קביעה מהירה בו זמנית של שישה רכיבים יעילים ב- Cistanche Tubulosa על ידי ספקטרוסקופיה קרובה לאינפרא אדום

איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

Xinhong Wang, Xiaoguang Wang ויוחאי גואו

תַקצִיר:

קביעה כמותית של מספר רכיבים יעילים בצמח נתון דורשת בדרך כלל כמות גדולה מאוד של מוצרים טבעיים אותנטיים. במחקר זה, הצענו שיטה מהירה ולא הרסנית לקביעה בו-זמנית של אכינאקוסיד, ורבסקוזיד, מניטול, סוכרוז, גלוקוז ופרוקטוז.Cistanche tubulosaעל ידי ספקטרוסקופיה קרובה לאינפרא אדום (NIRS). ספקטרוסקופיה מפוזרת של כמעט אינפרא אדום (DRS) וכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) נערכו על 116 קבוצות של דגימות Cistanche tubulosa. נתוני ה-DRS עובדו בשיטות של מגוון רגיל (SNV) ותיקון פיזור כפל (MSC). רגרסיה חלקית של ריבועים קטנים (PLSR) נוצלה לבניית מודלים של כיול עבור רכיבים בעלי עניין ב- Cistanche tubulosa. כל המודלים הוערכו לאחר מכן על ידי חישוב שגיאת הכיול הממוצעת של הבסיס (RMSEC), מקדם המתאם של הכיול (r). ערכי r של כל ששת דגמי הכיול נקבעו כגדולים מ-0.94, מה שמצביע על כך שכל דגם אמין. לכן, ניתן להכשיר את המודלים הכמותיים של ה-NIR המדווחים במחקר זה כדי לכמת במדויק את התוכן של שישה רכיבים רפואיים בCistanche tubulosa.

מילות מפתח: Cistanche tubulosa; כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים; ספקטרוסקופיה קרובה לאינפרא אדום; ריבועים קטנים חלקיים

מבוא

Cistanche(Hoffmg. Et Link) הוא סוג פנרוגמי רב שנתי ממשפחת הצמחים Orobanchaceae. רוב המינים השייכים לסוג Cistanche שימשו כצמח מרפא במשך אלפי שנים בסין; יש מוניטין של טוניק מעולה; ומוכרים כ"ג'ינסנג של המדבריות" [1,2].Cistanche tubulosaהוא טפיל חובה של שורשי הצמח הרב שנתי Tamarix Chinensis. הוא תועד בפרמקופאה הסינית כמקור האותנטי של Cistanches Herba (שם סיני: Roucongrong) מהמהדורה של 2005 [3]. מחקר תרופתי מודרני על מיני Cistanche החל בשנות ה-80 [4]. חקירות פרמקולוגיות הראו כי לתמציות של צמחי סיסטאנצ'י יש קשת רחבה של פעילויות, כגון ריפוי מחסור בכליות ועצירות סנילית, קידום היכולת ללמוד ושינון, אנטי מחלת אלצהיימר, שיפור חסינות, אנטי אייג'ינג, אנטי עייפות וכו'. [1,5–7]. בשלושת העשורים האחרונים שולבו מחקרים פרמקולוגיים מקיפים ושיטתיים עם חקירות פיטוכימיות כדי להאיר את הבסיס החומרי של ההשפעות המיטיבות של שורשי צמחי ה-Cistanche. סקרים אלו מצביעים על כך ש-phenylethanoid glycosides (PhGs) היו המרכיבים היעילים העיקריים בצמחי Cistanche הממלאים תפקידי מפתח לטיפול במחסור בכליות, אימפוטנציה [8], אנטי-אייג'ינג [9] ואנטי-אלצהיימר [10]. התוכן של שני PhGs (echinacoside ו-verbascoside) נדרש בפרמקופאה הסינית. בינתיים, פחמימות כמו מניטול, סוכרוז, גלוקוז ופרוקטוז בצמחי סיסטאנצ'י מחזיקות בתפקוד המשלשל ומקבצי הפחמימות של צמחי סיסטאנצ'י שימשו לטיפול בעצירות [11].

משאבי פרא שלCistanche tubulosaמופצים בעיקר באזור המקיף את מדבר טקלמקאן בדרום האזור האוטונומי של שינג'יאנג בסין. בדומה למינים רבים אחרים המשמשים כתרופות סיניות מסורתיות (TCMs), C. tubulosa הוא בעל ערך כלכלי רב וכמעט נכחד בבית הגידול הפראי שלו בגלל איסוף יתר. גידול C. tubulosa החל בשנות ה-90 בסין כדי להבטיח אספקת חומרי גלם עבור Cistanches Herba וכן להגן על משאבי צמחי הבר. נכון לשנת 2017, כמעט 13 אלף דונם של C. tubulosa מתורבת קיימים במחוז Hotan ב-Xinjiang [12,13]. התקדמות בטכנולוגיית השתילה נדרשת להרחיב את הגידול וכן לשפר את האיכות שלCistanche tubulosa.

המטרה העיקרית של טיפוחCistanche tubulosaהוא לייצר Cistanches Herba, בהיותו עשיר באותם רכיבים יעילים. עם זאת, תכולת הרכיבים היעילים ב- Cistanches Herba, כגון PhGs ואוליגוסכרידים, יכולה להיות מושפעת משמעותית מגורמים רבים במהלך הייצור [12,13]. יש לחקור מערכת זיהוי בזמן אמת של איכות C. tubulosa. לכן, יש צורך לפתח שיטת תפוקה גבוהה כדי למלא את הדרישה של ניתוח מספר רב של דגימות בתוך פרק זמן קצר. באופן מסורתי, הקביעה של אותם רכיבים יעילים ראשוניים, כגון PhGs ופחמימות, ב-C. tubulosa הושגה בדרך כלל באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) [14,15]. למרות היותו מדויק ואמין, הוא גוזל זמן ועמל לאיסוף ועיבוד נתונים. בנוסף, נדרשים גם הרבה זמן ומאמץ להכנת דגימה הכוללת לרוב פירוק, מיצוי וסינון, של מבחני HPLC. לכן יש צורך בעקרון ברור ובכלי קל לתפעול כדי להשיג כמות גדולה יחסית של נתונים. למרבה המזל, ספקטרוסקופיה קרובה לאינפרא אדום (NIRS) שימשה רבות להערכת מוצרים חקלאיים [16], מזון [17], דגימות רפואיות [18] ומוצרים פרמצבטיים [19] מכיוון שהיא מהירה וגם לא הרסנית. לכן, NIRS יכול להתאים בדיוק לדרישות למדידות יעילות של TCMs, וזה לא מפתיע ש-NIRS הוחל לזיהוי איכותי [20,21] וכימות של תרכובות [22] ב-TCMs.

במחקר זה, התוכן של שישה רכיבים יעילים, כולל echinacoside, verbascoside, mannitol, סוכרוז, גלוקוז ופרוקטוז ב-116 קבוצות של דגימות C. tubulosa שנאספו ממחוז Hotan ב-Xinjiang בין השנים 2013-2015 נקבעו תחילה על ידי HPLC. לאחר מכן, מודלי הכיול של ששת הרכיבים הללו הוקמו בשיטת רגרסיית הריבועים הקטנים החלקיים (PLSR). מודלים אלה אושרו לאחר מכן עם מקדם המתאם ושגיאות חיזוי בערכות הכיול. התוצאות הראו שניתן להשתמש בשיטה שפותחה כשיטה אמינה לניתוח כמותי של C. tubulosa.

תוֹצָאָה

ניתוח HPLC

התוכן של echinacoside ו-verbascoside נקבעו בשיטת HPLC-UV מוגדרת היטב בספרות [3,23] וארבע פחמימות (מניטול, סוכרוז, גלוקוז ופרוקטוז) נקבעו בשיטת HPLC-ELSD מוגדרת היטב ב הספרות [24] עבור כל 116 הדגימות. שיטות הכנה וקביעת דגימות תוארו בסעיפים 3.1 ו-3.3. איור 1 מציג את הכרומטוגרמות האופייניות של התקנים המעורבים. ניתן לראות שכל ששת המרכיבים היעילים הופרדו בקו הבסיס ולכן ניתן היה לכמתם. שיטת HPLC אומתה לפני בדיקת המדגם. התוצאות העיקריות של שיטת HPLC מפורטות בטבלה 1. יחס ליניארי חיובי (r=0.9998) והתאוששות (98.5 אחוזים) של שיטת קביעת האכינאקוסיד מוצגים בתוצאות, אותה תוצאה כמו כל התוצאות. חמישה מרכיבים. לכן, ניתן לקבוע במדויק את התוכן של ששת המרכיבים היעילים. כל טווחי התוכן שנקבעו מסוכמים בטבלה 1.

ניתוח NIRS

איור 2 מציג את ספקטרום ה-NIR (4000–10,000 cm−1) של דגימות C. tubulosa. שיאי ספיגה משמעותיים הופיעו מ-4000 ס"מ-1 עד 7500 ס"מ-1 בכל הדגימות, בעוד שתנודות עדינות הופיעו מ-7500 ס"מ-1 עד 10,000 ס"מ-1. סחיפה בסיסית של ספקטרום ה-NIR התרחשה מכיוון שהדגימה הושפעה בקלות מגורמים כמו גודל חלקיקים וצבע (איור 2A). נעשה שימוש בטיפולים מקדימים מתמטיים של הספקטרום כדי להפחית במידה מסוימת את ההשפעה של מידע מיותר. הטיפולים המקדימים המתמטיים כללו גזירה ראשונה (גזירה 1), גזירה שנייה (גזירה 2), זן תקין (SNV) ותיקון פיזור כפל (MSC). איור 2B מציג את הגזירה השנייה של ספקטרום ה-NIR של C. tubulosa, והשונות המשמעותיות שהתרחשו משלושה אזורים, 4000-4500 ס"מ-1, 5000-5500 ס"מ-1 ו-7000-7500 ס"מ-1, נצפות ללא ספק. .

הקמת מודלים של כיול כמותי

רגרסיה חלקית של ריבועים קטנים (PLSR) היא שיטת מידול קלאסית והיא יושמה באופן נרחב במודלים כמותיים בגלל האיכות הגבוהה של התוצאות. היתרונות של PLSR כוללים את יכולת החיזוי הטובה והפשטות היחסית שלו. PLSR מיושם באופן נרחב גם בהקמת מודלים של כיול כמותי של TCMs [25]. בהתבסס על ספקטרום ה-NIR שטופלו מראש, ומודל ניתוח כמותי של NIR לששת הרכיבים היעילים ב-C. tubulosa הוקם בשיטת PLSR עם נתוני ניתוח HPLC כערכים האמיתיים. 116 הדגימות חולקו באופן אקראי למערכות כיול ואימות ביחס של 3:1. התנאים המתאימים ביותר לכיול נבחרו על ידי RMSEC נמוך ומקדם מתאם גבוה.

בחירת רצועת הגלים עבור דגמי הכיול

בחירת רצועת גלים מתאימה הייתה צעד חשוב לבניית מודלים של כיול. במחקר זה, הושוו ספקטרום מרווחי ה-NIR של 4000–7500 ס"מ-1 (מומלץ על ידי תוכנת TQ Analyst) ו-4000–10,000 ס"מ-1. נצפה שטווח זה אינו מתאים לכיול במרווח שבין 4000 ס"מ-1 ל-7500 ס"מ-1 מטבלה 2. לפיכך, במחקר הנוכחי, המרווחים הספקטרליים של ששת המרכיבים הכימיים היו כולם נבחרו מתוך המרווח שבין 4000 ל-10,000 ס"מ-1 על ידי השוואת הביצועים של RMSEC ומקדם מתאם.

בחירת המספר האופטימלי של גורמים עבור דגמי הכיול

ה-PLSR מסביר את כמות השונות המקסימלית בנתונים על ידי הפחתת הממדיות של נתוני הספקטרום על ידי חישוב הגורמים. בעיית ה"חוסר כושר" הופיעה עקב מידע לא מספיק שנבע ממספר מצומצם של גורמים; עם זאת, בחירת הגורמים הגדולים מהערכים האופטימליים שהוצגו במודל תגרום לבעיית "התאמת יתר". או "חוסר כושר" או "כושר יתר" יפחיתו את כוח הניבוי של המודלים המבוססים [22]. איור 3 מציג את הקשר בין RMSECV לגורמים עבור כל ששת התרכובות. לכן, בחרנו את הגורמים המתאימים לערכים הנמוכים ביותר של RMSECV. הבחירה האופטימלית של גורמים עבור דגמי הכיול מופיעה בטבלה 3.

בחירת טיפול מקדים ספקטרלי עבור דגמי הכיול

גורם משפיע נוסף קריטי ביותר עבור מודלים של כיול הוא טיפול מקדים ספקטרלי שמטרתו להפחית את השפעת הפיזור והסחף הבסיסי, לשפר את יחסי האות לרעש ולהסיר שינויים לא סדירים. נעשה שימוש בשיטות תיקון פיזור כפול (MSC) ושיטות רגילות שונות (SNV) כדי למנוע את השפעת פיזור הקרינה המקובלת. כדי לפתור את ההשפעות של סחף קו הבסיס, הושוו ספקטרום נגזרת 1 ו-2 ונבחרה הגזרה השנייה [26]. עבור האפקט הרצוי, החלקנו את הספקטרום עם אלגוריתם המסנן Savitzky-Golay (SG) לפני הגזירה כדי למנוע הגדלת רעש. טבלה 3 מציגה את המידע על טיפול מקדים ספקטרלי ותוצאותיו עבור דגמי הכיול.

הערכת המודלים המבוססים

מודל כיול טוב של NIRS צריך להיות בעל ערכי RMSEC ו-RMSEP נמוכים, כמו גם מקדם מתאם גבוה (r) והבדלים קטנים בין RMSEC ו-RMSEP [27-29]. דגמי הכיול של שש התרכובות שנבחרו נקבעו על פי הנהלים שהוזכרו לעיל (טבלה 3). ערכי RMSEC ו-r עבור ערכת הכיול של echinacoside היו 27.6 ו-0.9808, בהתאמה. פרמטרי הביצועים של מודלים של תרכובות כימיות אחרות מופיעים בטבלה 3, שממנה אנו יכולים להסיק כי המודלים המבוססים עולים תוצאות חיזוי משביעות רצון, וניתן להשתמש בהם לניתוח כמותי מהיר של C. tubulosa. תרשימי פיזור של שש התרכובות הכימיות מוצגות באיור 4 כדי להפוך את מודלי הכיול לתיאוריים יותר ולצפוים בצורה ויזואלית. כפי שמוצג באיור 4, הבדלים קלים התרחשו בין הערכים החזויים והנמדדים, מכיוון שרוב הנקודות הופצו סביב העקומה הרגרסיבית עם משוואה כ-y=x. לכן, ביצועי חיזוי מצוינים נצפו באיור 4.

חומרים ושיטות

הכנת דוגמא

מאה שש עשרה דגימות C. tubulosa נאספו ממחוז Hotan שבאזור האוטונומי של שינג'יאנג משנת 2013 עד 2015. כל הדגימות טופחו, אך הן נאספו בשלבי צמיחה שונים. המשקל הטרי של הדגימות נע בין 20 גרם ל-1000 גרם. לאחר ייבוש השמש, הדגימות המיובשות נמחצו ונופו דרך מסננת רשת 60- [3,23].

איסוף נתונים ספקטרוסקופי של NIR

ספקטרום ה-NIR של הדגימות נאספו במרווח של 8 ס"מ-1 על פני האזור הספקטרלי של 4000-10,000 ס"מ-1 עם מערכת Antaris MXFT-NIR (Thermo Scientific, מדיסון, WI, ארה"ב) מצויד במתאם כף יד להחזרת סיבים אופטיים. כל ספקטרום התקבל על ידי ממוצע של 64 סריקות. כל הדגימות הורשו להתאזן לטמפרטורת החדר (25. C) לפני סריקת ספקטרום NIR כדי להבטיח שהדגימות נותחו באותה טמפרטורה. הלחות במעבדה נשמרה ברמה הסביבה.

איסוף נתונים HPLC

הכנת מיצוי

גרם אחד של אבקת C. tubulosa חולץ עם 50 מ"ל של 50 אחוז מתנול בבקבוק חרוט עם אולטרה-סוניציה (500 W, 40 קילו-הרץ) למשך 30 דקות. התמצית אוחסנה ב-4 ◦C. הסופרנטנט של התמצית סונן כדי לקבל דגימה לניתוח HPLC [3,23].

קביעה סימולטנית של Echinacoside ו- Verbascoside עם HPLC-UV

ניתוח כרומטוגרפי נוזלי נערך על מערכת Shimadzu UHPLC (Shimadzu, קיוטו, יפן) המורכבת משתי יחידות אספקת ממס LC-20ADXR, משאבת LC-20AD, דגימת SIL-20ACXRauto , CTO-20תנור עמודות AC, גלאי SPD-M20A DAD, מסיר גז DGU-20A3R ובקר ICBM-20.

עמודת Grace Prevail Carbohydrate ES (150 × 2.1 מ"מ, 2.7 מ"מ) ששימשה להפרדות הכרומטוגרפיות נשמרה ב-35 ◦C. השלב הנייד כלל מאצטוניטריל (A) ו-0.1 אחוז חומצה פורמית מימית (B) ונמסר בעקבות תוכנית הגרדיאנט כדלקמן: 0-7 דקות, שיפוע ליניארי של 10-20 אחוז א'; 7–15 דקות, 20 אחוז A; ו-15-20 דקות, שיפוע ליניארי של 20-10 אחוז A. קצב המעבר של השלב הנייד היה 0.4 מ"ל/דקה. ניטור UV בוצע ב-330 ננומטר.

קביעה סימולטנית של מניטול, סוכרוז, גלוקוז ופרוקטוז עם HPLC-ELSD

HPLC בוצע על מערכת LC מסדרת Agilent 1100 (Palo Alto, CA, ארה"ב) המורכבת ממסיר גז aG1322A, משאבה רבעונית G1311A, דגימה אוטומטית G1311A, בקר טמפרטורת עמודה G1316A וגלאי G1315B DAD.

עמודת Sigma Prevail Carbohydrate ES (4.6 × 250 מ"מ, 5 מיקרומטר) הופעלה להפרדות כרומטוגרפיות ונשמרה בטמפרטורת העמודה של 25 ◦C. השלב הנייד הורכב מאצטוניטריל ומים (77:23, v/v) ובעלי ברית איזוקרטיים שסופקו בקצב נוסף של 0.7 מ"ל/דקה. הקולחים נוטרו באמצעות גלאי פיזור אור באידוי (ELSD) עם פרמטרים המוגדרים כברירת מחדל [23,24].

עיבוד נתונים

TQ Analyst (גרסה 8.0, Thermo Scientific, מדיסון, WI, ארה"ב) שימש לביצוע חלוקה של ערכות הכיול והאימות, טיפול מקדים מתמטי של הספקטרום, הקמת מודלים של כיול וחישובים אחרים. המקור (גרסה 9.1) שימש לייצור הדמויות.

מסקנות

תודות: עבודה זו נתמכה על ידי הפרויקט הלאומי לתכנון מדע וטכנולוגיה של סין (2015BAD29B00-04).

תרומות מחבר: Xinhong Wang הגה ועיצב את הניסויים. Xinhong Wang ו- Xiaoguang Wang ביצעו את הניסויים. Xinhong Wang ויוחאי גואו כתבו את העיתון.

ניגודי עניינים: המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

הפניות

1. ג'יאנג, י.; טו, PF ניתוח של מרכיבים כימיים במינים של cistanche. J. Chromatogr. 2009, 1216, 1970–1979. [CrossRef] [PubMed]

2. שו, ר.; חן, ג'; חן, ש.-ל.; ליו, ט.-נ.; Zhu, W.-C.; Xu, J. Cistanche deserticola Ma מטופח כגידול חדש בסין. ג'נט. משאב. Crop Evol. 2008, 56, 137–142. [CrossRef]

3. עריכת ועדת הפרמקופיה הסינית. פרמקופיאה סינית, מהדורה 2005; עיתונות כימית תעשייתית: בייג'ינג, סין, 2005; כרך 1, עמ'. 90.

4. קוביאשי, ח.; Komatsu, J. Constituents of cistanchE herba (1). Yakugaku Zasshi 1983, 103, 508–511. [CrossRef] [PubMed]

5. שיר, ז"ה; ליי, ל.; Tu, PF התקדמות במחקר של פעילות פרמקולוגית בצמחים של cistanche huffing. קישור א'. סַנְטֵר. מסורת. עֵשֶׂב. סמים 2003, 34, 473–476.

6. שיונג, ש.; קדותא, ש; תני, ת.; Namba, T. השפעות נוגדות חמצון של פנילאתנואידים מ- Cistanche deserticola. ביול. פארם. שׁוֹר. 1996, 19, 1580–1585. [CrossRef] [PubMed]

7. שואן, GD; Liu, CQ מחקר על ההשפעה של phenylethanoid glycosides (PEG) של Cistanche deserticola על אנטי אייג'ינג בעכברים מבוגרים המושרה על ידי D-galactose. ג'יי צ'ין. Med. מאטר. 2008, 31, 1385–1388.

8. סאטו, ט.; קוזימה, ש.; קוביאשי, ק.; Kobayashi, H. מחקרים פרמקולוגיים על Cistanchis Herba. I. השפעות המרכיבים של Cistanchis Herba על מין והתנהגות למידה בעכברים בלחץ כרוני. Yakugaku Zasshi 1986, 105, 1131–1144. [CrossRef]

9. Shen, CY; Jiang, JG; יאנג, ל.; וואנג, DW; Zhu, W. חומרים פעילים אנטי אייג'ינג מצמחי מרפא וחומרים תזונתיים המשמשים ברפואה סינית מסורתית: מנגנונים פרמקולוגיים והשלכות לגילוי תרופות. בר. J. Pharmacol. 2016, 11, 1395–1425. [CrossRef] [PubMed]

10. לי, נ.; וואנג, ג'; מא, ג'; גו, ז; Jiang, C.; יו, ל.; Fu, X. השפעות עצביות הגנה של Cistanches Herba Therapy על חולים עם מחלת אלצהיימר בינונית. Evid. משלים מבוסס. אלטרנט. Med. 2015, 2015. [CrossRef] [PubMed]

11. Gao, JY; ג'יאנג, י.; דאי, פ.; האן, ז"ל; ליו, HY; באו, ז; ג'אנג, TM; Tu, PF מחקר על מרכיבים משלשלים ב- Cistanche deserticola YC Ma. מוד. סַנְטֵר. Med. 2015, 17, 307–310.

12. טו, PF; חן, QL; ג'יאנג, י.; גואו, י"ה; יאנג, טקסס; וואנג, XY; איירקאן, מ.; לי, XB; דו, י.; נאן, זד; et al. טכניקות גידול של Cistanche tubulosa והמארח שלה Tamarix spp. מוד. סַנְטֵר. Med. 2015, 17, 349–358.

13. טו, PF; ג'יאנג, י.; גואו, י"ה; טיאן, YZ; לי, XB; וואנג, XY; ווי, ג'; חן, QL; Aierkan, M. פיתוח תעשייה אקולוגית של cistanches herba לקידום הציוויליזציה האקולוגית של אזור המדבר המערבי. מוד. סַנְטֵר. Med. 2015, 17, 297–301.

14. לו, DY; Zhang, JY; יאנג, ZY; ליו, HM; לי, ש; וו, BJ; Ma, ZG ניתוח כמותי של cistanches herba באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשילוב עם זיהוי מערך דיודות וספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה בשילוב שיטות כיומטריות. J. Sep. Sci. 2013, 36, 1945–1952. [CrossRef] [PubMed]Molecules 2017, 22, 843 9 מתוך 9

15. ג'יאנג, י.; לי, SP; וואנג, YT; חן, XJ; Tu, PF בידול של עשבוני עשב על ידי טביעת אצבע עם כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים-זיהוי מערך דיודות-ספקטרומטריית מסה. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]

    ---