SLC37A2, מולקולה הקשורה לזרחן עולה בתאי שריר חלק באאורמה המסודדת

הסתיידות כלי דםהוא מקור מרכזי שלמחלת לב וכלי דםבחולים עם מחלת כליות כרונית.היפרפוספטמיהמוביל לזרימה מוגברת של זרחן תוך תאי, מה שמוביל לעלייה בתאים דמויי אוסטאובלסט בתאי השריר החלק של כלי הדם. PiT-1 מעביר פוספט בתאי שריר חלק של כלי הדם. עם זאת, המנגנון של הסתיידות כלי דם אינו מובן לחלוטין. מחקר זה חקר מולקולות מועמדות הקשורות לזרחן מלבד PiT-1. שיערנו כי מולקולות הקשורות לזרחן השייכות ל-נשא מומס(SLC) משפחת-על תהיה מעורבת בהסתיידות כלי דם. כתוצאה מניתוח מיקרו-מערכי DNA, התמקדנו ב-SLC37A2 והראינו שביטוי mRNA של תאים אלו גדל בתאי שריר חלק של אבי העורקים מסויידים (AoSMC). דווח כי SLC37A2 מעביר הן גלוקוז-6-פוספט/פוספט והן חילופי פוספט/פוספט. ניתוח במבחנה הראה שביטוי SLC37A2 לא הושפע מדלקת ב-AoSMC. הביטוי של SLC37A2 mRNA וחלבון גדל ב-AoSMC מסוייד. In vivo, ניתוח הראה שביטוי SLC37A2 mRNA באבי העורקים שלמחלת כליות כרוניתחולדות נמצאו בקורלציה עם גנים של סמן אוסטאוגני. יתר על כן, SLC37A2 התבטא באזור ההסתיידות של כלי הדם בחולדות עם מחלת כליות כרונית. כתוצאה מכך, הראינו ש-SLC37A2 היא אחת מהמולקולות שגדלות עםהסתיידות כלי דםin vitro ו-in vivo.

מילות מפתח: SLC37A2,הסתיידות כלי דם, תאי שריר חלק באבי העורקים,מחלת כליות כרונית, היפרפוספטמיה

לחץ כאן כדי לקבל תמצית CISTANCHE אורגנית טבעית עם 25% אכינאקוסיד ו-9% אקטוזיד לתפקוד הכליה

השירות התומך של Wecistanche - יצואנית ה-cistanche הגדולה בסין:

דוא"ל:wallence.suen@wecistanche.com

ווטסאפ/טלפון:+86 15292862950

קנה לפרטי מפרטים נוספים:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

כמספר החולים עםמחלת כליות כרונית(CKD) עולה, מספר החוליםדורש דיאליזהיגדל גם כן. רוב מקרי המוות בחולים שעובריםדיאליזהנובעים ממחלות לב וכלי דםכמואי ספיקת לב, הפרעות מוחיות, או אוטם שריר הלב. (,2) מקור עיקרי שלמחלת לב וכלי דםהוא הסתיידות חוץ רחמית,() חריגה הנגרמת על ידי היווצרות ושקיעה של גבישי סידן פוספט ברקמות רכות. (4 6) גורמים שונים כגון דלקת. עקה חמצונית, ועלייה ברמות הסידן (Ca) והזרחן (P) בפלזמה מעורבים בהתקדמות של הסתיידות כלי דם. בין הגורמים הללו, היפרפוספטמיה קשורה באופן החזק ביותר להסתיידות כלי דם. (7.8) היפרפוספטמיה נגרמת כתוצאה מצריכה עודפת של P בנוכחות ירידה בתפקוד הכליות. לכן, חולים שעוברים דיאליזה צריכים להגביל את צריכת P. (79-12). עם זאת, דווח כיהסתיידות כלי דםכבר מתקדם כאשר מתחילים דיאליזה; זה גם נראה בחולים עם CKD בשלב מוקדם כאשר היפרפוספטמיה אינה ברורה. (3) כתוצאה מכך, חשוב למנוע הסתיידות כלי דם בחולים עם CKD בשלב מוקדם כדי לשפר את תחזית החיים.

מה שמוביל לזרימה מוגברת של P לתאי השריר החלק של כלי הדם (VSMC). זרימת P מתבצעת באמצעות PiT-1, טרנספורטר על פני קרום התא של VSMC. PiT- הוא חבר במשפחת הנשאים המומסים (SLC), הכוללת טרנספורטר נתרן פוספט המקודד על ידי SLC20A1.04 PiT- מעביר פוספט על פני קרומי תאים תלויי Na ולאחר מכן מינרליזציה של מטריקס עקב רמות p גבוהות.s) תוך תאי. רמות ה-P עולות, VSMC מתחילה לבטא גורמי שעתוק אוסטאוגניים, כגון גורם שעתוק הקשור ל-runx 2(Runx2)(16) השפעה זו מלווה בביטוי מוגבר של גנים ספציפיים לאוסטאובלסטים, כגון אוסטאופונטין ואוסטאוקלצין. בנוסף, הפחית את הביטוי של חלבונים ספציפיים לשריר חלק. כגון חלבון שריר חלק 22-0 (SM22-0), מתרחש. כתוצאה מכך, VSMC הופך לתאים דמויי אוסטאובלסט. (1718)מחקרים קליניים אחרונים הראו כי רמות סידן בדם. חלקיקי חלבון (CPP), המייצגים חלקיקים קולואידים של סידן פוספט, עולים עם ירידה בתפקוד הכליות. (19-21) יתרה מכך, מתאמים עם רמות CPP ו-P בדם דווחו.2o2i) ייתכן שה-CpP עשוי לעורר את התקדמות הסתיידות כלי הדם.22-24)

עם זאת, הסתיידות כלי דם נצפתה בחולים עם CKD בשלב מוקדם עם רמות P תקינות בפלזמה. (13) בנוסף.PiT-1 mRNA מתבטא בכל מקום בכל הרקמות. לפיכך מולקולה אחרת עשויה לפעול בעיקר בתחום ההסתיידות של כלי הדם. יש דיווחים על כךדַלֶקֶתמקדם הסתיידות כלי דם. גורמים דלקתיים כגון אינטרלוקין (IL)-1B, IL-6 ו-Tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) גרמו התמיינות שלVSMC לתאים דמויי אוסטאובלסט (2s26) TNF-a גורם להסתיידות כלי דם דרך cAMP pathway, אשר ממלא תפקיד בהתמיינות אוסטאובלסט.2728) IL-6 מווסת מסלולים שונים המובילים להסתיידות כלי דם של VSMC2-31) יתרה מכך. IllB, IL-6 ו-TNF-a הם גם גורמים הקשורים להסתיידות מוגברת של כלי הדם הנגרמת על ידי רמות p גבוהות.3233) עם זאת. הנתונים הנוכחיים אינם מסבירים במלואם את המנגנון של כלי הדם

הסתיידות הנגרמת על ידי גורמים אלה. שיערנו שעשויות להיות מולקולות אחרות הקשורות ל-P כמו אלו במשפחת העל של SLC, המעורבות בהסתיידות כלי דם. התמקדנו בחלבוני ממברנה במשפחת העל SLC וחקרנו מולקולות פוטנציאליות הקשורות ל-P מלבד PiT-1 למעורבות בהסתיידות כלי דם. יתר על כן, בדקנו את הקשר בין מולקולות מועמדות לבין הסתיידות כלי דם בווידאו ובאינבו.

חומרים ושיטות

תרבית תאים. תאי שריר חלקים (AoSMC) נורמליים התקבלו מ-Lonza (באזל, שוויץ) AoSMC תורבת לפי הוראות היצרן. AoSMC נשמרו במצע גדילה (מדיום בסיסי של תאי שריר חלקים בתוספת של 5% סרום בקר עוברי (FBS), גורם גדילה אפידרמיס, אינסולין, גורם גדילה פיברובלסט-B ו-gentamicin/amphotericin-B). אמצעי התקשורת הוחלפו כל יומיים. AoSMC גודלו בחממת 5% CO לחות ב-37 מעלות ונשמרו עד שהגיעה למפגש ולאחר מכן השתמשו בניסויים.

Calcified AoSMC. הסתיידות של AoSMC נגרמה כמתואר קודם לכן.435) AOSMC תופחו במדיום של Dulbecco'smodified Eagle בתוספת של 15% FBS ופניצילין-סטרפטומיצין ותורבתו עם 2.6 mM P למשך 3, 6, 9, 12 ו-14 ימים. ריכוז P הותאם על ידי P bufferNaH, PO/Na ו-HPO. pH 7.2). AoSMCs אחרים לא תורבו עם 2.6 mM P.

מיקרו מערך DNA. נעשה שימוש ב-RNA הכולל של דגימות AoSMC שתורבתו ולא התרבתו עם 2.6 mM P. סך RNA 5.0 ug נותח באמצעות מיקרו-מערך DNA (Agilent Technologies, טוקיו. יפן). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray שימש לבדיקת כ-26,000 גנים. היחס חושב על ידי חלוקת רמת הביטוי של AoSMC בתרבית עם 2.6 מ"מ למשך 12 ימים ברמת הביטוי של AoSMC ללא תרבית עם 2.6 מ"מ P

מיקרו מערך DNA

נעשה שימוש ב-RNA הכולל של דגימות AoSMC שתורבתו ולא התרבתו עם 2.6 mM P. סך RNA 5.0 ug נותח באמצעות מיקרו-מערך DNA (Agilent Technologies, טוקיו. יפן). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray שימש לבדיקת כ-26,000 גנים. היחס חושב על ידי חלוקת רמת הביטוי ב-AoSMC בתרבית ב-2.6 mM למשך 12 ימים ברמת הביטוי ב-AoSMC ללא תרבית עם 2.6 mM P.Expression של SLC37A2 בדלקת כלי דם. כדי לעורר תגובה דלקתית ב-AoSMC, תאים תורבו עם מצע גידול עד שהגיעו למפגש ולאחר מכן טופלו ב-1 ugmL lipopolysaccharides (LPS) (LPS מ-escherichia coli O111:B4; Sigma, St. Louis, MO) למשך 24 ו-72 ללא 2.6 mM P. AoSMC אחרים לא תורבו עם ניתוח תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (PCR). סך ה-RNA הופק מ-AoSMC שטופל ב-LPS במשך 24 ו-72 שעות ותאים שלא טופלו ב-LPS. PCR כמותי בזמן אמת מבוסס SYBR ירוק בוצע באמצעות cDNA מסונתז וערכת פריימר מתאימה לכל גן מטרה עם מערכת PCR בזמן אמת aStepOnePlus (Applied Biosystems, FosterCity, CA). רצפי הפריימר היו כדלקמן: אנושי IL-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' ו-5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; human SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' ו-5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'; גליצרלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- ו-5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGGC-3.IL-6 ורמות ביטוי mRNA של SLC37A2 חושבו לאחר נורמליזציה של GAPDHcal7Expression. AoSMC. סך הכל חולצו מ-AoSMC שלא תורבת עם 2.6 מ"מ P ותאי AoSMC שתורבתו עם 2.6 מ"מ P במשך 3, 6, 9, 12 ו-14 ימים. PCR בזמן אמת בוצע באמצעות ה-cDNA המסונתז. רצפי הפריימר היו כמו להלן: Runx2 אנושי, 5-TGAGAGCCGCTTCTCCAACCC-3', ו-5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3. רמות הביטוי של Runx2 ו- SLC37A2 mRNA חושבו לאחר נורמליזציה עם APPH.

ניתוח סופג במערב.

החלבון הכולל נאסף מדגימות AoSMC שתורבתו באותם תנאים המשמשים לניתוח PCR בזמן אמת. דגימות אלו עברו ליטוש באמצעות תמיסת מלח מבוקרת Tris (pH 75) בתוספת של 5% NP-40 וקוקטייל מעכב פרוטאז של 1%. דגימות ריכוז החלבון נמדדו באמצעות ערכת BCA Protein Assay Kit (Thermo FisherScientific.Waltham, MA). והריכוז הותאם על ידי Western blotting, 10 אג' של חלבון הופרדו בג'ל 10% פוליאקרילאמיד באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל סודיום דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד. הממברנה טופלה בנוגדנים SLC37A2 (Novus Biologicals, Centennial, CO) או GAPDH (GeneTex, Irvine, CA) כנוגדנים העיקריים, מודגרים עם נוגדן מצומד ארנב lgG חזרת פרוקסידאז (R&D Systems, Minneapolis, MN) והוצגו באמצעות Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire, אנגליה) ומנתח תמונות זוהרות (LAS-1000 plus, FUNIFILM, טוקיו, יפן). הלהקה הוכמתה באמצעות lmagel.

נִסיוֹנִי

כל פרוטוקולי המחקר אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת Hyogo, בית הספר למדעי האדם והסביבה. חולדות Sprague-Dawley, זכר בן 12 שבועות, נרכשו מ-Japan SLC (Shizuoka, יפן). החולדות נשמרו במחזור 12-בהיר, 12-שעות כהה (09:00-21:00) ואפשרו גישה חופשית למזון ולמים טהורים במיוחד.

הדיאטות הניסיוניות כוללות דיאטת P בקרה (1.0% P, 0.6Ca, 20% חלבון), דיאטת אדנין (0.75% אדנין , 1.0% P, 0.6%Ca, 2.5% חלבון), דיאטה דלת P (LP) (0.2% P,0 .6% Ca, 10%חלבון), ודיאטה עתירת P (HP) (1.0% P, 0.6% Ca, 10% חלבון) המבוססת על דיאטת AIN93-G (מזרחית שמרים, טוקיו, יפן) עם קזאין כמקור החלבון.3637) דיאטה דלת חלבון דווחה כמעודדת הסתיידות כלי דם בחולדות עם אי ספיקת כליות הנגרמת על ידי אדנין, ולכן בוצעה הגבלת חלבון.3738)לפני קיבוץ, כל החולדות (n=23) הוזנו מדיאטת MF סטנדרטית (שמרים מזרחיים) במשך שבוע כדי להתאקלם. בגיל 13 שבועות חולקו חולדות ל-2 קבוצות: קבוצת הביקורת (n=5) וקבוצת CKD המושרה על ידי אדנין (n=18). קבוצת הביקורת קיבלה את דיאטת הביקורת P למשך 6 שבועות . קבוצת CKD המושרה על ידי אדנין קיבלה את דיאטת האדנין למשך כשלושה שבועות ולאחר מכן חולקה ל-2 תת-קבוצות: קבוצת CKD-LP (n=8) או קבוצת CKDHP (n=10). חולדות מקבוצת CKD-LP וקבוצת CKD-HP קיבלו את דיאטת LP ואת דיאטת HP למשך 3 שבועות, בהתאמה במהלך תקופת הניסוי, צריכת המזון נרשמה מדי יום. במהלך דיאטת אדנין, דגימות דם נאספו מוריד הזנב בין 10:00 בבוקר ל-11:00 בבוקר פעם בשבוע עד השבוע השני, ולאחר מכן אחת ליומיים כדי לנטר את רמות הפלזמה. במהלך דיאטת LP או דיאטת HP, דגימות דם נאספו פעם בשבוע. דגימות שתן נאספו ונפח השתן נרשם פעם בשבוע. חולדות הוקרבו עם חומר הרדמה באמצעות איזופלורן (Wako Pure Chemical Industries. אוסקה יפן) ולפרוטומיות. דגימות דם שנלקחו מהווריד הנבוב התחתון ומאבי העורקים ה-thoracoabdominal, נאספו לצורך ניתוח.

ביטוי SLC37A2 על אבי העורקים.

כשליש מאבי העורקים החזה-בטני שנאספו שימש להמחשה של הסתיידות וביצוע צביעה חיסונית. אבי העורקים הוטבע בפרפין וחתכו 4-מקטעים. חתכים נצבעו בשיטת Von Kossa עבור סידן ערכת (Polysciences. Warrington, PA) לפי הוראות היצרן. ניתוח צביעה חיסונית בוצע עם חתכים סדרתיים. הקטעים הודגרו עם נוגדן SLC37A2 למשך הלילה ב-4 מעלות ולאחר מכן טופלו עם Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Biosciences, טוקיו, יפן) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חלקים טופלו בערכת DABsubstrate (Nichirei).

RNA כולל הוצא משאר אבי העורקים החזה-בטני הקפוא. PCR בזמן אמת בוצע באמצעות ה-cDNA המסונתז. רצפי הפריימר היו כדלקמן: אוסטאו-פונטין של חולדה,5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' ו-5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' ו; חולדה SLC37A2,5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' ו-5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3. רמות הביטוי mRNA של אוסטאופונטין ו-SLC37A2 חושבו לאחר נורמליזציה עם GAPDH

ניתוח סטטיסטי.

הנתונים מוצגים כממוצע + SE. ההבדלים בין הקבוצות נותחו באמצעות מבחן t. בניסויי AoSMC מסוייד המושרה על ידי פוספט, נותחו הבדלים באמצעות ניתוח חד כיווני של שונות ואחריו השיטה של ​​דאנט. בניסויי מודל CKD, ההבדלים נותחו באמצעות מבחן K ruskal-Wallis ואחריו שיטת Steel-Dwass. מקדמי המתאם (rs) נקבעו באמצעות מבחן דירוג מקדם המתאם של Spearman. לכל המבחנים. ערכי p דו-זנביים<0.05 were considered statistically significant.