R. Vesicarius L. מפעיל אפקט מגן נפרו נגד מתח חמצוני המושרה על ידי ציספלטין
Mar 26, 2022
איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com
מד' מחמודול חסן1, רוב. סיילה טסמין2, אחמד מ' אל-שהווי3, Mona M. Elseehy4, מד' אבו רזא1ואריפול האק2*
תַקצִיר
רקע כללי:Cisplatin היא תרופה אנטי-סרטנית יוצאת דופן, אך השימוש בה ירד פלאים עקב רעילות נפרוטואלית חמורה. R. vicarious L. הוא ירק עלים הניכר בעל פוטנציאל אנטי-אנגיוגני, אנטי דלקתי, אנטי-שגשוג, מגן על הכבד ומגן על הכליות. לכן, מחקר זה תוכנן לבחון את תמצית המתנול שלו (RVE) עבור אפקט מגן על הכליות האפשרי.
שיטות:בעיקר, במבחנה, הפעילות נוגדת החמצון של RVE אושרה על סמך 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) כישרון לניקוי רדיקלים חופשיים. לאחר מכן, עכברי זכר אלבינו שוויצרים טופלו בציספלטין (2.5 מ"ג/ק"ג) במשך 5 ימים רצופים כדי לגרום לרעילות נפרוטית. התאוששות מרעילות נפרוטית נבדקה על ידי טיפול בבעלי החיים ב-RVE (25, 50 ו-100 מ"ג/ק"ג) תוך-צפקית (ip) במשך 5 הימים הבאים ברציפות. לאחר השלמת הטיפול, הקריבו עכברים ואספו כליות. חלק ממנו הומוגג במאגר נתרן פוספט להערכת רמת מלונדאלדהיד (MDA), חלק אחר שימש להערכת ביטוי הגנים (NQO1, p53 ו-Bcl-2). יתרה מכך, יכולת הנטרול של מי חמצן (H2O2) של RVE הוערכה בתאי HK-2 במבחנה. לבסוף, פיטוכימיקלים ביו-אקטיביים ב-RVE נקבעו באמצעות כרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסה (GC-MS).
תוצאות:RVE הראה פעילות נוגדת חמצון במבחנה באופן תלוי מינון עם ערך IC50 של 37.39 ± 1.89 ug/mL.
טיפול ב-RVE הפחית בצורה יוצאת דופן (p < {{0}}}.05)="" את="" תכולת="" ה-mda="" ברקמת="" הכליה.="" חוץ="" מזה,="" הביטוי="" של="" הגנים="" nqo,="" p53="" ו-bcl-2="" הופחת="" באופן="" משמעותי="" (p="">< 0.05)="" באופן="" תלוי="" מינון="" עקב="" מתן="" rve.="" rve="" באופן="" מובהק="" (p="">< 0.05)="" הפך="" את="" רמת="" h2o2="" בתאי="" hk-2="" לכמעט="" נורמלית.="" מ-gc-ms,="" עשר="" תרכובות="" כולל="" שלושה="" נוגדי="" חמצון="" ידועים="" "4h-pyran-4-one,="" 2,="" 3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-"="" ,="" "חומצה="" הקסדקנואית"="" ו-"squalene"="" זוהו.="" התמצית="" הייתה="" עשירה="" באלקלואיד="">
סיכום:בסך הכל, ל-RVE יש אפקט מגן מפני נזק לכליות הנגרמת על ידי ציספלטין.
מילות מפתח:Cisplatin, R. Vicarious, עכברים, כליה, תאי HK-2, מתח חמצוני, הגן NQO1
Cistanche deserticola מונע מחלת כליות, לחץ כאן כדי לקבל את הדוגמה
מבוא
עקה חמצונית היא תוצאה של חוסר פרופורציה בין היווצרות מיני חמצן תגובתיים (ROS) לבין מנגנוני הגנה רגילים של נוגדי חמצון [1]. תגובות ביוכימיות קבועות, חשיפה תכופה לסביבה הבלתי חיובית וצריכה מוגברת של קסנוביוטיקה גורמות לייצור ROS [1]. ROS מקיים אינטראקציה עם שאריות ציסטאין של מולקולות איתות רגישות לחיזור כולל גורמי שעתוק, חלבון טירוזין פוספטאזות וחלבונים קינאזות; כתוצאה מכך, חמצון של קבוצות תיול בשאריות אלו מנחה את השינויים של החלבונים הממוקדים, פעולות ביולוגיות, יכולות איתות, חסינות ופרדיגמות תאים חיים/מתים משלימים [2]. מינים כימיים המכילים חמצן בעלי תכונות תגובתיות ידועים כ-ROS הכוללים רדיקלים חופשיים ומולקולות לא רדיקליות כגון סופראוקסיד ו-H2O2, בהתאמה [3]. מתח חמצוני המושרה על ידי ROS קשור לאטיולוגיה של מחלות רבות כולל סרטן. לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) היא גידול סרטני של תאי דם בתוך מח העצם. האירועים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס AML כוללים נזק ל-DNA, התפשטות משובטית, מוות תאים מוגבר וחוסר יציבות גנטית נוספת, שהם תוצאה של מתח חמצוני המושרה על ידי ROS [4]. הפיזיולוגיה האנושית ניחנת במנגנונים רבים שיכולים ליצור נוגדי חמצון כדי להפעיל הגנה מפני מתח חמצוני המוביל להגנה על תאים מפני השפעות רעילות ולעזור למניעת מחלות [5]. עם זאת, תאים מפתחים מנגנונים אנדוגניים כדי לנטרל מתח חמצוני ולשמור על ROS הנדרש [6].
NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1 (NQO1) הוא פלבו-אנזים [7] שיכול לזרז הפחתת שניים או ארבעה אלקטרונים ומנצל תכונה זו לניקוי רעלים כינינים [8]. זה יכול להגן על תאים מפני נזק חמצוני על ידי שמירה על מחזור חיזור הצידה ועל ידי הפחתת הייצור של רדיקלים חופשיים [8]. מלבד ניקוי רעלים קסנוביוטי, NQO1 מעורב גם בניטרול סופראוקסיד, אפנון של פירוק פרוטאזומלי של p53 [9], עיכוב Bcl-2 [10] ושיפור הרגישות לפציעה בתאים [11].
Cisplatin היא התרופה הראשונה שאושרה על ידי מינהל המזון והתרופות (FDA) המבוססת על פלטינה [12]. Cisplatin מפעיל אפופטוזיס על ידי גרימת מתח חמצוני וביטוי יתר של גן מדכא הגידול p53 [12]. מספר תופעות לוואי כולל רעילות נפרוטוקסיות, רעילות בכבד, רעילות גסטרו, רעילות אוטו, דיכוי מיאלוס ונוירוטוקסיות הן תוצאה של מתח חמצוני המושרה על ידי ציספלטין [12]. תופעות הלוואי הללו הפחיתו באופן מדהים את השימוש בציספלטין למרות שיש לו פעילות אנטי סרטנית יוצאת דופן. ציספלטין ידוע כגורם ללחץ חמצוני ומדכא את הגן NQO1 בכליות עכברים [13]. לכן, חיפוש ואימות של מקורות טבעיים יעילים של נוגדי חמצון הופכים לתחום של מודעות. צריכת נוגדי חמצון תזונתיים שמקורם בצמחים כגון פלבנואידים, קרוטנואידים ותרכובות פנוליות עשויה להוביל להגנה מפני מחלות לב וכלי דם, קטרקט וסרטן [14].
R. Vicarious (Polygonaceae) ידוע בשם "Takpalong/ Chukapalong/Amlabetom" בבנגלית [15]. הוא גדל באזורים המדבריים והמדבריים למחצה של אסיה, אוסטרליה וצפון אפריקה [16]. זהו צמח שנחקר מעט בסכנת הכחדה בבנגלדש. בבנגלדש אנשים צורכים את כל הצמח כירק לאחר בישול עם מלח, תבלינים שונים ושמן. לפעמים, אנשים משתמשים רק בעלים הטריים בסלט מעורב כחלופה לחסה. העלה הגולמי חמצמץ מעט, אך הוא הופך חמוץ מאוד לאחר הבישול. יתר על כן, בדרך כלל מערבבים מספר קטן של עלים במנות דגים במהלך הבישול כדי שיהיה להם טעם חומצי עדין.
צמח זה משמש כצמח ירק וצמח מרפא ברחבי העולם [17]. העלים והזרעים משמשים כתרופה נגד ארס נחשים ועקרבים, בהתאמה [17]. בטיפול עממי, R. vicarious שימש כבר זמן רב בטיפול במחלות כבד, עיכול רע, עצירות, ערימות, הקאות, גזים, צרות לב, כאבים, הפרעות בטחול, דיספפסיה, כאבי שיניים, ברונכיטיס, אסטמה, גרדת, לוקודרמה, וכסם. משלשל, קיבה, מתאבן, טוניק, משתן ומשכך כאבים [18]. צמח זה מורכב ממספר רב של תרכובות חשובות ביולוגית, כולל פלבנואידים, אנתרקינונים, קרוטנואידים, ויטמינים, שומנים וחומצות אורגניות, הידועים היטב כנוגדי חמצון, אנטי מיקרוביאליים ואנטי סרטניים [19]. כל חלק בצמח זה מכיל קוורצטין (פלבנואידים) בכמות מוגברת [15]. צמח זה מכיל 0.25 מ"ג ויטמין A, 1.33 מ"ג ויטמין C, 2.37 מ"ג ויטמין E [15], 3.38 מ"ג פלבנואידים ו-5.66 מ"ג פוליפנולים [20] לכל 100 גרם משקל יבש.
Shahat ועמיתיו [21] הראו השפעות אנטי-אנגיוגניות ואנטי-שגשוגות של תמצית מתנול (80 אחוז) של חלק אווירי של R. vicarious נגד קרצינומה כבדית במודל של חולדה. מחקר אחר הראה פוטנציאל אנטי-אנגיוגני במבחנה של תמצית R. vicarious [22]. תמצית מתנול של R. vicarious שלם מפעילה הגנה מפני רעילות כבד הנגרמת על ידי פחמן טטרכלוריד in vivo [23]. השפעה אנטי דלקתית בארנבות ניכרה על ידי תמצית עלים מתנולית של R. vicarious [24]. מחקר שנערך לאחרונה [25] דיווח על השפעת הגנה על הכליות in vivo של תמצית אתנולית R. vicarious נגד רעילות גנטמיצין ואשלגן דיכרומט.
תוך התחשבות במידע הנ"ל, מטרתנו לבדוק את ההשפעה של תמציות R. vicarious (RVE) במונחים של התאוששות מרעילות נפרוטוקסית הנגרמת על ידי ציספלטין באמצעות שמירה על ביטוי גנים NQO1 במודל של בעלי חיים.
יתרונות בריאותיים של cistanche: טיפול במחלות כליות
חומרים ושיטות
כימיקלים וריאגנטים
Cisplatin ו-2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) נרכשו מ-SIGMA-ALDRICH (ארה"ב).
ערכת קריאטינין קולורימטרית (מזהה מוצר - 700,460) נרכשה מ-Cayman Chemical (ארה"ב). Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), סרום בקר עוברי (FBS) ואנטיביוטיקה (10,000 U/mL פניצילין ו-10,{5}} ug/mL סטרפטומיצין) נרכשו מ-Gibco (Gibco Laboratories, ארה"ב). ערכת Assay ROS-Glo™ H2O2 ו-GoTaq® qPCR Master Mix הושגו מ-Promega (ארה"ב). ערכת שעתוק לאחור TIAN- Script M-MLV נרכשה מ-TIANGEN (סין) ופריימרים מ-IDT (Integrated DNA Technologies, מלזיה). כל שאר הכימיקלים והריאגנטים ששימשו בניסוי זה היו בדרגה אנליטית.
איסוף דגימות צמחים והכנת תמציות
צמחים טריים של R. נרכשו משוק מקומי בסונדיג'י, ראג'שאהי, בנגלדש. דגימת צמחים זוהתה ואומתה על ידי ד"ר אחמד הומאיין כביר, המחלקה לבוטניקה, אוניברסיטת ראג'שאהי, בנגלדש. דגימה תחת שובר מס'. 00095 אוחסן בעשב של המחלקה לבוטניקה, אוניברסיטת ראג'שאהי. החלקים האוויריים של המפעל נוקו, יובשו ב-37 מעלות, טחנו לאבקה גסה באמצעות מייבש אלקטרוני, ואוחסנו בכלי אטום ב-4 מעלות. האבקה העדינה (10 גרם) הומסה במתנול (500 מ"ל). התוכן עבר קול (Soni-prep 150, סין) ב-20 קילו-הרץ למשך 10 דקות. סינון התמצית בוצע באמצעות נייר מסנן סיבי זכוכית (Macherey NAGEL, GmBH, גרמנית) עם מכשיר סינון DURAN (גרמנית). לבסוף, התסנין רוכז באמצעות מייבש הקפאה (VirTis Benchtop Pro, SP SCIENTIFIC, ארה"ב). התמצית קיבלה לבסוף את השם RVE.
בדיקת פעילות נוגדת חמצון במבחנה
קיבולת נוגדי חמצון במבחנה של RVE בוצעה על סמך ניקוי DPPH כפי שתואר קודם [26] עם מעט שינויים. יכולת הסרת DPPH רדיקלית של RVE הוערכה על סמך המרת הצבע הסגול של DPPH לצבע צהוב. תערובת התגובה בכל צינורית מיקרו-צנטריפוגה (2 מ"ל) כללה 950 מיקרוליטר מתנולי של רדיקלי DPPH (0.1 מ"מ) ו-50 μL RVE מחמישה ריכוזים שונים (200, 500, 1000, 2000 ו-4000 ug. /mL מתנול) כדי ליצור ריכוזים סופיים של 10, 25, 50, 100 ו-200 ug/mL. צינור נוסף שהכיל 50 μL מתנול ו-950 μL מתנול של DPPH נשמר כשליטה. המבחנות הושארו במשך 30 דקות במקום חשוך. הספיגה של התערובות נלקחה ב-517 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר GENESYS 10S UV-VIS (Thermo SCIENTIFIC, ארה"ב). לבסוף, אחוז הפעילות הרדיקלית (RSA) חושב על סמך שינוי הצבע של DPPH באמצעות הנוסחה הבאה אחוז RSA=[(ADPPH − ARVE)/ADPPH] × 100 כאשר ADPPH הוא הספיגה של תמיסת DPPH (שליטה) ו-ARVE הוא הספיגה של תמיסת ה-RVE. הריכוז שבו הביא RVE ל-50 אחוז RSA כונה כערך IC50 וחושב באמצעות גרף המציב אחוז RSA מול ריכוזי RVE שונים בשימוש.
חיות ניסוי ועיצוב ניסוי
עכברים זכרים שוויצריים לבקנים בני 42 ימים (30-32 גרם משקל גוף) התאקלמו במשך שבוע לפני תחילת הניסוי בחדר (טמפרטורה של כ-25 ± 2 מעלות ו-50 אחוזי לחות, 12 שעות מחזור חושך/אור). מי שתייה ומזון סופקו באופן חופשי.
עכברים הופרדו באופן אקראי לשמונה קבוצות (n {{0}}). הקבוצה הראשונה (ביקורת) טופלה ב-0.2 מ"ל של 0.9 אחוז NaCl. ארבע הקבוצות הבאות טופלו עם cisplatin במינון 2.5 מ"ג/ק"ג במשך 5 ימים במרווח של 24 שעות. לאחר מתן cisplatin, קבוצה אחת (קבוצה שנייה) נותרה ללא כל טיפול נוסף ונקבעה כקבוצת הביקורת בלחץ. הקבוצה השלישית, הרביעית והחמישית טופלו בהמשך ב-RVE ב-25, 50 ו-100 מ"ג/ק"ג, בהתאמה למשך 5 ימים. שלוש קבוצות נוספות טופלו ב-RVE רק ב-25, 50 ו-100 מ"ג/ק"ג, בהתאמה למשך 5 ימים. Cisplatin ו-RVE הומסו במים מזוקקים. כל הטיפולים ניתנו תוך צפקית. לאחר 24 שעות מהטיפול האחרון, החיות הורדמו לאחר נקע בצוואר הרחם [25]. לאחר מכן נפתח הצפק במספריים, דם נאסף בעקבות ניקור לב, וכליות נאספו באמצעות מלקחיים. דם נבדק כדי לבדוק את רמת הקריאטינין בסרום. הכליות היו נתונים להערכת רמת מלונדאלדהיד וביטוי גנים.
מדידת קריאטינין בסרום
קריאטינין בסרום נמדד באמצעות ערכת קריאטינין קולורימטרית -700,460 (Cayman Chemical, ארה"ב) בהתאם לפרוטוקול היצרן שסופק עם הערכה.
מדידת חמצון שומנים בכליות
מלונדאלדהיד (MDA) הוא תוצר סופי של חמצון שומנים ברקמת הכליה, ובדרך כלל נמדד כאינדיקטור לייצור ROS. עם זאת, רמת MDA נמדדה ברקמת הכליה על פי מחקר קודם [27]. בהתחלה, רקמת הכליה הומוגגה במאגר נתרן פוספט (0.1 M, pH 7.4). תמיסת תגובה הכוללת 0.8 אחוז חומצה thiobarbituric (1.5 מ"ל), 8.1 אחוז SDS (200 μL), 20 אחוז (pH 3.5) חומצה אצטית (1.5 מ"ל), ו-dH2O (600 μL) נוספה ל-100 μL של רקמה הומוגנית, והתערובת הודגרה ב-95 מעלות למשך שעה. לאחר הקירור, התערובות עברו צנטריפוגה ב-10,000 גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות והספיגה של הסופרנטנט נמדדה ב-532 ננומטר עם פרופאן סטנדרטי 1, 1, 3, 3- טטרה מתוקסי. כמות החלבון הכוללת נמדדה באמצעות ערכת Bradford Protein Assay (BIO-RAD, ארה"ב), ועל ידי השוואה עם אלבומין בקר סטנדרטי (BSA). עוצמת החמצנים של שומנים הוגדרה כננומולים (nM) של MDA למיליגרם (מ"ג) חלבון.
תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (PCR בזמן אמת)
PCR בזמן אמת בוצע כפי שתואר קודם [28, 29]. RNA הכולל מרקמת כליה בודד באמצעות ריאגנט TRIzol® (Invitrogen) לפי הפרוטוקול שסופק על ידי היצרן. ה-RNA המבודד (1 ug) הומר לאחר מכן ל-cDNA. ראשית, 2 μL hexamer אקראי (10 μM), 2 μL dNTPs (10 mM), 1 ug RNA, ו-HO ללא נוקלאז עד 15 μL נלקחו והודגרו למשך 5 דקות ב-70 מעלות. התערובת הונחה מיד על קרח למשך 2 דקות. לאחר מכן נוספו 4 μL של חיץ גדיל ראשון (5x) ו- 1 μL M-MLV transcriptase הפוכה בכל צינור והודגרו למשך 10 דקות ו-50
דקות ב-25 מעלות ו-42 מעלות, בהתאמה. לבסוף, האנזים M- MLV-reverse transcriptase הושבת על ידי דגירה של התערובת ב-95 מעלות למשך 5 דקות. מוצרי ה-cDNA המסונתזים עברו ל-PCR בזמן אמת לכימות של ביטוי גנים NQO1, p53 ו-Bcl-2 באמצעות פריימרים ספציפיים (טבלה 1). כל תגובה (10 μL) בוצעה בשלושה עותקים הכוללת 5 μL GoTaq qPCR Master Mix (2x) (Promega, ארה"ב), 0.5 μL (10 mM) מכל פריימר, 3 μL מים ללא נוקלאז, ו 1 μL cDNA ב48-צלחות תגובה של באר. רכיבה תרמית בוצעה באמצעות מכונת PCR בזמן אמת (Eco™ Real-Time PCR System, Illumine®, ארה"ב) עם תנאי הרכיבה הבאים: 95 מעלות למשך 10 דקות, ולאחר מכן 40 מחזורים של 95 מעלות למשך 30 שניות, 50 מעלות למשך 30 שניות, ו-72 מעלות למשך 25 שניות. הספציפיות של תגובות PCR אושרה על ידי ניתוח עקומת ההיתוך ב-95 מעלות למשך 15 שניות, 45 מעלות למשך 15 שניות ו-95 מעלות למשך 15 שניות. הספציפיות של תגובות PCR אושרה על ידי ניתוח עקומת ההיתוך ב-95 מעלות למשך 15 שניות, 45 מעלות למשך 15 שניות ו-95 מעלות למשך 15 שניות. הכימות היחסי של ביטוי הגנים בוצע באמצעות גן GAPDH אנדוגני כשליטה המבוססת על שיטת ΔΔCq.
תרבית תאים וטיפול
קו תאי אפיתל אבובתי פרוקסימלי של הכליה האנושית, תאי HK-2, נשמרו ב-DMEM בתוספת של 10 אחוז FBS ואנטיביוטיקה (50 U/mL של פניצילין ו-50 ug/mL סטרפטומיצין) באינקובטור עם 5% CO2 ו-95 אחוזי לחות ב-37 מעלות.
בדיקת מדידת H2O2
רמת H2O2 בתאי HK-2 הוערכה על ידי שימוש בערכת ROS-Glo™ H2O2 Assay (Promega, ארה"ב) לפי הפרוטוקול שסופק על ידי יצרן הערכה. תאי HK-2 (1000 תאים) ב-70 μL DMEM הונחו בארות של 96-צלחת המיקרוטיטר של הבאר. לאחר שאפשרו הצמדת התאים על פני הקיר, 10 μL DMEM מבארות של צלחת מיקרוטיטר הוחלפו ב-10 μL cisplatin (25 μM ב-DMEM) ונשמרו באינקובטור למשך 12 שעות. לאחר מכן, נוספו 10 μL RVE כדי ליצור ריכוזים סופיים של 125, 250 ו-500 ug/mL ב-DMEM והודגרו למשך 12 שעות נוספות. לאחר מכן, נוספו לכל באר 20 μL תמיסת מצע H2O2 ו-100 μL ROS-Glo™™ Detection Solution. התגובה הודגרה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לבסוף, הארה נמדדה באמצעות GloMax Luminometer (Promega, ארה"ב).
ניתוח GC-MS
ניתוח GC-MS של RVE (מומס במתנול) בוצע כמתואר קודם [30] באמצעות GCMS- QP2020 (SHIMADZU) הכולל דגימה אוטומטית (AOC{ {5}}s), מזרק אוטומטי (AOC-20i), וכרומטוגרף גז (GC-2010 פלוס) המשולבים בספקטרומטר מסה המצויד ב-SH-Rxi{{1{{ 37}}}}עמודת נימי סיל MS (30 מ' × 0.25 מיקרומטר מזהה × 0.25 מיקרומטר DF). הגז הנשא הליום נשמר בקצב זרימה קבוע של 1.72 מ"ל לדקה, ונפח הזרקה של 5 μL הועבר ביחס פיצול של 10:1. טמפרטורת המזרק נשמרה על 220 מעלות, טמפרטורת מקור היונים הייתה 280 מעלות, טמפרטורת התנור תוכננה מ-80 מעלות (החזקה למשך 2 דקות), עם עליה של 5 מעלות/דקה ל-150 מעלות (זמן החזקה 5.0). דקה), לאחר מכן 5 מעלות/דקה עד 280 מעלות, וכלה באיזותרמית של 8 דקות ב-280 מעלות. ספקטרום מסה נלקחו ב-1.5 קילו וולט עם מרווח סריקה של 0.5 שניות והדגימה בוצעה בטווח של 45-350 מ/צ. עיכוב הממס היה בין 0 ל-3 דקות, וזמן הריצה הכולל של GC-MS היה 55 דקות. הריכוז היחסי של התרכובות שזוהו נמדד על ידי השוואת שטח השיא הממוצע שלה לשטח הכולל. הפרשנות של ספקטרום המסה ב-GC-MS בוצעה באמצעות מסדי נתונים של התקן והטכנולוגיה של המכון הלאומי (NIST), כולל NIST08, NIST08s ו-NIST14.
ניתוח סטטיסטי
הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו על ידי ANOVA בעקבות מבחן T3 של דאנט באמצעות תוכנת IBM SPPS (גרסה 20). הנתונים מנוסחים כאמצעים ± סטיית תקן (SD). ההשוואה המשמעותית נבחנה בעמוד<0.05. all="" of="" the="" graphs="" were="" prepared="" using="" microsoft="" excel="" (version="">
תוצאות
בדיקת פעילות נוגדת חמצון במבחנה
למרות שבעבר דווח על RVE כבעל פעילות נוגדת חמצון, בדקנו מחדש את פעילות נוגדת החמצון של התמצית שלנו באמצעות יכולת ניקוי רדיקלים חופשיים של DPPH. RVE ניטרל DPPH בהתאם למינון (איור 1). RVE חשף פעילות נוגדת חמצון ניכרת במבחנה וערך ה-IC50 המחושב של RVE היה 37.39 ± 1.89 ug/mL.
מדידת קריאטינין בסרום
רמת הקראטינין בסרום בעכברים עלתה באופן מובהק (p < {0}}.05)="" לאחר="" מתן="" cisplatin="" (טבלה="" 2).="" טיפול="" ב-rve="" הביא="" לשיפור="" ניכר="" ברמת="" הקראטינין=""><0.05) באופן="" תלוי="" מינון="" (טבלה="">
מדידת חמצון שומנים בכליות
בהשוואה לבקרה, ציספלטין הגדיל במידה ניכרת (p < {0}}.05)="" את="" תוכן="" ה-mda="" ברקמת="" הכליה="" של="" עכברים="" (טבלה="" 3).="" לעומת="" זאת,="" הטיפול="" ב-rve="" באופן="" ניכר="" (p="">< 0.05)="" החזיר="" את="" mda="" למצב="" כמעט="" תקין="" באופן="" תלוי="" מינון="" (טבלה="">
PCR בזמן אמת
Cisplatin באופן מובהק (p < {{0}}.05)="" הפחית="" את="" ביטוי="" ה-nqo1="" mrna="" ב-0.15-פיפול="" והגדיל="" את="" p53="" ו-bcl-2="" mrna="" ביטוי="" לפי="" 24="" ו-4.2-קיפול,="" בהתאמה="" (איור="" 2).="" rve="" במידה="" ניכרת="" (p="">< 0.05)="" הפחית="" את="" ביטוי="" ה-mrna="" של="" nqo1,="" p53="" ו-bcl-2="" באופן="" תלוי="" מינון="" (איור="" 2).="" בהשוואה="" לקבוצה="" היחידה="" שטופלה="" בציספלטין,="" ביטוי="" mrna="" של="" nqo1="" גדל="" ב-3.57,="" 6.36="" ו-9.28-פי="" 25,="" 50="" ו-100="" מ"ג/ק"ג="" rve,="" בהתאמה="" (איור="" 2א).="" שוב,="" ביטוי="" mrna="" של="" p53="" ירד="" בפי="" 0.63,="" 0.46="" ו-0.21-="" ב-25,="" 50="" ו-100="" מ"ג/ק"ג="" rve,="" בהתאמה="" (איור="" 2ב).="" ביטוי="" bcl-2="" mrna="" הופחת="" גם="" בפי="" 0.71,="" 0.40="" ו-0.{47}}="" ב-25,="" 50="" ו-100="" מ"ג/ק"ג="" rve,="" בהתאמה="" (איור="" 2c).="" אבל,="" לא="" נמצאו="" שינויים="" משמעותיים="" (p=""> 0.05) ברמת הביטוי של הגנים NQO1, p53 ו-Bcl-2 עקב טיפול ב-RVE (איור 3).
H2O2בדיקת מדידה
במבחן מדידת H2O2, ה-H2O2הרמה נחשבה פרופורציונלית לזוהר. מתן cisplatin באופן מובהק (p < {{0}}.05)="" העלה="" את="" רמת="" h2o2="" פי="" 2.2-="" (איור="" 4).="" הטיפול="" ב-rve="" ירד="" במידה="" ניכרת="" (p="">< 0.05)="" רמת="" h2o2="" בפי="" 0.25,="" 0.38="" ו-0.49-בפי="" 125,="" 250="" ו-500="" ug/ml,="">
ניתוח GC-MS
סה"כ 10 תרכובות (טבלה 4 ואיור 5) כולל "Isoborneol, pentamethyldisilanyl ether (squiterpene alcohol)", "Thymine (pyrimidine nucleobase)", "4H-Py-ran-4-one, 2,{{ 8}}דיהידרו-3,5-דיהידרוקסי-6-מתיל-(ספונין)", "חומצה הקסדקנואית, מתיל אסטר (חומצת שומן מתיל אסטר)", "9,12- חומצה אוקטקדדיאנואית, מתיל אסטר (חומצת שומן מתיל אסטר)", "9-חומצה אוקטדצנואית (Z)-, מתיל אסטר (מתיל אסטר חומצת שומן)", "מתיל סטארט (מתיל אסטר חומצת שומן)", "דיאיזוקטיל פתלט (אסטר)", "13-דוקוסנאמיד, (Z)- (אלקלואיד)", ו-"Squalene (tri-terpene)" זוהו ב-RVE.
יתרונות cistanche tubolosa: הורדת שומנים בדם
דִיוּן
נוגדי חמצון טבעיים וסינתטיים נחקרו באופן מקיף והתגלו כפונקציונליות למניעה או לשיפור של רעילות בפיזיולוגיה של בעלי חיים [31]. תוספי תזונה נוגדי חמצון הם הרכיב שפותח על ידי סינתזה כימית או על ידי מיצוי ממזונות טבעיים, אך אלה אינם זהים בהרכבם לנוגדי חמצון הזמינים במזון [5]. לכן, הדעות מופרדות לאורך זמן בין אם נוגדי חמצון סינתטיים נותנים יתרונות בריאותיים דומים לנוגדי חמצון טבעיים [32]. הדחף עולה להפחית את השימוש בתוספי נוגדי חמצון סינתטיים ולחפש מקורות חלופיים, זולים, מתחדשים, טבעיים ואולי בטוחים יותר של נוגדי חמצון טבעיים יעילים.
אחד המנגנונים החשובים ביותר הוא מסלול הגורם הגרעיני-2 הקשור לגורם-2 (Nrf2) שבדרך כלל מגן על תאים מפני מתח חמצוני המושרה על ידי גורמי לחץ אקסוגניים או אנדוגניים [27]. נוגדי החמצון היעילים מעוררים ביטוי של Nrf2, אשר עובר הלאה לתוך הגרעין ונקשר לאלמנט תגובה נוגד חמצון (ARE) המעורר ביטוי של גן ניקוי רעלים שלב II ונוגדי חמצון NQO1 [33, 34]. NQO1 מתבטא באופן נרחב ודיפרנציאלי באופן ספציפי לרקמות. NQO1 הוא פלבופרוטאין נוגד חמצון ציטוזולי המזרז את 2-הפחתת האלקטרונים של קינונים להידרוקינונים, וכתוצאה מכך ניקוי רעלים של האלקטרופילים וציפייה למחזור חיזור [35]. על פי מחקר קודם [36], -lapachone מפעיל את NQO1, אשר מעלה עוד יותר את רמת ה-NAD התוך תאי ומגן על הכליה מפני פציעה חריפה הנגרמת על ידי ציספלטין.
ידוע ש-Cisplatin גורם לנזק בממברנת הסינון הגלומרולרית באמצעות עקה חמצונית, דלקת ואפופטוזיס, אשר מובילים בסך הכל להפחתת קצב הסינון הגלומרולרי ואובדן חדירות הממברנה התקינה [37]. לכן, רמת הקראטינין בסרום עלתה. קריאטינין בסרום הוא אחד מסמני תפקוד הכליות הפוטנציאליים. טיפול ב-Cisplatin העלה את תכולת ה-MDA ברקמת הכליה שהיא תוצר משני של חמצון שומנים ודיווח זה קבוע עם מחקרים קודמים [27, 35, 37, 38]. טיפול ב-RVE הפחית משמעותית את תכולת ה-MDA ברקמת הכליה. במקביל, גם רמת הקריאטינין ירדה מה שמעיד על ההשפעה המשפרת של RVE.
חוץ מזה, ביטוי NQO1 ירד באופן משמעותי, וביטוי p53 ו-Bcl-2 עלו באופן משמעותי לאחר חשיפה ל-cisplatin. במונחים של ביטוי NQO1 ו-p53 in vivo, התוצאה שלנו עולה בקנה אחד עם מחקר קודם [13]. מחקר שנערך לאחרונה [39] הראה שציספלטין הפחית משמעותית את הביטוי של Bcl-2 בכליות של עכברים, אך באופן מפתיע מצאנו ביטוי מוגבר. הבדל זה עשוי להיות תוצאה של הבדל במינון [40] שכן מוחמד ועמיתיו [39] השתמשו ב-8 מ"ג/ק"ג במשך 12 ימים, בעוד שהשתמשנו ב-2.5 מ"ג/ק"ג למשך 5 ימים בלבד. מחקר אחר [41] קבע שציספלטין עשוי להגביר את הביטוי של Bcl-2 במינון שהוא לא ציטוטוקסי. שוב, ביטוי מוגבר של Bcl-2 גורם לרגישות לתאים לקראת עקה חמצונית [40].
עם זאת, ביטוי של p53 נמוך במצבים פיזיולוגיים נורמליים אך צפוי להיות מווסת מעלה לאחר טיפול בציספלטין מכיוון שחומר כימותרפי זה מבוסס פלטינה מפעיל מסלול אפופטוטי תלוי p53. לאחר שטיפלנו בעכברים עם cisplatin, p53 עלה משמעותית בכליות העכברים בהשוואה לביקורת. פרוטו-אונקוגן נוסף Bcl-2 נמצא גם בקורלציה עם רמת הביטוי NQO1. מחקה את ביטוי p53, מצאנו גם שרמות Bcl- 2 עלו עם טיפול ב-cisplatin, אך התכסו מחדש באופן משמעותי עם טיפול ב-RVE. זה אפשרי, בתגובה ללחץ חמצוני, הגן p53 מופעל וגורם לעצירת מחזור התא, הזדקנות או אפופטוזיס [6]. עם ניקוי רעלים, ביטוי יתר של NQO1 נחשב לעתים קרובות כמתאם עם אפופטוזיס בתאי סרטן [10], אם כי המנגנון הבסיסי של אפופטוזיס וביטוי יתר של NQO1 עדיין שנוי במחלוקת. יתרה מכך, בקרצינומה של הפטוצלולרית, ביטוי יתר של NQO1 מקטין את ביטוי Bcl-2 [10]. לפרוטו-אונקוגן Bcl- 2 יש גם p53 כמו המתאם עם ביטוי NQO1. p53 הוא גורם שעתוק ספציפי לרצף המופעל על ידי סוגים רבים של לחץ תאי [42], בעוד שביטוי יתר Bcl-2 פעל כמייצב נקבוביות מיטוכונדריאלי כדי להקל על שחרור ציטוכרום-c בעת עקה חמצונית [12]. במקרה שלנו, בדקנו את שתי תגובות הגנים עם טיפול בציספלטין ברקמת כליה תקינה ומצאנו את הביטוי המוגבר שלהן. טיפול ב-RVE החזיר את הביטוי של p53 ו-Bcl-2 לכמעט נורמלי באופן תלוי מינון. סוג זה של ביטול ביטוי Bcl-2 הוצג גם באמצעות ROS scavenger Trolox [43]. יתרה מכך, רמת H2O2 עלתה באופן ניכר גם בתאי HK-2 עקב טיפול ב-cisplatin במבחנה. לאחר טיפול ב-RVE, רמת H2O2 הוחזרה באופן משמעותי לנורמה. זה אולי נובע מהשפעת הטיפול ב-RVE שהגביר את ביטוי NQO1 [44], אשר מפעיל הגנה מפני עקה חמצונית [6].
כרומטוגרמת GC-MS אישרה את קיומן של עשר תרכובות ב-RVE. בין אלה, "4H-Pyran- 4-one, 2, 3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-", "Hexadecanoic acid" ו-" סקוואלן" הם נוגדי חמצון ידועים[45–47]. שלושת התרכובות הללו בכלל הפעילו אפקט הגנה על כליות סינרגטיות. מחקרים קודמים דיווחו גם על אינדוקציה של ביטוי NQO1 על ידי ויטמין A [48], ויטמין C [49], ויטמין E [50], פלבנואידים [51] ופוליפנולים [50]. לכן, דו"ח זה מציע להבהיר האם תמצית מסוימת זו מכילה משהו בין ויטמין A, ויטמין C, ויטמין E, פלבנואידים ופוליפנול, או לא.
סיכום
הממצא הכולל מצביע על כך ש-RVE יעיל מבחינה פיזיולוגית בהגנה על הכליות מנזק שנגרם כתוצאה מציספלטין. לכן, חיוני להבהיר את התרכובות המדויקות האחראיות להפחתת הרעילות הנפרוטית הנגרמת על ידי ציספלטין, אשר עשויה להיות מועילה ליישום בבני אדם.
תודות
המחברים אסירי תודה למועצת בנגלדש למחקר מדעי ותעשייתי (BCSIR), סניף Rajshahi על מתן תמיכת מעבדה לכימות RNA.
תרומות מחברים
MMH ביצעה תכנון ניסוי, ניסויים, ניתוח והכנת נתונים, כתיבה ועריכה של כתבי יד, תיקון וניסוח כתבי יד; MST & MME עשו ניסויים וניתוח נתונים; AME & MAR תרמו בפיקוח ובמשאבים; AH הייתה אחראית על המשגה, פיקוח, משאבים ועריכת כתבי יד. כל המחברים
סקר את כתב היד. המחברים קראו ואישרו את כתב היד הסופי.
מימון
העבודה הנוכחית מומנה על ידי מספר חוקרים תומכים בפרויקט מאוניברסיטת Taif (TURSP - 2020/75), אוניברסיטת Taif, Taif, ערב הסעודית.
זמינות נתונים וחומרים.
כל הנתונים הרלוונטיים זמינים ויכולים להיות מסופקים על פי בקשה למחבר המתאים.
הצהרות
אישור אתיקה והסכמה להשתתפות
האתיקה לביצוע ניסוי זה אושרה על ידי הוועדה המוסדית לבעלי חיים, אתיקה רפואית, בטיחות ביולוגית ובטיחות ביולוגית (IAMEBBC), המכון למדעי הביולוגיה (IBSc), אוניברסיטת ראג'שאהי, וסופקה תחת התזכיר מספר 31/{{1} }IAMEBBC/IBSc. כל השיטות בוצעו על פי ההנחיות והתקנות שניתנו על ידי הוועדה האתית הנ"ל. מחקר זה בוצע בהתאם להנחיות ARRIVE (מחקר בבעלי חיים: דיווח על ניסויים ב-Vivo). "הסכמה להשתתפות" אינה רלוונטית למחקר זה.
פרטי מחבר
1המעבדה מולקולרית לביולוגיה ולמדעי החלבון, המחלקה להנדסה גנטית וביוטכנולוגיה, הפקולטה למדעי החיים והכדור הארץ, אוניברסיטת ראג'שאהי, ראג'שאהי 6205, בנגלדש. 2מעבדת פתולוגיה מולקולרית, המכון למדעי הביולוגיה, אוניברסיטת רג'שאהי, רג'שאהי 6205, בנגלדש. 3המחלקה לביוטכנולוגיה, המכללה למדעים, אוניברסיטת טאיף, ת.ד. 11099, טאיף 21944, ערב הסעודית. 4המחלקה לגנטיקה, הפקולטה לחקלאות, אוניברסיטת אלכסנדריה, אלכסנדריה 21545, מצרים.
הפניות
1. Bagchi K, Puri S. רדיקלים חופשיים ונוגדי חמצון בבריאות ומחלות: סקירה. East Mediterr Health J. 1998;4:350–60.
2. Koh EM, Lee EK, Song CH, Song J, Chung HY, Chae CH, et al. Ferulate, מרכיב פעיל של נבט חיטה, משפר את חוסר האיזון של PTK/PTP שנגרם כתוצאה מלחץ חמצוני ואי-אקטיבציה של PP2A. Toxicol Res. 2018;34(4):333–41.
3. חסן AI, איברהים RY. כמה פרופילים גנטיים בכבד של ארליך מיימת עכברים נושאי גידול תחת לחץ של הקרנה. J Radiat Res Appl Sci. 2014;7(2):188–97.
4. Zhou FL, Zhang WG, Wei YC, Meng S, Bai GG, Wang BY, et al. מעורבות של עקה חמצונית בהישנות של לוקמיה מיאלואידית חריפה. J Biol Chem. 2010;285(20):15010–5.
5. Pham-Huy LA, He H, Pham-Huy C. רדיקלים חופשיים, נוגדי חמצון במחלות ובריאות. Int J Biomed Sci. 2008;4:89–96.
6. Srijiwangsa P, Na-Bangchang K. תפקידים של NAD (P) H-quinone oxidoreductase 1 (NQO1) על התקדמות סרטן ועמידות כימיות. J Clin Exp Oncol. 2017;6:1–6.
7. Siegel D, Yan C, Ross D. NAD (P) H: quinone oxidoreductase 1 (NQO1) ברגישות ועמידות לקינונים נגד גידולים. Biochem Pharmacol. 2012;83(8):1033–40.
8. Dinkova-Kostova AT, Talalay P. NAD (P) H: quinone acceptor oxidoreductase 1 (NQO1), אנזים נוגד חמצון רב תכליתי והגנת ציטו צדדית במיוחד. Arch Biochem Biophys. 2010;501(1):116–23.
9. Cullen JJ, Hinkhouse MM, Grady M, Gaut AW, Liu J, Zhang YP, et al. עיכוב Dicumarol של NADPH: quinone oxidoreductase משרה עיכוב גדילה של סרטן הלבלב באמצעות מנגנון המתווך על ידי סופראוקסיד. Cancer Res. 2003;63(17):5513–20.
10. Zhang X, Han K, Yuan DH, Meng CY. ביטוי יתר של NAD (P) H: quinone oxidoreductase 1 מעכב שגשוג תאי קרצינומה כבדית וגורם לאפופטוזיס על ידי הפעלת מסלול AMPK/PGC-1. DNA Cell Biol. 2017;36(4):256–63.
11. Zeekpudsa P, Kukongviriyapan V, Senggunprai L, Sripa B, Prawan A. דיכוי של NAD (P) H-quinone oxidoreductase 1 הגביר את הרגישות של תאי cholangiocarcinoma לחומרים כימותרפיים. J Exp Clin Cancer Res. 2014;33(1):1–13.
12. Dasari S, Tchounwou PB. ציספלטין בטיפול בסרטן: מנגנוני פעולה מולקולריים. Eur J Pharmacol. 2014;740:364–78.
13. Zhu X, Jiang X, Li A, Zhao Z, Li S. S-Allylmercaptocysteine מחליש את הנפרוטוקסיות הנגרמת על ידי ציספלטין באמצעות דיכוי אפופטוזיס, עקה חמצונית ודלקת. חומרים מזינים. 2017;9(2):166.
14. מטקובסקי א. צמחי תרבית חוץ גופית לייצור נוגדי חמצון - סקירה. עו"ד ביוטכנולוגיה 2008;26(6):548–60.
15. אל-בכרי א.א., מוסטפא ח.מ., עלאם א.א. פעילות נוגדת חמצון של Rumex Vicarious L. בשלב הווגטטיבי של הצמיחה. Asian J Pharm Clin Res. 2012;5:111–7.
16. Rechinger KH. Rumex (Polygonaceae) באוסטרליה: בדיקה מחודשת. נויציה. 1984;5:75–122.
17. שחט א.א., אלסייד מ.ס., אליהיה מ.א., היגינס מ., דינקובה-קוסטובה א.ט. NAD (P) H: פעילות מעוררת של קינון אוקסדורודקטאז 1 של כמה צמחי מרפא ערב הסעודית. פלנטה מד. 2013;79(06):459–64.
18. El-Hawary SA, Sokkar NM, Ali ZY, Yehia MM. פרופיל של תרכובות ביו-אקטיביות של Rumex Vicarious L. J Food Sci. 2011;76(8): C1195–202.
19. Barbosa-Filho JM, Alencar AA, Nunes XP, Tomaz AC, Sena-Filho JG, Athayde- Filho PF, et al. מקורות לקרוטנים אלפא, בטא, גמא, דלתא ואפסילון: סקירה של המאה העשרים. ר' חזיות. 2008;18(1):135–54.
20. Laouini SE, Ouahrani MR. סקר פיטוכימי, נוגד חמצון במבחנה ופעילות אנטיבקטריאלית של תמצית Rumex Vicarious L.. Science Study Res: Chem Chem Engi Biotech Food Ind. 2017;18:367–76.