כימות של ניוון נויריטים עם דיוק ויעילות משופרים במודל חוץ גופי של מחלת פרקינסון חלק 1

תַקצִיר

ניוון עצבי קשור לשלבים מוקדמים של הפרעות ניווניות עצביות כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון (PD) וטרשת צדדית אמיוטרופית. שיטה אחת המשמשת בדרך כלל לניתוח ניוון עצבים כוללת חישוב של מדד ניוון (DI) בעקבות שימוש בכלי Analyze Particles של ImageJ כדי לזהות שברי עצבים בצילומי מיקרו של תאים מתורבתים. עם זאת, ניתוחי DI מועדים למספר סוגים של שגיאות מדידה, עלולים להיות גוזלים זמן לביצוע ומוגבלים ביישום.

ניוון עצבי מתייחס לשינויים המתרחשים בתאי עצב או סביבם, אשר עשויים להשפיע על התפקוד הקוגניטיבי האנושי, האינטליגנציה, הרגש, ההתנהגות וכו'. אנשים רבים חושבים שניוון עצבי קשור קשר הדוק להידרדרות הזיכרון, אך ייתכן שזה לא המקרה.

ראשית, ניוון עצבי לא אומר בהכרח שהזיכרון יורד עם הגיל. יש אנשים שיכולים לשמור על זיכרון טוב ואפילו להיות מסוגלים להבין צדקנות. הסיבה לכך היא שהזיכרון של אדם מושפע משילוב של גורמים כמו פעילות גופנית, תזונה ואורח חיים.

שנית, המוח האנושי יכול ליצור מחדש קשרים עצביים חדשים וליצור זיכרונות חדשים, מה שנקרא פלסטיות. ללא קשר לגיל, המוח לומד כל הזמן ויוצר זיכרונות חדשים. לכן, ניוון עצבי הוא פשוט שינוי טבעי במוח ולא אומר בהכרח שהזיכרון יתדרדר.

לבסוף, שמירה על גישה אופטימית יכולה גם לשפר את הזיכרון של האדם. דאגה ומתח יכולים להיות השפעות שליליות על המוח, מה שמוביל לאובדן זיכרון. גישה חיובית יכולה לקדם את בריאות המוח, ולשפר את הזיכרון והיכולת הקוגניטיבית.

לסיכום, ניוון עצבי לא בהכרח מוביל לאובדן זיכרון, וגישה אופטימית לחיים יכולה לעזור לנו לשמור על זיכרון טוב ויכולת קוגניטיבית. לכן, עלינו לשמור על גישה אופטימית, ולחזק פעילות גופנית, דיאטה וניהול אורח חיים כדי לשמור על בריאות המוח והזיכרון. ניתן לראות שעלינו לשפר את הזיכרון שלנו. Cistanche יכול לשפר משמעותית את הזיכרון, כי Cistanche יכול לווסת גם את האיזון של נוירוטרנסמיטורים, כמו הגברת רמת האצטילכולין וגורמי גדילה. חומרים אלו חשובים מאוד לזיכרון וללמידה. בנוסף, בשר יכול גם לשפר את זרימת הדם ולקדם אספקת חמצן, מה שיכול להבטיח שהמוח יקבל מספיק תזונה ואנרגיה, ובכך לשפר את החיוניות והסיבולת של המוח.

increase brain power

לחץ על דע דרכים לשיפור תפקוד המוח

כאן, אנו מתארים שיטה משופרת לביצוע ניתוחי DI. דיוק המדידות הוגבר באמצעות שינוי קריטריוני הבחירה לזיהוי שברי עצבים, הסרת חפצי תמונה וחומרים שאינם עצביים מהתמונות, ואופטימיזציה של ניגודיות התמונה. שיפורים כאלה יושמו במאקרו ImageJ המאפשר ניתוח DI מהיר ואוטומטי לחלוטין של מספר תמונות. המאקרו כולל פעולות להסרה אוטומטית של גופי תאים מצילומי מיקרוסקופ, ובכך מרחיב את היישום של ניתוחי DI לשימוש בניסויים הכוללים תרביות מנותקות.

אנו מציגים ממצאים ניסיוניים התומכים בכך שבהשוואה לשיטה הקונבנציונלית, שיטת הניתוח המשופר מניבה מדידות עם דיוק מוגבר ודורשת פחות זמן משמעותית לביצוע.

יתר על כן, אנו מדגימים את התועלת של השיטה לחקור ניוון עצבים במודל תרבית תאים של PD על ידי עריכת ניסוי שחשף את ההשפעות של c-Jun N-terminal kinase (JNK) על ניוון עצבים המושרה על ידי מתח חמצוני בתאי mesenphalic אנושיים. שיטת ניתוח משופרת זו עשויה לשמש כדי לקבל תובנה חדשה לגבי הגורמים העומדים בבסיס ניוון העצבים והתקדמות של הפרעות ניווניות.

מילות מפתח:

ניוון אקסונלי; מדד ניוון; ניוון עצבי; ניוון עצבי; מתח חמצוני; מחלת פרקינסון.

הצהרת משמעות

ניוון עצבי הוא אירוע תאי הקשור לשלבים המוקדמים של מספר סוגים של הפרעות ניווניות. גורמים מולקולריים המווסתים את ניוון העצבים נותרו לא מובנים, ולשיטות הקיימות לחקר ניוון העצבים יש יישום ויעילות מוגבלת. כאן, אנו מזהים שינויים בהליך בשימוש נרחב לניתוח ניוון עצבי המפחית שגיאות מדידה.

שיפורים מתודולוגיים כאלה שולבו במאקרו ImageJ, ובכך אפשרו ניתוח מהיר ואוטומטי לחלוטין של ניוון העצבים באמצעות סטים גדולים של מיקרוגרפים. באמצעות מודל תרבית תאים של מחלת פרקינסון (PD), אנו מדגימים שהמאקרו מאפשר מדידות ניוון עצביות מדויקות ויעילות יותר תוך הרחבת ההתאמה של שיטת הניתוח לניסויים הכוללים תרביות מנותקות.

מבוא

ניוון עצבי הוא תהליך תאי שבו אקסונים או דנדריטים עוברים חוסר תפקוד מתקדם ושינויים מורפולוגיים, המובילים לאובדן שלמות העצבים. ניוון עצבי הוא תהליך משומר מבחינה אבולוציונית שהוא קריטי לביסוס נכון של רשתות עצביות במהלך התפתחות מערכת העצבים המרכזית (Neukomm and Freeman, 2014).

עם זאת, התהליך מופעל גם בתגובה לצורות שונות של פציעה כגון נזק מכני או חשיפה לתרופות המשמשות לכימותרפיה (Salvadores et al., 2017). יתר על כן, ניוון העצבים קשור להתקדמות של מגוון הפרעות ניווניות הקשורות לגיל, כולל מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון וטרשת צדדית אמיוטרופית.

מעניין לציין שלכל ההפרעות הנוירודגנרטיביות הללו, עדויות מצטברות מצביעות על כך שניוון עצבי הוא אירוע מפתח בשלב מוקדם שלפני מוות נוירוני או הופעת תסמינים קליניים (Serrano-Pozo et al., 2011; Adalbert and Coleman, 2013; Marangoni et al. ., 2014; Suzuki et al., 2020). לפיכך, מחקרים החוקרים גורמים המווסתים תהליך תאי זה עשויים לחשוף מטרות חדשות לטיפול במגוון מצבים ניווניים.

חקירת ניוון העצבים חשובה במיוחד להבנת PD, מחלה המאופיינת בהצטברות של אגרגטים חלבונים המכילים a-synuclein, אובדן מתקדם של נוירונים דופמינרגיים ב-substantia nigra pars compacta (SNpc), והתפתחות של מגוון תסמינים מוטוריים וקוגניטיביים. (Aarsland et al., 2017).

עדויות ממחקרי הדמיה שלאחר המוות ומחקרי הדמיה אנושיים מצביעות על כך שאגרגטים של a-synuclein נמצאים בשפע יותר בסיבים עצביים מאשר בגופי התא, והשפלה של אקסונים דופמינרגיים מתרחשת במידה רבה יותר מאשר אובדן של נוירונים דופמינרגיים ב-SNpc במהלך התקופה המובילה להתפרצות הקלינית. (Tagliaferro and Burke, 2016).

בעוד שהאינטראקציות המולקולריות התורמות להידרדרות המתקדמת של נויריטים דופמינרגיים עדיין לא מובנות לחלוטין, עדויות עדכניות מצביעות על כך שניתן לתווך את ניוון העצבים על ידי אירועים שאינם תלויים במפלי איתות העומדים בבסיס מוות נוירוני (Fukui, 2016; Geden and Deshmukh, 2016). לפיכך, מחקרים שמעריכים ישירות את היסודות הפיזיולוגיים של ניוון העצבים הם קריטיים לפיתוח טיפולים המעכבים התקדמות PD מוקדמת.

improve your memory

בתגובה לעדויות על תפקיד מרכזי לניוון העצבים בהתקדמות של הפרעות נוירודגנרטיביות, פותחו מגוון שיטות למדידת ניוון העצבים באמצעות מיקרוגרפים של נוירונים מתורבתים. לדוגמה, הוקמו מספר שיטות שונות למדידת ניוון עצבים באמצעות תוכנה לזיהוי ירידה במספר העצבים או האורך (Ofengeim et al., 2012; Johnstone et al., 2018).

עם זאת, מכיוון ששיטות כאלה אינן מעריכות באופן ישיר את פיצול העצבים, הפרשנות של תוצאות לקביעת ההשפעה של משתנה על ניוון העצבים עשויה להתבלבל על ידי ההשפעות הפוטנציאליות של המשתנה על גדילת העצבים. קבוצות מחקר מסוימות גם מדדו ניוון עצבים על ידי ניקוד סובייקטיבי של תמונות של עצבים בהתבסס על תכונות מורפולוגיות ומידת הפיצול לכאורה (Zhai et al., 2003; Nakamura et al., 2016; Krishtal et al., 2017). עם זאת, שיטה חלופית זו גוזלת זמן ועשויה להציג שגיאת חוקר.

שיטה אחת המאפשרת מדידה אובייקטיבית וישירה של פיצול עצבי כוללת שימוש באלגוריתם Analyze Particles של ImageJ למדידת השטח של שברי עצבים בצילומי מיקרו של תאים מתורבתים. המדידות משמשות לחישוב אינדקס ניוון (DI), סולם בין {{0}}.0 ו-1.0 המשקף את מידת ניוון העצבים (Sasaki et al., 2009).

בעוד שניתן להשתמש בניתוחי DI כדי לזהות דרגות שונות של פיצול עצבים, הדיוק של המדידות מוגבל בדרך כלל על ידי מספר מקורות שגיאה, ויישום השיטה הוגבל בעיקר לתרביות השתלה או תאים שגדלו במכשירים מיקרו-נוזליים מדורגים. יתרה מזאת, ניתוחי DI גוזלים זמן כשהם מועברים לקבוצות תמונות גדולות. לפיכך, ביקשנו להתגבר על מגבלות אלו על ידי שינוי הליך ניתוח DI כדי להקל על דיוק ויעילות גדולים יותר, תוך הרחבת הישימות.

במחקר הנוכחי, אנו מזהים מספר מקורות שגיאה הקשורים בדרך כלל לניתוחי DI ומדווחים על תיקונים מתודולוגיים המפחיתים את צורות השגיאות השונות. אנו משלבים את השיפורים הפרוצדורליים במאקרו ImageJ המכונה Automated Neurite Degeneration Index (ANDI) כדי להפוך ניתוחי DI לאוטומטיים מקבוצות תמונות גדולות. הפעלת מאקרו ANDI דורשת רק תוכנות וקבצים שהם קוד פתוח וזמינים באופן חופשי. מדידות המתקבלות באמצעות ANDI נהנות מדיוק מוגבר תוך צמצום משמעותי של הזמן הנדרש לביצוע הניתוחים.

יתר על כן, אנו מדגימים כיצד ניתן ליישם את שיטת הניתוח החדשה לביצוע מדידה מדויקת ומהירה של ניוון עצבים במודל תרבית תאים של PD הכולל תאים מנותקים שגדלו ללא מידור. ביחד, שיפורים מתודולוגיים אלה עשויים להוביל לתובנה חדשה לגבי גורמים העומדים בבסיס תהליך תאי חשוב הקשור לניוון עצבי.

חומרים ושיטות

תרבית תאים

תרבויות של תאי מנצפלים אנושיים של לונד (LUHMES) הוקמו בשקופיות תאי שמונה בארות של Lab Tek II מצופים בפולי-L-ornithine (PLO) ופיברונקטין, פולי-D-ליזין (PDL) ולמינין, כל ארבעת המצעים, או לא. מצעים, כפי שצוין. כדי לצפות ב-PLO וב-fibronectin, השקופיות הודגרו למשך הלילה בטמפרטורת החדר עם תמיסה המכילה 200 מ"ג/מ"ל PLO (Sigma-Aldrich, קטלוג #P3655).

לאחר שטיפות במים סטריליים (Avantor), השקופיות הודגרו עם 2 מ"ג/מ"ל פיברונקטין (Sigma-Aldrich, קטלוג #F0895) למשך 3 שעות ב-37 מעלות. לאחר מכן, השקופיות נשטפו עם PBS סטרילי (Corning Life Sciences, קטלוג #21-040-CV) והורשו להתייבש באוויר. כדי לצפות ב-PDL ולמינין, השקופיות הודגרו בטמפרטורת החדר עם תמיסה המכילה 100 ננוגרם/מ"ל PDL (Sigma-Aldrich, קטלוג #P7280) ו-10 מ"ג/מ"ל למינין (Corning, קטלוג מס' 354232).

לאחר דגירה של לילה, השקופיות נשטפו עם PBS סטרילי והותרו להתייבש באוויר. כדי לצפות בכל ארבעת המצעים, ההליכים הנ"ל בוצעו ברצף. תאי LUHMES (ATCC, RRID: CVCL_B056) צופו בשקופיות החדר המצופה בצפיפות המצוינת במדיום התמיינות המורכב מ-DMEM/F12 (Invitrogen, קטלוג מס' 11330057) בתוספת 2 mM גלוטמין (VWR), 1% (v/v) N-2 תוסף, 1 מ"ג/מ"ל טטרציקלין (Sigma-Aldrich, קטלוג מס' 87128-25G), 1 mM N6,29-Odibutyryladenosine cAMP (db-cAMP ; Enzo Life Sciences, קטלוג #BML-CN125-0100), ו-2 ננו-נג/מ"ל גורם נוירוטרופי (GDNF; R&D Systems, קטלוג מס' 212-GD-010) שמקורו בקו תאי גליה.

למעט היכן שצוין אחרת, כל התרבויות צופו בצפיפות של 115,000 תאים לבאר. החלפת מדיה בנפח של 50% בוצעה כל 48 שעות עד לטיפול. כדי למנוע סחף גנטי, מניות תאים שעברו שש פעמים או פחות שימשו לכל הניסויים.

ניסויים הכוללים תרבויות ראשוניות של נוירונים סימפטיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מזרח קנטקי או באוניברסיטת וירג'יניה. גרעיני צוואר הרחם העליונים נותחו מ-0-6 עכברים C56Bl/6 לאחר הלידה, הודגרו ב-37 מעלות במאגר ניתוק אנזימטי, ונשטפו במצע גידול כדי להסיר אנזימים פרוטאוליטיים וחולקו.

תרחפי תאים צופו בצפיפות של 7000 תאים לבאר בשקופיות תא של שמונה בארים של Lab Tek II. המדיה הוחלפו ביום במבחנה (DIV) 1, ולאחר מכן החלפת מדיה כל יומיים. המדיה נוספה עם ציטוזין arabinofuranoside (Ara-C, Millipore-Sigma) על DIV1-DIV3 כדי למנוע צמיחה של תאים שאינם עצביים, ולאחר מכן הסרה של Ara-C מהמדיה למשך 24 שעות לפחות לפני הטיפול כפי שצוין. עבור ניסויים שנערכו באוניברסיטת מזרח קנטקי הכוללים טיפול במי חמצן, שקופיות החדר צפו ב-200 מ"ג/מ"ל PLO (Sigma-Aldrich, קטלוג #P3655), 2 מ"ג/מ"ל פיברונקטין, 100 ננוגרם/מ"ל PDL (Sigma-Aldrich, קטלוג #P7280) ו-10 מ"ג/מ"ל למינין (Corning, קטלוג מס' 354232) לפני השימוש, והדיסוציאציה בוצעה באמצעות דגירה של 30-דקות במאגר המורכב מ-DMEM (ThermoFisher, קטלוג מס'11960- 044) המכיל 0.025% טריפסין (Corning Life Sciences, קטלוג #25-053-CI) ו-0.3% קולגנאז (Worthington Biochemical, קטלוג מס' LS004176).

אמצעי גידול לניסויים כאלה כללו DMEM בתוספת של 10% סרום בקר עוברי (Invitrogen, קטלוג מס'26140-079), 2 מ"מ L-גלוטמין (Corning, קטלוג מס' 25-005-CI) ו-40 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה עצבי (Fisher Scientific, קטלוג מס' 13-257-019); 5 mM Ara-C (Sigma-Aldrich) שימש להסרת תאים לא עצביים.

עבור ניסויים שנערכו באוניברסיטת וירג'יניה הכוללים נסיגת NGF, תאים צופו על שקופיות חדרים מצופים ב-100 ng/ml PDL (Millipore Sigma) ו-10 mg/ml laminin (Invitrogen), והניתוק בוצע באמצעות 20-דקות דגירה במאגר המורכב מ-DMEM/F12 המכיל BSA (10 מ"ג/מ"ל, Sigma-Aldrich), קולגנאז מסוג 2 (4 מ"ג/מ"ל, Worthington Biochemical), deoxyribonuclease 1 (Millipore Sigma) והיאלורונידאז (Sigma-Aldrich). אמצעי גידול לניסויים כאלה כללו DMEM בתוספת של 10% סרום בקר עוברי (Invitrogen), 1 U/ml פניצילין/סטרפטומיצין (Invitrogen) ו-45 ng/ml NGF (מטוהרים מבלוטות הרוק); 10 mM Ara-C שימש להסרת תאים שאינם עצביים.

טיפולי תאים

תאי LUHMES מובחנים נחשפו לריכוזים המצוינים של {{0}}}הידרוקסידופמין (6-OHDA; Sigma-Aldrich, קטלוג מס' 162957) או תמיסת כלי רכב ביום החמישי שלהם במדיום ההתמיינות. מלאי של 6- OHDA הוכנו ב-PBS מקורר המכיל 0.02% אסקורבט (Sigma-Aldrich, קטלוג #A5960), ומנות אוחסנו בבקבוקונים מוגנים לאור תחת גז אינרטי ב-80 מעלות. לאחר 24 שעות של טיפול, התאים נקבעו על ידי דגירה ב-PBS המכיל 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 25 דקות בטמפרטורת החדר.

כדי לקבוע את התפקיד של c-Jun N-terminal kinase (JNK) בניוון עצבי המושרה על ידי עקה חמצונית, תרביות טופלו מראש למשך שעה אחת עם 10 mM SP600125 (Sigma-Aldrich, קטלוג #S5567) או תמיסת רכב לפני החלפה מלאה של מדיה במדיה המכילה 7.5 mM 6-OHDA, 7.5 mM 6-OHDA ו-10 mM SP600125, או פתרונות רכב. מלאי SP600125 הוכן על ידי המסת המעכב בדימתילסולפוקסיד סטרילי (DMSO), ומנות קפואות אוחסנו בבקבוקונים מוגנים מאור מלאים בגז אינרטי ב-20 מעלות. הטיפולים בוצעו כך שתאים נחשפו ללא יותר מ-0.1% DMSO.

תרבויות ראשוניות של נוירונים סימפטיים טופלו ב-DIV5. עבור ניסויים שכללו ניוון עצבי המושרה על ידי מי חמצן, התרביות נחשפו ל-500 mM מי חמצן (Sigma-Aldrich, קטלוג #H1009-100ML) או לתמיסת רכב המורכבת ממים סטריליים (Cytiva, קטלוג #SH30529.02) למשך 24 שעות.

עבור ניסויים הכוללים נסיגה מ-NGF, תרביות SCG קיבלו החלפת מדיה במצע גדילה או שהיו נתונים למניעת NGF. תרביות SCG שיש לשלול מ-NGF נשטפו שלוש פעמים עם אמצעי גידול ללא NGF ולאחר מכן הודגרו במצע גידול ללא NGF למשך 80 שעות ללא שינויי מדיה. לאחר הטיפול, התאים נקבעו על ידי דגירה ב-4% PFA ב-PBS למשך 30 דקות, ולאחר מכן הסרת ה-PFA על ידי שטיפה ב-PBS.

מיקרוסקופ צביעה ופלורסנטיות

עבור ניסויים עם תאי LUHMES, כמו גם הניסויים שכללו נוירונים סימפטיים שטופלו במי חמצן, שקופיות תא שמונה בארות המכילות תאים קבועים חולרו עם 0.1% Triton X-100 ב-PBS ונחסמו עבור שעה אחת עם 10% סרום עיזים רגיל ב-PBS המכיל 0.1% Triton X-100. לאחר מכן, השקופיות הודגרו עם נוגדן ראשוני ספציפי ל-b I tubulin (Covance; 1:1000, RRID: AB_2313773) בתמיסה חוסמת ב-4 מעלות למשך הלילה. לאחר מכן, השקופיות נשטפו עם PBS, הודגרו עם נוגדן משני מחובר ל-Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_142495) למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר, ועברו שטיפות נוספות.

עבור ניסויים הכוללים צביעת טירוזין הידרוקסילאז (TH), השקופיות עברו דגירה נוספת ב-PBS המכילה 10% סרום עז תקין, 0.1% Triton X-100, נוגדן ספציפי ל-TH (Sigma- Aldrich, 1:400, AB152) ב-4 מעלות בלילה. לאחר מכן, השקופיות נשטפו עם PBS, הודגרו עם נוגדן משני מחובר ל-Alexa Fluor 568 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_1500889), ועברו שטיפות נוספות של PBS.

לאחר השלמת התיוג האימונלי עבור b III-tubulin או TH, השקופיות הודגרו עם 5 mg/ml 49,69-diamidino-2-phenylindole (DAPI; קטלוג #D9542) ב-PBS למשך 5 דקות. לאחר מכן, השקופיות נשטפו עם PBS, וכיסויי כיסוי הותקנו באמצעות מדיום הרכבה Fluoromount G (Southern Biotech, קטלוג מס' 0100-01).

עבור ניסויים שכללו נוירונים סימפתטיים שהיו נתונים לנסיגה מ-NGF, השקופיות נחסמו למשך שעה אחת על ידי דגירה בטמפרטורת החדר במאגר המורכב מ-5% סרום עיזים תקין (Life Technologies) ו-0.0005% Triton X-100 ב-PBS, ולאחר מכן דגירה בתמיסת נוגדנים ראשונית המכילה Tuj1 עכבר אנטי-עכבר (1:1000, Covance) למשך הלילה ב-4 מעלות. לאחר מכן, השקופיות נשטפו עם PBS, הודגרו במשך שעה אחת ב-IgG Alexa Fluor 488 נגד עיזים נגד עכברים (1:800, Invitrogen) ו-0.1 מ"ג/מ"ל Hoechst 33342 (Invitrogen) במאגר חוסם, נתון לשטיפות PBS נוספות, והותרו לייבש. השקופיות הותקנו עם Fluoromount-G (Southern Biotech, קטלוג מס' 0100-01) ואוחסנו בטמפרטורת החדר.

שקופיות המכילות תאי LUHMES הוצגו עם מטרה של 20 של מערכת מיקרוסקופ הפוך של Nikon Eclipse II Ti-U עם מקור אור LED של Lumencor Mira 4-Channel. 1280 1024-תמונות פיקסלים נלכדו באמצעות מצלמת Nikon DSQi1Mc 5 MP CCD ו-NIS Elements 3.22.15 (Build 738). למעט היכן שצוין אחרת, כל תמונות ניגודיות הפאזה צולמו באמצעות הגדרות עוצמת האור וזמן החשיפה שהפיקו עוצמת רקע ממוצעת של 165 בתמונות 8-bit.

כדי להפחית הצללת רקע או חוסר עקביות אחרות, לפני כל סשן מיקרוסקופיה, נלכדה תמונה של באר ריקה ושימשה לתיקון רקע במהלך הדמיית תא LUHMES. שקופיות המכילות נוירונים סימפטיים שתורבתו באוניברסיטת מזרח קנטאקי או באוניברסיטת וירג'יניה צולמו באמצעות מערכת מיקרוסקופ Zeiss LSM 800 או מערכת מיקרוסקופ Zeiss LSM 980, בהתאמה. התמונות צולמו בהגדלה של 20 וברזולוציה 1024 1024 באמצעות תוכנת זן (Carl Zeiss Microscopy).

improving brain function

ניתוח כדאיות תאים

תרביות תאי LUHMES מובחנות הוקמו על שקופיות תא עם שמונה בארים של Lab Tek II שצופו כמצוין במצעים שונים. שינוי מדיה של 50% בוצע כל 48 שעות, והתאים נקבעו עם 4% PFA ב-PBS ביום השישי להתמיינות. שקופיות המכילות תאים קבועים עברו צביעה עם DAPI, ותמונות של צביעה גרעינית נלכדו עם Nikon Eclipse II Ti-U Inverted Microscope System ומצלמת Nikon DS-Fi1 5 MP CCD.

תאים הוגדרו כבריאים או לא בריאים על ידי חוקר עיוור בהתבסס על מראה הגרעינים. תאים עם ירידה בשטח גרעיני או פיצול גרעיני צוינו כלא בריאים. מספר התאים הבריאים לתמונה נרשם עבור לפחות חמישה שדות ראייה לכל מצב בכל ניסוי.

מדידות DI

מדידות DI מסורתיות בוצעו באמצעות חבילת Fiji Is Just ImageJ (FIJI) המכילה ImageJ 1.52p באמצעות שיטה הכוללת פרמטרים שצוטטו בהרחבה לניתוח DI (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al., 2020; Shin and Cho, 2020). תמונות שמונה סיביות של תאי LUHMES מובחנים עם מסלולי אקסון מופרדים היטב עברו בינאריזציה באמצעות אלגוריתם הבינאריות המוגדר כברירת מחדל, עם אפשרויות בינאריות שהוגדרו לייצר תמונה עם תאים שחורים בחזית ורקע לבן.

כלי הציור ביד חופשית שימש להתחקות ידנית של כל אזורי התמונה הכוללים גופי תאים, וכל הפיקסלים השחורים הומרו ללבן באזורי המעקב. הכלי Measure של ImageJ יושם למדידת השטח השחור הכולל של התמונות הבינאריות הכוללות עצבים בלבד. הכלי Analyze Particle הוחל לאחר מכן באמצעות הגדרת גודל של 20–10,000 פיקסלים והגדרת מעגליות של 0.2-1.0 כדי לזהות שברי עצבי. השטח המסוכם של כל שברי הנויריט חולק בשטח השחור הכולל כדי לחשב את ה-DI של התמונה.

עבור ניסויים הקשורים לאופטימיזציה של פרמטרי גודל לזיהוי שברי עצבים, נעשה שימוש בקריטריונים של מעגליות של {{0}}.2–1.00 עבור כל מדידות החלקיקים. תוסף מסיר החלקיקים (גרסה 20{{10}}4/02/09), שפותח על ידי Wayne Rasband, התקבל מ-https://imagej.nih.gov/. היכן שצוין, היישום של הפלאגין Particle Remover באמצעות פרמטרים של גודל של 0-9 פיקסלים ופרמטרים מעגליות של 0.0-1.0 בוצע כדי להסיר אובייקטים קטנים, שאינם עצביים, מתמונות בינאריות שהתקבלו ממיקרוגרפי ניגודיות פאזה.

באופן דומה, נעשה שימוש בפרמטרי גודל של {{0}}–4 פיקסלים ובפרמטרים של מעגליות של 0–1.0 כדי להסיר אובייקטים קטנים מתמונות בינאריות שהתקבלו ממיקרוגרפי פלואורסצנציה המייצגים צביעה חיסונית של b III-tubulin. אלא אם כן צוין אחרת, לפני ניתוח DI כל תמונות ניגודיות הפאזה היו נתונים לשיפור ניגודיות באמצעות ImageJ כדי להחיל טבלת חיפוש (LUT) עם מינימום של 90 ומקסימום של 205.

מדידת פיצול מלאכותי

תרבויות המכילות תאי LUHMES בריאים נקבעו עם 4% PFA ביום השישי להתמיינות וסומנו אימונו עבור b III-tubulin. באמצעות 20 אובייקטיביים, נלכדו 1280 1024-מיקרוגרמי ניגודיות פאזה פיקסלים ומיקרוגרפי פלואורסצנטי, שכל אחד מהם מתאר שדות ראייה זהים, מאזורים שנדגמו באקראי. בסך הכל צולמו עשרה סטים של תמונות מתשע תרבויות נפרדות.

ImageJ שימש ליצירת עותקים בינאריים של מיקרוגרפי ניגודיות פאזה וקרינה מקוריים, כמו גם עותקים של מיקרוגרפי ניגודיות פאזה שעברו בינאריות לאחר שיפור ניגודיות באמצעות יישום של LUT עם מינימום של 90 ומקסימום של 205. עבור כל סט של תמונות, חוקר עיוור זיהה אזור קטן, 150 150-פיקסל של המיקרוגרף המקורי של ניגודיות הפאזה, הכולל נויריטים בריאים ושלמים בלבד.

גודל האזור והקואורדינטות אוחסנו לאחר מכן במנהל אזור העניין (ROI) של ImageJ ושימשו לביצוע מדידות DI באזורים אנלוגיים של תמונות בינאריות מאותו סט תמונות. מדידות ה-DI בוצעו בשיטה המסורתית הכוללת פרמטרים של גודל קטע של 20 -10,000 פיקסלים. מכיוון שכל האזורים שנמדדו הכילו אך ורק נוירונים שלמים, כל השברים שהתגלו נחשבו לשברים מלאכותיים.

ANDI מאקרו

מאקרו ANDI נכתב בשפת מאקרו ImageJ. המאקרו כולל סדרה של פעולות המאפשרות למשתמש לבחור נתיבים עבור שלוש ספריות, ספרייה אחת המכילה תמונות של נוירונים המסומנים באימונם לסמן עצבי כגון b III-tubulin, ספרייה שנייה המכילה תמונות מתאימות המתארות צביעה גרעינית, וספרייה שלישית. מיועד לשמירת קבצי תוצאות. אזורי השבר ושטחי העצב הכוללים של התמונות בספריות שנבחרו מחושבים לאחר מכן באמצעות סדרה של פעולות ImageJ. בקצרה, תמונה המתארת תיוג גרעיני נפתחת, נתונה לשיפור הניגודיות, ובינארית. תוסף מסיר החלקיקים משמש להסרת חפצים קטנים שאינם גרעיניים מהתמונה הבינארית, והתמונה הבינארית נתונה לסדרה של הרחבות ושחיקות.

תמונה מתאימה של תאים המסומנים אימונו ל-b III-tubulin (או סמן עצבי אחר) נפתחת ונתונה לשיפור הניגודיות. התמונה הבינארית המתארת גרעיני תאים מוגדלים מופחתת מהתמונה הכוללת תאים המסומנים אימונו ל-b III-tubulin, ובכך מייצרת תמונה הכוללת נויריטים בלבד. לאחר מכן, תמונת הנויריט עוברת בינאריות ונתונה להסרה של חלקיקים בין 0 ל-4 פיקסלים. אזור שברי ה- Neurite מחושב על ידי יישום אלגוריתם Analyze Particle למדידת חלקיקים בעלי מעגליות בין 0.2 ל-1.0 ובגודל שבין 5 ל-10,0000 פיקסלים. שטח העצב הכולל מחושב על ידי יישום הכלי Measure כדי לחשב את השטח השחור הכולל. תמונה המתארת את אזור הנויריטים הבינארי עם קטעים מודגשים נשמרת בספרייה שמיועדת על ידי המשתמש, יחד עם קבצי .csv המדווחים על אזור הנויריט המפוצל ועל מדידות שטח הנויריט הכולל.

בנוסף לפעולות שהוזכרו לעיל, מספר פעולות נוספות כלולות במאקרו כדי לתמוך בנוחות השימוש ולהגביל את שגיאות המשתמש. אלה כוללים פונקציות המסירות מידע על קנה מידה מתמונות ומבטיחות שהמדידות מתקבלות ביחידות פיקסלים; הגדר את הגדרות הצבע של ImageJ והאפשרויות הבינאריות עבור חיסור ובינאריות מתאימות של תמונה; ודא שהספריות שנבחרו עבור תמונות של צביעת b III-tubulin ו-DAPI מכילות מספר שווה של תמונות; סגור תמונות ששימשו בעבר כדי לשפר את זמן העיבוד; תוצאות ברורות מניתוחים קודמים לפני ביצוע ניתוחים חדשים; ולמנוע שגיאות הקשורות ליצירת קובץ .ini על ידי Windows 10.

עבור ניסויים הכוללים ניתוחים של נוירונים סימפטיים, מאקרו ANDI תוקן כך שיכלול פעולה המציגה תיבת דיאלוג המאפשרת למשתמש לשלוט במספר הפעמים שתמונות בינאריות של גרעינים יורחבו. הגרסה של ANDI הכוללת גרסה זו נקראה ANDI v1.1. שינוי הערך בתיבת הדו-שיח למספר גבוה יותר מגדיל את גודל הסרת הסומה בעוד ששינוי הערך למספר נמוך יותר מקטין את גודל הסרת הסומא. ערך ברירת המחדל הוא 12, שהוא מספר ההרחבות המשמשות לכל הניסויים הכוללים תאי LUHMES. ערך של 16 שימש להסרת אזורי גוף גדולים יותר של תאים במהלך ניתוחים של נוירונים סימפטיים.

מאקרו ANDI הוא קוד פתוח וזמין באופן חופשי לשימוש או לשינוי באמצעות כתובת האתר הבאה: https://github. com/kraemerb/kraemerlab. הפעולה המדויקת של ANDI אומתה באמצעות מספר מחשבים אישיים הכוללים את מערכת ההפעלה Windows 10. ערכת תמונה הכוללת תרביות תאים של LUHMES המציגות דרגות שונות של ניוון עצבי זמין גם בכתובת האינטרנט האמורה וניתן להשתמש בה כדי לחקור את הביצוע המדויק של המאקרו על ידי סוגים אחרים של מחשבים. כתובת האינטרנט מספקת גם גישה לפרוטוקול המתאר כיצד להשתמש במאקרו.

הערכות זמן

כדי להעריך את הזמן הדרוש לביצוע מדידות DI באופן ידני, מיקרוגרמי ניגודיות פאזה המתארים תאי LUHMES שטופלו בתמיסת כלי רכב, 2.5 mM 6-OHDA, 5.0 mM 6-OHDA, או 7.5 mM 6-OHDA הועברו לניקוד DI בשיטות שנקבעו בעבר (Kraemer et al., 2014). כל תמונה הייתה נתונה לשיפור ניגודיות ובינאריזציה. הכלי החופשי של ImageJ שימש לאחר מכן להסרה דיגיטלית של כל גופי התא המתוארים מהתמונות הבינאריות. הכלי Analyze Particle שימש למדידת מקטעים בעלי מעגליות בין 0.2 ל-1.0 ובגודל שבין 20 ל-10,000 פיקסלים, והכלי Measure שימש לקביעת שטח העצב הכולל.

ערכים על שטח עצבי מקוטע ושטח עצבי הכולל הועברו לגיליון אלקטרוני ב-Microsoft Excel, ופעולה מתמטית באקסל שימשה לחישוב ציוני ה-DI. לאחר פתיחת תמונה עם ImageJ, נמדד הזמן הדרוש לביצוע ידני של כל אחד מההליכים הללו. זמני ניתוח ממוצעים חושבו מ-36 תמונות בסך הכל. התמונות התקבלו מתשע תכשירי תרבית תאים עצמאיים, וניתוחים בוצעו באמצעות תמונה אחת לכל מצב טיפול מכל תכשיר תרבית תאים. כדי לקבוע את המהירות של מדידות DI שבוצעו באמצעות מאקרו ANDI, נעשה שימוש באותם ערכות תמונה כדי לקבוע את הזמן הנדרש לפתיחת המאקרו ב-ImageJ, להפעיל את פעולות המאקרו, להעביר את הנתונים לגיליון אלקטרוני של Excel ולחשב את ה-DI.

סטָטִיסטִיקָה

השוואות כמותיות מוצגות כחלקות תיבה ושפם, כאשר הקו האמצעי מייצג את החציון, תיבות מתרחבות לאחוזון 25 ו-75, ושפם מתארים את האחוזון החמישי וה-95. האמצעים הושוו סטטיסטית ב-GraphPad Prism 9.1.2 על ידי מדידות חוזרות ונשנות ANOVA עם השוואות פוסט הוק באמצעות תיקון Sidák. תקינות הנתונים הכמותיים נבדקה באמצעות מבחן Shapiro–Wilk ב-IBM SPSS 26.

כאשר הנחת התקינות הופרה (איורים 1C, 3D), נערכו השוואות קבוצות באמצעות מבחן פרידמן הלא-פרמטרי עם מבחן של דאן שבוצע עבור השוואות פוסט-הוק. ניתוחים מתאמים מתוארים כחלקי פיזור וכוללים קווים בהתאמה הטובה ביותר. יחסים כאלה נותחו באמצעות מתאמים של Pearson product-moment או r Spearman's כאשר הנחת הנורמליות הופרה. נורמליות של שאריות עבור ניתוח מתאם הוערכה באמצעות בדיקה ויזואלית של חלקות QQ מתאימות.

מקדמי מתאם מוצר-רגע של פירסון הושוו זה לזה באמצעות מבחן ה-z האסימפטוטי של סטייגר (Steiger, 1980; Lee and Preacher, 2013). לא נכללו חריגים. מובהקות סטטיסטית התקבלה ב-p, 0.05. ערכי P מעוגלים לארבעה מקומות עשרוניים ומדווחים לאורך הטקסט הראשי. גדלי אפקטים ורווחי סמך של 95% מדווחים גם עבור ניתוחים פרמטריים, כאשר גדלי אפקטים מתוארים לאורך הטקסט הראשי ומרווחי סמך המפורטים בטבלה 1.

supplements to boost memory