RNA-Seq מבוסס De Novo Transcriptome Assembly וגילוי גנים של Cistanche Deserticola בשרני-Ⅱ

סיווג פונקציונלי של כל התמלילים המובעים בהתבסס על אונטולוגיה גנטית ומסדי נתונים של KEGG

הערת Gene Ontology (GO) התקבלה מקובץ הביאור והשיוך של UniProt. בסך הכל, 20,907 תמלילים, המהווים 32.69% מסך הרצפים המבוטאים, הוקצו ל-1,745 מונחים פונקציונליים. מתוך כלל מונחי ה-GO הפונקציונליים, ההקצאות לתהליך הביולוגי היוו את הרוב (1,116, 63.95%) ואחריהם הרכיב הסלולרי (329, 18.85%) ותפקוד מולקולרי (300, 17.20%). הפונקציות שהוקצו של תמלילים מפורשים כיסו מגוון רחב של קטגוריות GO, ו-10 מונחי ה-GO המובילים עם התמלילים המוערים ביותר פורטו בטבלה 3. אנו מספקים את כל התמלילים המפורשים בשלוש קטגוריות אונטולוגיה של גנים (תפקוד מולקולרי, רכיב סלולרי ו תהליך ביולוגי) בקובץ המשלים (S3 Dataset). מונחי GO הקשורים לתפקודים מחייבים ופעילות טרנספראז היו מיוצגים בעיקר בקטגוריית התפקוד המולקולרי. לגבי פונקציות הקישור, קשירת קטיון (4,394 תעתיקים) ייצגה את הנפוצה ביותר, ואחריה קישור נוקלאוטיד/נוקלאוזיד (3,404 תמלילים בממוצע) וקשירת חלבון (2,422 תמלילים). בעוד שבקבוצת פעילות טרנספראז, הכי הרבה הם אלו עם קבוצות המכילות זרחן מעבירות (2,256 תעתיקים, 65.77%). בקרב קטגוריית הרכיבים התאיים, התמלילים היו יותר ממוקמים תוך-תאיים (10,581 תמלילים בממוצע), בעוד שבקטגוריית התהליך הביולוגי, התמלילים היו מעורבים יותר בתהליך המטבולי הביופולימרי (6,683 תמלילים בממוצע), ואחריו וויסות התהליך הסלולרי (4,841 תמלילים). ), ביטוי גנים (4,678 תעתיקים) ותחבורה (3,512 תעתיקים).

TURAL CISTANCHE TUBULOSA למניעת מחלת אלצהיימר PHGS75% ECH 30% ACT 12%

כדי לכרות גנים המעורבים בביוסינתזה של ליגנין ו-PhG, נבדקו 21,358 רצפי חלבון פוטנציאליים שאינם מיותרים כנגד רצפי גנים של 13 אורגניזמים צמחיים במסד הנתונים של KEGG, והם הוקצו ל-275 מסלולי KEGG עם לפחות 5 כניסות. 10 המסלולים המובילים עם הרצפים המיושרים ביותר מפורטים בטבלה 4. רוב המסלולים היו מעורבים בתהליכים מטבוליים ראשוניים, כגון מטבוליזם של חומצות אמינו או חלבון (ko01230, ko04141 ו-ko04120), חילוף חומרים של פחמימות (ko01200 ו-ko00500), ונוקלאוטיד או מטבוליזם של נוקלאוזידים (ko03018, ko00230 ו-ko00240). חוץ מזה, ישנם 27 מסלולים הקשורים לחילוף חומרים משניים (איור 2), כגון ביוסינתזה של עמוד השדרה של טרפנואידים, ביו-סינתזה של פניל-פרופנואידים, ביו-סינתזה של קרוטנואידים, ביו-סינתזה של אלקלואידים של איזוקינולין, וביוסינתזה של טרופן, פיפרידין ופירידין אלקלואיד. תוצאות אלו מספקות אינדיקציה נוספת לכך שתהליכים מטבוליים פעילים היו בעיצומםC. deserticolaרקמת גזע. כל התמלילים המבוטאים הקשורים לנתיבי KEGG נרשמו בקובץ המשלים (S4 Dataset). למרות שיש כמה מסלולים שהשתנו באופן משמעותי בין C. deserticola לצמחים אחרים, כגון אורז (S5 Dataset), המטרה העיקרית שלנו במחקר זה היא לחשוף את כל פרופיל התעתיק של גזע C. deserticola ולדמיין את המסלולים הקשורים לביוסינתזה של PhGs מה שיכול להיות שימושי להנחיית הטיפוח.

גנים מועמדים המקודדים לאנזימים המעורבים בביוסינתזה של ליגנין

לגנין הוא הפולימר הטבעי היבשתי השני בשכיחותו בממלכת הצמחים, המרכיב עד שליש מהחומר המצוי בדפנות תאי הצמח. כמרכיב חשוב בדפנות התא, ליגנינים מסייעים להובלת מים, מספקים תמיכה מכנית ושלמות מבנית, ומתגוננים מפני פתוגנים ואוכלי עשב. תפקידים אלה של ליגנין הם בעלי ערך רב בתמיכה בגידול הזקפה התת-קרקעי של C. deserticola במדבר. במחקר זה, הצגנו את התמונה השלמה של מסלולי ביוסינתזה של ליגנין ב-C. deserticola (איור 3), בהם מונומרים ליגנין עוברים סינתזה ביולוגית מפנילאלנין באמצעות סדרה של תגובות אנזימטיות, כולל הידרוקסילציה, מתילציה, הפחתה ותהליך פילמור חמצוני. אנזימים הקשורים לביו-סינתזה של ליגנין זוהו עבור שלוש צורות מסונתזות בעיקר ברקמת כלי הדם (p-hydroxyl-phenyl (H), guaiacyl (G) ו-syringyl (S) lignin) ו-5-hydroxyl-guaiacyl lignin שזוהה רק בצמחים חסרי COMT (כמו חומצה קפאית 3-O-methyltransferase, EC 2.1.1.68) (כגון נוק-דאון).

פנילאלנין אמוניה-ליאז (PAL, EC 4.3.1.24) הוא האנזים המפתח הראשון במסלול הביוסינתזה של ליגנין (איור 3) אשר הופך פנילאלנין לחומצה קינמית על ידי דמינציה לא חמצונית. סך של 6,297 קריאות PAL רוצו ו-7 תמלילי PAL הורכבו ב-C. deserticola (טבלה 5). על ידי השוואת דמיון ברצף, מצאנו שלארבעה מהם (comp28550_c1_seq1/2/3/5) יש יותר מ-95% דמיון עם רצף ה-mRNA הידוע של C. deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), בעוד ש-comp28550_c1_seq4 ו-comp25940_c0_seq1 היו בעלי דמיון של 77% ו-82%, בהתאמה. חיזוי ORF גילה של 5 תעתיקים יש פוטנציאל של קידוד חלבונים ונושאים עם תחום ליאז של חומצת אמינו ארומטית (PF00221.14). ביניהם, רק התעתיק comp28550_c1_seq4 יכול לקודד רצף חלבון שלם של 718 שיירי חומצות אמינו. דווח ש-PAL הקודד על ידי משפחה רב-גנים קטנה ברוב מיני הצמחים, כגון 4 ב- Arabidopsis thaliana, 5 ב- Populus trichocarpa, 3 ב- Scutellaria baicalensis ו-7 Cucumis sativus וכו'. הניתוח הפילוגנטי שלנו הציע שיש 4 גנים המקודדים ל-PAL ב-C.

deserticola וקראנו להם CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 ו-CdPAL4, בהתאמה (איור S2). 4-coumarate-CoA ligase (4CL, EC 6.2.1.12) ו-trans-cinnamate 4-monooxygenase (CYP73A, EC 1.14.13.11) הם שני אנזימים שאחראים על הפיכת חומצה קינמית ל-dicumarol-CoA בשני הפוך הזמנות. הם גם נמצאים בעמוד השדרה, וערכי הביטוי שלהם FPKM הם 39.57 ו-51.93, בהתאמה.

ארבעת סוגי הליגנינים עברו סינתזה ביולוגית על ידי מסלולים שונים שנשלטו על ידי שלושה אנזימים מרכזיים, Cinnamoyl-CoA reductase (CCR, EC 1.2.1.44), shikimate o-hydroxycinnamoyltransferase (HCT, EC 2.3.1.133) ו-ferulate{{1{ {56}}}}הידרוקסילאז (F5H, EC 1.14.-.-). CCR דווח כנקודת בקרה של מסלול הליגנינים [50, 51] אשר זירז את X-CoA (X כולל dicoumarol, caffeoyl, feruloyl, 5-hydroxyl-feruloyl ו-sinapoyl) לתוך Y-aldehyde (Y כולל p -קוגר, קפאויל, קוניפריל, 5-הידרוקסיל-קונפריל, ו-Snap), בעוד HCT זירז p-coumaroyl-CoA לחומצה שיקמית p-coumaroyl/p-coumaroyl quinic acid. שני האנזימים, ממש כמו מתג, ויסתו את הביוסינתזה של P-hydroxyl-phenyl lignins או שלושת הסוגים האחרים של ליגנינים. F5H היה מתג ענף נוסף שהסדיר את סירינגיל ליגנין ואת 5-הידרוקסיל-גואיאציל ליגנין. אנזימים חשובים אחרים, כולל חומצה קפאית 3-O-methyltransferase (COMT, EC 2.1.1.68), caffeoyl-CoA O-methyltransferase (CCoAOMT, EC 2.1.1.104), ו-cinnamyl-alcohol dehydrogenase (CAD, EC 1.51.1.1. ) זוהו גם באו לידי ביטוי. מידע מפורט על ביטוי מופיע בטבלה 6. גנים אלו של אנזים שזוהו במחקר זה יספקו משאב רב ערך למחקרים גנומיים פונקציונליים בצמח מרפא חשוב זה. 10 גנים הקשורים למסלול הביוסינתזה של ליגנינים בטבלה 6 נבחרו לאימות RT-qPCR כדי לאשר את תוצאות ה-RNAseq שלנו (איור 4), והמתאמים הגבוהים שלהם (מקדם מתאם Pearson: 0.90343) הצביעו על דיוק ושחזור גבוהים של ניתוח התעתיק שלנו. S1 Dataset מפרט את רצפי ה-primer המשמשים בניתוח זה.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA לשיפור התפקוד המיני PHGS75% ECH 30% ACT 12%

גנים מועמדים המקודדים לאנזימים המעורבים בביוסינתזה של PhGs

גלוקוזידים של פנילאתנואידים (PhGs) ידועים כמרכיבים הפעילים העיקריים ב-C. deserticola עם פעילויות של שיפור העוצמה המינית, ניקוי רדיקלים חופשיים ואנטי-אייג'ינג. שלושה מרכיבים כימיים של PhGs הם חומצה אורגנית, סכריד ו-phenylethanol aglycon (איור 3). החומצות האורגניות כולל חומצה קפאית, חומצה פרולית וחומצה קומלית הן תוצרים של מסלול הביוסינתזה של פניל ​​פרופנואיד. מרכיבי הסכריד כולל גלוקוז ו-rhamnose הם תוצרים של מסלולי חילוף החומרים של פחמימות, כגון מטבוליזם של עמילן וסוכרוז, מטבוליזם של סוכר אמינו וסוכר נוקלאוטידים, מטבוליזם של פרוקטוז ומנוזה, וכו'. עם זאת, מסלול הביוסינתזה של חלק הפנילטנול אינו ברור עדיין. כאן, הצענו שני מסלולי ביוסינתזה אפשריים של פנילטנול בהתבסס על נתוני הרצף שלנו. האחד הוא המסלול המדווח של חומצה קפאית או חומצה פרולית, המכונה גם מסלול חומצה קינמית הדומה למסלול עמוד השדרה של ביוסינתזה של ליגנין. מסלול נוסף מבוסס על מסלול חילוף החומרים של פנילאלנין (איור 3), שבו הפנילאלנין לפנילתנול הושג על ידי 'מסלול אנרליך' ידוע שנמצא לראשונה בשמרים לפני מאה שנה ואושר בפרחי פטוניה, עגבנייה וורד. התגלו ארבעה גנים אנזים המקודדים אספרטאט/טירוזין אמינוטרנספראז, היסטידין-פוספט אמינוטרנספראז ו-primary-amine oxidase אשר אחראים על ההמרה של פנילאלנין ל-phenylethanol באו לידי ביטוי בגזע של C. deserticola. התוצר של פניל ​​אתנול עשוי להיות מחומצן נוסף על ידי מונואוקסיגנאז או מתילציה על ידי מתילטרנספראז לנגזרות שלו (פניל אתנול אגליקון) אשר לוקחות חלק בביוסינתזה של PhG. לסיכום, הוצעו שני מסלולי ביוסינתזה משוערים של פנילטנול אגליקוןC. deserticolaאבל עדיין צריך מחקר נוסף.

דיונים

בשנים האחרונות, גנומיקת צמחים התפתחה במהירות עם יישום טכנולוגיית הדור הבא של רצף, בעוד שמחקרים מעטים התמקדו בגנומיקה של צמחי מרפא מדבריים. יש צורך דחוף לבצע מחקר גנומי או תעתיק כדי להבין את התאמתו לבצורת ולסביבות מליחות ואת מסלול הביוסינתזה של הרכיבים הביו-אקטיביים העיקריים. גילוי התעתיק דה נובו עבור כמה צמחים רפואיים,

כגון ג'ינסנג Panax, Ginkgo biloba ו-Glycyrrhiza uralensis נוצלו לראשונה באמצעות פלטפורמת Roche 454 לאורכה הארוכה של הקריאה. בגלל יכולת ההרכבה האפקטיבית עם קריאה קצרה, במיוחד הקריאה המועדפת בקצה הזוגי, נעשה שימוש נרחב גם בריצוף והרכבה מבוססי תעתיקים עבור מודלים ואורגניזמים שאינם מודל. במחקר הנוכחי, יצרנו כ-8G של קריאות קצה זוגיות של 101 bp ויצרנו רצפי אוניגן ארוכים יותר עם אורך ממוצע של 725 bp. נתוני תעתיק ספציפיים לגזע יכולים לספק נתוני התייחסות שימושיים ולשמש לכריית חילוף החומרים המשני של רכיבים ביו-אקטיביים של C. deserticola. יש 81.62% מסך הקריאה הגולמית שעברו מסנני איכות מחמירים (כולל חיתוך מתאם וביטול קריאה באיכות נמוכה) לפני ההרכבה, מה שמרמז על האיכות הגבוהה של נתוני הרצף שלנו, ו-82.08% מהקריאות האיכותיות היו שימושיות להרכבה. קריאות אחרות שנכשלו בשימוש להרכבה עשויות להגיע משגיאות רצף, פרמטרי הרכבה וכו'. קריאות באיכות גבוהה שאינן בשימוש נשארו מועילות בשיפור הרכבה דה נובו בשילוב עם קריאה ארוכה יותר מפלטפורמה אחרת (כגון Roche 454) בעתיד.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA לשיפור התפקוד המיני PHGS75% ECH 30% ACT 12%

מספר רב של תמלילים מורכבים (30,098) הראו קווי דמיון גבוהים ברצף לגנים ידועים במאגרי מידע ציבוריים, מה שמצביע על כך שהנתונים המזווגים מבוססי Illumina שלנו כיסו חלק ניכר מהתמלילים של C. deserticola. תעתיקים ללא פגעי BLAST עשויים להיות בגלל אזורים לא מתורגמים ב-3' או 5', RNA לא מקודד או רצפי גנים חדשים של C. deserticola. התמלילים המובעים צוינו למגוון רחב של קטגוריות GO ומסלולי KEGG (טבלאות 3 ו-4), שבהן תמלילים רבים הוקצו למסלולים הקשורים לחילוף חומרים משניים. כידוע, פניל-פרופנואיד יכול לתפקד כתרכובת אנטי-מיקרוביאלית הניתנת להשראתה עם רווחה רבה לאורח חיים תת-קרקעי [1], וגם לפעול כמולקולת איתות באינטראקציות בין צמחים למיקרובים מלבד התועלת הרפואית שלה [68, 69]. טרפנואיד משמש לבוסינתזה של רכיבים ביו-אקטיביים (כגון 6- deoxycatalpol) [70]. מצאנו שגנים המעורבים במסלול הביוסינתזה של עמוד השדרה של פניל ​​פרופנואיד ושל טרפנואיד היו בשפע רב ב-C. deserticola. חשוב מכך, הגילוי של מסלולים מיוצגים היטב של ביוסינתזה של ליגנין (איור 3) הצביע על התהליך המטבולי הפעיל של ליגנין בגזע C. deserticola. כל הגנים הידועים של האנזים המעורבים בביוסינתזה של ליגנין (איור 3) זוהו באו לידי ביטוי, ולארבעה אנזימים מרכזיים כולל PAL, CCR, HCT ו-F5H היו שפע ביטוי נמוך יותר (FPKM 26.47, 3.89, 3.4 ו-3.83, בהתאמה) בהשוואה ל גנים אחרים של אנזים (טבלה 6). האם שינוי הביטוי של שלושת הגנים הללו יכול להשפיע על ייצור ליגנין ב-C. deserticola ראוי למחקר נוסף. PAL הוא אנזים מפתח בביו-סינתזה של ליגנין ומעורב גם בביו-סינתזה של פניל ​​פרופנואיד, רסברטרול, פלבנואיד וקומרין [71-74]. זיהינו ארבעה גנים PAL ברורים בגנום C. deserticola (איור S2) אשר עלה בקנה אחד עם ה-PAL הזה שקודד על ידי משפחת מולטיגנים קטנה [39, 43, 45-49] והוכחנו עוד יותר שהוא עשוי למלא תפקידים חשובים בשטף הפחמן המטבולי .

PhG הוא החומר הפעיל העיקרי ב-C. deserticola. גנים המעורבים בביוסינתזה של פנילטנול חשובים לאיכות של C. deserticola. הסקנו שני מסלולי ביוסינתזה שונים של פניל ​​אתנול ו-17 גנים של אנזימים המעורבים בביוסינתזה של PhG בגזע C. deserticola. התהליכים האפשריים שלאחר קפה/חומצה פרולית (איור 3) נגזרו גם הם לראשונה על סמך נוסחה מבנית של תוצרי ביניים ותכונות קטליטיות של אנזימים מקבילים, שבה החומצה הקפאית/פרולית תחמצן לראשונה לנגזרת פנילפירובט; לאחר מכן, קבוצת הקרבוקסיל נשללה על ידי דקרבוקסילאזות; לבסוף, קבוצת האלדהיד הומרה בחזרה לקבוצת אלכוהול על ידי דהידרוגנאז. זהו היישום הראשון של טכנולוגיית רצף קצה מזווג של Illumina כדי לחקור את כל התעתיק של C. deserticola ולהרכבת קריאות RNA-seq ללא גנום התייחסות. מחקר זה יספק משאבים ורצפי גנים שימושיים למחקר גנומי פונקציונלי ופרוטאומיקה על C. deserticola בעתיד.

מסקנות

במחקר זה, סקרנו את התעתיק של גזע C. deserticola בהתבסס על נתוני רצף בתפוקה גבוהה, זיהינו גנים המעורבים במסלולי ביוסינתזה של ליגנין, וגם הסקנו את מסלול הביוסינתזה הפוטנציאלי של PhGs בפעם הראשונה, מה שבוודאי יאיץ את ההבנה של התהליכים הפיזיולוגיים המעורפלים והערך הרפואי הרב ברמה המולקולרית. עד כה, זהו הניסיון הראשון להרכיב דה נובו את כל התעתיק של גזע C. deserticola ולזהות את מסלול הביוסינתזה של רכיבים רפואיים באמצעות מערכי נתונים של רצף מבוססי Illumina. המחקר שלנו עשוי לקדם פיתוח של תרופות טבעיות ובחירת זנים בעלי תכונות רפואיות.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA לשיפור התפקוד המיני PHGS75% ECH 30% ACT 12%