AKT המופעל על ידי התניה מוקדמת שולט בסובלנות עצבית לאיסכמיה דרך MDM2–p53 PathwayⅠ

תַקצִיר

אחד המנגנונים החשובים ביותר של הגנה עצבית מתווכת מראש הוא הפחתה של אפופטוזיס של תאים, מה שגורם לסובלנות מוחית לאחר איסכמיה מזיקה לאחר מכן. בהקשר זה, מסלול האיתות האנטי-אפופטוטי PI3K/AKT ממלא תפקיד מפתח בוויסות ההתמיינות וההישרדות של התאים.

לחץ כדי cistanche tubulosa אבקת עבורהגנה עצבית

ידוע ש-Active AKT מגביר את הביטוי של דקה כפולה של עכברים-2 (MDM2), ליגאז E3-ubiquitin שמערער את היציבות של p53 כדי לקדם את הישרדותם של תאים סרטניים. בנוירונים, לאחרונה הראינו שהאינטראקציה של MDM2-p53 מועצמת על ידי התניה מוקדמת תרופתית, המבוססת על גירוי תת-טוקסי של הקולטן NMDA לגלוטמט, המונע אפופטוזיס נוירוני הנגרמת על ידי איסכמיה.

עם זאת, לא ידוע האם מנגנון זה תורם לסובלנות נוירונלית במהלך התניה איסכמית (IPC). כאן, אנו מראים ש-IPC גרם לזרחון בתיווך PI3K של AKT ב-Ser473, שבתורו זירחן את MDM2 ב-Ser166. זרחון זה גרם לייצוב הגרעיני של MDM2, מה שהוביל לחוסר יציבות של p53, ובכך מנע אפופטוזיס עצבי לאחר עלבון איסכמי. עיכוב של מסלול PI3K/AKT עם wortmannin או על ידי השתקת AKT גרמה להצטברות של MDM2 ציטוזולי, וביטל את ההגנה העצבית הנגרמת על ידי IPC.

לפיכך, IPC משפר את ההפעלה של מסלול האיתות PI3K/AKT ומקדם סובלנות נוירונית על ידי שליטה באינטראקציה MDM2-p53. הממצאים שלנו מספקים מסלול מכניסטי חדש המעורב בהגנה עצבית הנגרמת על ידי IPC באמצעות אפנון של איתות AKT, מה שמצביע על כך ש-AKT הוא יעד טיפולי פוטנציאלי נגד פגיעה איסכמית. מילות מפתח: AKT; MDM2; p53; PI3K; סובלנות איסכמית; התניה מוקדמת

1. הקדמה

בבני אדם, קיומו של התקף איסכמי חולף (TIA) התגלה כמצב מותנה אנדוגני עם היתרונות של תוצאות תפקודיות בחולי שבץ מוחי [1-3]. הגנה עצבית אנדוגנית המושרה על ידי גירוי איסכמי קצר ותת-טוקסי, המכונה תנאי קדם איסכמי (IPC), נחשבת לאסטרטגיה בתחום המתפתח של הגנה עצבית מפני פגיעה איסכמית [4-6].

עדויות מראות כי הגנה עצבית מקודמת IPC תלויה במנגנונים של שעתוק, תרגום ומנגנונים שלאחר תרגום, אשר משנה את תפקודם של חלבוני מפתח לאחר איסכמיה [6-11]. עם זאת, המנגנון המעורב בסובלנות איסכמית (IT) הנגרמת על ידי IPC לא הובהר במלואו במוח האנושי [12,13].

הפיתוח של גישות ניסיוניות חדשות להבנת הגנה עצבית בתיווך IPC מייצג כלי רב עוצמה לפענוח המנגנונים האנדוגניים העומדים בבסיס ה-IT של המוח [6], שיש להם פוטנציאל לחשוף מטרות טיפוליות חדשות שמטרתן למזער נזק מוחי בחולי שבץ. בשני העשורים האחרונים, מוות תאים עצביים אפופטוטיים מיקם את עצמו כמנגנון חיוני המעורב בפגיעה איסכמית מוחית [14-16]. במובן זה, חלבון קינאז B או AKT, סרין/תרונין קינאז הדורש הפעלת phosphoinositide kinase פונקציונלי (PI3K), נחשב למטרה חיונית לטיפולים נוירו-פרוטקטיביים לאחר איסכמיה [17,18].

לאחרונה, הוכחנו שהעיכוב של מסלול האיתות PI3K/AKT מגביר את הרגישות הנוירונית לרעילות אקסיטוטאלית [19]. AKT מעורב ברשת איתות אנטי-אפופטוטי מורכבת [20], שמרכיביה עשויים להיות נוכחים במיקומים תת-תאיים שונים בהתאם לסוג הרקמה [21,22]. בלב, AKT היה מעורב בהגנה על לב מקודם בתנאים מוקדמים [23].

עדויות מראות גם ש-AKT מזורחן מקדם הישרדות נוירונים בתחילת איסכמיה מוחית [24]. למרות שהפעלת AKT עשויה לתרום להשראת IT במוח [25], המנגנון המדויק הכרוך בהפעלתו בתיווך IPC נותר חמקמק. בתאי גידול, הפעלה של מסלול האיתות PI3K/AKT מובילה לזרחון MDM2 ב-Ser166/186, מה שמקדם את הטרנסלוקציה הגרעינית של MDM2 [26,27] ומשפר את פעילות ה-Ubiquitination שלו [28].

בגרעין, MDM2 נקשר ל-p53 ומקדם את ה-ubiquitination שלו והפירוק פרוטאזומלי שלאחר מכן, אשר מעכב את תפקוד p53 [29]. בתנאי לחץ, p53 יכול גם לעורר ביטוי יתר של MDM2, אשר לעומת זאת מדכא את הפעלת p53 בלולאת משוב שלילי [30]. העיכוב של PI3K מונע הפעלת AKT [31] וזרחון MDM2 בלב המותנה מראש [32].

בהקשר זה, גילינו בעבר שטיפול מוקדם במוח in vivo הפחית את נפח האוטם לאחר חסימת עורק מוח בינוני חולף (tMCAO) על ידי הגדלת ביטוי רמת החלבון MDM2. כתוצאה מכך, המתחם MDM2-p53 מוחלש הפעלה הנגרמת על ידי איסכמיה של מסלול האיתות p53/PUMA/caspase-3 בנוירונים ראשוניים בקליפת המוח [33].

כאן, אנו חופרים בתפקידו של מסלול האיתות PI3K/AKT בסובלנות עצבית בתיווך IPC נגד פציעה איסכמית שלאחר מכן, כמו גם במנגנון הבסיסי, ואנו מתמקדים בעיקר בקשר הפוטנציאלי בין הפעלת AKT לבין קומפלקס MDM2-p53 .

2. תוצאות

2.1. IPC-Promoted Neuroprotection

מתווך על ידי זרחון של AKT ב-Ser473, זרחון של MDM2 ב-Ser166, ו-p53 Destabilization. תיארנו בעבר את ההשפעה של אינטראקציה MDM2-p53 על רגישות נוירונים לאיסכמיה [34] ו-IT [33]. כאן, חקרנו את התפקיד הפוטנציאלי של AKT על הגנה עצבית בתיווך IPC כמועמד להיות מעורב במסלול MDM2-p53.

ראשית, אישרנו שאיסכמיה קידמה את הפעלת AKT בנוירונים, כפי שהוכח על ידי זרחון AKT ב- Ser473. כפי שמוצג באיור 1A, OGD קצר (20 דקות) גרמה באופן משמעותי לביטוי p(Ser473)AKT ו-MDM2, בעוד שרמות החלבון AKT נותרו ללא שינוי (איור S1A). עם זאת, זרחון AKT לא נצפתה כאשר נוירונים היו נתונים ל- OGD ממושך (90 דקות). יתר על כן, רמות חלבון MDM2 היו נמוכות יותר, מה שעולה בקנה אחד עם הביטוי הגבוה יותר של חלבון p53 כפי שמוצג באיור 1A.

הוויסות העל תלוי בזמן של ביטוי Mdm2 לאחר OGD (איור 1B) מאשר כי איסכמיה תת-חריפה עשויה להיות חשובה כדי לגרום למנגנונים המונעים התייצבות של p53 לאחר OGD, כפי שתואר בעבר [33]. השתמשנו ב-OGD קצר (20 דקות) ואחריו 2 שעות של חימצון מחדש כמודל של IPC (איור S1B) [33]; לפיכך, ניתחנו תמציות עצביות שנאספו לאחר 4 שעות של חימצון מחדש לאחר OGD (OGD/R) או לאחר OGD שלפניו פרוטוקול IPC (IPC ועוד OGD/R). במקביל, נוירונים הודגרו בהגדרות של נורמוקסיה (Nx) או התניה מוקדמת (IPC) (איור S1B).

כפי שמוצג באיור 1C ובאיור S1C, IPC גרם להפעלה מוקדמת של AKT, כפי שהתגלה על ידי זרחון ב-Ser473 [35], ואחריו ייצוב חלבון MDM2 וזרחון ב-Ser166. IPC גם מנע ייצוב p53 המושרה על ידי OGD/R (איור 1C). מעניין לציין שתמונות אימונופלואורסצנטיות המוצגות באיור 1D גילו ש-IPC קידמה זרחון AKT ב-Ser473 בנוירונים, שהצטברו בעיקר בגרעין, והפחיתו את ייצוב ה-p53 לאחר OGD/R (IPC בתוספת OGD/R) בהשוואה לנוירונים שאינם מותנים מראש (OGD) /R).

כתוצאה מכך, IPC מנע אפופטוזיס עצבי והפעלת קספאז-3 הנגרמת על ידי OGD/R, כפי שנמדד על ידי ציטומטריית זרימה (איור S1D) ומבחני פלואורמטריה (איור S1E), בהתאמה. כדי לאשר את תפקידו של p53 בהגנה עצבית בתיווך IPC, השתמשנו בנוירונים המבטאים (סוג פראי; wt) או לא (נוקאאוט; ko) חלבון p53. התוצאות שלנו מראות כי נוירונים חסרי p53 (איור S1F) היו עמידים יותר לאפופטוזיס המושרה על ידי OGD מאשר נוירוני p53 wt.

יתר על כן, רמות האפופטוזיס בנוירוני p53KO היו דומות לאלו שנצפו בנוירונים מותנים מראש (IPC פלוס OGD/R) wt (איור S1G), ובכך מאשרות את תפקיד המפתח של ערעור היציבות של p53 בהגנה עצבית בתיווך IPC [33]. התוצאות שלנו מראות ש-IPC גרמה להגנה עצבית נגד עלבון איסכמי באמצעות מנגנון הכרוך בזרחון של AKT ב-Ser473, ייצוב MDM2 וזרחון ב-Ser166, וערעור יציבות p53.

2.2. IPC מפעיל זרחון MDM2 ב-Ser166 דרך PI3K/AKT Pathway

מסלול האיתות PI3K/AKT מעורב ב-IT נוירוני הן במבחנה [36] והן in vivo [37]. עם זאת, התפקיד של הפעלה בתיווך IPC של מסלול PI3K/AKT בוויסות של קומפלקס MDM2-p53 נותר בלתי נחקר. כדי להבהיר זאת, נוירונים הודגרו עם המעכב הבלתי הפיך והספציפי של מסלול PI3K/AKT, wortmannin [19].

כפי שמוצג באיור 2A, wortmannin ביטל את זרחון ה-IPC (Ser473)AKT וערעור היציבות של p53, כפי שמוצג באיור 1D. תוצאות אלו מצביעות על קשר ישיר בין הפעלת AKT ועיכוב של אפופטוזיס עצבי מתווך p53-(איור S1D) והפעלת caspase-3 (איור S1E) המושרה לאחר OGD/R. הרגולטור העיקרי של ייצוב p53, MDM2, הוא יעד של AKT [26], אשר מזרחן MDM2 ב- Ser166 ו- Ser186 [26]. עיכוב PI3K עם wortmannin מנע את הזרחון של שני (Ser473)AKT ו- (Ser166)MDM2 המושרה על ידי IPC (איור 2B).

הזרחון הספציפי בתיווך Akt של MDM2 ב-Ser166 המושרה על ידי IPC אושר על ידי שימוש ב-RNA מתערב קטן (siRNA) שתוכנן במיוחד כנגד חלבון AKT1 (siAkt), המתבטא מאוד בנוירונים בקליפת המוח, ושפעילותו חיונית להישרדות נוירונים לאחר איסכמיה [ 38]. כפי שמוצג באיור 3, siAkt הפחית את רמות החלבון הכוללות של AKT ו-p(Ser473)AKT ביום 3 לאחר ההעברה, הן בתאי HEK-293T (איור 3A) והן בתאי עצב קליפת המוח (איור 3B).

יתר על כן, AKT knockdown (siAkt) מנע (Ser166) MDM2 זרחן (איור 3B). תוצאות אלו מדגימות כי מסלול האיתות PI3K/AKT המופעל על ידי IPC מקדם זרחון של MDM2 ב-Ser166, שעשוי להיות אחראי לייצוב MDM2 וכתוצאה מכך חוסר יציבות של p53 לאחר פציעה איסכמית.

2.3. IPC-Activated AKT מפעיל ייצוב חלבון גרעיני MDM2 לאחר איסכמיה

ההפעלה של AKT הייתה מעורבת בטרנסלוקציה הגרעינית של MDM2 בתאי גידול [26]. בהתחשב ברלוונטיות של ייצוב MDM2 גרעיני להישרדות נוירונלית לאחר איסכמיה [34] וליתר דיוק, תפקידו המגן על העצבים ב-IPC [33], החלטנו לחקור עוד את הרלוונטיות של מסלול איתות PI3K/AKT בוויסות לוקליזציה תת-תאית של MDM2 חֶלְבּוֹן.

לפיכך, נוירונים או תאי HEK-293T הועברו טרנסfected עם חלבון אדם מתויג MDM2- (MDM2-GFP). כתמים מייצגים של תאי HEK-293T שעברו טרנספקציה ותמונות מנוירונים המבטאים חלבון MDM2 אנושי באופן אקטופי לאחר ארבעה תנאי ניסוי שונים (Nx, IPC, OGD/R ו-IPC בתוספת OGD/R) מוצגים באיור 4A ובאיור S1H , בהתאמה.

ביטוי חוץ רחמי של MDM2- GFP אישר ש-IPC מקדם הצטברות גרעינית MDM2 בהשוואה לנוירונים איסכמיים לא מותנים (OGD/R) או נורמוקסיים (Nx) (איור 4A, B), כפי שנחשף על ידי כימות יחס הקרינה הגרעינית/ציטוזולית (איור S2B) ועוצמת הקרינה הגרעינית של MDM 2-GFP (איור S2C).

2.4. IPC מקדם אינטראקציה של p(Ser473)AKT ו-MDM2, אשר משפרת את ייצוב MDM2 בגרעין ומפחיתה אפופטוזיס עצבי המושרה על איסכמיה

לאחר הדגמת התפקיד של הפעלה משופרת של IPC של מסלול PI3K/AKT בייצוב הגרעיני של MDM2, חקרנו עוד האם p(Ser473)AKT ו-MDM2 קיימו אינטראקציה בתוך הגרעין (איור 6A). משקעים חיסוניים של MDM2 מתמציות חלבון גרעיני, ואחריו אימונובלוטינג נגד MDM2 ו-p(Ser473)AKT, גילו ש-IPC קידם את האינטראקציה בין p(Ser473)AKT ו-MDM2, לאחר OGD/R, ובכך מונע ייצוב P53 גרעיני המושרה על ידי OGD/R, כפי שמוצג בקלט הגרעין (איור 6A).

לבסוף, חקרנו את ההשפעה המזיקה של שיבוש מסלול PI3K/AKT על אפופטוזיס עצבי (איור 6B). עיכוב AKT פעל נגד ההשפעה המגנה של IPC לפני OGD, מה שמאשר את התפקיד הנוירו-פרוטקטיבי של AKT-MDM2 בהקשר של IT. התוצאות שלנו, אם כן, מוכיחות כי IPC משרה זרחון והפעלה של AKT, המעודדת זרחון MDM2 ב-Ser166 וטרנסלוקציה גרעינית, שם היא מקיימת אינטראקציה עם p(Ser473)AKT. מנגנון זה עשוי לתרום לייצוב גרעיני משופר של MDM2, אשר ממלא תפקיד חיוני בסובלנות איסכמית הנגרמת על ידי IPC.

כיצד Cistanche מגן על נוירונים?

ישנן עדויות המצביעות על כך ש-Cistanche עשוי להגן על נוירונים על ידי הפחתת אפופטוזיס (מוות תאי מתוכנת) וקידום הישרדות נוירונים. אפופטוזיס הוא תהליך טבעי המתרחש בגוף להסרת תאים פגומים או לא רצויים, אך הוא עלול להזיק כאשר הוא מתרחש באופן מוגזם או לא מתאים. נמצא כי Cistanche מעכב אפופטוזיס במחקרי מעבדה, והשפעה זו עשויה לסייע בהגנה על נוירונים מנזק.

בנוסף, Cistanche מכיל מספר תרכובות ביו-אקטיביות אשר הוכחו כבעלי השפעות נוירו-פרוטקטיביות. לדוגמה, הוא מכיל אכינאקוסיד, אשר הוכח כמגן על נוירונים מלחץ חמצוני ודלקת. הוא מכיל גם אקטאוזיד, שנמצא כבעל תכונות אנטי דלקתיות ונוגדות חמצון.

המשך יבוא...

אמיליה באריו 1,†, רבקה וצ'ינו 1,2,†, אירן סאנצ'ס-מוראן 1, כריסטינה רודריגס 1,2,3, אלברטו סוארז-פינדאדו 1, חואן פ. בולנוס 1,2,3,4, אנג'לס אלמיידה 1, 2,3 ומריה דלגדו-אסטבן 1,2,3,*

1 המכון לביולוגיה פונקציונלית וגנומיקה, אוניברסיטת סלמנקה, CSIC, 37007 סלמנקה, ספרד; emibg7@gmail.com (EB); rebecavecino@usal.es (RV); irene_sm@usal.es (IS-M.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (AS-P.); jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (AA)

2 המכון למחקר ביו-רפואי של סלמנקה, בית החולים האוניברסיטאי של סלמנקה, אוניברסיטת סלמנקה, CSIC, 37007 סלמנקה, ספרד

3 המחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית, אוניברסיטת סלמנקה, 37007 סלמנקה, ספרד. ; טל.: פלוס 34-923-29-4908