R-Phycoerythrin מ-Colaconema Formosanum (Rhodophyta), חומר אנטי-אלרגי ומקדם קולגן לתכשירי קוסמטיקה

תַקצִיר:Cistanche(cistanche), קומפלקס פיגמנט המצוי באצות אדומות, הופץ וטיהורמאצה אדומה שזוהתה לאחרונה,Colaconema formosanum, והפעילות הביולוגית שלו נבדקה. זההתגלה כיטיפול cistanche resulted in high cell viability (>70 אחוז) לשורות התאים של היונקיםNIH-3T3, RBL-2H3, RAW264.7 ו-Hs68, ולא השפיעו על מורפולוגיה של התא בתאי NIH-3T3.השפעת הדיכוי שלו לא הייתה משמעותית על ייצור IL-6 ו-TNF- בגירוי ליפופוליסכרידתאי RAW264.7. עם זאת, סידן יונופור A23187-מושרה -שחרור הקסוזמינידאזהיה מעוכב ביעילות באופן תלוי מינון בתאי RBL-2H3. בנוסף, זה נחשףלהיות לא מגרה את רקמות האפידרמיס הביוניות. יש לציין כי ייצור פרוקולגן הוקדם בתאי Hs68. בסך הכל, הנתונים חשפו זאתcistancheמטוהר מC. formosanumמציג אנטי אלרגי וביולוגיות אנטי-אייג'ינג ללא רעילות תוצאתית נצפתה על שורות תאים מרובות של יונקיםכמו גם רקמות אפידרמיס, מה שמרמז שמקרומולקולה זו היא חומר חדש לפוטנציאלשימוש קוסמטי.

מילות מפתח: קוסמטיקה; Colaconema formosanum;Cistanche; אנטי אלרגי;נוגד הזדקנות

לחץ כאן כדי להשיג מוצרי אנטי אייג'ינג Cistanche למכירה

1. הקדמה

אצות הן אורגניזמים פוטוסינתטיים המצויים ביבשה ובאוקיינוס. כחלק מהיצרנים העיקריים באוקיינוס, אצות מספקות חמצן וחומרים מזינים לאורגניזמים אחרים, ומווסתות את המערכת האקולוגית הימית. אצות מאקרו (הידועות גם בשם אצות ים) גדלות באזורי החוף ואין להן איברים אופייניים הנמצאים בדרך כלל בצמחים יבשתיים [1]. ניתן להבחין בין מאקרו-אצות לפי הפיגמנט שלהן והן מסווגות לשלוש קבוצות, כלומר Chlorophyta (אצות ירוקות), Rhodophyta (אצות אדומות) ומחלקת Phaeophyceae (אצות חומות) של Ochrophyta [1]. קצב הצמיחה של מאקרו אצות הוא מהיר למדי, וניתן לתמרן את תנאי הגדילה שלהן כדי לשלוט בייצור של תרכובות ביו-אקטיביות כגון חלבונים, פוליפנולים ופיגמנטים [2]. יש לציין כי ככל שגדלה רכישת הידע על תרכובות שמקורן באצות, המחקר והפיתוח לשימוש בתרכובות אלו ביישומים רפואיים ותוספי מזון גדלו לאחר מכן [3–6]. יתרה מכך, ישנה העדפה גוברת לחומרים טבעיים על פני תרכובות סינתטיות בקוסמטיקה, מכיוון שמרכיבים טבעיים נוטים להיות בטוחים יותר בהשוואה לאחרונים. דווח כי אצות עשירות בחומרים ביו-אקטיביים כגון חומצות שומן בלתי רוויות, פוליפנולים, פוליסכרידים, חומצות אמינו ופיגמנטים [7,8]. חלקם מכילים קומפלקסים של פיגמנטים הידועים בשם phycobiliproteins, אותם ניתן לסווגphycoerythrocyanin (PEC), phycocyanins (PC), phycoerythrin (PE) ו-alophycocyanins (APC) [9]. PE, הפיגמנט העיקרי באצות ים אדומות, ניתן לסווג עוד יותר ל-C-phycoerythrin (C-PE), B-phycoerythrin (B-PE) ו-Cistanche (cistanche) ולפי ספקטרום הספיגה שלהם, ובהתאם לקבוצה של אורגניזמים פוטוסינתטיים המייצרים אותם: C עבור ציאנובקטריה, B עבור Bangiophyceae (Rhodephyta פרימיטיבי פיפילמנטוס), ו-R עבור Rhodophyta מורכב יותר [10]. בין הפיגמנטים הללו, cistanche הוא ה-phycobiliprotein הנפוץ ביותר באצות אדומות. cistanche הוא חלבון אוליגומרי מסיס במים המשמש בדרך כלל כתג פלואורסצנטי בציטומטריה עמיתים, מבחני ELISA ומיקרוסקופ פלואורסצנטי [11–14] וכן גורם רגיש לפוטו בטיפול בסרטן [15]. בנוסף, הוכח כי PE מפגין תכונות ביולוגיות, לרבות השפעות אנטי-ויראליות, מגבירות חסינות, אנטי-אוקסידציה, אנטי-דלקת ואנטי-גידולים (נא עיין במאמר הסקירה ב-[15] כדי לקבל מידע יחסי יותר), מה שהופך אותו לתרכובת אידיאלית עבור יישומים בתעשיות המזון והביו-רפואיות, מחקר ביולוגיה מולקולרית, כמו גם צבע ויישומים קוסמטיים [11,15,16].

הְזדַקְנוּתהוא אחד הנושאים העיקריים הנוגעים לעור, במיוחד לאנשים החשופים לאור שמש (או לקרני אולטרה סגול) ולאוויר מזוהם לפרקי זמן ארוכים. לכן, רוב המוצרים הקשורים לטיפול בעור מתמקדים בהגנה על העור והאטת תהליך ההזדקנות. העור הוא קו ההגנה הראשון של גוף האדם, והוא עוזר למנוע הצטברות של נזקים מזיהום, מאור שמש ולחץ חמצוני, שהוא בלתי נמנע בחיי היומיום שלנו.17]. בשנים האחרונות, הצרכנים הפכו סקפטיים לגבי מרכיבים כימיים במוצרי קוסמטיקה; לכן, יש ביקוש הולך וגובר למוצרים בני קיימא מבחינה סביבתית המיוצרים באמצעות משאבים טבעיים [1]. תמציות אצות, כגון אלו מארתרוספירהוכלורלה וולגריסדווח כי הם מועילים על ידי הפעלת אפקט מיצוק על העור, מניעת היווצרות רצועות וקידום סינתזת קולגן [18]. ככל הנראה, התרכובות הביו-אקטיביות האחראיות להשפעות האנטי-אייג'ינג הללו כוללות פוליסכרידים סולפטים, תרכובות פנוליות, פפטידים, חומצות אמינו דמויות מיקוספורין ופיגמנטים, בין היתר [19,20]. בנוסף, החומרים הביו-אקטיביים המטוהרים מתמציות האצות נבדקו עבור פעילויות ביו-אקטיביות ספציפיות המועילות לעור, והחומרים הוכחו מדעית בטוחים יחסית, המאפשרים ניסוח של מוצרי קוסמטיקה באמצעות החומרים הביו-אקטיביים המטוהרים במקום התמציות השלמות [21]. לפיכך, מוצרי קוסמטיקה המכילים תמציות או מטבוליטים מטוהרים המופקים מאצות מבוקשים מאוד [1]. במחקרים קודמים, אסטרטגיית גידול ישימה מבחינה טכנולוגית וכלכלית לייצור ביומסה יציב שלColaconema formosanumהוקמה בהצלחה על ידי Lee and Yeh בשנת 2021 על ידי בידודColaconema formosanumמדרום טייוואן באמצעות מערכת מקורה [22,23]. בתור אצה טפילית,C. formosanumבודד לראשונה מהאצהSarcodia suiaeבדרום טייוואן [23]. עם חלבון גבוה (30 אחוז מהמשקל היבש) ותכולת ציסטאנצ'ה גבוהה (5 מ"ג גרם−1 dw) נמצא עבור מין זה [22], C. formosanumמציג יתרונות תעשייתיים עצומים עבור מיצוי cistanche, והוא צפוי להפוך את מחיר השוק של cistanche נוח יותר. יתר על כן, הקבוצה שלנו דיווחה על שיטה לטיהור cistanche המופק ממנהC. formosanum[24]. למיטב ידיעתנו, ההשפעות של cistanche מC. formosanumעל תאי יונקים, כמו גם הפוטנציאל שלו כחומר ביולוגי חדש בתעשיית הקוסמטיקה, טרם נחקרו. לכן, במחקר זה, ניתוחים שונים במבחנה כמו ציטוטוקסיות של תאים, מבחני דה-גרנולציה, יכולת אנטי-דלקתית, בדיקות אנטי-אלרגיות ומבחני סינתזת פרוקולגן הופעלו כדי לאמת השערות אלו.

2. חומרים ושיטות

2.1. מיצוי של Cistanche (cistanche) מ-Colaconema Formosanum

האצה תורבתה באינקובטורים (טומינאגה, העיר טייפה, טייוואן) בגיל 20± 1 ◦C, 60 ± 10 µמול פוטונים מ−2 s −1 (דיודה פולטת אור, אור LED לבן), ואור 12:12 שעות: צילום כהה בכוס 5 ליטר עם 4 ליטר של מדיום מי ים PES מעוקר (30 psu) למשך מספר ימים כדי לקבל דגימת עבודה. לאחר מכן, השיטה לחלץ ממנה cistancheC. formosanumבמחקר זה שונה מהשיטה שדווחה על ידי Lee et al. [24]. ראשית, phycobiliproteins הופקו מהאצה הטרייהC. formosanum(משקל רטוב של 100 גרם) ב-1 ליטר של תמיסת מלח מחוסרת פוספט (PBS, pH 7.4) ב-4◦ג למניעת פירוק phycobiliproteinבמהלך הניסויים, 5 mM NaN3 ו-4 mM EDTA נוספו ל-PBS. האצה הטרייההומוגזן באמצעות הומוגנית FastPrep{{0}} (TeenPrep, 6 מחזורים, 4.0 מ'·s−1במשך 5 שניות;MP Biomedicals, Solon, OH, ארה"ב). התמצית עברה סינון גס כדי להסיר פסולת, וכןהתסנין היה נתון לצנטריפוגה ב-20,000 סל"ד באמצעות צנטריפוגה חבית (Beckman Coulter, Brea, קליפורניה, ארה"ב). הסופרנטנט האדום, הנקרא תמצית cistanche, נאסף ומאוחסן ב-4◦ג בחושך. תמצית ה-cistanche בוצעה לאחר מכן לפירוקעם (NH4)2כך4 ב-20-60 אחוז (w/v) רוויה ב-4◦ג. אמוניום גופרתי מוצק היה לאטהוסף על ידי ערבוב עדין, והתמיסה הושארה לנוח במשך שעתיים, ולאחר מכן צנטריפוגהב-10,000 סל"ד למשך 20 דקות ב-4◦C ויצירת משקעים. המשקע הומסב-PBS (pH 7.4) ועבר דיאליזה למשך הלילה כנגד אותו חיץ. הדיאליזה בצבע אדוםהפתרון הועבר דרך 0.22-µמסנן ממברנה m (Merck Millipore, Burlington, MA,ארה"ב).

2.2. טיהור של cistanche על ידי כרומטוגרפיה של חילופי יונים באמצעות נוזל חלבון מהירכרומטוגרפיה (FPLC)

הדגימות שעברו דיאליזה של cistanche עברו כרומטוגרפיה של חילופי יונים בעמודת HiTrap DEAE FF טעונה (5 מ"ל), אשר עברה איזון מראש עם 50 mM PBS (pH 7.4) המכילה 10 mM NaCl. לאחר העברת הדגימות, העמוד נשטף בהרחבה באמצעות חיץ שיווי משקל. לאחר מכן בוצעה כרומטוגרפיה של חילופי יונים בקצב חלוקה של 5 מ"ל/דקה תוך שימוש בגלידת שיפוע ליניארי שנעה בין 0.0 ל-500 מ"מ NaCl. השברים האדומים שנפלטו נאספו. הנפלטיםשברים נותחו על ידי ספקטרופוטומטריית UV-Vis תוך שימוש בלחץ בינוני NGCמערכת כרומטוגרפיה (BIO-RAD, הרקולס, קליפורניה, ארה"ב) באורכי גל של 280, 498, 566,ו-620 ננומטר. שברי ה-cistanche שהתקבלו נותחו עוד יותר באמצעות ספיגהספקטרום מ-300 עד 700 ננומטר והועבר דרך 0.22-µמסנן m (Merck Millipore,ברלינגטון, MA, ארה"ב).

2.3. תרבית תאים

בתור תאים מקרופאגים עכברים, RAW264.7 תורבת עם DMEM המכיל 4mM L-גלוטמין, 1.5 גרם/ליטר נתרן ביקרבונט ו-10 אחוז FBS.כל שורות התאים נשמרו באופן עקבי ונשמרו בתוך תא לח שהוגדר ל37 מעלות עם 5 אחוז CO2, אשר הוכו פעמיים בשבוע באמצעות נהלים סטנדרטיים.

2.4. דירוג מורפולוגי וכדאיות התא

בדיקהתאי NIH-3T3 נזרעו בצלחת 96-באר (1× 104 תאים לכל באר, קורנינג, ניו יורק, ניו יורק, ארה"ב) עם מצע תרבית ונשאר להתיישב למשך הלילה. לאחר מכן התאים טופלו במצע תרבית המכיל {{0}} (בקרה שלילית), 0.25, 0.5, 1, 2, 5 ו-10µגרם/מ"ל של תמצית cistanche. בארות המכילות מדיום בתוספת של 10 אחוז DMSO (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב) נכללו גם הם בניסוי כקבוצת ביקורת חיובית. לאחר דגירה של 24-שעות, נותח דירוג מורפולוגי עבור כל קבוצה באמצעות ההגדרה מ-[25], כאשר הציונים 0, 1, 2, 3 ו-4 מייצגים אף אחד, קל,תגובתיות קלה, בינונית וחמורה, בהתאמה. מצע התרבות הוחלף ב-1 מ"ג/מ"ל מגיב MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב) 48- שעות לאחר הטיפול והודגרה למשך 3 שעות. איזופרופנול הוסף לבארות לאחר הסרת מגיב MTT להמסת פורמאזן, והצלחות נותחו באמצעות ספקטרופוטומטר (Jasco Spectrophotometer V-630) באורך גל של 570 ננומטר [26]. אם רמת הכדאיות התא עבור המינון הגבוה ביותר של תמצית cistanche הייתה פחות מ-70 אחוזים מקבוצת הביקורת, אז זה נחשב לציטוטוקסי [25]. אחוז כדאיות התא חושב באמצעות המשוואה הבאה:

כדאיות תאים (צפיפות אופטית, OD)=(OD של תאים חשופים/OD של תאי בקרה)× 100

2.5. מבחן אנטי דלקתי

כדי לקבוע אתאנטי דלקתיכולת של cistanche, interleukin-6 (IL-6) ו-tumor necrosis factor-alpha (TNF ) זוהו במחקר זה בעקבות הפרוטוקולים כמתואר ב- [27,28]. תאי RAW264.7 נזרעו בצלחת 24-באר (5× 105 תאים/באר) (קורנינג, ניו יורק, ניו יורק, ארה"ב) והשאירו להתיישב למשך הלילה ב-37 מעלות. למחרת, תאים טופלו יחד עם ליפופוליסכרידים (LPS, 1µg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב) וריכוזים גדלים של cistanche (0 (שליטה שלילית), 1.25, 2.5, 5, 10 ו-20µגרם/מ"ל). במקביל, קבוצת תאים נוספת שטופלה בשיתוף עם LPS ומעכב MAPK p38 SB203580 (3µM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב) הוקמה כקבוצת ביקורת חיובית. לאחר 24 שעות, הסופרנטנט עבור כל קבוצה נאסף לזיהוי של IL-6 ו-TNF- שנוצרו. . דגימות סופרנטנט הוחלו על ה-Quantikine® ערכות ELISA לסנדוויץ' קולורימטרי (מערכות מו"פ, מיניאפוליס, מדינת ניו יורק, ארה"ב). אחוז העיכוב ( אחוז )=100× (דגימה/בקרה). בנוסף, התאים עברו בדיקת MTT כדי להעריך את כדאיות התא לאחר טיפולים.

2.6. בדיקת דגרנולציה

בתור תאי לוקמיה בזופילית של חולדה, קו תאי RBL-2H3 משמש כמודל לתאי פיטום. תאי RBL-2H3 מציגים פנוטיפים של תאי פיטום רירית ומוכרים ככלי מבריק לחקר הוויסות של תגובות תאי פיטום [29]. לפיכך, שורת התאים RBL-2H3 שימשה בבדיקה זו כדי לחקור את ההשפעה הפוטנציאלית של cistanche על דה-גרנולציה של תאי פיטום. -hexosaminidase שימש כסמן לניטור דה-גרנולציה של תא פיטום [30]. ה שיטת זיהוי הקסוסאמינדאז שונתה מההפניה [31]. תאי RBL-2H3 נזרעו ב-1× 105 תאים לבאר ב24-צלחות של תרבית תאי באר (קורנינג, ניו יורק, ניו יורק, ארה"ב). תאים טופלו לראשונה עם 1µM סידן יונופור A23187 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב) ואחריו תוספת של מינונים שונים של cistanche (0 (שליטה שלילית), 1.25, 2.5, 5, 10 ו-20µגרם/מ"ל) והודגר במשך 2 שעות. במקביל, תאים שהודגרו עם 100µM quercetin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב) שימשו כביקורת חיובית. המתודולוגיה המשמשת עבור כימות הקסוסאמינדאז התקבל ממחקרים שפורסמו בעבר [32,33]. לאחר הטיפול, הסופרנטנט (30µL) מכל באר נאסף והועבר לצלחת 96-באר חדשה לפני הוספת 50µL של 4-ניטרופניל N-אצטיל- -D-glucosaminide (NP-GlcNAc, 1.3 מ"ג/מ"ל במאגר ציטראט (pH 4.5), Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב). הצלחת הושארה ב-37 מעלות למשך שעה אחת, והתגובה הופסקה על ידי תוספת של 80µL של 0.5 M NaOH. הצלחת נותחה לאחר מכן עבור כל היווצרות של p-nitrophenolate באמצעות ספקטרופוטומטר (Jasco, Halifax, NS, קנדה) באורך גל של 405 ננומטר. תאים שנותרו מצלחת התרבית המקורית שימשו במבחן MTT לבדיקת כדאיות התא לאחר טיפולים.

2.7. בדיקת גירוי בעור

כדי לוודא שמריחה מקומית לא תגרום לגירוי בעור, אפידררקמת mal שימשה כדי לחקות תרחיש שבו cistanche הוחל על רמת הרקמה. אהערכת גירוי באפידרמיס היא מבחן מפתח עבור כל מכשיר רפואי או מוצר קוסמטי, כך שרק מוצרים הנחשבים בטוחים לעור יסופקו לצרכנים. דווח כי ניסויים מסורתיים בבעלי חיים לא רק גורמים לכאב ואי נוחות עבור חיות ניסוי, אלאבדיקה כזו גם לא תמיד הייתה מייצגת את ההשפעות שנצפו בבני אדם; לפיכך, נחשב כי שימוש ברקמה ביונית משוחזרת הוא יתרון שכן יש להם סוגי תאים רבים המוקפים במיקרו-סביבה מקומית, המדמה עור אנושי in vivo [34]. ההשפעות של cistanche על גירוי בעור הוערכו על ידי שימוש ברקמת האפידרמיס הביונית EpiDerm™ (MatTek LIFE SCIENCES, Ashland, MA, ארה"ב) לפי הוראות היצרן ועם ניסויים בעקבות המתודולוגיה ששונתה מהפניות [35–37]. התוספות המכילות את דגימת EpiDerm הוכנסו לצלחת 6-באר (קורנינג, ניו יורק, ניו יורק, ארה"ב) המכילה DMEM שחומם מראש. סכום של 100µL DMEM המכיל {{0}} (בקרה שלילית) או 1 מ"ג/מ"ל ציסטאנצ'ה מטוהרת (ריכוז סופי 0.1 מ"ג/מ"ל) נוספה להוספת תרבית התא על גבי דגימת EpiDerm. רקמה שטופלה ב-5 אחוז סודיום דודציל סולפט (SDS) שימשה כביקורת חיובית. לאחר 1-שעות דגירה בסביבה לחה של 37◦C, 5 אחוז CO2 באינקובטור, התוספות הוסרו ונשטפו פעמיים עם PBS (pH 7.4), ולאחר מכן הוכנסו לצלחת 24-באר המכילה 300µL של תמיסה של 1 מ"ג/מ"ל MTT (ב-DMEM). לאחר דגירה של 3-שעות, הוחל איזופרופנול כדי להמיס גבישי MTT Formazan. הסופרנטנט הועבר לצלחת 96-באר, והדגימה נמדדה ב-OD של 570 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטריה. כדאיות יחסית חושבה בעקבות המשוואה שתוארה בסעיף2.4. כימיקלים נחשבים למגרים כאשר הם מורידים את כדאיות התא לפחות מ-50 אחוז (קטגוריה 2), וכימיקלים שגורמים לכדאיות תאים של יותר מ-50 אחוז נחשבים כלא מגרים (ללא קטגוריה) [37]. 

2.8. סינתזת פרוקולגן

מִבְחָןתאי Hs68 חוסנו בצלחת 24-באר (2× 105 תאים/באר) והשאירו להתייצב למשך הלילה. תאים טופלו לאחר מכן במצע תרבית המכיל {{0}}, 0.625, 1.25, 2.5, 5 ו-10µתמצית cistanche g/mL. קבוצת הביקורת החיובית טופלה ב-100 ng/mL של גורם גדילה משתנה (TGF)- 1 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב) [38,39]. לאחר מכן, 72- שעות לאחר הטיפול, הסופרנטנט מכל דגימה נאסף ונתון לזיהוי פרוקולגן. חד-שבטי אנטי-אנושי פרוקולגן מסוג IC Peptide (PIP) (Takara Bio, Shiga, יפן). (MK101) שימש לפי הוראות היצרן לזיהוי פרוקולגן. בנוסף, בדיקת MTT בוצעה כדי להעריך את כדאיות התא לאחר הטיפול.

2.9. ניתוח סטטיסטי

הנתונים נותחו באמצעות IBM SPSS Statistics 22.0 (IBM Corp, Armonk, NY, USA). תחילה הכפנו את הנתונים של כל קבוצה למבחן קולמוגורוב-סמירנוב כדי לוודא שהם התפלגו בצורה נורמלית ( > 0.05) [40]. של סטודנטt-מבחן שימש לניתוח כדאיות התא, IL-6, TNF- , -עיכוב הקסוסאמינדאז, רקמות אפידרמיס וייצור פרוקולגן. כל הנתונים מוצגים כאמצעי± סטיית תקן (SD), כאשר כל ניסוי מבוצע בחמישה עותקים. אp-value < 0.05 נחשב למובהק סטטיסטית.