ציטוטוקסיות סלקטיבית של החומר הצמחי אקטאוזיד נגד תאי גידול ותובנותיו המכניות
Mar 14, 2022
איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com
Christina Cheimonidi et al
תַקצִיר
מוצרים טבעיים מאופיינים בגיוון מבני קיצוני ולכן הם מציעים מקור ייחודי לזיהוי חומרים נוגדי גידולים חדשים. כאן, אנו מדווחים כי החומר הצמחיאקטאוזידבידוד בשיטות פיטוכימיות מתקדמות מעלי Lippia citriodora הראה ציטוטוקסיות מוגברת כנגד תאי גידול גרורתיים; פעלה בסינרגיה עם חומרים ציטוטוקסיים שונים ותאים סרטניים עמידים לכימו.אקטאוזידלא היה רעיל בהקשרים תאיים פיזיולוגיים, בעוד שהוא הגביר עומס חמצוני, השפיע על פעילותם של מודולים פרוטאוסטטיים ודיכא מטלופרוטאינזים של מטריקס בשורות תאי גידול. מתן תוך-צפקי או פומי (באמצעות מי שתייה) של אקטאוזיד במודל של עכבר מלנומה העלה ויסות של תגובות נוגדות חמצון בגידולים; עם זאת, רק לידה תוך-צפקית דיכאה את צמיחת הגידול ועוררה תגובות חיסוניות נגד גידולים. ניתוחי זיהוי/כימות בספקטרומטריית מסה גילו כי מסירה תוך פריטונאלית שלאקטאוזידהביא לריכוז גבוה משמעותית של התרכובת בפלזמה ובגידולים של עכברים מטופלים בהשוואה למתן פומי, מה שמצביע על כך שהאפקט האנטי-גידולי שלו in vivo תלוי בדרך המתן ובריכוז שהושג בגידול. לבסוף, מחקרי מודלים מולקולריים ומבחני פעילות אנזימטית הראו זאתאקטאוזידמעכב חלבון קינאז C. לסיכום, לאקטאוזיד יש הבטחה כפיגום כימי לפיתוח תרופות נוגדות גידולים חדשות.
מילות מפתח:אקטאוזיד, סרטן, תרכובת טבעית, מתח חמצוני, פרוטאוסטזיס, אימונומודולציה
1. הקדמה
קרצינוגנזה מאופיינת בדה-וויסות של מספר מסלולי איתות של תאים וקשורה ללחץ חמצוני, רפליקטיבי, מטבולי, גנוטוקסי ופרוטאוטוקסי מוגבר [1]. כדי להסתגל ולהתגבר על פנוטיפים אלה של לחץ, תאים ממאירים מעלים ויסות (מלבד אונקוגנים) מספר מסלולים לא אונקוגניים במטרה לדכא או (לפחות) להקל על מתח מתמשך. בין המסלולים השונים הלא-אונקוגניים שנמצאו כבעלי ויסות גבוה יותר במהלך הגידול בגידול הם המודולים של רשת הפרוטאוסטזיס (PN) יחד עם תגובות נוגדות חמצון תאיות [2,3].
מרכיבי המפתח של ה-PN הם שני מכונות הפירוק העיקריות, כלומר מסלול האוטופגיה-ליזוזום (ALP) ומסלול Ubiquitin-Proteasome (UPP), יחד עם הרשת של הצ'פרונים המולקולריים התאיים. ALP מעורב בעיקר בפירוק של אגרגטים חלבונים ואברונים פגומים [4], בעוד UPP מפרק חלבונים נורמליים קצרי חיים וחלבונים שאינם ניתנים לתיקון שגוי מקופלים או לא מקופלים [5-8]. הפרוטאזום 26Seukaryotic מורכב מהחלקיקים הרגולטוריים של 19S (RP) ומחלקיק 20 Score (CP); האחרונה מורכבת מארבע טבעות הפטאמריות מוערמות (שתיים מהסוג המקיפות שתיים מהסוג) היוצרות מבנה דמוי חבית. פעילויות פרוטאזום פפטידאזות דמויות כימוטריפסין (CT-L), דמויות טריפסין (TL) ו-Caspase-like (CL) ממוקמות בתת-יחידות הפרוטאזומליות 5, 2 ו-1, בהתאמה [6]. היעילות הקלינית המווכחת של מעכבי הפרוטאזום Bortezomib (Velcade®; נקראים גם PS-341) ו-Carfifilzomib כנגד גידולים המטולוגיים שונים [9] סיפקה את "הוכחת הרעיון" של מיקוד UPP כאסטרטגיה מבטיחה עבור טיפול בסרטן. הרשת המורכבת של מסלולי הגנה נוגדי חמצון תאיים המווסתת לעתים קרובות במהלך סרטן [3,10] כוללת אנזימים נוגדי חמצון, כמו גם מספר גורמי שעתוק המגייסים תגובות גנומיות ציטו-פרוקטטיביות; אלה כוללים את תיבת המזלג O (Foxo) ואת הגורם הגרעיני אריתרואידי 2-הגורם הקשור (Nrf-2). Nrf-2 הוא מרכזי בהגנה על תאים מפני נזק חמצוני ו/או קסנוביוטי מכיוון שהוא ממריץ את הביטוי של גנים נוגדי חמצון ושלב II [11-13].
לאחרונה אנו ואחרים הצענו כי התמקדות בתלות הגידול הללו (כלומר, מודולים פרוטאוסטטיים ו/או מסלולי תגובה נוגדי חמצון) או הגדלת רמות התא של ROS בהקשר של גנוטיפ שעבר טרנספורמציה מציעים חלון טיפולי פוטנציאלי להרג סלקטיבי של תאי גידול [3] ,14]; כתמיכה, דווח על הרג סלקטיבי של תאים סרטניים על ידי מולקולה קטנה שהעלתה את רמות ה-ROS התאיות [2]. צפוי שגישות קומבינטוריות הכוללות גם הפעלה של תגובות חיסוניות נגד גידולים [15] ככל הנראה ימקסמו את החלון הטיפולי המוצע על ידי עיכוב PN ותגובות נוגדות חמצון ו/או על ידי העלאת רמות ROS התאיות.
מוצרים טבעיים (תמציות או תרכובות טהורות) (NPs) ממקורות שונים (צמחים, אורגניזמים ימיים, מיקרואורגניזמים וכו') נבדקים על יכולתם לפעול כסוכנים נגד גידולים בשל המגוון המבני והמורכבות הכימית הקיצונית שלהם, וכן בגלל הם פועלים באופן פליאוטרופי תוך אפנון של מספר מסלולי איתות סלולריים [16]. על פי הדיווחים, NPs מפעילים תגובות אנטי דלקתיות, אנטי גידוליות ו/או אנטי גרורות [16,17] וגם מתחמקים מתנגודת ריבוי תרופות [18,19]. בין אלה, תרכובות פנוליות (כולל גליקוזידים פנילתנואידים) משכו עניין משמעותי בגלל תפקידן המדווח במניעה ו/או טיפול במחלות אנושיות שונות.
אקטאוזיד, הנקרא גם usage או verbascoside [20], הוא גליקוזיד פנילתנואיד מבודד מדו-קוטילונים רבים. לפי הדיווחים, אקטאוזיד מפעיל כמה פעילויות ביולוגיות מעניינות, כולל תכונות נוגדות חמצון, אנטי דלקתיות ותכונות מווסתות אפופטוזיס בתאים [21,22]. עם זאת, הפעילות האנטי-גידולית הפוטנציאלית שלו לא טופלה. אנו מדווחים כאן כי אקטאוזיד הראה ציטוטוקסיות מוגברת כנגד תאי סרטן יונקים ללא השפעות רעילות ברורות בהקשרים תאיים פיזיולוגיים. יתר על כן, אקטאוזיד דיכא את צמיחת גידולי מלנומה במודל העכבר של Vivo, על ידי (בין היתר) הפעלת תגובות חיסוניות אנטי-תגובתיות לגידולים.
2. חומרים ושיטות
2.1. חומר צמחי ומיצוי
עלי Lippia citriodora (Lmiaceae) מיובשים (4.5 ק"ג) נרכשו מהשוק המקומי באתונה, יוון. העלים נגרסו וחולצו על ידי ערבוב מכני במשך 12 שעות עם מתנול (2 × 20 ליטר). התמצית המתנולית התאודה ליובש ונשטפה בתערובת של CH2Cl2/MeOH 98/2 (15 ליטר). השאריות הבלתי מסיסות הופרדו וייבשו, ויצרה אבקה ירוקה-צהובה (450 גרם).
2.2. טיהור של אקטאוזיד וניתוח UPLC-HRMS
חלק (10 גרם) מהשייר הנ"ל עבר לכרומטוגרפיה נגד זרם באמצעות מנגנון כרומטוגרפיה צנטריפוגלי מהיר (FCPC) (Kromaton, צרפת); תערובת של EtOAc/EtOH/H2O ביחס 5/0.5/4.5 שימשה כמערכת ממס דו-פאזית. שברים שנאספו עברו לכרומטוגרפיה של שכבה דקה; לאחר מכן נצפו הכרומטוגרמות תחת מנורת UV (254 ו-365 ננומטר) והוצגו על ידי ריסוס עם מתנול ונילין גופרתי ולאחר מכן חימום למשך שתי דקות. סך של 2.1 גרם של אקטאוזיד (טוהר גדול מ-90 אחוזים או שווה ל-90 אחוזים) בודדו בתהליך האמור לעיל. זיהוי האקטאוזיד בוצע על ידי תהודה מגנטית גרעינית (NMR) וספקטרומטריית מסה (MS), בעוד שטוהרתו נקבעה על ידי ניתוח UPLC-MS ו-NMR; לפרטים ראה תוספת. חומרים ושיטות.
2.3. קוי טלפון
פיברובלסטים עובריים ריאתיים אנושיים (תאי IMR90) יחד עם שורות תאים של עכברים B16.F1, B16.F10, YAC-1 ו-WEHI-164 התקבלו מאוסף הרקמות האמריקאי (ATCC). קווי התאים U2 OS ו- Sa OS אנושיים נתרמו באדיבות על ידי פרופ' V. Gorgoulis (בית הספר לרפואה, האוניברסיטה הלאומית והקפודיסטריאן של אתונה, יוון), בעוד שתאי האוסטאוסרקומה של KH OS וקווי התאים האוסטאוסרקומה העמידים לכימו [23] היו תרומה של ד"ר א. גונוס (הקרן הלאומית למחקר הלני, יוון). שורות תאי סרטן העכבר C5N ו-A5 שייכות למודל של סרטן עור רב-שלבי של עכבר [24,25] ונתרמו על ידי פרופ' A. Balmain (מרכז הסרטן המקיף, אוניברסיטת קליפורניה, ארה"ב). תנאי התרבות של שורות התאים המשומשות מדווחים ב- Suppl. חומרים ושיטות.
תועלת שלcistanche acteoside
2.4. זכר דגם עכבר מלנומה
עכברי C57BL/6 (25-30 גרם במשקל, גיל 6-8 שבועות) הושגו ממכון הלניק פסטר ושוכנו בטמפרטורה מבוקרת (22 מעלות) ובתקופת צילום (12 שעות אור: 12 שעות כהה ) עם גישה חופשית למים ומזון. עכברים חוסנו תת עורית עם 105 תאי מלנומה B16.F1 (ב-100 μL PBS) והוקצו באקראי ל-3 קבוצות (n=5/קבוצה). כאשר גידולים הפכו למוחשים (יום 11) עכברים קיבלו אקטאוזיד בשני מסלולים; או תוך צפקית (IP) (1 מ"ג/עכבר מדולל ב-200 μL PBS; בסך הכל 6 מנות ניתנות כל יומיים) או דרך הפה על ידי שתיית מים (OR) (2.5 מ"ג/עכבר; בסך הכל 13 מנות במשך 13 ימים רצופים). לעכברי ביקורת קיבלו PBS. צמיחת הגידול תועדה כל יומיים על ידי מדידת הצירים העיקריים והקטנים של הגידולים שנוצרו עם קליפר דיגיטלי. המדידות הועברו לנפח גידול באמצעות הנוסחה: נפח גידול (cm3)=ציר ראשי × ציר קטן2 × 0.5. ביום 28, בעלי חיים הורדמו על ידי נקע בצוואר הרחם, והטחול הוסרו באופן אספטי. הניסוי חזר על עצמו שלוש פעמים עם ממצאים דומים.
ספלנוציטים בודדו מטחולים הומוגניים בנפרד ונבדקו מיד עבור ציטוטוקסיות שלהם לעומת יעדי תאי B16.F1, YAC-1 ו-WEHI-164. ציטוטוקסיות הוערכה בהתבסס על זיהוי של חשיפה ל-CD107 על פני התא, כתוצאה מפירוק תאי אפקטור. ספלנוציטים (105 תאים/באר) תורבו יחד עם מטרות במיקרו-צלחות תחתונות 96-well U ביחס של משפיער למטרה (E:T) של 100:1, ב-37 מעלות ב-5% CO2. בכל באר נוספו נוגדנים חד שבטיים אנטי-CD107a ו-CD107b מצומדים ב-FITC (25 μL/mL) ומוננסין (6 μL/mL; כולם מ-BD Biosciences). תאים נקצרו 6 שעות לאחר מכן ונותחו באמצעות ציטומטר זרימה FACSCanto II. במקביל, גידולים נכרתו ועובדו עבור מבחני במורד הזרם כמתואר ב- Suppl. חומרים ושיטות.
cistanche acteoside
