום, גרסה 12 (12156792910; Roche Diagnostics). בקצרה, השקופיות שעברו שחרור משעווה הוזרמו מחדש ונשטפו פעמיים עם PBS. לאחר מכן, הם הודגרו עם תערובת התגובה TUNEL באווירה לחות למשך 60 דקות ב-37 C. לאחר מכן, קטעים הורכבו עם DAPI ונצפו במיקרוסקופיה פלואורסצנטית (FLoidTM Cell Imaging Station). IOD עבור TUNEL חושב עבור שכבות הרשתית.

2.3.5. בדיקת חמצון ליפידים

לצורך הערכת רמות המלונדאלדהיד (MDA) ברקמת הרשתית, כ-3 מ"ג של רקמה טריה (n=3) הומוגגו ועובדו כפי שדווח בעבר [38]. רמות ה-MDA כומתו בהתאם להוראות ספק הערכה (ערכת בדיקות OXItek-TBARS, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, ארה"ב).

2.4.ניתוח סטטיסטי

לצורך ניתוח סטטיסטי, כל צילומי המיקרוסקופ ברשתית נלכדו בגודל של 200× ב-100 מיקרומטר מעבר לאזור עצב הראייה. נותחו כ-40 תמונות לכל קבוצת בעלי חיים (n=7). ניתוח תמונה בוצע באמצעות תוכנת Image-Pro Premier גרסה 9.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, ארה"ב). השתמשנו בתוכנת GraphPad Prism (לה ג'ולה, קליפורניה, ארה"ב; גרסה 8.0). הדמויות מציגות ערכים בגרפים בתרשים-קופסה (חציון, רבעון ראשון-שלישי, ערך מינימום-מקסימלי) עבור שכבת תאי הגנגליון (GCL), שכבה גרעינית פנימית (INL) ושכבה גרעינית חיצונית (ONL). הממוצע וסטיית התקן (ממוצע ± SD) מוצגים בנספח א' (טבלאות A1-A3). בכל המקרים בוצעה בדיקת ANOVA חד כיוונית ולאחריה בדיקת Tukey. ע<0.05 was="" considered="" statistically="">