השפעה רינו-פרוטקטיבית של איזוליקווריטיגנין על פגיעה חריפה בכליות הנגרמת על ידי ציספלטין באמצעות עיכוב של FPR2 במקרופאג

למידע נוסף, צור קשר עם: ali.ma@wecistanche.com

Tan Rui-Zhi et al

לחץ ל- Cistanche לטיפול במחלת כליות

תַקצִיר

פגיעה חריפה בכליות (AKI) הוא סיבוך רציני בחולים קשים. עדויות מצטברות הצביעו על כך שמקרופאגים ממלאים תפקיד פרו-דלקתי חשוב בפגיעה חריפה בכליותו- isoliquiritigenin (ISL) יכולים לעכב דלקת מקרופגית, אך תפקידו בפגיעה חריפה בכליותוהמנגנון הבסיסי אינו ידוע. מטרת המחקר הנוכחי היא לחקור את ההשפעה המגן מחדש של ISL על AKI ואת תפקידם של קולטני Formylpeptide 2 (FPR2) בתהליך זה. במחקר זה, מודל ה-AKI המושרה על ידי ציספלטין והמודל הדלקתי של מקרופאגים המושרה על ידי ליפופוליסכרידים הופעלו לביצוע הניסויים in vivo ו-in vitro. התוצאות הראו ש-ISL הקלה מאודפגיעה בכליותועיכוב דלקת כליות in vivo ומדכא את התגובה הדלקתית המקרופגית במבחנה. חשוב לציין, נמצא ש-FPR2 היה מווסת באופן משמעותי בהשוואה לקבוצת הביקורת במקרופאגים המושרים על ידי AKI ו-LPS, בעוד שהוא דוכא חזק על ידי ISL. מעניין לציין שביטוי יתר של FPR2 עם טרנספקציה של pcDNA3.1-FPR2 הפך למעשה את ההשפעה האנטי-דלקתית של ISL במקרופאגים, מה שמרמז ש-FPR2 עשוי להיות המטרה הפוטנציאלית של ISL למניעת דלקת ולשיפורפגיעה בכליותשֶׁלפגיעה חריפה בכליות. ביחד, ממצאים אלה הצביעו על כך ש-ISL השתפר בהשראת cisplatinפגיעה בכליותעל ידי עיכוב FPR2 מעורב דלקת מקרופגית, אשר עשוי לספק אפשרות טיפולית פוטנציאלית עבור AKI.

1. הקדמה

חַדכִּליָהפציעה (AKI) היא סוג חמור שכיח שלכִּליָהמחלה עם תמותה גבוהה.1 היא מאופיינת בירידה מהירה בתפקוד הכליות המתרחשת תוך 7 ימים או פחות. פרסומים אחרונים דיווחו כי השכיחות של AKI היא עד 5 אחוזים מהמאושפזים ו-30 אחוזים מהחולים הקשים, וכןAKIגורם ל-2 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם מדי שנה, מה שהפך לבעיה בריאותית עולמית. למרות שההגדרה היא רגילה ואחידה, AKI יכולה להיגרם ממגוון סיבות, כולל צריכת תרופות נפרוטוקסיות, פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה (Ischemia-reperfusion injury, IRI), אלח דם, ניתוחי לב וכלי דם, יתר לחץ דם וסוכרת.2,3 Old גיל, סוכרת ואי ספיקת לב מגבירים את הסיכון ל-AKI, שבדרך כלל מוביל למחלת כליות כרונית בלתי הפיכה (CKD) ולמחלת כליות סופנית (ESRD) בחלק מהחולים.4 יש לציין, מחקרים הראו שכמעט כל תאי החיסון מעורבים בדלקת החיסונית של הכליה ב-AKI.5 ביניהם, הוכח כי למקרופאגים יש תפקיד חשוב בקידום דלקת כליות.6 מחיקת מקרופאגים משפרת את הפגיעה והדלקת בכליות AKI.7 לכן, עיכוב יעיל של דלקת מקרופאגית עשוי להועיל עבור שיפור הגישות הטיפוליות הנוכחיות לניהול AKI.

Isoliquiritigenin (ISL) הוא פלבנואיד בעל מבנה צ'לקון, המושרש ברפואת הצמחים הסינית המסורתית המפורסמת.8 בשנים האחרונות, הוא משך תשומת לב רבה מצד מדענים בשל נוגד החמצון, אנטי דלקתי, אנטי צבירה של טסיות דם, אנטי בקטריאלי. , תכונות אנטי-ויראליות, אנטי-גידוליות, מגן על הכבד, נוירו-הגן, הגנה על הלב וניקוי רעלים.9 הוכח כי ISL מעכב שגשוג תאים, מפחית ROS וגורם לאפופטוזיס, נמק ומוות של תאים סרטניים בדרגות שונות.10 לאחרונה דיווחים הצביעו על כך ש-isoliquiritigenin יכול לעכב את הייצור של IL-6 ו-TNF-a המושרה על ידי חלק הליפיד A של LPS במקרופאגים RAW264.7 ולהחליש את היווצרות קומפלקס LPS-TLR4/MD-2. בנוסף, ISL יכול לגרום לאפופטוזיס של תאי HepG2 באמצעות מסלולי איתות MAPK, STAT3 ו-NF-kB בתיווך ROS.11 ראיות ניסיוניות הראו גם ש-ISL משרה הפעלה פנימית בתיווך ROS ומפעילה את מנגנון הפרוטאז המיטוכונדריאלי-ציטוכרום c-cysteine. של אפופטוזיס של תא PC-12. ראוי לציין שלעתים קרובות משתמשים ב-ISL כתוסף תזונה לנשים.12 מחקרים אחרונים הראו של-ISL יש השפעה אנטי דלקתית משמעותית על AKI, אך מנגנון הפעולה הספציפי עדיין לא ברור.

מחקרים קודמים של הצוות שלנו מצאו כי Mincle, לקטין מסוג C המושרה על ידי מקרופאג, הוא קולטן לזיהוי דפוסים טרנס-ממברניים המעורב בדלקת כליות, 13 שדרכו בדקנו קולטני פורמיל פפטיד 2 (FPR2) שיש לו קשר מסוים עם Mincle מ. מסד הנתונים של GEO. עם זאת, תפקידו במחלת כליות חריפה לא אומת. FPR2 הוא גן מקודד חלבון השייך למשפחת הקולטנים הצמודים לחלבוני G ומכיל 351 שיירי חומצות אמינו.14,15 הם 7- קולטנים מצמדים לחלבון G טרנסממברני שיכולים לתווך ויסות חיסוני, הפרשת גורם דלקתי, כימוטקסיס של תאים והיצמדות תאים, אשר קשורים קשר הדוק להתרחשות והתפתחות של מחלות שונות.16 ההומולוגיה שלו עם FPR1 ו-FPR3 היא עד 69 אחוזים ו-83 אחוזים. תאי משנה FPR2 ממוקמים בממברנת התא והם חלבוני ממברנה מרובי מעברים. הם מתבטאים בעיקר בנויטרופילים, אאוזינופילים, מונוציטים, תאי אפיתל, פיברובלסטים, תאי גליה, תאי מסנגיאל ועוד, המופצים באיברים שונים כגון ריאה, טחול וכבד. יש לציין כי FPR2 מתבטא בשפע באינטרסטיטיום הכלייתי,17 שבו שוכנים תאים דלקתיים. התפקיד העיקרי של FPR2 הוא לשלב חומרי פירוק מיוחדים מסוימים (SPM) כדי לתווך את הפעילות של מטבוליטים אלה בדיכוי ובחיסול דלקת. עם זאת, תפקידו של FPR2 בדלקת AKI והאם הוא יכול לשמש כמטרה להתערבות תרופתית עדיין לא ידוע.

במחקר הנוכחי הזה, השתמשנו במודל AKI של עכברים המושרה על ידי תרופה נפרוטוקסית ומודל של תאים דלקתיים המושרים על ידי LPS כדי לחקור את השפעת השיפור של ISL על פציעה ודלקת של כליות ב-AKI, כמו גם את תפקיד המפתח של FPR2 בדלקת כליות וטיפול ISL של AKI. מחקר זה יספק כיוונים חדשים להבנת המנגנון של פציעה דלקתית ואסטרטגיות טיפול עבור AKI.

2. חומרים ושיטות

2.1. סמים

Isoliquiritigenin (purity>98 אחוז) היא תרכובת איזופלבון המופקת משורש ליקוריץ. הנוסחה המולקולרית שלו היא C15H12O4. במחקר זה, נרכש isoliquiritigenin מ-Chengdu Bio purify Phytochemicals Ltd. (BP0787), מומס ב-10% DMSO(ST038, Beyotime, סין), ועכברים המושרים על ידי ציספלטין ניתנו תוך קיבה במינון של 7.5 מ"ג/ק"ג ו-30 מ"ג. /kg, בהתאמה.

2.2. בידוד של BMDM

עכברי C57BL/6 זכרים בגילאים של 6e8 שבועות נבחרו לבודד את תאי ה-BMDM. הפרד בזהירות את עצם הרגל האחורית מעצם הירך והסר את השרירים המחוברים. טוחנים את העצמות ב-PBS במכתש עד שצבע העצמות משתנה מאדום ללבן. לאחר מכן, אסוף את הסופרנטנט וסנן דרך מסננת 70, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-1500 סל"ד למשך 5 דקות. האריתרוציטים נשברו בנוזל מסונן עם 10 - PBS, שסונן לאחר מכן במסננת תאים של 40 מ"מ. דגירה של התאים שהתקבלו בצלחת תרבית של 10 ס"מ והשראת עם 30 אחוז סופרנטנט L929 למשך 7 ימים. תאי ה-BMDM עוררו עם 100 ננוגרם/מ"ל LPS לבניית מודל התא הדלקתי.

2.3. ביטול וביטוי יתר של FPR2 ב-BMDM

FPR2 היה מווסת מטה על ידי טרנספקציה עם Zeta LifeAdvanced Transfection Reagent (AD600050, Zeta life, ארה"ב) ו-FPR2 siRNA ל-BMDM (הרצפים של FPR2 siRNA: Sense, 5'-GGAGAUGUGUAUUGUACAUTT-3'; Antisense, 5'-AUGUACAAU CAUCUCCTT-3'. Sangon Biotech, סין). באופן דומה, pcDNA3.1-FPR2plasmid (נבנה על ידי Fenghui Biotech, סין) הועבר ל-BMDM עם ZETA לביטוי יתר של FPR2 בתאים.

2.4. ניסויים בבעלי חיים

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי ההנחיות של ועדת האתיקה של Southwest MedicalUniversity. 32 עכברי C57BL/6 זכרים נרכשו מ-ChengduDaShuo Animal Co., Ltd, אשר חולקו באופן אקראי ל-4 קבוצות: קבוצת דמה, קבוצת מודל (קבוצת AKI המושרה על ידי ציספלטין), קבוצת מינון נמוך של ISL (7.5 מ"ג/ק"ג, קבוצה L), וקבוצת מינון גבוה (30 מ"ג/ק"ג, קבוצה H). לקבוצת המודל הוזרק 20 מ"ג/ק"ג ציספלטין (P4394, Sigma-Aldrich, ארה"ב) ביום הראשון, בעוד לקבוצת המינון הנמוך ניתנו 7.5 מ"ג/ק"ג ISL ולקבוצה הגבוהה ניתנו 30 מ"ג/ק"ג ISL למשך 3 ימים . לאחר 3 ימים, הסרום והכליות נאספו מהעכברים שהוקרבו.

2.5. בדיקת תפקודי כליות

לאחר איסוף הסרום של כל קבוצת עכברים, עקוב בקפדנות אחר ההוראות של ערכות כדי לזהות את רמות הקריאטינין בסרום (C011-2-1, Jiancheng Biotech, סין) וחנקן אוריאה (C013-2-1, Jiancheng Biotech, חרסינה).

2.6. צביעה פתולוגית

צביעת H&E: מקטע הסרת שעווה והידרדרציה באופן שגרתי, צביעת המטוקסילין למשך 5 דקות, שטיפת מים RO, הפרדת אלכוהול חומצה הידרוכלורית של 1 אחוז למשך 2 שניות, שטיפת מי ברז, טבילת אתנול 75 אחוז למשך 2 שניות, 1 אחוז אאוזין מסיס באלכוהול למשך 30 שניות , שטיפה במי ברז, 100 אחוז אתנול התייבש למשך דקה אחת, יבש, קסילן שקוף למשך 10 דקות, יבש, אטום עם מדיום הרכבה בלזם ניטרלי (36313ES60, Yepsen, סין).

צביעת PAS: הפרוסות הונחו בתמיסת חומצה מחזורית בטמפרטורת החדר למשך 5e8 דקות, ולאחר מכן שטיפה פעמיים עם מי RO. לאחר מכן, הכניסו את הפרוסות הללו לריאגנט של Schiff למשך 10e20 דקות, שטופו במי ברז למשך 10 דקות, מוכתמות בהמטוקסילין למשך 1e2 דקות, מיובשות ושקופות ב-100 אחוז אלכוהול, יבשות, אוטמות במדיום הרכבה בלזם ניטרלי.

2.7. אימונופלוארסצנציה

מניחים חלקי רקמה קפואים ב-PBS, שטפו פעמיים, קבעו עם 10 אחוז פורמלדהיד למשך 10 דקות. הרקמה בחתכים נחסמה בסרום עיזים של 5% למשך 30 דקות, ולאחר מכן דגירה עם FPR2 ראשוני נגד עכבר עכבר (1:200, sc-57141, סנטה קרוז, ארה"ב) ועכבר נגד עכבר F4/80 נוגדנים (1:200, sc-52664, סנטה קרוז, ארה"ב) ב-4 - C למשך הלילה. למחרת, לשטוף את המקטעים פעמיים עם PBS, לדגור עם נוגדן משני (1: 200) בטמפרטורת החדר למשך שעה, ולכתום את הגרעין עם DAPI. התמונות צולמו על ידי מערכת EVOS.

2.8. אליסה

הריכוז של IL-1b, IL-6, TNF-a בסרום ובסופרנטנט סלולרי נותחו באמצעות ערכות ELISA (EMC001B, EMC004, EMC102A, Neobioscience, סין) לפי הוראות הערכה.

2.9. RealTime-PCR

RNA כולל הוצא באמצעות ערכת מיצוי RNA (Tiangen, סין) בהתאם להוראות היצרן. לאחר שעתקה הפוכה של ה-RNA המופק ל-cDNA, הוספתו למערכת תגובה של 10 מ"ל כדי לבצע את ה-PCR בזמן אמת על ידי Roche LightCycler 480 ומערכת התגובה היא כדלקמן: Eastep® qPCR MasterMix 2 -, 5 מ"ל; תבנית cDNA, 1 מ"ל; פריימר במעלה הזרם (10 מ"מ), 0.5 מ"ל; פריימר במורד הזרם (10 מ"מ), 0.5 מ"ל; מים ללא נוקלאז, 3 מ"ל. פריימרים ששימשו בניסוי זה סונתזו על ידי Sangon (שנחאי, סין), והרצפים של כל הפריימרים מפורטים בטבלה 1.

2.10. כתם מערבי

חיץ תמוגה של RIPA שימש להפקת חלבון מרקמות כליות ותאי BMDM. לאחר פירוק חלבון ב-10 אחוז SDS-PAGEgel והעברה לממברנת PVDF, חסימת הממברנה ב-5 אחוזי BSA למשך שעה אחת ושטיפה עם TBST 3 פעמים, ולאחר מכן דגירה של הממברנה עם נוגדנים ראשוניים ב-4 - C למשך הלילה (הוכן עם 5 אחוזי BSA, 1: 1000). לאחר מכן, הממברנות הודגרו עם הנוגדן המשני (Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG (ZB-2305, 1:3000), Goat anti-rabbit IgG (ZB-2301, 1:3000)) בטמפרטורת החדר למשך שעה. התמונות צולמו על ידי מערכת הדמיית ג'ל (BIORAD, ארה"ב). עוצמת האפור של הרצועות חושבה על ידי תוכנת Image J.

2.11. ניתוח סטטיסטי

התוצאות הוצגו כממוצע ± סטיית תקן. ניתוח נתונים בוצע עם מבחן ANOVA חד כיווני ולאחריו השוואה מרובה עם מבחן LSD באמצעות תוכנת SPSS 21.0. P < 0.05="" נחשב="" מובהק="" סטטיסטית.="" כל="" קבוצת="" ניסויים="" משתכפלת="" 3="">

3. תוצאות

3.1. Isoliquiritigenin שיפר פגיעה בכליות הנגרמת על ידי ציספלטין ועיכבה דלקת כליות

כדי לחקור את ההשפעות המונעות מחדש ואנטי דלקתיות של isoliquiritigenin ב-AKI, זיהינו את רמות ה-Cre וה-BUN בסרום של כל קבוצה, כמו גם את הביטוי וההפרשה של ציטוקינים דלקתיים על ידי PCR ו-ELISA בזמן אמת. בנוסף, הפתולוגיה הכלייתית נמדדה על ידי צביעת H&E ו-PAS. התוצאות הראו כי בהשוואה לקבוצה הרגילה, רמות ה-Cre וה-BUN בנסיוב עלו במודל AKI, בעוד שטיפול ב-7.5 מ"ג/ק"ג או 30 מ"ג/ק"ג של ISL הפחית משמעותית את רמות ה-Cre וה-BUN בסרום, ביניהם. , מנה של 30 מ"ג/ק"ג יש את ההשפעה הטיפולית הטובה ביותר (איור 1A ו-B). יש לציין, 30 מ"ג/ק"ג של ISL יכול לשפר את הנזק הצינורי הכלייתי בהתאם לאחוז הנמק הצינורי המוערך (איור 1C). תוצאות ה-ELISA וה-PCR הראו שהפרשת IL-1b, IL-6 ו-TNF-a ירדה בוויסות לאחר התערבות ISL (7.5 מ"ג/ק"ג ו-30 מ"ג/ק"ג), וביטוי ה-mRNA של IL-1b, IL-6 ו-TNF-a גם הצטמצמו באופן מדהים על ידי מתן 30 מ"ג/ק"ג של ISL (איור 1DeI). מצד שני, התוצאות של צביעת H&E ו-PAS הוכיחו שהכליה בקבוצת AKI הציגה נזק חמור לצינורית הכלייתית, נשירת אפיתל כלייתי, תאים מסנגיאליים והיפרפלזיה אינטרסטיציאלית מסנגיאלית וחדירת תאים דלקתיים, באופן מפתיע, 30 מ"ג/ק"ג של ISL. יכול למעשה להפוך את הפגיעה של הכליה ב-AKI (איור 1J). כל התוצאות גילו כי מתן של 7.5 מ"ג/ק"ג ו-30 מ"ג/ק"ג ISL יכול גם לשפר את הפגיעה בכליות הנגרמת על ידי ציספלטין וגם לעכב דלקת כלייתית, שבה ל-30 מ"ג/ק"ג ISL יש את ההשפעה הטובה ביותר.

3.2. Isoliquiritigenin הפחית את הביטוי של FPR2 במקרופאגים של עכברי AKI

הרבה דיווחים קודמים הצביעו על כך ש-FPR2 ממלא תפקיד חיוני בתגובה חיסונית ומחלות הקשורות לדלקת. עם זאת, ההשפעה הפוטנציאלית של FPR2 בכליה של AKI אינה מוגדרת. במחקר זה, ביצענו אימונופלואורסצנטי כדי לאתר יחד את ה-FPR2 והמקרופאגים (F4/80, יצרנית מקרופאגים). התוצאות הראו שמקרופאגים (כתמים ירוקים) הוחדרו בנפח גדול לכליה של עכברי AKI, בינתיים, FPR2 (כתמים אדומים) אותר יחד עם F4/80, מה שממחיש ש-FPR2 התבטא בעיקר על מקרופאג' ורמת FPR2 הייתה משמעותית גדל בכליה של עכברי AKI (איור 2A). עוד זיהינו את הביטוי של FPR2 mRNA וחלבונים הקשורים לדלקת על ידי PCR בזמן אמת ו-Western blotting בכליה, והתוצאות הוכיחו ש-30 מ"ג/ק"ג של ISL יכולים לווסת ביעילות את רמות ה-mRNA והחלבון של FPR2 ב כליה של עכברי AKI בהשוואה ל-7.5 מ"ג/ק"ג של קבוצת ISL (איור 2B, G, H). חשוב לציין, תוצאות הספיגה המערבית הראו ש-30 מ"ג/ק"ג של ISL גם עיכבו את ההפעלה של p-65 והסדירו את רמות החלבון של TNF-a, IL-6 ו-IL{{28} }b בכליה של עכברי AKI (איור 2CeF). כל הנתונים לעיל הצביעו על כך שדלקת כלייתית בהקלה על ISL של עכברי AKI עשויה להתייחס להפחתת הביטוי של FPR2 במקרופאגים.

3.3. Isoliquiritigenin דיכא את הביטוי וההפרשה של FPR2 וציטוקינים דלקתיים בתאי BMDM המושרים על ידי LPS

כדי לזהות עוד יותר את ההשפעות של ISL על תאי BMDM המושרים על ידי LPS, בחנו את רמת ה-mRNA של FPR2, ביטוי והפרשה של ציטוקינים דלקתיים בתאי BMDM המושרים על ידי LPS לאחר מתן ISL על ידי PCR ו-ELISA בזמן אמת. התוצאות הראו ש-ISL הפחית את רמת ה-mRNA של FPR2, IL-1b, IL-6 ו-TNF-a (איור 3AeD), כמו גם את הפרשת IL-1b , IL-6 ו-TNF-a בסופרנטנט תאי בתאי BMDM המושרים על ידי LPS (איור 3EeG). התוצאות לעיל הצביעו על כך שטיפול ב-ISL בריכוז של 40 mM עיכב מאוד דלקת בתאי BMDM המושרים על ידי LPS.

3.4. Isoliquiritigenin הוריד את רמות החלבון של FPR2 וציטוקינים דלקתיים בתאי BMDM המושרים על ידי LPS

כמו כן, זיהינו את רמות החלבון של FPR2 וציטוקינים דלקתיים בתאי BMDM המושרים על ידי LPS לאחר מתן ISL באמצעות Western blotting. הנתונים הראו שבהשוואה לקבוצת הביקורת, רמות החלבון של FPR2, p-p65, IL-6 ו-TNF-a עלו באופן משמעותי בתאי BMDM המושרים על ידי LPS, והצטמצמו מאוד עם מתן 40 mM ISL ( איור 4AeE). תוצאות אלו המחישו עוד יותר ש-ISL יכול לדכא את ההפעלה של NF-kB ולווסת למטה את רמות החלבון של ציטוקינים דלקתיים בתאי BMDM המושרים על ידי LPS.

3.5. עיכוב של FPR2 דיכא דלקת הנגרמת על ידי LPS בתאי BMDM

כדי לחקור את התפקיד של FPR2 בדלקת מקרופאגים, השתמשנו ב-siRNA כדי להפיל FPR2 בתאי BMDM. התוצאות הראו כי טרנספקציה של siRNA יכולה לעכב משמעותית את הביטוי של FPR2 במקרופאג'ים המושרה על ידי LPS (איור 5A), ולהפחית ביעילות את הביטוי של IL-1b ו-TNF-a (איור 5B ו-C). בנוסף, תוצאות הכתם המערבי הוכיחו כי לאחר טרנספקציה של siRNA, רמת החלבון של FPR2 הייתה מעוכבת באופן משמעותי, ללא קשר לשאלה אם היא גורה על ידי LPS (איור 5D ו-E). יש לציין, כי הורדת FPR2 הפחיתה באופן משמעותי את רמות החלבון של ציטוקינים דלקתיים ועיכבה את הפעילות של איתות NF-kB (איור 5FeK), מה שמעיד על כך ש-FPR2 ממלא תפקיד חשוב בקידום התגובה הדלקתית במקרופאגים. כמו כן, זה עשוי להיות המטרה העיקרית של ISL לעכב דלקת מקרופאגים.

3.6. ביטוי יתר של FPR2 פעל נגד ההשפעה האנטי דלקתית של isoliquiritigenin בתאי BMDM המושרים על ידי LPS

כדי לקבוע ש-ISL מדכא דלקת ב-AKI באמצעות עיכוב FPR2 במקרופאג'ים, השתמשנו בפלסמיד ביטוי יתר FPR2 כדי לווסת את הביטוי של FPR2 בתאי BMDM דלקתיים שטופלו ב-ISL. כפי שמוצג באיור 6, רמת החלבון וה-mRNA של FPR2 עלו באופן משמעותי ב-pcDNA3.1- קבוצת FPR2 שעברה העברה (איור 6A, B, G), וביטוי יתר של FPR2 ביטל למעשה את ההשפעה המעכבת של 40 mM ISL על ההפעלה של p65 ורמות החלבון של IL-1b, IL-6 ו-TNF-a בתאי BMDM המושרים על ידי LPS (איור 6CeF). באופן דומה, מווסת-על של FPR2 הסיר את ההשפעה המדכאת של 40 mM ISL על ביטוי והפרשה של ציטוקינים דלקתיים בתאי BMDM המושרים על ידי LPS, כגון IL-1b, IL-6 ו-TNF-a (איור 6HeM), המצביע על כך ש-ISL הפחית את הדלקת בתאי BMDM המושרים על ידי LPS על ידי עיכוב FPR2.

4. דיון

פגיעה חריפה בכליות היא אחת המחלות הקליניות הנפוצות. זה בדרך כלל מוביל לפגיעה בתפקוד החיסוני של החולים תוך תקופה קצרה. במקרים של אובדן דם טראומה, נזק לאיברים, הלם, הכליה היא האיבר הרגיש ביותר ונוטה להתפתח לפציעה חריפה.18e20 מחקרים רבים אישרו שלדלקת תפקיד מרכזי בהתפתחות של AKI, שנחשבה כיעד התערבות פוטנציאלי לטיפול ב-AKI. בשנים האחרונות, התרופות הסיניות עשו התקדמות עצומה בהתערבות של דלקת, כולל כורכומין, קוורצטין, נרינגן ומונומרים אחרים. Iso-liquiritigenin הוא תרכובת פלבנואידית, בעלת פעילויות ביולוגיות רבות, כגון אנטי דלקתיות, אנטי רדיקלים חופשיים, אנטי גידולים ואחרים.21 מחקרים קודמים מצאו ש-ISL עיכב אפופטוזיס, דלקת וייצור מטריצה ​​חוץ תאית באנגיוטנסין II-induced HK-2 cells.22 מחקרים מ-Wu Yangping הראו ש-ISL יכול לווסת למטה את IL-6 ו-IL-8 על ידי עיכוב הפעילות של NF-kB במודל הפסוריאזיס, מה שמציע ISL עשוי להיות מועמד לטיפול בפסוריאזיס ומחלות דלקתיות אוטואימוניות אחרות.23 מצד שני, מחקר שנערך לאחרונה הראה ש-ISL יכול להקל על AKI ספטי על ידי דיכוי טרנסלוקציה של NF-kB p65 ועיכוב תגובות דלקתיות.24 במחקר זה, אנו מצא כי ISL יכול לשפר ביעילות את תפקוד הכליות בעכברי AKI המושרה על ידי ציספלטין, להפחית נזק לכליות ולעכב דלקת כלייתית. עם זאת, המנגנון המדויק של עיכוב דלקת ISL אינו ברור.

FPR2 שייך למשפחת הקולטנים הכימוקטיים והוא קולטן מצמד חלבון G של פי 7 טרנסממברנה. מחקרים קודמים מצאו כי FPR2 מעורב במגוון תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים, כולל תגובות הגנה, דלקות, מחלות ניווניות, גידולים, הפרעות הקשורות לחילוף החומרים של גלוקוז ושומנים. ופרוסטגלנדין E2 בתהליך הדלקתי שעשוי למלא תפקיד אנטי דלקתי ופרו-דלקתי.27,28 ההשפעות השונות של FPR2 על דלקת תלויות בסביבה ובליגנדים המפעילים מסלולי איתות שונים.29 במחקר זה, מצאנו כי FPR2 מתבטא בעיקר במקרופאגים באינטרסטיטיום הכלייתי, ובא לידי ביטוי גבוה בכליות של עכברי AKI הנגרמות על ידי ציספלטין, מה שמצביע על כך ש-FPR2 במקרופאגים עשוי להיות מעורב בתגובה הדלקתית של מקרופאגים בכליות AKI. עדויות הולכות וגדלות אישרו שמספר רב של מקרופאגים חדרו לתוך הכליה תוך שעות ספורות לאחר התרחשות AKI, והחמירו את הנזק לכליות על ידי תגובה לדלקת.30e33 לכן, וויסות מטה של ​​הדלקת של מקרופאג שחדר בכליות AKI עלול להיות כיוון חשוב לשיפור AKI, והאם FPR2 מעורב בתהליך זה אינו ידוע.

תוצאות הניסוי שלנו הראו שטיפול עם ISL במינון נמוך וגבוה בעכברי AKI המושרה על ידי ציספלטין, לא רק יכול לשפר את המבנה והתפקוד הכלייתי, אלא גם להפחית את רמת הציטוקינים הדלקתיים. בנוסף, ISL יכול לווסת ביעילות את רמת החלבון של FPR2 ואת הפעילות של p65. מכיוון ש-FPR2 מתבטא בעיקר במקרופאגים, זה מצביע על כך ש-ISL עשוי לשפר דלקת בכליות על ידי עיכוב FPR2 במקרופאגים. בגלל התפקיד החשוב של המקרופאג המסתנן בדלקת כלייתית, לאחר מכן חילצנו מקרופאגים ראשוניים שמקורם במח עצם לזיהוי חוץ-גופני של השפעת השיפור של ISL על דלקת מקרופאגים והמנגנון הפוטנציאלי. התוצאות שלנו הראו ש-ISL יכול לעכב באופן משמעותי דלקת מקרופאגים הנגרמת על ידי LPS ולווסת את הביטוי וההפרשה של גורמים דלקתיים IL-1b, IL-6 ו-TNF-a. במקביל, ה-ISL יכול גם להפחית את רמת החלבון של מולקולות דלקתיות במקרופאג'ים ומעכב את ביטוי ה-mRNA ואת רמות החלבון של FPR2 המגורה על ידי LPS. כדי לאמת את תפקיד המפתח של עיכוב FPR2 של דלקת עם ISL, השתמשנו ב-pcDNA3.1-FPR2plasmid לביטוי יתר של FPR2 ומצאנו שבמקרופאג הדלקתי שטופל ב-ISL, ביטוי יתר של FPR2 מנטרל את ההשפעה המעכבת של ISL על דלקת, מה שמצביע על כך שדלקת מקרופאגים מווסתת מטה של ​​ISL היא בעיקר באמצעות עיכוב של FPR2. יש לציין, השתמשנו במודל AKI המושרה על ידי ציספלטין in vivo ובחרנו את מודל התא הדלקתי המושרה על ידי LPS in vitro. למרות שמגיבי האינדוקציה של שני המודלים אינם עקביים, שתי השיטות הללו מוכרות כיום לבניית מודלים של דלקת in vivo ו-in vitro, בהתאמה. בהתחשב בעובדה שמחקר זה מתמקד בתגובות דלקתיות, ניתן להשתמש בשתי השיטות הללו במחקר אחד.

נתונים אלו הוכיחו כי ISL יכול להפחית ביעילות את הביטוי של גורמים דלקתיים in vivo ו-in vitro, וניתן להשיגו על ידי עיכוב הביטוי של FPR2. לפיכך, ISL עשוי לשמש כתרופה טיפולית פוטנציאלית עבור AKI.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הפרויקט המשותף לוז'ו - Southwest MedicalUniversity Joint (2017LZXNYD-P01 ו-2018LZXNYD-PT03), האוניברסיטה הרפואית הדרום-מערבית - פרויקט משותף לרפואה מסורתית (2018XYLH-034), פרויקט הבנייה של סצ'ואן. רפואה (2018#53), פרויקט המדע והטכנולוגיה של לוז'ו (2020-JYJ-56) והענקה המיוחדת המשותפת של אוניברסיטת לוז'ו העירונית - דרום מערב רפואית להכנסת כישרונות ברמה גבוהה (צוות לאן הואי-יאו ).

הפניות

1. Soares DB, Mambrini JVM, Botelho GR, Girundi FF, Botoni FA, Martins MAP. טיפול תרופתי וגורמים אחרים הקשורים להתפתחות של פגיעה חריפה בכליות בחולים קשים: מחקר חתך.PeerJ. 2018;6:e5405. e-pub לקראת ההדפסה 2018/08/22.

2. Sato Y, Yanagita M. תאי חיסון ודלקת בהתקדמות AKI ל-CKD.Am J Physiol Ren Physiol. 2018;315(6):F1501eF1512. e-pub לקראת ההדפסה 2018/ 30/08.

3. Ram P, Mezue K, Pressman G, Rangaswami J. פגיעה חריפה בכליות לאחר החלפת מסתם אבי העורקים.קלינ קרדיול. 2017;40(12):1357e1362. e-pub לקראת ההדפסה 2017/12/19.

4. YH H, IJ C, YF L, YJ C, YH L, HW C. לקטופרין תורם אפקט מגן מחדש בפגיעה חריפה בכליות ובפיברוזיס כלייתי מוקדם.תרופות. 2020;12(5):434.

5. Bonavia A, Singbartl K. סקירה של תפקידם של תאי מערכת החיסון בפגיעה חריפה בכליות.רופא ילדים נפרול. 2018;33(10):1629e1639. פאב אלקטרוני לקראת ההדפסה 2017/08/13.

6. Li J, Tang Y, Tang PMK, et al. גורם מעכב נדידת מקרופאגים חוסם מגן מפני פגיעה חריפה בכליות הנגרמת על ידי ציספלטין בעכברים.מול ת'ר. 2018;26(10):2523e2532. e-pub לקראת ההדפסה 2018/08/06.

7. Ferenbach DA, Sheldrake TA, Dhaliwal K, et al. דלדול מקרופאג/מונוציטים על ידי clodronate, אך לא רעלן דיפתריה, משפר איסכמיה כלייתית/פגיעה חוזרת בעכברים.כליות אינט. 2012;82(8):928e933. e-pub לקראת ההדפסה 2012/06/08.

8. JQ, JC, BM, et al. Isoliquiritigenin מעכב טרשת עורקים על ידי חסימת ביטוי ערוץ TRPC5.טיפולים קרדיווסקולריים. 2020;2020:1926249.

9. YG, XL, HY, LP, X C. Isoliquiritigenin מפעיל השפעות נוגדות חמצון ואנטי דלקתיות באמצעות הפעלת מסלול KEAP-1/Nrf2 ועיכוב מסלולי NF-kB ו-NLRP3 בדלקת קרום דם המושרה על ידי קרגנין.מזון& פוּנקצִיָה. 2020;11(3):2522e2534.

10. LS, XY, XY, YW, Q Z. Isoliquiritigenin משרה אפופטוזיס של תאי T24 סרטן שלפוחית ​​השתן האנושית באמצעות מנגנון תלוי קינאז בלתי תלוי בציקלין.מכתבים אונקולוגיים. 2017;14(1):241e249.

11. Wang JR, Luo YH, Piao XJ, et al. מנגנונים העומדים בבסיס אפופטוזיס המושרה על ידי isoliquiritigenin ועצירת מחזור תאים באמצעות מסלולי MAPK/STAT3/NF-kappaB בתיווך ROS בתאי קרצינומה כבדית אנושית.Drug Devמילון. 2019;80(4):461e470. e-pub לקראת ההדפסה 2019/01/31.

12. AH, CS, YY, et al. הערכת הפעילות האסטרוגנית של מיני ליקריץ בהשוואה לכשות המשמשת בצמחים בוטניים לתסמיני גיל המעבר.PLoSאחד. 2013;8(7):e67947.

13. LL L, PM T, CJ L, et al. קולטן זיהוי הדפוסים, Mincle, חיוני לשמירה על הפנוטיפ המקרופאג M1 בדלקת חריפה של הכליה.כליות אינט. 2017;91(3):587e602.

14. Schroder N, Schaffrath A, Welter JA, et al. עיכוב של קולטני פפטיד פורמיל משפר את התוצאה במודל עכבר של מחלת אלצהיימר.Jדלקת עצבית. 2020;17(1):131. פאב אלקטרוני לקראת ההדפסה 2020/04/26.

15. Neymeyer H, Labels R, Reverte V, et al. הפעלה של איתות אנקסין A1 בפיברובלסטים של הכליה מפעילה השפעות אנטי-פיברוטיות.Acta Physiol. 2015;215(3):144e158. e-pub לקראת ההדפסה 2015/09/04.

16. FC, MP, R A. מפלי איתות ברורים שנוצרו על ידי אגוניסטים שונים של קולטן פפטיד פורמיל 2 (FPR2).Int J Mol Sci. 2013;14(4):7193e7230.

17. HW, XP, YG, et al. תרכובת הנגזרת של Ganoderma-A מפעילה אפקט מעכב באמצעות קולטן פורמיל פפטיד 2.פרונט פרמקול. 2020;11:337.

18. Wang Y, Cai J, Tang C, Dong Z. Mitophagy בפגיעה חריפה בכליות ותיקון כליות.תאים. 2020;9(2). פאב אלקטרוני לקראת ההדפסה 2020/02/07.

19. Sato Y, Takahashi M, Yanagita M. Pathophysiology of AKI to CKD התקדמות.סמינ נפרול. 2020;40(2):206e215. פאב אלקטרוני לקראת ההדפסה 2020/04/19.

20. Ronco C, Bellomo R, Kellum JA. פגיעה חריפה בכליות.אִזְמֵל. 2019;394(10212): 1949e1964. פאב אלקטרוני לקראת ההדפסה 2019/11/30.

21. PZ, HM J, JW Z, et al. אפקט מגן של isoliquiritigenin נגד פגיעה מוחית בעכברים ספטי באמצעות הנחתה של NF-kB.בflאמופרמקולוגיה. 2019;27(4): 809e816.

22. DX, WH, ST Y, YS T. Isoliquiritigenin הקל על הפגיעה הכלייתית היפר-טנסיבית הנגרמת על ידי Ang II באמצעות דיכוי ציטוקינים דלקתיים ואפופטוזיס הנגרמת על ידי מתח חמצוני דרך מסלולי Nrf2 ו-NF-kB.Biochem BiophysRes Coמ"מun. 2018;506(1):161e168.

23. YW, XC, XG, et al. Isoliquiritigenin מונע התקדמות של תסמינים דמויי פסוריאזיס על ידי עיכוב NF-kB וציטוקינים פרו-דלקתיים.J MolMed(ברל). 2016;94(2):195e206.