סמנים ביולוגיים לדמעות פוטנציאליים לאבחון מחלת פרקינסון - מחקר פיילוט Ⅰ

תקציר: מחלת פרקינסון (PD) היא המחלה הנוירודגנרטיבית השנייה בשכיחותה אחרי מחלת האלצהיימר. במחקר זה, פרופיל פרוטום הדמעות של חולים עם PD אידיופטי (iPD, n=24), נשאים של המוטציה E46K-SNCA (n=3) ובקרה בריאה (CT, n {{4 }}) נבדקים נותחו כדי לזהות סמנים ביולוגיים מועמדים לאבחון PD. בוצע מחקר פיילוט תצפיתי, פרוספקטיבי ומקרה-ביקורתי, שחקר את דגימות הדמעות של המשתתף על ידי כרומטוגרפיה של ננו-נוזל-ספקטרומטריית מסה (nLC-MS/MS) והעריך את הליקוי הנוירולוגי שלהם. הנתונים הפרוטאומיים שהתקבלו זמינים ב-ProteomeXchange עם מזהה 10.6019/PXD028811.

לחץ כדי לבדוק את Amway עבור מחלת פרקינסון

ניתוחים אלה הובילו לזיהוי של 560 חלבוני דמעות, שחלקם הופרעו בחולי PD ואשר היו מעורבים בתגובות חיסוניות, דלקת, אפופטוזיס, פירוק קולגן, סינתזת חלבון, הגנה, הובלת שומנים ושינוי בתפקוד הליזוזומלי. מתוך חלבונים אלה, שישה היו קשורים לתהליכים נוירודגנרטיביים והראו יכולת מצוינת לסווג חולים ובקרות. ממצאים אלה חשפו שחלבונים מסוימים היו מווסתים בדמעות של חולי PD, בעיקר חלבונים המעורבים בתפקוד הליזוזומלי. לפיכך, במחקר זה, חלבוני דמעות זוהו כמעורבים בניוון עצבי שעלול להיות קשור לפנוטיפ מחלה אגרסיבי בחולי PD.

מילות מפתח: סמנים ביולוגיים; מחלת פרקינסון; סרט דמעות; ליזוזום

1. הקדמה

מחלת פרקינסון (PD) היא המחלה הנוירודגנרטיבית השנייה בשכיחותה אחרי מחלת אלצהיימר (AD), והיא מאופיינת באיטיות בתנועה (ברדיקינזיה), טונוס שרירים מוגבר (נוקשות), רעד (רעד) ופגיעה בשליטה ביציבה. ב-PD שאושר פתולוגית, ישנה כמות משתנה ושקיעה של אלפא-סינוקלאין (-syn) שגויה מקופלת בצורה של גופי Lewy (LBs) ו-Lewy neurites במערכת העצבים המרכזית (CNS). השונות הזו בהצטברות של מבנים אלה עשויה לשקף את ההטרוגניות הקלינית במחלה זו [1-3]. אכן, מספר הפרעות קליניות נמצאות בספקטרום של מחלות גוף Lewy (LBDs), כולל חולים עם PD אידיופתי (IPD) וגנטי וחולים הסובלים מדמנציה עם LBs. אחד האתגרים המרכזיים בהתמודדות עם מחלות נוירודגנרטיביות הוא למצוא סמנים קליניים המאפשרים סיווג מוקדם של החולים ומסייעים במעקב אחר התקדמות המחלה.

גורמים כמו עקה חמצונית, פרוטאוליזה ושינוי בריכוזי חומצות שומן או פוספוליפידים נקשרו לשינויים מבניים ב-syn, ושינויים שלאחר תרגום יכולים גם לשנות את הגודל, המבנה או עומס החלבון של -syn [4]. ביטול הוויסות של מוטציות והכפלות בגן -syn (SNCA) גורמים לצורות משפחתיות דומיננטיות אוטוזומליות של PD [5]. אולי המוטציה הפתוגנית ביותר הידועה כמעוררת PD היא המוטציה E46K ב-syn (E46K-SNCA), העומדת בבסיס קבוצה של LBDs אגרסיביים וגנטיים עם מאפיינים קליניים ופתולוגיים המזכירים דמנציה עם LBs [6,7]. למרות שמוטציות ב-syn הן נדירות, הן מספקות הזדמנות ייחודית לזהות חולים עם PD ולהבין טוב יותר את התקדמות הפתולוגיות הללו.

ידוע שחולי PD מפתחים הזיות, שינויים בתנועת העין והעפעפיים ושינוי בהרכב הדמעות בכמויות מופחתות [8,9]. בנוסף לנזק לפני העין, חולים אלו יכולים לחוות שינויים באקומודציה, חדות ראייה מופחתת, היווצרות סקוטומה (אזורים שבהם שדה הראייה שלהם מופחת חלקית או מנוון לחלוטין), ודילול של שכבות הרשתית, במיוחד עקב הפחתה במספר סיבי העצב [10,11]. חוסרים בהולכה עצבית ומטבוליזם של מונואמין משפיעים גם על השינויים הפתולוגיים במערכת הראייה של חולי PD [12].

שינויים אלה אופייניים למדי מכיוון שמונואמינים מעורבים בהעברת מידע חזותי ברשתית [13]. יתרה מכך, חולי PD עלולים לחוות שינויים בעצבוב של החלק הקדמי של העין שיכולים בסופו של דבר לשנות את הרכב הדמעות. נוירוטרנסמיטורים וחומרים טרופיים רבים מופרשים בדמעות, שמקורם בהומור המימי או בעצבים העוברים דרך הקרנית [14].

עם זאת, המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס האסוציאציות הללו טרם הובהרו במלואן. מכיוון ש-PD משפיע על מספר מערכות לא מוטוריות ועצבים היקפיים, הפרשת הדמעות עשויה להשתנות בחולים אלה, והרכב חלבון הדמעות עשוי להפגין פרופיל אופייני בחולים אלה שיכול לשמש כסמן ביולוגי אבחנתי. במובן זה, ניתוח חלבוני הדמעות של חולים עם E46K-SNCA ו-iPD יכול לעזור לזהות סמנים ביולוגיים מועמדים שימושיים לאבחון ולהתקדמות של PD.

לכן, המחקר הנוכחי נועד לנתח את פרופיל פרוטאום הדמעות בחולי iPD ובנשאים של המוטציה E46K-SNCA כדי למצוא סמן ביולוגי שיכול לסייע באבחון העתידי של PD, באמצעות דגימות לא פולשניות.

2. חומרים ושיטות

2.1. קבוצת לימוד

תכננו מחקר פיילוט תצפיתי, פרוספקטיבי, מקרה-ביקורת בו נרשמו 24 חולים עם iPD, 3 נשאים של המוטציה E46K-SNCA ו-27 נבדקים בריאים (CTs). מחקר זה נערך על ידי צוות מוסמך רפואי לאחר קבלת אישור מוועדת האתיקה של OSI Ezkerralde-Enkaterri-Cruces CEIC E18/47. המחקר בוצע בהתאם לעיקרי הצהרת הלסינקי על מחקר ביו-רפואי הכולל נבדקים אנושיים. לפני איסוף המדגם, התקבלה הסכמה מדעת חתומה מכל הנבדקים לאחר שהסבירו את מהות המחקר וההשלכות האפשריות. המטופלים גויסו ביחידות השירות לנוירולוגיה ורפואת עיניים של בית החולים האוניברסיטאי קרוס (Barakaldo, Bizkaia, ספרד) במהלך התייעצויות חוץ, בהתבסס על קריטריוני ההכללה וההדרה המוסכמים. חולים עם IPD מילאו את הקריטריונים של Parkinson's UK Brain Bank לאבחון PD ולא נשאו כל מוטציות ידועות.

קריטריוני ההכללה של CT היו להיות מעל גיל 40, מכל המינים, וללא היסטוריה קלינית של הפרעה נוירולוגית כלשהי. אנשים עם (או עם היסטוריה של) הפרעה מערכתית או עינית כלשהי נכללו במחקר. קריטריוני ההכללה כללו ניתוחי עיניים בשלושת החודשים הקודמים, תרופות כרוניות לעיניים (למשל, לגלאוקומה), היסטוריה של אלרגיות, שימוש בכל תרופה מקומית (מלבד דמעות מלאכותיות) או תרופות דרך הפה המכילות קורטיקוסטרואידים, אטופיה וחולים עם סיוגרן. תִסמוֹנֶת.

גם משתמשי עדשות מגע לא נכללו כדי למנוע כל הפרעה אפשרית לפרשנות התוצאות. בדיקות עיניים ראשוניות ואיסוף דגימות בוצעו באותו יום, בעוד חולים עם PD נראו גם ביום נפרד על ידי חברי צוות המחקר המומחים בהפרעות תנועה להערכת סולם פרקינסון.

2.2. בדיקת עיניים

הבדיקה הקלינית של העיניים כללה את בדיקת שרמר I (SCH), הקובעת אם העין מייצרת מספיק דמעות כדי לשמור עליה לחה. הבדיקה מאפשרת למים בדמעות לנוע לאורך רצועת בדיקה מנייר, והערכים התקינים גדולים או שווים ל-10 מ"מ הרטבה של הנייר לאחר 5 דקות. חוסר יציבות של סרט דמעות הוערכה על ידי שימוש בזמן פריצת דמעות (TBUT) עם פלואורססאין. TBUT הוא הזמן שלוקח להופעת הנקודה היבשה הראשונה על הקרנית לאחר מצמוץ מלא. ערך פחות מ-10 שניות משקף בדרך כלל חוסר יציבות של סרט דמעות. כל מחלה מערכתית או כל מצב/שימוש תרופתי אחר שעלול להפריע לפרשנות התוצאות נחשבו כקריטריון להדרה.

2.3. בדיקה נוירולוגית

מומחה נוירולוג בתחום הפרעות תנועה רשם את גילם של חולי הפרעת דמעות בעת איסוף הדמעות, משך המחלה שלהם וציונו בסולם Unified Parkinson's Disease Rating Scale (UPDRS) ו-Hohn Yahr. בדיקות אלו משמשות קריטריוני ריבוד למעקב אחר התקדמות המחלה. סודיות נתוני המטופל הובטחה באמצעות השימוש בביובנק הבאסקי.

2.4. אוסף דגימות דמעות

כל דגימות הדמעות נאספו באמצעות צינורות מיקרו-קפילרי זכוכית מכוילים בנפח 10 μL (BLAUBRAND intraMark, Wertheim, גרמניה). דגימות דמעות התקבלו מהמיניסקוס הטמפורלי התחתון, תוך מזעור גירוי של משטח העין או שולי המכסה, וללא התקנת הרדמה. דגימות הדמעות נאספו משתי העיניים של כל משתתף והונחו מיד בצינורות אפנדורף מקוררים מראש. לאחר איסוף הדמעות, הדגימות אוחסנו ב-80 ◦C עד לניתוח.

2.5. ניתוחי פרוטאומיקה

הניתוחים הפרוטאומיים בוצעו בשירות CIC bioGUNE Proteomics (Derio, Bizkaia, ספרד), תוך שימוש בפרוטוקול Filter Aided Sample Preparation (FASP) [15] לעיבוד דגימה ועיכול. טריפסין (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב) הוסף ביחס טריפסין: חלבון של 1:50, והתערובת הודגרה למשך הלילה ב-37 ◦C, מיובשת ב-RVC{{4} } רכז Speedvac (משיח, וינה, אוסטריה). הפפטידים שהתקבלו הומלחו והושפו מחדש ב-0.1 אחוז חומצת פורמי (FA) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב) באמצעות טיפים בשלב C18 (Millipore, St. Louis, MO, ארה"ב).

דגימות נותחו בספקטרומטר חדשני של ניידות יונים לכוד היברידי quadrupol time of flight ספקטרומטר מסה (timsTOF Pro עם PASEF, Bruker Daltonics, ברמן, גרמניה), מחובר מקוון לכרומטוגרף נוזלי nanoElute (Bruker, Coventry, בריטניה). ספקטרומטר מסה זה מנצל מצב סריקה חדש הנקרא פיצול טורי של צבירה מקבילה (PASEF), אשר מכפיל את מהירות הרצף ללא כל אובדן רגישות, והוכח כמספק מהירות אנליטית ורגישות יוצאת דופן עבור ניתוחי פרוטאומיקה [16].

דגימות (200 ng) הועמסו ישירות על גבי עמודה אנליטית של Bruker nano elute FIFTEEN C18 (Bruker, Coventry, UK) בגודל 400 nL/min. העמוד חומם ל-50 ◦C בתנור. זיהוי וכימות חלבונים בוצעו באמצעות תוכנת PEAKS (Bioinformatics Solutions Inc., Waterloo, CA, ארה"ב). חיפושים בוצעו על-פי מסד נתונים של ערכי Uniprot/Swissprot אנושיים קנוניים (ללא שוקל איזופורמים), עם סובלנות מבשר ושברים של 20 עמודים לדקה ו-0.05 דא.

כימת חלבון ללא תווית על בסיס שטח בוצע על ידי שימוש במודול PEAKS Q הזמין בתוכנת PEAKS. רק חלבונים שזוהו עם לפחות שני פפטידים בשיעור גילוי כוזב (FDR) < 1 אחוז ונוכחים בלפחות 70 אחוז מהדגימות מאחת מקבוצות הניסוי בניתוח נשקלו לניתוח נוסף. הנתונים הועמסו על פלטפורמת Perseus [17] ועובדו עוד יותר (טרנספורמציה log2, זקיפה) לפני היישום של מבחן t של Student לניתוח ביטוי דיפרנציאלי של חלבון. נתוני ה-Proteomics מסוכמים בקובץ חומרים משלימים S1, ונתוני ה-Proteomics של ספקטרומטריית המונים הופקדו ל-ProteomeXchange Consortium דרך מאגר השותפים PRIDE [18], עם מזהי מערך הנתונים PXD028811 ו-10.6019/PXD028811.

2.6. ניתוח סטטיסטי

ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות חבילת IBM SPSS Statistics עבור Windows, 23.0v (IBM-SPSS, Armonk, New York, NY, USA). תקינות הנתונים הרציפים הוערכה באמצעות בדיקת Shapiro–Wilk. ערכי ה-p המחושבים קובעים את ההסתברות שהקשר בין חלבונים במערך הנתונים למסלול קנוני נתון, רשת תפקודית או מווסת במעלה הזרם מוסבר במקרה בלבד, בהתבסס על בדיקה מדויקת של פישר, עם ערך p < {{5 }}.05 נחשב משמעותי.

רגרסיות לוגיסטיות חד-משתניות שימשו כדי לזהות את המאפיינים המובהקים סטטיסטית הקשורים לאפליה של PD-מטופל. לאחר בחירת משתנים, רגרסיות לוגיסטיות רב-משתניות שימשו לבניית מודל אבחנה של PD וכדי לזהות את המשתנים הקליניים והפרוטאומיים הרלוונטיים לזיהוי PD. מודלים לוגיסטיים מאפשרים להעריך את הקשר בין משתנה תלוי בדיד לבין קבוצה של משתנים בלתי תלויים מתמשכים או נפרדים. המודלים מאפשרים סיווג של חולים עם או בלי PD, בחישוב ההסתברות להשתייך לכל קבוצה. ערך ה-p של כל משתני משנה מתאר את המובהקות הסטטיסטית של הקשר בין התגובה לכל מונח שנכלל במודל.

למידע נוסף: Ali.ma@wecistanche.com