השפעות הגנה של חומצה אלפא ליפואית נגד 5-דלקת רירית העיכול הנגרמת על ידי פלואוראורציל בחולדות חלק 1

תַקצִיר: חומצה אלפא-ליפואית (ALA) נמצאת בשימוש נרחב בפורמולות מולטי ויטמין ומוצרי אנטי אייג'ינג. מטרת מחקר זה הייתה לחקור את יתרונות ההגנה הפוטנציאליים של ALA על 5-fluorouracil (5-FU) המושרה בדלקת ברירית העיכול בחולדות Wistar לבקנות. רקמות מהקיבה, המעי הדק והמעי הגס נכרתו, והתקבלו סרום דם לזיהוי מדדים ביוכימיים כגון TNF- , IL-1, MDA, GPx, SOD, MMP-1, {{ 8}}, -8 ו-TIMP-1. כמו כן בוצע מחקר היסטופתולוגי. התוצאות חשפו רמות TNF-, IL-1, MDA, MMP-1, -2, -8 ו-TIMP-1 מוגברות ברקמות ובסרים וערכים אלו ירדו באופן דרמטי בעקבות טיפול ALA. פעילויות מופחתות של SOD ו-GPx בקבוצות רירית התהפכו בקבוצות שטופלו ב-ALA. הנזק שנוצר כתוצאה מדלקת רירית בקיבה ובמעי הדק נסוג בקבוצה שטופלה ב-ALA, על פי הערכה היסטופתולוגית. כתוצאה מכך, היישום של תוספת ALA בטיפול 5-FU עשוי לשמש התערבות הגנה עבור חולי סרטן עם רירית מערכת העיכול. לאור הממצאים, ALA, נוגד חמצון שמקורו במזון עם תכונות פליאוטרופיות, עשוי להוות טיפול יעיל ל5-דלקת ברירית העיכול המושרה על ידי FU, ולמנוע עקה חמצונית, דלקת ונזק לרקמות בחולי סרטן המקבלים {{ 24}}טיפול ב-FU.

גליקוזיד של cistanche יכול גם להגביר את הפעילות של SOD ברקמות הלב והכבד, ולהפחית באופן משמעותי את תכולת הליפופוסצין וה-MDA בכל רקמה, תוך ניקוי יעיל של רדיקלי חמצן תגובתיים שונים (OH-, H₂O₂ וכו') ומגן מפני נזקי DNA הנגרמים על ידי OH-רדיקלים. לגליקוזידים פנילתנואידים של Cistanche יש יכולת ניקוי חזקה של רדיקלים חופשיים, יכולת צמצום גבוהה יותר מאשר ויטמין C, משפרים את פעילות ה-SOD בתרחיף זרע, מפחיתים את תכולת ה-MDA ויש להם השפעה הגנה מסוימת על תפקוד קרום הזרע. פוליסכרידים של Cistanche יכולים לשפר את הפעילות של SOD ו- GSH-Px באריתרוציטים וברקמות ריאה של עכברים מתבגרים שנגרמו על ידי D-galactose, כמו גם להפחית את תכולת ה-MDA והקולגן בריאה ובפלזמה, ולהגדיל את תכולת האלסטין. השפעה ניקוי טובה על DPPH, להאריך את זמן ההיפוקסיה בעכברים מזדקנים, לשפר את פעילות SOD בנסיוב, ולדחות את הניוון הפיזיולוגי של הריאות בעכברים מזדקנים ניסיוני. ובעלת פוטנציאל להיות תרופה למניעה וטיפול במחלות הזדקנות העור. יחד עם זאת, לאכינאקוסיד ב-Cistanche יש יכולת משמעותית לסלק רדיקלים חופשיים של DPPH והוא יכול לנקות מיני חמצן תגובתיים, למנוע פירוק קולגן הנגרמת על ידי רדיקלים חופשיים, וגם יש לו אפקט תיקון טוב על נזקי אניון רדיקלים חופשיים של תימין.

לחץ על Cistanche Tubulosa

【למידע נוסף:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

1. הקדמה

חומצה אלפא-ליפואית (ALA) קיימת במגוון רחב של מזונות, כולל ירקות (תרד, ברוקולי, עגבניות) ובשר (במיוחד קרביים), כמו גם מספר תוספי תזונה [1,2]. ל-ALA יש השפעות נוגדות חמצון רבות, כולל הפעלה של מנגנונים נוגדי חמצון אנדוגניים והקלציה של יוני מתכת כגון ברזל, אבץ ונחושת [3,4]. כמולקולת גופרית אורגנית, ALA יכולה לסלק מיני חמצן תגובתיים (ROS) ולהגביר את הפעילות של אנזימים נוגדי חמצון ברקמות כגון גלוטתיון פרוקסידאז (GPx) וסופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) [5-7]. בגלל תכונותיו נוגדות החמצון, נמצא כי ALA מפחית מוות תאי תלוי ALA בסרטן ריאות [8], סרטן שד [9] וסרטן המעי הגס [10]. יתר על כן, מחקר מוקדם יותר הראה כי ל-ALA יש תכונות אנטי דלקתיות [11-16]. ALA פועלת להפחתת דלקת על ידי אפנון הביטוי של ציטוקינים דלקתיים כגון tumor necrosis factor-alpha (TNF-) ואינטרלוקין-1 (IL-1) [17,18]. היתרונות הפרמקולוגיים של ALA הוכחו במגוון רחב של תחומים הקשורים לרפואה, כולל מודלים קרדיווסקולריים, נוירו-פרוטקטיביים, קוגניטיביים ואנטי-אייג'ינג [19].

סרטן הוא הגורם המוביל לתמותה בכל מדינה ומכשול גדול לאריכות ימים [20]. תופעות הלוואי של תרופות כימותרפיות הן אחד הגורמים המתישים החשובים ביותר במלחמה בסרטן, ודלקת רירית היא אחת המחלות השכיחות ביותר שנתקלים בחולי סרטן [21]. רירית היא מצב דלקתי פתולוגי המאופיין בכיב ודלקת של הרירית של מערכת העיכול [22]. רירית מגבירה את השימוש במשככי כאבים אופיואידים עקב כאב ומזרזת את המעבר לתזונה פרנטרלית מלאה עקב בעיות תזונתיות [23]. רירית וקשיים הקשורים לרירית מפחיתים את איכות החיים של המטופל, בעוד שהתפתחות מצבים מסכני חיים ותגובות שליליות לטיפול מהווים סיבה לדאגה עקב טיפול לקוי בנגע [24].

התרופה הכימותרפית הנפוצה ביותר בגידולים ממאירים במערכת העיכול היא אנלוגי הפירימידין 5-fluorouracil (5-FU). 5-FU מפעיל את ההשפעות האנטי-סרטניות שלו על ידי עיכוב thymidylate synthase (TS) ושילוב המטבוליטים שלו ב-RNA ו-DNA [25]. עם זאת, חומר זה גורם לדלקת ברירית מערכת העיכול, תופעת לוואי מתישה חמורה [26]. בפרט, הפירוק של מאזן החמצון-נוגדי החמצון, עלייה ברמות הציטוקינים הפרו-דלקתיים ופעילות האנזים הפרוטאוליטי משחקים תפקיד מרכזי בהתפתחות תופעות לוואי אלו. למרות שתרופות נוגדות חמצון ואנטי דלקתיות נוצלו בניסיון לטפל בבעיה זו, שיטה טיפולית חזקה במיוחד טרם זוהתה [27,28].

עד כה, מספר מחקרים דיווחו על השימוש ב-5-FU ו-ALA יחד בסוגי סרטן שונים; אלה כוללים גידולי צוואר הרחם ומעי הגס [29,30]. יתרה מזאת, תרופות עזר שעשויות להשתלב בהליכי טיפול כדי למנוע מחולי סרטן את ההשפעות השליליות של דלקת הרירית במערכת העיכול הנגרמת על ידי 5-FU יהיו יתרון. לפיכך, מטרת מחקר זה הייתה לקבוע את ההשפעות הביולוגיות של שימוש ב-ALA בחולדות עם מודל רירית שנוצר על ידי 5-FU, בנוסף לבחינת השימוש האפשרי שלו כסוכן מועמד בפרוטוקולי טיפול.

2. חומרים ושיטות

2.1. בעלי חיים

החיות נלקחו מיחידות הניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה למזרח הקרוב. החולדות (Wistar לבקנות, שני המינים) נשמרו במחזור חושך/אור של 12:12 שעות מההתחלה בטמפרטורת חדר של 22 ± 2 ◦C במתקן מבוקר לחות (50 ± 5 אחוזים). האכלה הייתה באופן חופשי ללא כל הגבלה למזון החולדות הסטנדרטי ולמי השתייה שלהם. חולדות שוכנו בכלוב פרספקס (4 חולדות לכל כלוב במידות של 60 × 40 × 40 ס"מ). פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה המקומית לניסויים בבעלי חיים באוניברסיטת Near East (אישור מס' 2019/01 ב-17 בינואר 2019 ו-2020/11 ב-27 בנובמבר 2020), והנחיות אתיות המוזכרות בהצהרת הלסינקי משנת 1964 ותיקוניה המאוחרים יותר. היו בעקבותיהם.

32 חולדות Wistar Albino משני המינים במשקל 200-250 גרם הוקצו לארבע קבוצות של שמונה חולדות כל אחת (n=8): קבוצות בקרה, ALA, Mucositis ו- Mucositis פלוס ALA. קבוצת הביקורת קיבלה רק מלח תוך-צפקי (ip) פעם ביום במשך שבוע. קבוצת ALA קיבלה רק ALA במינון של 100 מ"ג/ק"ג ip פעם ביום למשך שבוע מהיום הראשון [31,32]. קבוצת Mucositis טופלה ב-SF (ip) ביום 1 וב-400 מ"ג/ק"ג 5-FU ip מהיום השני ועד סוף הניסוי [33]. קבוצת Mucositis plus ALA קיבלה 100 מ"ג/ק"ג ip ALA ביום 1 ו-400 מ"ג/ק"ג ip 5-FU ביום 2. לאחר מכן, מתן 100 מ"ג/ק"ג/יום ip ALA נמשך עד לסיום הניסוי . החיות היו במעקב במשך שבוע אחד ללא תמותה במהלך תקופה זו. החיות בכל הקבוצות הורדמו בתום תקופת המחקר על ידי מתן שילוב של מנת יתר של קטמין/קסילזין. מבחני מעבדה בוצעו במעבדת האבחון וההיסטופתולוגיה של בית החולים לבעלי חיים, אוניברסיטת Near East.

2.2. אוסף דגימות דם ורקמות

התקבלו דגימות דם והוגשו למעבדה בצינורות הפרדה בסרום. דגימות הסרום הופרדו ב-2000×g למשך 10 דקות ונשמרו ב-80 ◦C עד ניתוח נוסף. כדי לסלק דם נוסף, רקמות הקיבה, המעי הדק והמעי הגס נאספו ונשטפו בתמיסת חיץ פוספט (pH=7.4). לאחר מכן, לאחר שנמסרו למעבדה, הם עברו הליך הומוגניזציה. הומוגניזציה של רקמות בוצעה על פי פרוטוקול היצרן באמצעות חיץ RIPA (פריט מס' 10010263, אצווה מס' 0490889-1, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, ארה"ב) ו-Dounce סט מטחנות רקמות (D8938, Lot. 3110, Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב) על קרח. לאחר הומוגניזציה, דגימות עברו צנטריפוגה ב-1600×g למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס פלוס. טכניקת קביעת החלבון של ברדפורד נוצלה כדי לכמת את רמות החלבון בדגימות רקמה, והסופרנטנטים הוקפאו לאחר מכן ב-80 ◦C לבדיקה לאחר מכן.

2.3. מדידות של מדדים ביוכימיים

פעילויות של אלנין טרנסמינאז (ALT), אספרטאט טרנסמינאז (AST), פוספטאז אלקליין (ALP), דהידרוגנאז לקטט (LDH), ליפאז (LIP), עמילאז (AMY), קריאטינין, חנקן אוריאה בדם (BUN), חלבון כולל (TP) , ורמות אלבומין נמדדו כמדדים ביוכימיים בדגימות סרום באמצעות מנתח BS-240 VET Clinical Chemistry אוטומטי (Mindray, שנזן, סין).

2.4. מדידת ציטוקינים בסרה וברקמות

ריכוזי TNF-ו-IL-1 בדגימות סרום ורקמות נמדדו באמצעות ערכות בדיקה זמינות מסחרית זמינות לאנזים-קישור לאנזים קשורים (ELISA) (ELR-TNF- ו-ELR-IL1 -, RayBiotech Life Inc., Norcross, GA, ארה"ב) בהתאם להוראות היצרן.

2.5. מדידה של מטריקס מטאלופרוטאינזים (MMPs) ומעכבי רקמות של מטאלופרוטאינז-1 (TIMP-1) בסרה וברקמות

MMPs ו-TIMP-1, המעורבים במגוון תהליכים ביולוגיים, כגון סרטן ודלקת, נמדדו הן בהומוגניות של רקמות והן בסרה באמצעות הוראות היצרן והמלצות של מבחני ELISA זמינים מסחרית (MMP{ {2}} E-EL-R0617; Elabscience, ווהאן, סין; MMP-2 ELR-MMP2; MMP-8 ELR-MMP8; TIMP-1 ELR-TIMP-1 RayBiotech Life Inc., Norcross, GA, ארה"ב). ריכוזי ה-MMP וה-TIMP-1 בנסיוב הובעו כpg/mL, בעוד שרמות הרקמה באו לידי ביטוי כpg/mg חלבון.

2.6. מדידת מלונדאלדהיד (MDA), GPx ו- SOD ברקמות

רמות MDA ברקמות הוערכו באמצעות ערכות בדיקה זמינות מסחרית כדי לקבוע את מצב החמצן של שומנים (TBARS Assay Kit, פריט מס' 10009055, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, ארה"ב). עקרון המדידה מבוסס על התגובה עם חומצה thiobarbituric (TBA) במים רותחים במשך 60 דקות במדיום חומצי ומדידת הספיגה של תערובת התגובה ב-532 ננומטר (Ohkawa et al., 1979). קורא VersaMax Tunable Microplate שימש למדידת הספיגה (Molecular Devices, San Jose, CA, USA). ריכוזי MDA ברקמות התבטאו כ-nmol MDA/mg חלבון.

ברקמות, פעילות GPx ו-SOD הוערכה באמצעות ערכות בדיקה מוכנות לשימוש. (RANSEL RS505, RANSOD SD125, Randox Laboratories Ltd., Crumlin, בריטניה) על ידי שימוש ב-BS-240 VET Clinical Chemistry Analyzer אוטומטי (Mindray, שנזן, סין). הכמויות של GPx ו- SOD בדגימות הרקמה (קיבה, מעי דק ומעי גס) באו לידי ביטוי כחלבון U/mg.

2.7. הערכה היסטופתולוגית

רקמות הקיבה, המעי הדק והמעי הגס שהתקבלו מיד לאחר תקופת הניסוי נקבעו ב-10 אחוז (v/v) פורמלין ניטרלי למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבוע הונחו הרקמות על מכשיר מעקב רקמות, Leica TP1020 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, גרמניה). רקמות שנלקחו ממכשיר מעקב הרקמות הוטבעו לאחר מכן בפרפין. קטעים בעובי 5-מיקרומטר נחתכו מהרקמות בעזרת מיקרוטום Leica RM2255 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, גרמניה), ובוצעה צביעת המטוקסילין ואאוזין (HE) שגרתית. החתכים נבדקו היסטומורפולוגיים עם מיקרוסקופ אור Leica DM500 יחד עם מערכת ניתוח הדמיה דיגיטלית משולבת Leica Microsystem Framework (Leica Application Suite גרסה 3.0 Series 38132019, Leica ICC50 HD, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Nußloch, גרמניה).

2.8. ניתוח סטטיסטי

תוכנת GraphPad Prism שימשה לניתוח סטטיסטי (גרסה 7.04, GraphPad Software, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב). הנתונים כולם הובעו כממוצע ± סטיית תקן (X ± SD). מבחן ניתוח השונות (ANOVA) שימש להשוואת קבוצות נתונים, ולאחריו מבחן ההשוואה המרובה של Tukey. בנוסף, מבחן Kruskal–Walis שימש להשוואת ציונים היסטומורפולוגיים בין קבוצות. הבדל של p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

3. תוצאות

3.1. ALA משפיע באופן חיובי על מדדים ביוכימיים

טבלה 1 מציגה את פעילות האנזים בסרום ואת ריכוזי המטבוליטים. בהשוואה לקבוצת הביקורת, לקבוצת Mucositis היו רמות גבוהות משמעותית של אלבומין, ALT, AST, ALP, LDH, עמילאז, ליפאז, BUN, קריאטינין ו-TP (p < 0.05 –0.0001). עם זאת, היה הבדל מובהק ברמות אלבומין, AST, ALT, ALP, LDH, BUN, קריאטינין, עמילאז, BUN וקריאטינין בין קבוצת ALA plus Mucositis וקבוצת Mucositis (p<0.05-0.001). רמות ALP, ALT, AST, LDH ועמילאז היו שונות באופן מהותי בין הקבוצות Mucositis ו-ALA (p <0.05-0.0001). בהתאם, נצפו רמות אנזימי כבד, אנזימי הלבלב ומטבוליטים מופחתות באופן דרמטי בקבוצת Mucositis כאשר הוספה ALA לטיפול.

3.2. ALA מפחית את הייצור של ציטוקינים פרו-דלקתיים

ניתן לראות את רמות הציטוקינים הפרו-דלקתיים TNF- ו-IL-1 בסרום, קיבה, מעי דק ומעי גס באיור 1. רמות TNF ו-IL-1 בסרום ובכלל רקמות של בעלי חיים בקבוצת Mucositis היו גבוהים יותר באופן משמעותי בהשוואה לקבוצות Control, ALA ו- Mucositis plus ALA (p < 0.05–0.0{ {17}}{{20}}1). עם זאת, רמות TNF- ו-IL-1 בסרה ובכל הרקמות פחתו משמעותית בקבוצת Mucositis plus ALA בהשוואה לקבוצת Mucositis (p < 0.05-0.0001). בין קבוצות ה-Control ו- Mucositis פלוס ALA, היה הבדל מהותי ברמות TNF- במעי הדק והגס. (p < 0.01). היו גם הבדלים משמעותיים ברמות TNF- במעי הגס והדק בין הקבוצות ALA ו- Mucositis plus ALA. (p < 0.01, p < 0.001, בהתאמה). יתר על כן, היו הבדלים מובהקים סטטיסטית בין קבוצות ה-Control ו- Mucositis plus ALA במונחים של רמות IL-1 בקיבה (p<0.05). לכן, נראה ש-ALA מדכא באופן משמעותי את רמות הציטוקינים פרו-דלקתיים ברירית.

3.3. טיפול ALA מפחית חמצון שומנים ומגביר את הפעילות של אנזימים נוגדי חמצון ברקמות

רמות MDA, GPx ופעילויות SOD כומתו כדי להעריך את החמצן ואת מצב נוגדי החמצון ברמת הרקמה (איור 2). רמות ה-MDA בקיבה, במעי הדק ובמעי הגס של קבוצת Mucositis היו גבוהות משמעותית מאשר בקבוצות ה-Control, ALA ו- Mucositis plus ALA (p < 0.05–0 .0001). בנוסף, רמות ה-MDA במעי הגס של קבוצת Mucositis plus ALA היו שונות באופן מהותי מאלו של קבוצות ה-Control ו-ALA (p<0.0001).

לחולדות בקבוצות הבקרה וה-ALA היו רמות SOD גבוהות משמעותית בכל הרקמות מאשר לחולדות בקבוצת Mucositis (p < {{0}}.05–0.{{8 }}{{10}}01). רמות SOD בדגימות המעי הגס היו שונות באופן משמעותי בקבוצות ALA ו- Mucositis plus ALA (p <0.01). בדגימות הקיבה, רמות SOD היו נמוכות משמעותית בקבוצות ALA ו- Mucositis plus ALA (p<0.05). יתר על כן, רמות SOD במעי הדק של חולדות מקבוצת Mucositis היו נמוכות משמעותית מרמות SOD בקבוצת ALA (p<0.05). עם זאת, רמות SOD בקיבה ובמעי הגס של בעלי חיים בקבוצות Mucositis ו- Mucositis plus ALA היו שונות באופן מהותי (p <0.05-0.0001).

3.4. טיפול ALA מעלה את רמות ה-MMP של רקמות ו-TIMP-1

פעילויות MMP{{0}}, MMP-2, MMP-8 ו-TIMP-1 (טבלה 2) בסרום, בקיבה, במעי הדק ובמעי הגס היו משמעותית גבוה יותר בקבוצת Mucositis בהשוואה לקבוצות בקרה ו-ALA (p < 0.05–0.0001). העלייה ברמות MMP-1, MMP-2, MMP-8 ו-TIMP-1 בסרום ובקיבה, במעי הדק והמעי הגס של חולדות מוקוזיטיס דוכאו באופן משמעותי ב חולדות רירית פלוס ALA (p < 0.05-0.0001), אם כי לא היה הבדל משמעותי ברמות MMP-8 בסרום בין הקבוצות Mucositis plus ALA ו- Mucositis.