ננו-מכלולים בעלי רגישות לאור תרופתית המכילים פונקציית תרדמה כימותרפית מעצימה אימונותרפיה לסרטן

תַקצִיר

אימונותרפיה בשילוב עם טיפולים יעילים כגון כימותרפיה וטיפול פוטודינמי היא אסטרטגיה מוצלחת להפעלת תגובות חיסוניות אנטי-גידוליות לשיפור הטיפול האנטי-סרטני. עם זאת, פיתוח ננו-אימונוסטימולנטים רב-תכליתיים מתכלים, תואמים ביולוגיים, רעילים נמוכים אך יעילים ביותר וזמינים קלינית שעברו טרנספורמציה נותר אתגר וזוכה לביקוש רב. כאן, אנו מדווחים ומתכננים ננו-פרו-דרוג חדשני נטול נשא נטולי נשא, COS-BA/Ce6 NPs על ידי שילוב של שלושה רכיבים רב-תכליתיים בהרכבה עצמית של מולקולה קטנה טבעית חומצה בטולינית (BA), אוליגוסכריד קיטוזן מסיס במים (COS), ו-Photosensitizer נמוך e6 (Ce6) כדי להגביר את היעילות האנטי-גידולית של אימונותרפיה נגד סרטן בתיווך אנטי-PD-L1-. אנו מראים כי הננו-תרופות המעוצבות טומן בחובו מאפיין "רדמה" חכם וייחודי בהשפעה כימותרפית עם ציטוטוקסיות נמוכה יותר רצויה, ותכונות טיפוליות מרובות, כולל שיפור יצירת 1 O2 המושרה על ידי פער האנרגיה המופחת של Ce6, היענות pH, מתכלות ביולוגית טובה, ו תאימות ביולוגית, המבטיחה פוטוכימותרפיה יעילה ביותר, סינרגטית. יתרה מכך, בשילוב עם טיפול אנטי-PD-L1, גם כימותרפיה מבוססת ננו-משותף וגם טיפול כימותרפי/פוטודינמי (PDT) יכולים להפעיל ביעילות חסינות אנטי-גידולית בעת טיפול בגידולים ראשוניים או מרוחקים, ולפתוח אפשרויות אטרקטיביות בפוטנציה לאימונותרפיה קלינית.

היתרונות של cistanche tubulosa-Antitumor

מילות מפתח

אימונותרפיה לסרטן; ננו-אימונוסטימולנטים; תרדמה כימותרפית; פרו סמים; הרכבה עצמית; מולקולה קטנה טבעית; חומצה בטולינית; טיפול פוטודינמי

1. הקדמה

טיפול אימונותרפי לסרטן, כגון אסטרטגיית חסימת המחסום החיסונית באמצעות PD-L1 או CTLA-4 כדי להילחם בסרטן על ידי הפעלת המערכת החיסונית של המארח, חוללה ללא ספק מהפכה בטיפול בסרטן1,2. לרוע המזל, התגובה החיסונית החלשה וההשפעות הטיפוליות הבלתי יעילות הגבילו מאוד את הסיכויים הקליניים שלה3,4. לאחרונה, מחקרים עדכניים גילו כי שילוב של אימונותרפיה עם שיטות אחרות כגון כימותרפיה5, טיפול פוטודינמי (PDT)6, טיפול פוטותרמי (PTT)7 ורדיותרפיה8, יכול ביעילות לעורר אימונוגניות אנטי-גידולית על ידי גרימת תאי סרטן לעבור מוות תאי אימונוגני ( ICD)9, המצביע על הפוטנציאל של אפנון חיסוני להפעלת תגובות חיסוניות אנטי-גידוליות. עיצובים חדשניים רבים של ננו-חומרים המבוססים על שילובים סינרגטיים אלה של אסטרטגיות אימונותרפיה השיגו שיפור משמעותי בפעילות אנטי-סרטנית, כולל ננו-חלקיקים 10, פולימר11 ו-biomimetic12 (NPs). עם זאת, פיתוח ננו-אימונוסטימולנטים רב-תכליתיים מתכלים, תואמים ביולוגיים, רעילות נמוכה אך יעילים ביותר וזמינים קלינית שעברו טרנספורמציה נותר אתגר גדול וביקוש עצום. חומרים ביולוגיים טבעיים כמו חומצות גרעין13, חלבונים12, פפטידים14,15 ומוצרים טבעיים מולקולריים קטנים16,17 בשל היתרונות המובנים שלהם (למשל, תאימות ביולוגית, אי-רעילות) משכו עניין מחקר משמעותי ליישומים רפואיים. במיוחד בשנים האחרונות התגלו ברציפות מולקולות קטנות של טרפנואיד טבעיות (NSMs) ביו-אקטיביות אנטי-סרטניות בעלות פונקציה של הרכבה עצמית18,19. לדוגמה, חומצה בטולינית (BA), ארגוסטרול (ET) וחומצה אביאטית (AA) יכולים להרכיב בעצמם לחלקיקים בעלי מבנה מיקרוני או ננו. NSMs אלה הם אבני בניין אטרקטיביות לשימוש לפיתוח תרופות אנטי-גידוליות לכימותרפיה סינרגטית ו-PDT. הם הוכחו כמציגים יתרונות משמעותיים של ייצור ננו קל, תאימות ביולוגית והתכלות ביולוגית טובה יותר, רעילות נמוכה יותר עם פגיעה בכבד מופחתת, וסינרגיזם גבוה בטיפול נגד גידולים20e23. זה מספק חלופות מבטיחות לפיתוח ננו-אימונוסטימולנטים זמינים קלינית לתרגום עבור אימונותרפיה סינרגטית. עם זאת, הליפופיליות החזקה יותר בדרך כלל של NSMs אלה הובילה לאנדוציטוזיס תאית לא יעיל, שהחלישה את הפעילות האנטי-סרטנית שלהם והגבילה את ערכם הקליני לטיפול בסרטן24. בדומה לננו-מרוכבים המדווחים בדרך כלל, הפורמולציות הננו-מתאים של NSMs קידמו ספיגה תאית כדי לשפר את ההשפעות הכימותרפיות, אך גם הגדילו בטעות את הסיכון לציטוטוקסיות לא ספציפית לתאים נורמליים22. לכן, כדאי לחשוב לעומק על איך למקסם את היעילות האנטי-סרטנית של ננו-סוכנים טרפנואידים NSM תוך מזעור הרעילות שלו לרקמה רגילה כעל נושא מכריע בתהליך האימונותרפיה הסינרגטית.

יתרונות cistanche לגברים - מחזקים את המערכת החיסונית

אסטרטגיות פרו-תרופתיות יושמו בהרחבה כדי לשפר את ספיגת התאים של מולקולות קטנות ליפופיליות על ידי הגברת ההידרופיליות25. בדרך כלל, לתרופות אמפיפיליות יש יעילות קליטה תאית גבוהה יותר מאשר תרופות הידרופיליות או ליפופיליות26. ככל שהפגוציטוזה התאית גבוהה יותר, כך היעילות הטיפולית טובה יותר24. לפיכך, פיתוח מולקולות פרו-תרופתיות טרפנואידיות אמפיפיליות טרפנואידיות עשויות להיות שיטה פוטנציאלית למקסום ההשפעות הטיפוליות שלהן. בנוסף, ננו-תרופות המגיבות לגירויים למיקרו-סביבת הגידול הספציפית (למשל, חומצה, תגובת חיזור) מבטיחות הבטחה רבה לשליטה בשחרור תרופות, דבר שהוא יתרון בדיכוי הציטוטוקסיות של התרופות הכימותרפיות27,28. בינתיים, שילוב על-מולקולרי (למשל, גישת משקעים חוזרים) הייתה אסטרטגיה יעילה להכנת ננו-תרופות נטולות נשא מסיסות במים ביותר22,29, אשר ניתן היה לצפות להקטין מעט את יעילות הפאגוציטוזיס של NSMs אמפיפיליים, ובכך להחליש מראש שלהם. ציטוטוקסיות מעוצבת. אנו משערים כי ננו-תרופות מגיבות לגירויים והידרופיליות לחלוטין הוקמו עוד יותר על בסיס אמפיפיליים NSMs pro-drug ויכולות לדכא ביעילות את הציטוטוקסיות הלא ספציפית שלה לתאים נורמליים תוך גירוי שחרור NSMs אמפיפיליים רעילים מאוד לתאי הגידול, מה שמקל על תרדמתם ברקמות נורמליות. הפעלה באתר הגידול. חשוב לבחור את המבשר המתאים במים ומגיב לגירויים כדי לשנות NSMs טרפנואידים כדי להכין מולקולות פרו-תרופות אמפיפיליות. במשך שנים, לאוליגוסכרידים של Chitosan (COS), כמוצרים המפורקים של Chitosan, יש לא רק מסיסות מים טובה וקבוצות eOH oreNH2 בשפע שמובילות לתגובת pH טובה, אלא גם בעלי פעילות אנטי-גידולית מועילה על ידי שיפור התפקוד החיסוני של המארח באמצעות ויסות הפעילות. של תאי חיסון כגון מקרופאגים מונוציטים ולימפוציטים30,31. אלה מבטיחים את האפשרות העצומה של בניית מטרה ננו-אימונוסטימולנטי המגיבים לגירויים עבור אימונותרפיה סינרגטית.

כאן, בהתבסס על השיקולים לעיל, בתכנון הניסוי שלנו, NSMs triterpene pentacyclic של חומצה betulinic (BA) משמשת כחומר אנטי-סרטני חזק32, COS הוצג כדי לסנתז מולקולת COS-BA אמפיפילית כדי לשפר את ההשפעה הכימותרפית. Chlorin e6 (Ce6), גורם פוטו-רגיש בשימוש נרחב עם רעילות נמוכה מאוד/ללא כהה33, שימש לבניית פרו-תרופת COS-BA/Ce6 NPs נטולת נשא מסיס לחלוטין, ללא רגישות לאור, תוך שימוש באסטרטגיית הרכבה משותפת ישירה. COS-BA/Ce6 NPs שילבו שני שיטות טיפוליות, כימותרפיה וטיפול פוטודינמי (PDT), שיכולים להגביר ביעילות את הצגת אנטיגנים שמקורם בגידול לתאי T, וליצור תגובות אימונולוגיות חזקות בסיוע אדג'ובנט חיסוני אנטי-PD-L1 לגרום לכימותרפיה אנטי-גידולית/PDT/אימונותרפיה יעילה וסינרגטית במיוחד (סכמה 1). ה-COS-BA/Ce6 NPs המהונדסים הראו פונקציית תרדמה חכמה עם השפעות כימותרפיות ערמומיות, כלומר, NPs שהורכבו יחד ללא קרינה הראו ציטוטוקסיות מעוכבת בצורה יוצאת דופן במבחנה בהשוואה ל-COS-BA אמפיפילי, בין אם נגד סרטן או תאים נורמליים. מייחס להתנהגות הייחודית המגיבה ל-pH, הוא מבצע רעילות נמוכה ובטיחות ביולוגית לרקמה רגילה in vivo, אך הוא רעיל מאוד לרקמת הגידול עקב שחרור מגרה של COS-BA היפראקטיבי במיקרו-סביבה של גידול חומצי חלש34. למיטב ידיעתנו, נכון לעכשיו, תרופות הננו המעוצבות המכילות את פונקציית התרדמה הכימותרפית הזו עדיין מדווחות לעתים רחוקות. בינתיים, לננו-תרופה יש מספר מאפיינים טיפוליים חיוביים כמו שיפור יצירת 1 O2 על ידי הפחתת פער האנרגיה (DEST) של Ce6, חילוף חומרים ביולוגי מהיר והצטברות גידול משופרת, מה שהוביל לשילוב יעיל ובטוח נגד גידולים של כימותרפיה וטיפול PDT. חשוב מכך, גם כימותרפיה מבוססת NP וגם מערכות כימותרפיה/PDT יכולות להפעיל ביעילות חסינות אנטי-גידולית על ידי הקלה על התפשטות תאי TNF-a ו-IFN-g המייצרים CD8þ T בגידולים ראשוניים או מרוחקים. הננו-תרופה הפוטו-כימותרפית המוצעת המתכלה, תואמת ביולוגית, רדומה באופן ייחודי, בטוחה ויעילה במיוחד, משיגה תגובות טיפוליות מערכתיות מערכתיות משמעותיות, ופותחת אפשרויות אטרקטיביות ליישום קליני בטיפול בסרטן מרוחק או גרורתי.

סכימה 1 PDT וכימותרפיה של COS-BA/Ce6 NPs מורכבים משותפת הגדילו את אנטי-PD-L1 כדי לגרום לטיפול אימונותרפי סיסטמי נגד גידולים. ההחדרה של COS מסיס במים יכולה לשפר ביעילות את הפעילות הכימותרפית של BA (מתוארת כחצי חרב), וכתוצאה מכך נוצרת פרו-תרופה אמפיפילית COS-BA היפראקטיבית (חרב ארוכה). בהרכבה משותפת עם פוטוסנסייזר Ce6 (נדן), למכלולי הננו בעלי המבנה של הקליפה וה-PH היו פונקציית "רדמה" חכמה וייחודית עם רעילות כימותרפית מעוכבת לרקמות תקינות. אבל ברגע שהיא הגיעה וגוררה על ידי המיקרו-סביבה הגידולית החומצית (Hþ), תשוחרר הפר-תרופה האמפיפילית הפעילה מאוד COS-BA שתגרום לכימותרפיה משמעותית. בנוסף, המכלולים המשותפים הפגינו פעילות PDT מצוינת עם יצירת חמצן בודד (1 O2) משופרת שנגרמה על ידי פער האנרגיה המופחת בין המצבים המעורבים של סינגל וטריפלט (DEST) של Ce6. בשילוב עם חסימת מחסום אנטי-PD-L1, שחרור אנטיגנים הקשורים לגידול לאחר טיפול כימותרפי/PDT יכול להפעיל ביעילות תגובה חיסונית אנטי-גידולית מערכתית עבור אימונותרפיה מרוחקת של סרטן.

2. חומרים ושיטות

2.1. סינתזה של COS-BA

חומצה בטולינית (40 מ"ג, 0.1 מ"ג), EDC (38 מ"ג, 0.2 ממול) ו-NHS (17 מ"ג, 0.15 מ"ג ) הומסו ב-3 מ"ל של N,N-dimethylformamide (DMF). לאחר ערבוב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, 96 מ"ג של תמיסת מי COS (1 מ"ל) הוספו בעדינות טיפה לתערובת וערבבו במשך 24 שעות. לאחר מכן תערובת התגובה דוללה ב-CH2Cl2, וחולצה שוב ושוב. שכבת CH2Cl2 התאדה וטיהרה על עמודת סיליקה ג'ל. ה-BA שלא הגיב הוסר תחילה באמצעות אתר נפט: אצטון (5:1, v/v) כמפלט, ולאחר מכן שונה ל-3:1 כדי להניב COS-BA לבן (תשואה: 42%), כאשר COS זוהה כדימר ( n Z 2). 1 H NMR (40{{70}} MHz, CDCl3) d: 8.98 (1H, s, BA-28 O] CeNH), 4.73 (1H, s, H -29a), 4.60 (1H, s, H-29b), 3.18 (1H, dd, JZ 4.8, 10.8 Hz, H-3), 2.95e3.93 (8H, m, COS), 2.64 (3H, s, CH3eCOS), 0.76 (3H, s, H-24), 0.83 (3H, s, H-25), 0.90 (3H, s, H{ {69}}), 0.97 (3H, s, H-26), 0.98 (3H, s, H-27), 1.70 (3H, s, H-30). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) d: 179.18 (CO, COS), 156.43 (C- 28), 150.97 (C-20), 109.03 (C-29), 78.74, 77.04 , 69.32, 69.22, 65.25, 58.14, 55.62, 55.21, 53.65, 53.22, 50.52, 45.96, 44.32. 04, 36.39, 35.31, 34.21, 31.81, 31.54, 31.17, 30.28 , 29.09, 27.80, 27.22, 25.74, 25.53, 20.91, 19.48, 18.12, 16.02, 15.87, 15.17, 14.65, 14.62. ESIeMS m/z: 814.5871 [M‒6H] (C44H72N2O12).

2.2. הכנת NPs COS-BA/Ce6

NPs COS-BA/Ce6 בהרכבה משותפת הוכנו בשיטת משקעים חוזרים בשלב אחד. בדרך כלל, 5 מ"ל של Ce6 (33 mmol/L) ו-40 מ"ל של COS-BA (33 mmol/L) DMSO תמיסות ערבבו תחילה. לאחר מכן, התערובת הוזרקה במהירות ל-1 מ"ל מים המכילים 10 מ"ל של NaOH (50 מ"ל/ליטר) בבדיקת אולטרסאונד (KQ-250E, ShuMei, Kunshan, סין). לאחר סוניציה למשך 10 דקות, ה-COS-BA/Ce6 NPs הושגו באמצעות צנטריפוגה ב-13,000 סל"ד (TGL-16G, Xiangyi, Changsha, סין) למשך 25 דקות. פורמולציות אחרות עם יחסים שונים של COS-BA ל-Ce6 הוכנו באותו הליך עם יחס מולרי קבוע של NaOH ל-Ce6 של 3:1.

2.3. קוי טלפון

קווי תאים מסוג MCF-7, HepG2, LO2 ועכבר 4T1, L929 מסופקים על ידי המכון לביוכימיה וביולוגיה של התא, SIBS, CAS (סין). MCF-7, HepG2 ו-LO2 תורבו במדיום DMEM עם 10% סרום בקר עוברי (FBS, Gibco) ו-1% אנטיביוטיקה פניצילין-סטרפטומיצין (Life Technology, ארה"ב) ב-37 C. 4T1 ו-L929 תורבו ב בינוני RMPI-1640 עם אותו יחס כמו לעיל.

2.4. מחקרים על קליטה סלולרית ומסלולים אנדוציטיים

לצורך בדיקה של קליטה תאית, תאי 4T1 או LO2 הודגרו עם Ce6 או COS-BA/Ce6 NPs חופשיים (ריכוז שווה ערך של Ce6: 1.7 מ"ג/מ"ל, COS-BA: 19.5 מ"ג/מ"ל, BA: 10 .8 מ"ג/מ"ל) לזמנים שונים. לאחר שטיפה, תיקון וצביעת DIPA (#D9542, Sigma), התאים צולמו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך (FIM) (DSY-2000X, UP Optotech, Changchun, סין). עוצמת הקרינה נקבעה באמצעות ציטומטריית זרימה באמצעות מערכת המיני Guava EasyCyte (Merck Millipore, גרמניה). לצורך כימות של יעילות הספיגה, הצטברות התא של BA ו-COS-BA נמדדה באמצעות HPLC (Agilent 1200, ארה"ב). בדרך כלל, תאי 4T1 טופלו עם COS-BA חופשי או BA (BA שווה ערך: 25 מ"ג/מ"ל) במשך 0.5 ו-3 שעות. לאחר שטיפה עם PBS, כדורי התאים נקצרו ועברו הומוגניזציה אולטרה-סונית (JY92-IIN, Scientz Biotechnology, Ningbo, China) לתמוגגת תאים. לאחר מכן, COS-BA או BA חולצו על ידי כלורופורם לניתוח HPLC לאחר ליאופיליזציה של הדגימות. השלב הנייד היה מים (0.2% חומצה זרחתית) ואצטוניטריל בקצב זרימה של 1.0 מ"ל לדקה, ויחסי נפח מתאימים היו 60:40 ו-15:85 (V/V) לניתוח של COS-BA ו-BA, בהתאמה. . אורך הגל לזיהוי היה 213 ננומטר. לחקירה של מסלולים אנדוציטיים של COS-BA/Ce6 NPs, תאי 4T1 נזרעו ב6-צלחות באר והודגרו במשך 24 שעות לפני טיפול מקדים במעכבי אנדוציטוזיס שונים למשך 30 דקות, כולל מעכב מיקרופינוציטוזיס [50 mmol/L , ethyl isopropyl amiloride (EIPA) (#N132356, Aladdin)], מעכב אנדוציטוזיס בתיווך קלתרין [20 mmol/L, chlorpromazine (#C7010, Solarbio)], מעכב אנדוציטוזיס מתווך caveolae [25 mmol/L, nystatin ( #IN0260, Solarbio)], ומעכבי חומצה ליזוזום [50 mmol/L, chloroquine phosphate (#C9720, Solarbio)]35. לאחר מכן, התאים הותרבו עוד יותר עם 2 מ"ל של COS-BA/Ce6 NPs (Ce6: 1.7 מ"ג/מ"ל, COS-BA: 19.5 מ"ג/מ"ל) למשך שעתיים והצטלמו תחת FIM (UP Optotech). התאים שהודגרו ללא מעכב אנדוציטי ב-37 C נקבעו כשליטה ובדגירה בטמפרטורה נמוכה (4 C) להערכת האנדוציטוזיס התלוי באנרגיה. בינתיים, עוצמת הקרינה הממוצעת של תאים נקבעה גם על ידי ציטומטריית זרימה.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Enhance Immunity

【בקש עוד】 דוא"ל:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. בדיקת ציטוטוקסיות

תאי 4T1 נזרעו בצלחת 96-באר. לאחר מכן התאים טופלו בריכוזים שונים של COS-BA NPs במשך 24 שעות. לאחר מכן, 10 מ"ל של צבע MTT (#M158055, אלאדין) (5 מ"ג/מ"ל) נוספו לבאר והודגרו במשך 4 שעות נוספות, ולאחר מכן נוספו 150 מ"ל של DMSO כדי להמיס את גבישי הפורמזן . הספיגה של כל באר ב-492 ננומטר תועדה על ידי קורא מיקרו-לוחות. עבור קבוצת ההקרנה, התאים טופלו בתרופות במשך 4 שעות, ולאחר מכן הוקרנו במשך 10 דקות באור 675  10 ננומטר והודגרו למשך 20 שעות נוספות. הציטוטוקסיות של COS-BA/Ce6 NPs (1 מ"ג/מ"ל של Ce6 מתאים ל-11.5 מ"ג/מ"ל COS-BA ו-6.4 מ"ג/מ"ל BA) כנגד תאים אחרים (MCF-7, HepG2, LO2 ו-L929) נקבעו גם על ידי אותו מבחן MTT רק עם מדיום אחר. בינתיים, מדד השילוב חושב על ידי התוכנה CompuSyn 2.0 באמצעות חישוב משפט Chou Talalay36.

2.6. דוגמניות של בעלי חיים

כל ההליכים הניסויים בוצעו על פי הפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של חרבין. תאי 4T1 הושעו במדיום RMPI-1640 והוזרקו תת עורית לחלק האחורי הימני של כל עכבר BALB/c נקבה (18e22 גרם, 6e7 שבועות).

2.7. הדמיית פלואורסצנטי In/ex vivo

200 מ"ל של תמיסת COS-BA/Ce6 NPs 5% גלוקוז (שווה ערך ל-Ce6: 0.35 מ"ג/מ"ל, COS-BA: 4.02 מ"ג/מ"ל) הוזרק דרך וריד הזנב לעכברים נושאי גידול. לאחר מכן, בוצעה הדמיית פלואורסצנציה של אתרי גידול בזמן שנקבע מראש באמצעות מערכת הדמיה של בעלי חיים רב-מודלים מסוג AniView 100/600 (Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., סין) עם עירור ב-630 ננומטר. לאחר 24 שעות לאחר ההזרקה, האיברים העיקריים (לב, כבד, טחול, ריאה וכליות) והגידול נאספו לצורך הדמיית פלואורסצנטי לשעבר. בנוסף, הוערכו גם תמונות הקרינה של גידולים ואיברים מרכזיים בזמנים שונים לאחר הזרקות iv של Ce6 או COS-BA/Ce6 NPs.

2.8. כימותרפיה/PDT in vivo

4T1-עכברים הנושאים (75e100 mm3) מחולקים באופן אקראי לשש קבוצות (n Z 5): 1) תמיסה של 5% גלוקוז; 2) Ce6; 3) Ce6 עם הקרנה; 4) COS-BA (40.2 מ"ג/ק"ג, כאשר BA: 22.3 מ"ג/ק"ג); 5) COS-BA/Ce6 NPs; 6) COS-BA/Ce6 NPs עם הקרנה. עבור כל קבוצה, לעכברים מוזרקים 200 מ"ל של COS-BA/Ce6 NPs (שווה ערך ל-Ce6: 3.5 מ"ג/ק"ג של הגוף) דרך וריד הזנב בימים 0, 2 ו-4. עבור קבוצות ההקרנה, ב-4 שעות לאחר ההזרקה לאחר כל מתן, כל העכברים הורדמו עם איזופלורן, ואתרי הגידול הוקרנו באור 675  10 ננומטר (150 mW/cm2) למשך 15 דקות. נפחי הגידול ומשקל הגוף של עכברים מתועדים גם כל יומיים. נפחי הגידול מחושבים לפי הנוסחה: VZ width2 length/2. לאחר 14 ימי טיפול, הגידולים נכרתו ושקללו כדי לחשב את יחס עיכוב הגידול (TIR) ​​לפי המשוואה הנפוצה: TIRZ (1 דגימה/ביקורת) 100%. כאשר המדגם והביקורת היו משקל הגידול הממוצע של כל קבוצה שטופלה וקבוצת תמיסה מימית של 5% גלוקוז, בהתאמה.

2.9. כימותרפיה/PDT/אימונותרפיה in vivo

כדי להדגים את הפוטנציאל של COS-BA/Ce6 NPs בשילוב עם אימונותרפיה, מודל הגידול הדו-צדדי תוכנן באמצעות הזרקה תת-עורית של תאי 4T1 לאיפי השמאלי והימין. כאשר הגידולים התקרבו ל-75e100 mm3, העכברים חולקו לחמש קבוצות. (1) שליטה; (2) COS-BA/Ce6 NPs (COS-BA Z 40.2 מ"ג/ק"ג, כאשר BA Z 22.3 מ"ג/ק"ג); (3) COS-BA/Ce6 NPs þ אור; (4) COS-BA/Ce6 NPs þ anti-PDL1; (5) COS-BA/Ce6 NPs þ anti-PD-L1 þ אור. ביום 0, 200 מ"ל של תמיסה של 5% גלוקוז (קבוצה 1) או COS-BA/Ce6 NPs (Ce6 Z 3.5 מ"ג/ק"ג) (קבוצה 2, 3, 4, 5) הוזרקו לעכברים. לאחר 4 שעות לאחר ההזרקה, הגידולים הנכונים של קבוצות 3 ו-4 הוקרנו במשך 15 דקות. העכברים הורדמו עם איזופלורן וגלגלו על צד אחד כדי להימנע מחשיפת הגידולים השמאליים. לאחר מכן הוזרק נוגדן אנטי-PD-L1 (BioXcell, מספר מוצר: BE0101, מספר שיבוט: 10F.9G2) לעכברים עבור קבוצות 4 ו-5 בימים 2, 4 ו-6 (15 מ"ג לכל עכבר לכל זריקה). האורך והרוחב של כל גידול נבדקו כל יומיים. לאחר 14 ימי טיפול, סרום הדם של עכברים נאסף כדי להעריך אינטרפרון-גמא (IFN-g) (#KMC4021) וגורם נמק גידול (TNF-a) (#BMS607-3) באמצעות מבחן ELISA (eBioscience) ). הגידולים נאספו, ניתקו, טופלו במאגר תמוגה של תאי דם אדומים, ונשטפו עם PBS על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, ההשעיה התא הוכתמה באנטי-CD3-FITC (#MA1-10187, שיבוט 145-2C11, eBioscience) ואנטי-CD8a-PE (#12-0081-85, שיבוט 53-6.7, eBioscience). לאחר מכן, חדירת לימפוציט T ציטוטוקסי (CTL) בגידולים הימניים והשמאליים לאחר טיפולים שונים הוערכה על ידי ציטומטריית זרימה.

3. תוצאות ודיון

3.1. סינתזה, ייצור ואפיון של NPs COS-BA/Ce6

במחקר זה, אנו מתכננים מולקולת פרו-תרופתית קטנה COS-BA המבוססת על Chitosan אוליגוסכריד מסיס במים (COS), אשר עשויה להעלות את הפעילות הכימותרפית של חומצה פנטציקלית triterpene betulinic (BA) על ידי שיפור ספיגת התא באמצעות הגברת הידרופיליות. COS (דרגת פילמור, DP: 2e6) המופעלת כאן הוכנה בשיטה שתוארה קודם לכן30. לאחר מכן, ה-COS-BA סונתז באמצעות תגובת עיבוי של התייבשות. בשילוב עם ניתוח הרכיבים העיקרי של COS, המבנה הכימי של COS-BA נחשב לדיסכריד (DP:2) שונה BA (תמונה תומך איור S1), אשר אושר על ידי 1 H NMR, 13C NMR ו- ESIeMS (איור מידע תומך. S2eS4). ניתוח של 1 H NMR הנציג הראה את אות הפרוטונים המובהק של COS סביב 2.64e3.93 ppm ו-C]CH2 פסגות (4.60, 4.73 ppm) של BA, מה שהדגים את הסינתזה המוצלחת של COS-BA (איור 1A). להכנת המגיב הסינרגיסטי האנטי-גידולי COS-BA/Ce6 NPs, הופעלה גישת משקעים חוזרת רב-תכליתית על ידי שיתוף פעולה עם גורם פוטוסנסיטיזר יעיל במיוחד Ce6. על ידי שינוי היחסים המולאריים הראשוניים, שני ניסוחי ההרכבה המשותפת של COS-BA/Ce6 יכולים ליצור ננו-מבנים כדוריים עם גדלים מאופננים (איור 1B ומידע תומך איור S5). על פני יחסי קלט שונים של COS-BA/Ce6, הקוטרים ההידרופיליים של NPs COS-BA/Ce6 היו קרובים ל-200e300 ננומטר עם פוטנציאל z שלילי. בהתחשב בכך ש-NPs שהוכנו בפורמולציה של 8:1 הראו אינדקס polydispersity נמוך יותר (PDI, 0.143) עם גודל קטן יחסית (249 ננומטר), נדרשה גם כמות מספקת של חומר כימותרפי COS-BA לטיפול המשולב. לכן, בחרנו את הניסוחים של COS-BA/Ce6 (8:1) עבור המחקר הבא. תחת אופטימיזציה זו, COS-BA/Ce6 NPs הפגינו התפלגויות גודל צרות (איור 1C) ומסיסות מים טובה, מה שמעיד על אופיו הקולואידי (איור 1D). כדי לחקור את הסיבות מאחורי הרכבה משותפת מוצלחת זו, נחקרה התנהגות ההרכבה העצמית העיקרית של COS-BA חופשית באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת (SEM) (איור 1E), שהציעה ש-COS-BA יכול ליצור ננו-אחיד מאוד כדור של w168 ננומטר, מה שמרמז שהשינוי הכימי של COS אינו משנה את יכולת ההרכבה העצמית של BA עצמו (מידע תומך איור S6). הנכס הוא זה שגורם בסופו של דבר לבנייה מוצלחת של המכלולים המשותפים. יש לציין, מלבד הננו-מבנה המוצק שאושר על ידי מיקרוסקופיה אלקטרונית העברה (TEM), NPs COS-BA/Ce6 הראו NPs של COS-BA ללא מבנה קליפה, ועובי המעטפת הממוצע היה כ-2.35 ננומטר. האפיון הפיזי-כימי האחר מסוכם באיור 1F. חוץ מזה, COS-BA/Ce6 NPs הראו פוטנציאל z שלילי של 5.38 mV וגודל הידרודינמי של w249 nm, גבוה מזה שהתקבל מ-SEM (w182 nm). במקביל, היעילות של טעינת Ce6 והקפסולציה הייתה 8.1 ו-96%, בהתאמה, כפי שנקבע על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC). כמו כן, נתוני FT-IR (איור 1G) אישרו עוד יותר את ההרכבה המשותפת הזו מכיוון ש-COS-BA/Ce6 NPs הציגו את פסגות C]N, CeN ו-C]CH האופייניות של Ce6 המופיעות ב-1633, 1078 ו-633 cm 1 , בהתאמה.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

3.2. מנגנון בהרכבה משותפת ויצירת מבנה המעטפת

לאחר מכן, כדי להבין טוב יותר את מנגנון ההרכבה המשותפת, חקרנו תחילה את תהליך ההיווצרות העיקרי של NPs. מצאנו שההרכבה המשותפת של COS-BA עם Ce6 עשויה להיות ספונטנית מכיוון ששני המינים הללו יכולים גם ליצור ננו-מבנה כדורי גם אם ללא קול (Supporting Information Fig. S7), מה שעשוי לנבוע משינוי האנרגיה החופשית של Gibbs השלילי (DG ) בהרכבות משותפים37. הרכבה ספונטנית זו הציעה גם אינטראקציה בין-מולקולרית חזקה יותר בין COS-BA ו-Ce6. באופן כללי, האינטראקציות הבין-מולקולריות במכלולים עצמיים על-מולקולריים (או קו-מולקולריים) הן ערימת p‒p לא קוולנטית, קשרי מימן וכוחות ואן דר ואלס 38,39. לצורך ניתוח זה, חקרנו לאחר מכן את ספיגת ה-UV של NPs COS-BA/Ce6 (איור 1H ו-F), מה שהציע פסים של Soret (410 ננומטר) ו-Qy (667 ננומטר) בשינוי אדום Ce6 חופשי (405 ו-665 ננומטר, בהתאמה). בינתיים, ניתן למצוא גם את הספיגה האופיינית המוסטת באדום של COS-BA, מה שמצביע על ערימת pp בין-מולקולרית אפשרית בין COS-BA ל-Ce640. יתרה מכך, לאחר דגירה עם חומר השטח פעיל השטח סודיום דודציל סולפט (SDS, 0.2% w/v) (תמונה תומך איור S8), COS-BA/Ce6 NPs הראו פס Qy שהשתנה כחולה לאחרונה ב-641 ננומטר והתאוששה בצורה דרמטית את הקרינה, מה שמוכיח. שגם האינטראקציות ההידרופוביות תרמו להרכבה המשותפת28. מאז אינטראקציות לא-קוולנטיות אסוציאטיביות אלה, הרכבות משותפות הראו כיבוי הקרינה יוצא דופן (98.2%) במים (איור 1I). באופן קולקטיבי, סביר להאמין ש-p‒p-stacking ואינטראקציות הידרופוביות עשויות להיות הכוחות המניעים העיקריים לבניית מכלולים משותפים. לאחר מכן, כדי להמחיש יותר את תהליך ההרכבה בצורה אינטואיטיבית יותר ולחשוף את הסיבות הבסיסיות לכך ש-NPs בנוי מעטפת יכולים להיווצר, ביצענו מודל סימולציה של דינמיקה מולקולרית (MD) פשוטה המכיל 16 מולקולות COS-BA אופטימליות ושתי Ce6 נוספות בקופסת מים . בתחילה, הערכנו את האינטראקציה/הכריכה האפשרית של הרכבות עצמיות של COS-BA בתוך 5 ns מזמן סימולציה (איור 2A ומידע תומך איור S9). מצאנו שלמעט קשרי מימן תוך-מולקולריים רבים בשבריר COS, ניתן היה לצפות גם בכמה זוגות של קשרי H בין-מולקולריים בין COS-BA (איור 2B ומידע תומך איור S10), שהצביעו על כך שקשר מימן עשוי להיות אחד של הכוחות המניעים העיקריים להיווצרות של COS-BA NPs. מעניין במיוחד, בהרכבות עצמיות של COS-BA, כל מולקולות COS-BA יוצרות מבנה סימטרי לכאורה (איור 2C). תופעה מרתקת זו הניעה אותנו לחקור את הקשר האפשרי בין תכונה זו לבין היווצרות של COSBA NPs במבנה של מעטפת. לאחר מכן, ניסינו להרחיב את יחידות התיבה. באופן מפתיע, הקופסאות המחוברות המורכבות ממולקולות COS-BA היו מסודרות באופן קבוע וכתוצאה מכך נוצרו מבני רשת חלולים "אורתוגונליים" (תמונה תומכת באיור S11). חשוב מכך, חישבנו באופן אקראי את עובי מולקולות הקליפה ומצאנו שהן תואמות ל-TEM (w2.35 ננומטר) (איור 2D). נטייה זו ליצור מבני רשת חלולים עשויה להיות אחראית להיווצרות של NPs במבנה מעטפת. כדי לבחון רעיון זה, מבנה ה-MD של רכיבים משותפים של COS-BA/Ce6 בוצע הדמיה (איור 2E ומידע תומך איור S12). בדומה למכלולים עצמיים של COS-BA, נמצאו גם מספר רב של קשרי H תוך מולקולריים ואינטרמולקולריים במכלולים המשותפים (איור 2F ומידע תומך איור S13). בנוסף, ערימת ה-pp האפשרית בין C]C של COS-BA והטבעת הארומטית של Ce6 נצפתה במכלולים המשותפים (איור 2G), מה שעולה בקנה אחד עם הנתונים מחקירות UV קודמות. לאחר הרחבת מספר הקופסאות, עדיין ניתן למצוא מבני רשת חלולים דומים, רק עם סדירות ואורתוגונליות מופחתת (מידע תומך איור S14). זו עשויה להיות הסיבה האפשרית למורפולוגיה הלא אחידה של COS-BA/Ce6 NPs בהשוואה ל-COSBA NPs. יתר על כן, המרחק המולקולרי-שכבת מעטפת קרוב גם לעובי הקליפה (w2.35 ננומטר) של NPs כפי שניתן לראות באמצעות TEM (איור 2H). באופן קולקטיבי, שיערנו כי היווצרותם של COS-BA/Ce6 NPs מובנים או COS-BA NPs עשויה להיות מיוחסת במידה רבה לנטייה זו של מולקולות להתאסף למבני רשת מעטפת חלולים.

איור 1 איור 1 ייצור ואפיון של חומצה בטולינית (COS-BA) עם ננו-מכלולים COS-BA/Ce6 NPs בתיווך פרו-תרופות. (א) עמדות המפתח המוגברות של 1 H NMR של COS-BA. (ב) הכנת NPs COS-BA/Ce6 בהרכבה משותפת עם יחסי COS-BA/Ce6 שונים. (ג) התפלגות גודל של COS-BA/Ce6 NPs באמצעות COS-BA ו-Ce6 (יחס מולארי, 8:1) כאבני בניין. (ד) מסיסות המים ואפקט Tyndall של הרכבים משותפים, מצביעים על אופי קולואידי. (ה) תמונות SEM ו-TEM של הרכבות עצמיות של COS-BA בחינם ו-COS-BA/Ce6 NPs בהרכבה משותפת. (ו) סיכום של תכונות פיזיוכימיות של COS-BA/Ce6 NPs. (G) ספקטרום FT-IR, (H) ספקטרום UV Vis ו-(I) ספקטרום פליטת הקרינה של Ce6 חופשי, COS-BA ו-COS-BA/Ce6 NPs מורכבים במים.

איור 2 מבנים של (A) מכלול עצמי של COS-BA ו-(E) COS-BA/Ce6 NPs מורכבים לאחר הדמיית דינמיקה מולקולרית (MD) למשך 5 ns עם יחס מולרי יחידה מבני של 8:1 (COS-BA /Ce6, מחושב על סמך יעילות טעינת Ce6). מודל הקו שימש עבור H2O ודגמי המקל מייצגים מולקולות COS-BA או Ce6, כאשר אטומי ה-C של Ce6 מסומנים בסגול. המידע על קשרי המימן בין מולקולות COS-BA ב-(B) המכלולים העצמיים שלה ו-(F) בהרכבים המשותפים של COS-BA/Ce6 NPs. (ג) המבנה הסימטרי לכאורה של הסידור המולקולרי COS-BA לאחר הדמיית MD. (ז) אינטראקציות מולקולריות אפשריות בין COS-BA ו-Ce6 מציגות ערימת pp פוטנציאלית. העובי המצוין של מולקולות המעטפת במבנה רשת חלול "אורתוגונלי" לאחר הארכת קופסאות MD תואמות של (D) מכלולים עצמיים חופשיים של COSBA ו- (H) מכלולים משותפים של COS-BA/Ce6 NPs.

3.3. מנגנון אנרגיה של יצירת O2 משופרת

לאחר מכן, בחנו עוד יותר את יצירת חמצן יחיד (1 O2), אחד ממיני החמצן התגובתי הקריטיים (ROS) של ביצועי PDT באמצעות DPBF (1,3-diphenylisobenzofuran) כבדיקה. לאחר הקרנה מתמשכת של תמיסות התערובת של COS-BA/Ce6 NPs עם DPBF, ספיגת ה-UV של DPBF ירדה בעוצמתה, מה שמעיד על יצירת O2 1 (איור 3A). לאחר השוואה עם ההתייחסות של מתילן כחול (MB), ה-F (1 O2) של COS-BA/Ce6 NPs חושב כ-0.26, מעט גבוה יותר מ-Ce6 חופשי (FZ0.19) (איור 3B). בדרך כלל, האנרגיה הנספגת על ידי חומרי רגישות פוטו תעבור שלושה מסלולי הרפיה הכוללים פלואורסצנטיות, אפקט חימום באמצעות הרפיית רטט ויצירת ROS דרך מעבר בין-מערכתי (ISC)41. בהתאם לפליטת הקרינה המרוווה באופן משמעותי, COS-BA/Ce6 NPs גם לא קידמו שום אפקט חימום במים (מידע תומך איור S15), מה שמרמז על תהליך ISC משופר לאחר הרכבה משותפת של Ce6 עם COS-BA, ובכך הוביל לדור 1 O2 המשופר. כדי להבהיר עוד יותר את המנגנון המולקולרי של השפעה כזו, ניסינו לייעל ולחשב את המודל החד-מולקולה האפשרי של COS-BA/Ce6 המורכב מערימה פוטנציאלית של pp המתקבלת מהדמיית MD על ידי תיאוריית פונקציונליות צפיפות (DFT) (איור 3C) . למרבה הפלא, COS-BA/Ce6 הראה קליטת UV המוזזת באדום של 581.24 ננומטר מזו של Ce6 חופשי (579.30 ננומטר), מה שמצביע על התרחשות של ערימת pp (איור 3D). למרות שהגיאומטריה הממוזערת באנרגיה של COS-BA/Ce6 הראתה הבדלים מבניים קלים עם תצורת ה-MD המוזמנת, עדיין ניתן היה להבחין ב-pstacking הייחודי בין קשרי C]C או C]O של COS-BA עם טבעת הפורפין של Ce6, מה שמאשר עוד יותר כי לערום p‒p אפשרית. בינתיים, לאחרונה הוכח שהיעילות המוגברת של תרומת אלקטרונים על ידי ערימת p‒p יכולה להקל על תהליך ISC42, בעוד שקצב ISC (KISC) הוא פרופורציונלי ל-(1/DEST) 2,43. כלומר, פער האנרגיה הנמוך יותר (DEST) של הפוטוסנסיטיזר ישפר את תהליך ה-ISC ויקדם יצירת ROS יעילה. לאחר מכן אנו מחשבים את מצב הסינגלט הנרגש הנמוך ביותר (S1) ומצב הטריפלט (T1) של Ce6 ו- COS-BA/Ce6 (איור 3E), בהתאמה. התוצאות הצביעו על כך ש-COS-BA/Ce6 הראה ירידה ב-DEST של 1.1892 eV בהשוואה ל-Ce6 חופשי (1.2001 eV), המאשר את תהליך ה-ISC המשופר. הפחתת ה-DEST מועילה לייצור 1 O2, אשר אומת גם בננו-פוטוסנסייטיזרים אחרים44. ביחד, נראה ש-p-stacking מפחית את ה-DEST של Ce6 לאחר הרכבה משותפת עם COS-BA, ובכך מוביל לשיפור 1 O2.

איור 3 מנגנון אנרגיה של שיפור יצירת 1 O2 המושרה על ידי COS-BA/Ce6 NPs. (א) ספקטרום UV Vis של פירוק צילום של 1,3-diphenylisobenzofuran (DPBF) לאחר הקרנה ממושכת של COS-BA/Ce6 NPs. (ב) בחלקות הסדר הראשון של שינויים בספיגת UV DPBF (DOD), התשואה של 1 O2 הוערכה באמצעות מתילן כחול (MB) (FZ 0.52) ב-DMSO כתרכובת הייחוס. (ג) מבנים ממוזערים באנרגיה של מודל COS-BA/Ce6 אפשרי חד מולקולה במבט מהצד והחזית, שהתקבל על פי התצורה המולקולרית הראשונית בין Ce6 עם COS-BA לאחר הדמיית MD ובעקבות חישובי DFT. (ד) מעברי ספקטרום ספיגת UV Vis חזויים (פסים אנכיים) של Ce6 חופשי ומודל COS-BA/Ce6 מותאם. (ה) רמות האנרגיה המחושבות של מצב הסינגלט הנרגש הנמוך ביותר שלהם (S1) ומצב הטריפלט הנמוך ביותר (T1), בהתאמה, [Gaussian 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. כאשר DEST חושב כ-ES1 ET1.

3.4. מאפייני תרדמת כימותרפיה

לאחר מכן, כדי לאמת את תפיסת התכנון במחקר הנוכחי לפיה פיתוח מולקולת COS-BA אמפיפילית יכול להגביר ביעילות את ההשפעה הטיפולית של BA על ידי שיפור קליטת התא באמצעות הגברת ההידרופיליות, ובינתיים עוד בניית COS-BA/Ce6 המגיב לגירויים והידרופילי לחלוטין. NPs הקלו על תרדמתו ברקמות תקינות והפעלה באתרי גידול. כדי לבדוק השערה זו, חקרנו תחילה את התנהגות שחרור התרופה של COS-BA/Ce6 NPs בפתרונות חיץ שונים (איור 4A). התוצאות הצביעו על כך ש-COS-BA/Ce6 NPs הראו התנהגות מגיבה ל-pH עם שחרור מצטבר של Ce6 של 88% ב-pH 5.6 ו-57% ב-pH 7.4 לאחר 24 שעות, בהתאמה. תכונה זו נוצרה ככל הנראה מהרס של קשרי מימן רבים שהיו קיימים ב-COS-BA/Ce6 NPs לאחר הכנסת Hþ45 חומצי, ובכך הוביל לשחרור Ce6 מוגבר (איור 4B). זה אושר עוד יותר על ידי פירוק של COS-BA/Ce6 NPs לאחר דגירה בסביבות חומציות ישירות (איור 4C). תכונה זו המגיבה ל-pH עשויה להיות מועילה לטיפול אנטי-גידול יעיל בשל המיקרו-סביבה של הגידול החומצי והחלש34. בינתיים, ל-COS-BA/Ce6 NPs הייתה יציבות טובה יותר מכיוון שלא ניתן היה לצפות בשינויים משמעותיים בגודל או PDI לאחר דגירה ב-PBS ו-1640-RMPI מדיום תרבית תאים במשך 10 ימים (מידע תומך איור S16), וזה יהיה חשוב לשימושם הפוטנציאלי ליישומים ביו-רפואיים נוספים. לאחר מכן, נערכו חקירות נוספות על ידי הערכת הציטוטוקסיות של BA lipophilic חופשי (זווית מגע q: 133.3) ו-Amphiphilic COS-BA (q: 52) (איור 4D) על ידי מבחני מתיל תיאזוליל-דיפניל טטרזוליום ברומיד (MTT) סטנדרטיים. כפי שצפוי, או עבור תאי סרטן 4T1 או הפטוציטים נורמליים LO2, ל-COS אינדיבידואלי אין למעשה פעילות אנטי-סרטנית במינונים נמוכים יחסית. ייתכן שהסיבה לכך היא ההשפעות האנטי-התפשטותיות של COS המופעל באמצעות מסלול איתות NF-kB מעורר רק בריכוזים גבוהים (בערך ברמת מיליגרם)30. בעוד, COS-BA מבצע ציטוטוקסיות משופרת להפליא עם ערכי IC50 נמוכים במיוחד (6.03 מ"ג/מ"ל עבור 4T1 ו-9.92 מ"ג/מ"ל עבור LO2) בהשוואה לאלו של BA (17.63 מ"ג/מ"ל עבור 4T1 ו-20.53 מ"ג/מ"ל עבור LO2) אפילו באותם ריכוזי מסה (איור 4E ו-J). התוצאות שהתקבלו מרמזות ששינוי של COS מסיס במים משפר מאוד את יעילות הספיגה התאית של BA ליפופילי, ובכך מוביל לפעילות אנטי סרטנית חזקה של COS-BA. כדי לכמת את יעילות הספיגה, הצטברות BA או COS-BA בתוך תאי 4T1 נקבעה ישירות על ידי HPLC (מידע תומך איור S17). התוצאות תמכו בבירור ש-Amphiphilic COS-BA מציג ספיגה גבוהה משמעותית מזו של BA חופשי (בערך פי 3.6- לאחר 3 שעות של דגירה), מה שמוכיח את הפעילות הכימותרפית המשופרת של COS-BA. המסקנה שלעיל נתמכה עוד יותר על ידי שיפור משמעותי בציטוטוקסיות של COSBA amphiphilic כנגד תאי סרטן HepG2 ו-MCF-7 (תמונה תומך איור S18), אשר תואמים היטב את רעיון התכנון. לאחר הרכבה משותפת עם Ce6, מצאנו ש-COS-BA/Ce6 NPs ללא הקרנה מפגינים ציטוטוקסיות מעוכבת להפליא כנגד תאי סרטן 4T1 בהשוואה ל-COS-BA המקביל, במיוחד ב-11.5 מ"ג/מ"ל, אך פעילות ה-PDT הבסיסית לא הושפעה ( איור 4F). כדי לאמת תופעה זו בצורה מלאה יותר, חקרנו עוד יותר את הציטוטוקסיות במבחנה של COS-BA/Ce6 NPs כנגד תאים סרטניים אחרים כולל MCF-7 ו-HepG2. מעניין לציין ש-Amphiphilic COS-BA הראה ציטוטוקסיות חזקה מאוד כנגד תאי MCF-7 (איור 4G), אך הפעילות הכימותרפית ירדה באופן משמעותי לאחר הרכבה משותפת עם Ce6, כלומר, NPs COS-BA/Ce6 ללא קרינה. תוצאות דומות נצפו גם בתאי HepG2 רק עם ירידה קלה (איור 4H). כדי לתמוך עוד יותר במסקנות לעיל, הערכנו גם את ההשפעות הכימותרפיות של ננו-מכלולים ו-COS-BA כנגד תאי פיברובלסט L929 של עכברים נורמליים והפטוציטים LO2 אנושיים (איור 4I). התוצאות הצביעו על כך שה-COS-BA/Ce6 NPs שהורכבו הפחיתו באופן משמעותי את התרופה האמפיפילית הרעילה המקורית COS-BA, והראו תאימות ביולוגית מעולה. על ידי ניתוח הציטוטוקסיות, ערכי ה-IC50 של COS-BA האמפיפיליים היו נמוכים משמעותית מזה של ה-COS-BA/Ce6 NPs המורכבים יחד ללא קשר לסרטן או לתאים נורמליים (איור 4J). כלומר, בניית ננו-קו-הרכבים הידרופיליים לחלוטין ומגיבים לגירויים יכולה לדכא מראש ביעילות את הציטוטוקסיות הגבוהה של התרופה האמפיפילית COS-BA. בהתחשב בתכונה הייחודית המגיבה ל-pH, נראה ש-COS-BA/Ce6 NPs יהיו רדומים ברקמות רגילות עם רעילות כימותרפיה נמוכה רצויה, אך פעילים ברקמות הגידול בשל שחרור המגרה שלהם של COS-BA רעיל מאוד בגידול החומצי החלש מיקרו-סביבה. ביחד, בניגוד לניאו-פונקציונליזציה המדווחת באופן נרחב של ריאגנטים כימותרפיים שישפרו פעילות אנטי-סרטנית22,23, מכלולי ננו בתיווך אמפיפיליים של COS-BA לא רק מציגים מאפיין "רדמה" חכם עם השפעות כימותרפיות ערמומיות אלא גם שומרים על פעילות PDT מיוחדת, המציגים פוטנציאל עצום לטיפול חכם נגד גידולים.

איור 4 (א) פרופילי שחרור Ce6 במבחנה מ-COS-BA/Ce6 NPs ב-PBS (pH 7.4, 6.5 או 5.6) המכילים Tween 80 (0.5%, v/v) בשעה 37 ג. (ב) המנגנון האפשרי המגיב ל-pH ש-Hþ מפעיל את פירוק ה-NPs. (ג) פירוק של COS-BA/Ce6 NPs לאחר דגירה ישירה במים pH 4.0 בקירוב. (ד) זווית המגע של NPs BA, Ce6, COS-BA ו-COS-BA/Ce6 חופשיים, בהתאמה. (ה) ציטוטוקסיות של תאים של BA, COS ו-Amphiphilic COS-BA חופשיים נגד סרטן 4T1 ותאי LO2 נורמליים. כדאיות התא של (F) 4T1, (G) MCF-7, (H) תאי סרטן HepG2 לאחר דגירה עם COS-BA, COS-BA/Ce6 NPs חופשיים עם/ללא הקרנה בריכוז שווה ערך של COS-BA. למשך 24 שעות. (I) ציטוטוקסיות של תאים של COS-BA חופשי, COS-BA/Ce6 NPs לא מוקרנים כנגד תאי LO2 ו-L929 תקינים. (י) ניתוח IC50 של COS-BA נגד סרטן ותאים נורמליים. הנתונים מבוטאים כאמצעי SD (n Z 6). *P ˂ 0.05, **P ˂ 0.01 ו-***P ˂ 0.001 מציגים את ההבדלים המשמעותיים.

כדי לחקור את הסיבות האפשריות מאחורי מאפיין תרדמת כימותרפיה זה, התנהגות הספיגה התאית התלויה בזמן של COS-BA/Ce6 NPs הוערכה ברציפות על ידי דגירה עם תאי סרטן 4T1. התוצאות הצביעו על כך שלמרות COS-BA/Ce6 NPs הראו כיבוי קרינה יוצא דופן, הם עדיין הראו יעילות פגוציטית משופרת בהשוואה ל-Ce6 חופשי בגלל הקרינה האדומה הציטופלזמית החזקה יותר, כפי שנקבע על ידי ניתוח כמותי של ציטומטרי זרימה (איור 5A). הפנמה תאית משופרת זו של NPs עשויה להיות מיוחסת לאנדוציטוזיס21. ביחד, שיערנו שלמרות שהרכבים משותפים COS-BA/Ce6 NPs מסיסים מאוד במים (זווית מגע q: 36.7) הפגינו אנדוציטוזיס תאית משופרת מאשר Ce6 ליפופילית (ש': 132.6, קרוב ל-BA), היעילות הפאגוציטוזיס המופחתת של NPs עשויים להופיע בהשוואה למולקולת COS-BA אמפיפילית, ובכך נראה דיכא את הציטוטוקסיות הכימותרפית של COS-BA/Ce6 NPs. כלומר, יעילות קליטת התא מגבוה לנמוכה כרצף כזה: COS-BA amphiphilic, COS-BA/Ce6 NPs הידרופילי, BA lipophilic או Ce6. חשוב מכך, פירוק לא הולם של NPs תאיים עשוי להיות סיבה חשובה נוספת להחלשת ההשפעה הכימותרפית, כל אלה עשויים להיות קשורים לתרדמת הכימותרפיה החכמה של COS-BA/Ce6 NPs. חוץ מזה, מכיוון שהפירוק של NPs נערך במיוחד בסביבה החומצית של תאי גידול, כדי להדגים את התכונה המגיבה ל-pH, ניסינו עוד להשוות את השפעות הספיגה של COS-BA/Ce6 NPs בתאי LO2 נורמליים (איור 5B) . עם זאת, COS-BA/Ce6 NPs לא הפגינו קרינה אדומה של Ce6 מעוכבת משמעותית בתאי LO2. לעומת זאת, התנהגות הספיגה של LO2 הייתה דומה לזו של תאי סרטן 4T1, מה שמצביע על כך ש-COS-BA/Ce6 NPs יכולים גם להתפרק אפילו בתאים נורמליים, מה שעלול לנבוע מהתאים התוך-תאיים של pH חומצי חלש (אנדוזומים/ליזוזומים) הקיימים בפנים גם סרטן וגם תאים נורמליים46. מכיוון שהספיגה התאית של NPs תלויה בתהליך האנדוציטוזיס, ייתכן שהדגירה הישירה של התרופה לא תדגיש את תגובת ה-pH של COS-BA/Ce6 NPs ברמה התאית. עם זאת, המיקרו-סביבה של הגידול (TME) חומצית מאוד בהשוואה לרקמות רגילות47. ללא קשר לסרטן תוך תאי או TME, COS-BA/Ce6 NPs יכולים להיות מגיבים ל-pH ומפורקים כדי לעורר שחרור של COS-BA רעיל ביותר. בעוד שברקמות רגילות, ניתן היה לפרק COS-BA/Ce6 NPs רק לאחר כניסה לסביבה תאית רגילה, מה שמפחית את ההסתברות לשחרור COSBA. לכן, אנו מסיקים כי תרדמת הכימותרפיה האופיינית ל-COS-BA/Ce6 NPs למיקרו-סביבה של הגידול היא תקפה ואמינה, ורעיון התכנון במחקר הנוכחי הוא בר ביצוע.

3.5. יעילות כימותרפיה חוץ גופית/PDT אנטי סרטן של COS-BA/Ce6 NPs

בנוסף, לפני יעילות מפורטת של כימותרפיה חוץ גופית/PDT אנטי-סרטני של COS-BA/Ce6 NPs וכדי לחשוף עוד יותר את מנגנון האנדוציטוזיס, אנו חוקרים את ארבעת מסלולי האנדוציטוזיס העיקריים על ידי הוספת מעכבי אנדוציט מתאימים כולל כלורפרומאזין (בתיווך קלתרין), כלורוקין פוספט ( מעכב חומצה ליזוזום), ניסטטין (בתיווך caveolae), ומעכב מקרופינוציטוזיס EIPA (אתילאיזופרופיל אמילוריד) (איור 5C ו-D). אנו רואים שהחדרה של ניסטטין וכלורפרומזין יכולה לעכב את היעילות הפאגוציטית בצורה יעילה יותר מאשר EIPA וכלורוקין פוספט, והראתה ירידה משמעותית בקרינה תאית בהשוואה לטמפרטורה רגילה של 37 C. תוצאות אלו הצביעו על כך ש-COS-BA/Ce6 NPs הופנמו על ידי מנגנונים מרובים, בעיקר באמצעות מסלולי האנדוציטוזיס בתיווך קלתרין ו-caveolae. מאז הדור המוגבר של 1 O2 באמצעות אינטראקציות בין-מולקולריות, COS-BA/Ce6 NPs מציגים תפוקת ROS בין-תאית משופרת משמעותית מזו של Ce6, כפי שמצוין על ידי הקרינה הירוקה החזקה יותר של בדיקה DCFH (איור 5E), מה שמרמז על היעילות הפוטודינמית הגבוהה יותר. מבחני MTT מוכיחים ש-COS-BA/Ce6 NPs תחת הקרנה מבצעים השפעת עיכוב משופרת להפליא על תאי 4T1 מזו של Ce6 המקבילה, בעוד עם ציטוטוקסיות מתונה יחסית ללא הקרנה (איור 5F). באופן משמעותי, ה-IC50 של Ce6 (0.53 מ"ג/מ"ל) ב-COS-BA/Ce6 NPs היה נמוך בהרבה מ-Ce6 חופשי (1.39 מ"ג/מ"ל) (איור 5G), מה שמרמז על יעילות משופרת להפליא של PDT, שהיה הודגם בצורה מושלמת נוספת על ידי הציטוטוקסיות של COSBA/Ce6 NPs נגד תאי סרטן MCF-7 ו-HepG2 אנושיים (תמונה תומכת באיור S19). באופן דומה, בהשוואה ל-Ce6 החופשי, ערכי IC25, IC50 ו-IC75 הנמוכים יחסית נצפו גם במכלולים משותפים (איור 5G). בינתיים, בהשוואה ל-Ce6 PDT לבד וכימותרפיה בודדת של NPs בחושך, COS-BA/Ce6 NPs תחת הקרנה השיגו כימותרפיה משולבת/PDT יעילה יותר כנגד שלושת התאים הסרטניים לעיל, והראו סינרגיזם (מדד שילוב: CI ˂ 1) ( איור 5I). חוץ מזה, הצביעה הכפולה של הקרינה של תאים חיים/מתים באמצעות אסתר קלצין-אצטוקסי-מתיל (calcein-AM) ופרופידיום יודיד (PI) אישרו עוד ש-COS-BA/Ce6 NPs יכולים לגרום ביעילות לאפופטוזיס ונמק של תאים, שכן התאים המטופלים כמעט הוכתמו. עם אות קרינה PI אדום כאשר תורבת במשך 10 שעות נוספות לאחר הקרנה (איור 5H). בינתיים, COS-BA/Ce6 NPs ללא קרינה (מינון גבוה יותר של Ce6: 3.2 מ"ג/מ"ל) היו גם הם בעלי פעילות כימותרפית מסוימת כפי שנראתה על ידי אותות AM ו-PI בו-זמנית. פעילות PDT משופרת זו של COS-BA/Ce6 NPs אומתה עוד יותר על ידי צביעת AM/PI לאחר טיפול למשך 20 שעות נוספות (מידע תומך איור S20). יתר על כן, כאשר מוסיפים נתרן אזיד (SA) ו-D-mannitol (DM), מרווה מיוחד בנפרד של 1 O2 ו-$OH48, לתאי 4T1 שטופלו ב-COS-BA/Ce6 NPs-PDT, הכדאיות המוגברת של התא רמזה כי סוג I ($OH) וסוג II (1 O2) photoreactions התרחשו בו זמנית בתהליך PDT בתיווך COSBA/Ce6 NPs (איור 5J). יתר על כן, COS-BA/Ce6 NPs בעלי תאימות דם טובה יותר, כפי שמצוין על ידי המוליזה זניחה של תאי דם אדומים (איור 5K), מה שמרמז על הפוטנציאל ליישומים ביו-רפואיים באמצעות מתן תוך ורידי.

3.6. הפצה ביולוגית של COS-BA/Ce6 NPs

לאחר מכן, לפני חקירת ההפצה in vivo, בשלב הבא הערכנו את הפרמקוקינטיקה של COS-BA/Ce6 NPs על ידי ניטור ריכוז Ce6 בדם לאחר הזרקה לווריד עם Ce6 או COS-BA/Ce6 NPs מקבילים. פרופילי הריכוז-זמן של Ce6 בדם (איור 6A) והפרמטרים הפרמקוקינטיים ההשוואתיים (טבלת מידע תומכת S1) תומכים בבירור בכך של-COS-BA/Ce6 NPs יש מחזור דם ממושך בזרם הדם, מה שעשוי לאפשר הצטברות גדולה יותר בגידול. אתרים. במיוחד, COS-BA/Ce6 NPs הראו סילוק דם מהיר תוך 2 שעות, מה שמרמז על התכלות ביולוגית חיובית. בהתאם, לאחר מכן חקרנו את ההפצה הביולוגית in vivo ויכולת הצטברות הגידול של COS-BA/Ce6 NPs (איור 6B ו-C). בדומה לננו-מרוכבים של Ce6 המדווחים אוניברסלית, COS-BA/Ce6 NPs יכולים להיות מופצים במהירות בכל הגוף. במיוחד במהלך 4 השעות הראשונות, מכלולים הפגינו פליטת פלואורסצנציה חזקה יותר באתרי הגידול מאשר Ce6 חופשי, מה שמרמז על שיפור יכולת השמירה והצטברות ממוקדת גידול של COS-BA/Ce6 NPs, כנראה מיוחסת להשפעה הפסיבית של שימור חדירות מוגברת (EPR). שניתן על ידי הננו-חלקיקים14. לאחר 6 שעות לאחר ההזרקה, עוצמת הקרינה באתרי הגידול ירדה בהדרגה במהירות. יש לציין, שלא כמו הננו-מרוכבים המדווחים הנפוצים עם הצטברות גידול משופרת משמעותית בהשוואה לתרופה חיובית חופשית29, NPs של COS-BA/Ce6 לא הראו הצטברות בולטת מאוד בישיבת הגידול ב-24 שעות לאחר ההזרקה מאשר Ce6 חופשי (איור 6C), שהיה נתמך עוד יותר על ידי הדמיה של הגידול שנכרת (איור 6D ו-E). הפירוק הביולוגי המצוין של NPs עשוי להיות אחראי להחדרת מולקולות אורגניות קטנות טבעיות. זה נצפה גם עם טרפנואידים אחרים עם ננו-מכלולים קטנים בתיווך מולקולה49. חוץ מזה, COS-BA/Ce6 NPs גם הראו הפצת רקמות דומה כמו Ce6 חופשי (איור 6E), ועוצמת הקרינה הממוצעת ex vivo הייתה בדרך כלל נמוכה מזו שהוצגה in vivo, מה שמרמז עוד יותר על התכלות ביולוגית טובה. בנוסף, בהתחשב בהבדל ברמת הקרינה הקרובה בין 2 ל-4 שעות לאחר הזרקת NPs ו-Ce6, כמו גם יכולת פעולה ניסיונית המאפשרת מרווחים מספיקים להקרנה, 4 שעות לאחר המתן נבחרה כנקודת זמן האור לטיפול PDT שלאחר מכן.

בהתחשב בהצטברות הגידול הלא מאוד בולטת ב-24 שעות מ-Ce6 חופשי, כדי לאמת עוד יותר את השפעת ה-EPR המוגברת שיש ל-COS-BA/Ce6 NPs, עקבנו מיד אחר תמונות הקרינה של גידולים בזמנים שונים לאחר הזרקה לווריד עם ננו-תרופות ( איור 6F ו-G). באופן מדהים, בין אם ב-20 דקות או ב-12 שעות לאחר ההזרקה, COS-BA/Ce6 NPs אכן הראו פליטת פלואורסצנטי חזקה יותר באתרי גידול מאשר Ce6 חופשי, והדגימו יכולת הצטברות גידול מעולה ומשופרת. בינתיים, ככל שחלף הזמן, עוצמות הקרינה שנשמרו ברקמת הגידול נחלשו בהדרגה (איור 6G), מה שעולה בקנה אחד עם התוצאות של הדמיית פלואורסצנטי של בעלי חיים in vivo. ברור שחילוף חומרים ביולוגי מהיר זה והצטברות גידולים משופרת נמנעו מרעילות פוטנציאלית של הצטברות ארוכת טווח, מה שמבטיח טיפול אנטי-גידול יעיל ביותר עם בטיחות ביולוגית טובה יותר.

איור 5 יעילות נוגדת סרטן במבחנה של COS-BA/Ce6 NPs. הפנמה תאית של (A) תאים סרטניים 4T1 ו-(B) תאים נורמליים LO2 שהודגרו ב-Ce6 או COS-BA/Ce6 NPs חופשיים למשך 0.5 ו-3 שעות, וניתוח ציטומטרי זרימה תואם של עוצמת הקרינה. (ג) עיכוב ספיגה של מחקרי מסלול אנדוציטי ספציפיים ו-(D) עוצמת הקרינה המתאימה של תאים שנמדדה על ידי ציטומטריית זרימה לאחר דגירה עם COSBA/Ce6 NPs עם/בלי מעכבי אנדוציטי כולל כלורפרומאזין, כלורוקין, ניסטטין, ואתיליסופרופיל אמילוריד (EIPA). פסי קנה מידה Z 20 מ"מ. (ה) יצירת ROS סלולרי המושרה על ידי Ce6 חופשי או COS-BA/Ce6 NPs (שווה ערך ל-Ce6: 1.6 מ"ג/מ"ל). פסי קנה מידה Z 20 מ"מ. (ו) כדאיות התא של תאי 4T1 לאחר טיפולים שונים במשך 24 שעות. (ז) ניתוח IC25, IC50, IC75 של Ce6 ו-COS-BA/Ce6 NPs חופשיים כנגד תאי 4T1, MCF-7 ו-HepG2, בהתאמה. (H) צביעה חיה/מתה של Calcein-AM/propidium iodide (PI) של תאי 4T1 שטופלו ב-COS-BA/Ce6 (Ce6: 1.6 מ"ג/מ"ל) לאחר דגירה של 10 שעות נוספות, כמו גם COS- לא מוקרן BA/Ce6 NPs (Ce6: 3.2 מ"ג/מ"ל). מוטות קנה מידה Z 50 מ"מ. (I) אינדקס שילוב (CI) של NPs COS-BA/Ce6 על תאי 4T1, MCF-7 ו-HepG2, כפי שנקבע על ידי חישוב משפט Chou Talalay. (J) מנגנוני PDT (סוג I וסוג II) המושרים על ידי הקרנה של COS-BA/Ce6 NPs ומוערכים על ידי 1 O2 ו-$OH מרווה נתרן אזיד (SA) ו-D-mannitol (DM), בהתאמה. (K) אחוז המוליזה של תאי דם אדומים לאחר דגירה עם COS-BA/Ce6 NPs למשך 4 שעות. הנתונים מבוטאים כאמצעי SD (n Z 3). *P ˂ 0.05, **P ˂ 0.01 ו-***P ˂ 0.001 מראים את ההבדלים המשמעותיים.

איור 6. זרימת דם ב-vivo והפצה ביולוגית של NPs COS-BA/Ce6. (א) פרופילי ריכוז-זמן של Ce6 בדם לאחר הזרקות iv של Ce6 שווה ערך או COS-BA/Ce6 NPs מורכבים (n Z 3). (ב) תמונות הקרינה של כל הגוף של עכברים נושאי גידול 4T1 לאחר הזרקות iv של תרופות מסומנות בנקודות זמן שונות. (ג) עוצמת הקרינה הממוצעת המתקבלת מאתרי הגידול ב (B). (ד) תמונות הקרינה Ex vivo של גידולים ואיברים מרכזיים שנכרתו מהעכברים לעיל ב-24 שעות, ותוצאה כמותית (E) עוצמת הקרינה (N Z 3). (ו) תמונות הקרינה Ex vivo של גידולים ואיברים מרכזיים בזמנים שונים לאחר הזרקות iv של Ce6 או COS-BA/Ce6 NPs, ו-(G) ניתוח עוצמת הקרינה המקביל של גידולים. הנתונים מבוטאים כאמצעי SD (n Z 3).

3.7. טיפול כימותרפי אינוויו/PDT קומבינטורי אנטי גידולי 

מונע על ידי מאפיין התרדמה הייחודי, הפירוק הביולוגי הטוב ופעילות ה-PDT, נחקר הטיפול המשולב של כימותרפיה/PDT. עכברים נושאי גידול 4T1 חולקו באופן אקראי ל-6 קבוצות והוזרקו לווריד עם Ce6 שווה ערך (3.5 מ"ג/ק"ג גוף) כל יומיים בסך הכל שלוש מנות. 4 שעות לאחר ההזרקה, אתרי הגידול של עכברים בקבוצות האור הוקרנו במשך 15 דקות (איור 7A). בינתיים, נפחי גידול או משקל גוף תואמים נרשמו כל יומיים. לאחר 14 ימי טיפול (איור 7B), Ce6 חופשי עם הקרנה ו-COS-BA חופשי לא היו יעילים בדיכוי הגידול, ככל הנראה בשל הצטברות התרופה המוגבלת ברקמת הגידול. לעומת זאת, לאחר הקרנה של COS-BA/Ce6 NPs, נצפתה עיכוב הגידול המשמעותי ביותר, המאמת את היעילות המצוינת של שילוב כימותרפיה/PDT. משקלי הגידול הממוצעים (איור 7D) והתצלומים המקבילים של גידולים מנותחים (איור 7E) הראו שניהם את היעילות האנטי-גידולית הטובה ביותר של COS-BA/Ce6 NPs תחת הקרנה, שכן עכברים מטופלים הראו את גדלי הגידול הקטנים ביותר מאלו של קבוצות אחרות. יחס עיכוב הגידול הממוצע של COS-BA/Ce6 NPs שטופלו ב-PDT הגיע ל-80.3%, גבוה מאלה של Ce6 PDT חופשי (42.4%) ו-COS-BA חופשי (38.5%). יש לציין, למרות שמחקרים קודמים במבחנה הראו ש-COS-BA/Ce6 NPs ללא אור הראו פונקציה רדומה של פעילות כימותרפית, הם עדיין מבצעים יעילות אנטי-גידולית משופרת (49.5%) בהשוואה ל-COS-BA חופשי (איור 7D). השערנו ששתי סיבות אפשריות תורמות לתוצאה זו, האחת היא הצטברות גידולים גבוהה יותר של COS-BA/Ce6 NPs עקב אפקט ה-EPR המדווח באופן נרחב. גורם נוסף הוא המיקרו-סביבה של הגידול החומצי והחלש שעורר את שחרורו של COS-BA רעיל ביותר. בגלל ריכוז המיצל הקריטי הגבוה יותר (CMC, 187 מ"ג/מ"ל) של COS-BA (מידע תומך איור S21), הוא יכול להתקיים במצב המונומר בסביבת הגידול, ובכך להעדיף את הכימותרפיה המשופרת של COS- ללא הקרנה. BA/Ce6 NPs. חוץ מזה, כדי לאמת עוד יותר את היעילות האנטי-סרטנית המעולה של COS-BA/Ce6 NPs, בוצעה צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) של גידולים (איור 7G).

איור 7 מחקר יעילות עם מודל xenograft תת עורי 4T1. (א) המחשה סכמטית של טיפול PDT in vivo. (ב) פרופילי גידול גידולים, (ג) שינויים במשקל הגוף ו-(ד) משקלי גידול שנכרתו המכילים יחסי עיכוב גידולים של עכברים נושאי 4T1- לאחר טיפולים שונים בקבוצות המצוינות (n Z 5 לכל קבוצה). (ה) תמונות של גידולים שנכרתו מעכברים מייצגים לאחר טיפול. (ו) ניתוח ביוכימיה בסרום לאחר טיפול עם COS-BA/Ce6 NPs במשך 14 ימים. (ז) צביעת H&E מייצגת של קטעי גידול שנכרתו לאחר טיפולים שונים. פסי קנה מידה Z 50 מ"מ. (ח) צביעת TUNEL של קטעי גידול חופשיים Ce6 ו-COS-BA/Ce6 NPs PDT. פסי קנה מידה Z 20 מ"מ **P < 0.01 מציינים את ההבדלים המשמעותיים.

התוצאות הצביעו על כך שקטעי גידול שטופלו ב-COS-BA/Ce6 NPs-PDT הראו הידרדרות רצינית של רקמות וחוסר גרעינים, בעוד שבשאר הקבוצות נצפתה נמק רקמה בינוני. במקביל, בהשוואה לאור Ce6 חופשי, COS-BA/Ce6 NPs תחת הקרנה הגדילו באופן מדהים את מספר התאים החיוביים ל-TUNEL המראים צביעה גרעינית חומה חזקה יותר (איור 7H), מה שמאשר עוד יותר את הטיפול המשולב של כימותרפיה/PDT. יתר על כן, לא נצפו שינויים ברורים של משקלי הגוף בכל הקבוצות (איור 7C). גם אם לקבוצות COSBA/Ce6 NPs או Ce6 קל הייתה ירידה מתונה במשקל הגוף במהלך מתן, משקלי הגוף חזרו למצב נורמלי לאחר מספר ימים. לא ניתן היה למצוא נזק ברור או נגע דלקתי באיברים העיקריים שנקטפו בתום הטיפולים (מידע תומך איור S22), שניהם מצביעים על רעילות מערכתית נמוכה/לא ועל בטיחות ביולוגית טובה של COS-BA/Ce6 NPs. יתר על כן, למרות ש-COS-BA/Ce6 NPs מצטברים בעיקר ברקמת הכבד, סמני תפקודי הכבד המתאימים (ALT, AST ו-ALP) לא הראו שינויים משמעותיים בהשוואה לעכברים בריאים רגילים (איור 7F), מה שמצביע על תאימות ביולוגית טובה יותר. בנוסף, נראה כי גם סמני התפקוד הכלייתי (BUN, CRE ו-UA) והפרמטרים הביוכימיים (ALB ו-TBIL) דומים לעכברים רגילים, מה שמרמז עוד יותר על בטיחות ביולוגית טובה יותר. ברור שמולקולה קטנה אורגנית פרו-תרופתית זו לרכיבים משותפים בתיווך COS-BA של COS-BA/Ce6 NPs בעלת מספר תכונות טיפוליות חיוביות הפותחות אפשרויות אטרקטיביות ליישומים ברפואה קלינית.

3.8. חסינות נגד גידולים של כימותרפיה/PDT משולבת וחסימה נגד PD-L1

לאחרונה, מחקרים חדשניים רבים הראו שהשילוב של אימונותרפיה בסרטן עם שיטות טיפול אחרות יכול לעורר ביעילות תגובות חיסוניות ספציפיות לגידול לחיסול גידולים ראשוניים או מרוחקים1. מעודדים מתפקוד התרדמה הייחודי של הכימותרפיה והיעילות המצוינת של כימותרפיה/PDT אנטי-גידולית של COS-BA/Ce6 NPs, אנו תוהים אם זה יכול גם לעורר תגובות אימונולוגיות בעזרת אדג'ובנט חיסוני אנטי-PD-L1 כדי לגרום לטיפול אנטי-גידול יעיל ביותר . האם זה יכול לטפל בגידולים מרוחקים שלא ניתן לטפל בהם ישירות באמצעות טיפול PDT, ובכך לספק אסטרטגיה חלופית ליישומים קליניים נגד סרטן? כדי לבדוק השערה זו, במחקר זה, הוקם מודל "שני גידולים" והליכי ניסוי מפורטים הוצגו באיור 8A. בדרך כלל, שני גידולי 4T1 חוסנו הן בצד שמאל והן בצד ימין של כל עכבר. בהתחשב בכך שלאנטי-PD-L1 לבדו אין השפעה אימונותרפית בולטת50, הניסויים חולקו ל-5 קבוצות כולל קבוצה לא מטופלת, COS-BA/Ce6 NPs, COS-BA/Ce6 NPs עם anti-PD-L1, COS- BA/Ce6 NPs עם אור, COS-BA/Ce6 NPs עם אור ואנטי-PD-L1. לאחר הזרקה iv בודדת של NPs (Ce6: 3.5 מ"ג/ק"ג), הגידולים הימניים (גידול ראשוני) בקבוצות האור הוקרנו במשך 15 דקות כדי להעריך את ההשפעות האימונולוגיות של PDT/כימותרפיה, ואילו הגידולים השמאליים (גידולים מרוחקים) בכל הקבוצות ללא כל טיפול נבחרו לכימותרפיה פרטנית. לאחר מכן, בימים 2, 4 ו-6, לעכברים בקבוצות החיסון הוזרקו נוגדן אנטי-PD-L1 (15 מ"ג לכל עכבר לכל זריקה) לשלוש מנות. באופן משמעותי, ללא קשר לטיפול ב-PDT או לא, COS-BA/Ce6 NPs פלוס אנטי-PD-L1 יכולים לעכב ביעילות את התקדמות הגידול הראשוני (איור 8B). ויחסי עיכוב גידול ממוצעים תואמים בנפרד הגיעו ל-86.7% (הקרנה) ו-76.5% (ללא הקרנה), גבוהים בהרבה מאשר טיפול כימותרפי פרטני (5.7%) או כימותרפיה/PDT (27.4%) (איור 8C) . גם הצילומים של גידולים מנותחים (איור 8D) ועכברים נושאי 4T1- (תומך מידע איור S23) לאחר 14 ימי טיפול תמכו חזותית במסקנה שלעיל. תוצאות אלו הצביעו על כך שגם כימותרפיה מבוססת NPs וגם כימותרפיה/PDT יכולים להפעיל ביעילות חסינות נגד גידולים. בינתיים, באופן הבולט ביותר, חסימת אנטי-PD-L1 בתוספת NPs הציעו גם אפקט עיכוב גידול יוצא דופן לגידולים מרוחקים (שמאליים) שאינם מוקרנים (איור 8E ו-F), בדרך כלל חזקים יותר מ-COS-BA/Ce6 NPs בלבד, שהיה אושר גם על ידי הגידולים המנותחים המתאימים ותמונות העכברים לאחר הטיפול (איור 8D ואיור. S23), המדגים עוד יותר את התגובה החיסונית האנטי-גידולית הנגרמת על ידי COS-BA/Ce6 NPs.

כדי לחקור באופן מלא את התגובה החיסונית האנטי-גידולית הזו, לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיים מסוג CD8þ (CTL), אימוציט קריטי עבור אימונותרפיה בסרטן4, הוערכו עוד יותר על ידי ניתוח תאי החיסון בגידול הימני או השמאלי לאחר 14 ימי טיפול. נמצא כי COS-BA/Ce6 NPs בתוספת אנטי-PD-L1 עם או בלי טיפול PDT גרמו לחדירת CD8þ CTL חזקה בגידולים הראשוניים (איור 8H ו-J). חדירת CD8þ CTL הייתה עד 11.3% לאחר כימותרפיה מבוססת COS-BA/Ce6 NPs/PDT פלוס טיפול אנטי-PD-L1, מעט גבוה יותר מאשר COS-BA/Ce6 NPs פלוס אנטי-PD-L1 (9.63%), וכן גבוה בהרבה מזה בקבוצות אחרות ללא אנטי-PD-L1, כולל טיפול בכימותרפיה מבוססת COS-BA/Ce6 NPs (5.12%) או כימותרפיה/PDT בלבד (4.07%). באופן דומה, בהשוואה לקבוצות שאינן חיסוניות, נצפתה חדירת CTL מוגברת משמעותית גם בגידולים השמאליים (הרחוקים) עבור עכברים לאחר COS-BA/Ce6 NPs בתוספת antiPD-L1 עם או בלי טיפול PDT (איור 8I ו-K). מרמז על תגובות חיסוניות יעילות ביותר הנגרמות על ידי כימותרפיה או טיפול משולב כימותרפי/PDT. בינתיים, לאחר הצגת אנטי-PD-L1, גם כימותרפיה מבוססת COS-BA/Ce6- וגם כימותרפיה/PDT הובילו לייצור חזק של ציטוקינים מרובים הממלאים תפקידים מרכזיים בוויסות הפונקציות הציטוטוקסיות של CTLs8, כולל הגידול. גורם נמק-אלפא (TNF-a) (איור 8L) ואינטרפרון-גמא (IFN-g) (איור 8M) בדגימות הסרום של עכברים לאחר 14 יום של טיפול, מה שתומך עוד יותר בכך שהיו תגובות חיסוניות יעילות נגד גידולים. חוץ מזה, לא נצפו שינויים ניכרים במשקל הגוף בקבוצות טיפול שונות (איור 8N), מה שמעיד על הבטיחות הביולוגית הטובה של כימותרפיה/PDT/אימונותרפיה משולבת זו. ביחד, מצאנו שלמרות ש-anti-PD-L1 פלוס COSBA/Ce6 NPs עם אור הראו יחס עיכוב גידולים גבוה במקצת (86.7%) מאשר הקבוצה הלא מוקרנת (76.5%) נגד הגידולים הנכונים בשל השפעת PDT (איור 8B-D), לא נצפו הבדלים משמעותיים בהשפעות הטיפוליות על הגידולים השמאליים בנוכחות (77.8%) או היעדר (78.4%) של PDT (איור 8E-G). אנו משערים שהסיבות האפשריות הבאות מובילות לתופעה זו. ראשית, למנגנון של כימותרפיה או PDT המגבירים את ההשפעות האימונולוגיות של חסימת מחסום אנטי-PD-L1, מחקרים מצטברים הוכיחו ששיטות טיפול אלו עלולות לעורר דלקת חריפה באזור הגידול, ובכך להגביר את הצגת האנטיגנים הקשורים לגידול ל-T. תאים, ובכך לגרום לתאים סרטניים לעבור ICD8,9. תאי גידול שעוברים ICD יסווטו את אותות "אכל אותי" על ידי חשיפת הקלרטיקולין (CRT) על פני השטח של תאי גידול גוססים באופן אימונוגני ואותות "סכנה" על ידי שחרור תיבת קבוצתית 1 עם ניידות גבוהה (HMGB1), תוך קידום הפעלה של תאים דנדריטים. כדי להפעיל CTLs, שאת פעילותם ניתן לשפר על ידי אנטי-PD-L1, ובכך להביא לשיפור משמעותי של אימונותרפיה נגד סרטן51.

איור 8 השפעה אנטי-גידולית של כימותרפיה/PDT מבוססת COS-BA/Ce6 NPs בתוספת חסימת מחסום אנטי-PD-L1 אימונותרפיה. (א) המחשה סכמטית של כימותרפיה/PDT מבוססת CNP עם טיפול אנטי-PD-L1. (BeD) (B) פרופילי צמיחת הגידול, (C) משקלי גידול ממוצעים ו-(D) תמונות של גידולים שנכרתו מעכברים מייצגים עבור גידולים ראשוניים (ימני) לאחר טיפולים שונים במשך 14 ימים כמצוין. (EeG) (E) עקומות צמיחת הגידול, (F) משקלי גידול ממוצעים ו-(G) תמונות של גידולים שנכרתו עבור גידולים מרוחקים (שמאליים) שאינם מוקרנים לאחר טיפולים שונים כפי שצוין. (H) אוכלוסיות של תאי CD8þ T בגידולים ימניים ואחוזים (J) של חדירת CTL זוהו כמותית על ידי ציטומטריית זרימה לאחר 14 ימי טיפול. (I, K) אוכלוסיות של תאי CD8þ בגידולים שמאליים ביום 14 זוהו כמותית על ידי ציטומטריית זרימה (n Z 3). הפרשת ציטוקינים בסרה לאחר 14 ימי טיפול כולל (L) IFN-g ו-(M) TNF-a שנמדדו על ידי בדיקת ELISA (n Z 3). (נ) שינויים במשקל הגוף של עכברים במהלך טיפולים שונים. *P < 0.05, **P < 0.01 ו-***P < 0.001 מציגים את ההבדלים המשמעותיים.

שנית, בעבודה זו, ניתן היה להפיץ COS-BA/Ce6 NPs על הגידול השמאלי והימני בו זמנית, הן לכימותרפיה השמאלית והן לכימותרפיה הימנית/PDT יש פוטנציאל עצום לגרום לתאי גידול לעבור ICD. בינתיים, COS-BA/Ce6 NPs ניתנים במנה אחת בלבד, האימונותרפיה תלויה בעיקר בשלוש מנות של אנטי-PD-L1, בין אם כימותרפיה או כימותרפיה/PDT, הם רק פריימרים. ההבדלים הטיפוליים בהשראת ICD של תאי גידול בין כימותרפיה פרטנית לבין טיפולי כימותרפיה/PDT משולבים עשויים שלא להיות בולטים במיוחד. האחוז של CD8þ CTLs בצד שמאל (איור 8I ו-K) וגידולים ימין (איור 8H ו-J) תמך גם הוא את ההשערה לעיל, לא נצפה הבדל משמעותי ב-CD8þ CTLs בנוכחות או בהיעדר PDT. לכן, COS-BA/Ce6 NPs פלוס אנטי-PD-L1 עם או בלי הקרנה השיגו יעילות אנטי סרטנית דומה נגד הגידולים השמאליים. יתר על כן, מכיוון שתאי 4T1 מבטאים רמות נמוכות של PD-L152, הוכח באופן נרחב כי אנטי-PD-L1 לבדו הוא בעל השפעה אימונותרפית בולטת על סרטן שד 4T153,54. למרות השפעות ה-ICD המתווכות על ידי COS-BA/Ce6 NPs מחייבות חקירה נוספת, התוצאות שהוצגו הראו כי COS-BA/Ce6 NPs משיגים תגובות חיסוניות משופרות להפליא בעזרת אנטי-PD-L1. באופן קולקטיבי, נראה ש-COS-BA/Ce6 NPs אכן העצימו את האימונותרפיה בסרטן של אנטי-PD-L1, לא רק טיפול משולב. למרות ש-anti-PD-L1 פלוס COS-BA/Ce6 NPs עם או בלי טיפול PDT לא הראו הבדלים משמעותיים בהשפעות הטיפוליות, שניהם הראו ללא ספק יעילות אנטי-גידול משופרת בהשוואה למינון אחד של COS-BA/Ce6 NPs. כלומר, גם אם ללא טיפול באור, לאחר הצגת האדג'ובנט החיסוני antiPD-L1, ניתן להגביר את האימונוגניות של שאריות הגידול לאחר כימותרפיה COS-BA/Ce6 NPs וכתוצאה מכך לתגובות חיסוניות אנטי-גידול מערכתיות יוצאות דופן, ובכך להוביל לדיכוי יעיל של גידולים ראשוניים או מרוחקים. לפיכך, זה אמור להיות אפשרי לחסל גידולים ראשוניים וגרורתיים במהלך אימונותרפיה קלינית נגד סרטן עם טיפולים חוזרים ונשנים עם NPs. ברור שתוצאות אלו מספקות עדות קולקטיבית לתגובות חיסוניות אנטי-גידוליות יעילות וסינרגטיות ביותר הנגרמות על ידי COS-BA/Ce6 NPs בשילוב עם חסימה אנטי-PD-L1, עם כימותרפיה לבד או בשילוב עם כימותרפיה/PDT.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

4. מסקנות

לסיכום, בכוונה תכננו, סיננתזנו ופיתחנו ננו-פרו-תרופה COS-BA/Ce6 NPs ביולוגית, מתכלה, רעילה נמוכה אך יעילה מאוד וזמינה קלינית שעברה טרנספורמציה בפוטו-כימותרפיה COS-BA/Ce6 NPs על ידי שילוב של שלושה רכיבים רב-תכליתיים בהרכבה עצמית של חומצה בטולינית טבעית, מולקולה קטנה. (BA), COS מסיס במים, וגורם פוטו-סנסיטיזר רעיל נמוך Ce6 לכימותרפיה משולבת/PDT. לאחר מכן, הוא מעורר תגובות חיסוניות אנטי-גידוליות יעילות וסינרגיות בשילוב עם חסימה אנטי-PD-L1, עם כימותרפיה לבד או בשילוב עם כימותרפיה/PDT. באופן ספציפי, אנו מראים כי סידור מולקולרי של רשת חלולה עשוי להקל על היווצרות של ננו-חלקיקים בעלי מבנה קליפה. שינויים של COS מסיס במים יכולים לשפר מאוד את הפעילות האנטי סרטנית של מולקולות קטנות טבעיות ליפופיליות על ידי בניית פרו-תרופה אמפיפילית. אנו גם מראים כי הננו-תרופות שהתקבלו הראו מספר תכונות טיפוליות חיוביות, במיוחד פונקציית "רדמה" חכמה עם השפעות כימותרפיה ערמומיות. בשילוב עם היענות ה-pH הייחודית, ההרכבים המשותפים הללו מבצעים רעילות נמוכה ובטיחות ביולוגית עם רקמה רגילה, אך הם רעילים מאוד לרקמות הגידול. יחד עם הדור המשופר של 1 O2, מתכלות ביולוגית טובה ותאימות ביולוגית, כל אלו תרמו לכימותרפיה אנטי סרטנית יעילה, סינרגטית ומאובטחת/PDT/אימונותרפיה. בפרט, כימותרפיה פרטנית ללא טיפול PDT יכולה להפעיל תגובות חיסוניות אנטי-גידוליות מערכתיות, ולפתוח אפשרויות אטרקטיביות לטיפול כימותרפי אנטי-סרטני סינרגטי קליני. בסך הכל, עבודה זו מספקת תובנה מבטיחה לפיתוח ננו-אימונוסטימולנטים טבעיים רב-תכליתיים ביו-אקטיביים ביותר ובעלי רעילות נמוכה עבור אימונותרפיה קלינית.

הפניות

1. Sang W, Zhang Z, Dai YL, Chen XY. ההתקדמות האחרונה בתחום האימונותרפיה המשולבת של סרטן סינרגטי מבוסס ננו-חומר. Chem Soc Rev 2019;48:3771e810.

2. Li XY, Guo XM, Ling JB, Tang Z, Huang GN, He LZ, et al. טיפולים אימונותרפיים לסרטן המבוססים על ננו-רפואה שפותחו על ידי תכנות מחדש של מקרופאגים הקשורים לגידול. ננומטרי 2021;13:4705e27.

3. Chao Y, Xu LG, Liang C, Feng LZ, Xu J, Dong ZL, et al. טיפול רדיואיזוטופ מקומי מעורר חיסוני משולב וחסימה מערכתית של נקודת ביקורת חיסונית מעניקים תגובות אנטי-גידול חזקות. Nat Biomed Eng 2018;2:611e21.

4. Wen YY, Chen X, Zhu XF, Gong YC, Yuan GL, Qin XY, ועוד. ננו-חלקיקים משולבים עם כימותרפיה פוטותרמית עם תגובה מיקרו-סביבה של הגידול הגבירו את השראת מוות תאים אימונוגני לטיפול יעיל בסרטן המעי הגס. ממשקי ACS Appl Mater 2019;11:43393e408.

5. Peng JR, Xiao Y, Yang Q, Liu QY, Chen Y, Shi K, et al. צבירה תוך-תאית של ננו-הרכבים של מולקולות קטנות מתוכנתות מחדש על ידי פפטיד משפרת את הכימותרפיה בסרטן ואימונותרפיה קומבינטורית. Acta Pharm Sin B 2021;11:1069e82.

6. Song W, Kuang J, Li CX, Zhang MK, Zheng DW, Zeng X, et al. אימונותרפיה משופרת המבוססת על טיפול פוטודינמי למיגור גידול גרורות ראשוני וריאות כאחד. ACS Nano 2018;12: 1978e89.

7. Wang C, Xu LG, Liang C, Xiang J, Peng R, Liu Z. תגובות אימונולוגיות המופעלות על ידי טיפול פוטותרמי עם ננו-צינוריות פחמן בשילוב עם טיפול אנטי-CTLA-4 לעיכוב גרורות בסרטן. עו"ד מטר 2014;26:8154ה62.

8. He CB, Duan XP, Guo NN, Chan C, Poon C, Weichselbaum RR, et al. פולימרי קואורדינציה ננומטרית בקנה מידה ליבה משלבים כימותרפיה וטיפול פוטודינמי כדי להעצים אימונותרפיה של סרטן חסימת מחסום. Nat Commun 2016;7:12499.

9. Galluzzi L, Buque A, Kepp O, Zitvogel L, Kroemer G. מוות תאים אימונוגני בסרטן ובמחלות זיהומיות. Nat Rev Immunol 2017;17: 97e111.

10. Chiang CS, Lin YJ, Lee R, Lai YH, Cheng HW, Hsieh CH, et al. שילוב של ננו-חלקיקים מגנטיים מבוססי פוקואידן ואימונומודולטורים משפר את האימונותרפיה הממוקמת בגידול. Nat Nanotechnol 2018;13:746e54.

11. Zheng XL, Ge JC, Wu JS, Liu WM, Guo L, Jia QY, et al. ננו-נובית מתכלה הנגזרת של היפוקרטין כתרנוסטית מונעת על ידי אור כמעט אינפרא אדום להדמיה וטיפול כפול בסרטן פוטו-אקטיבי. Biomaterials 2018;185:133e41.

12. ספייסר CD, Jumeaux C, Gupta B, Stevens MM. ננו-חלקיקי פפטיד וחלבון מצמידים פלטפורמות מגוונות ליישומים ביו-רפואיים. Chem Soc Rev 2018;47:3574e620.

13. Mei YL, Wang RB, Jiang W, Bo Y, Zhang TF, Yu JL, et al. התקדמות אחרונה בננו-חומרים לאספקת חומצות גרעין באימונותרפיה של סרטן. Biomater Sci 2019;7:2640e51.

14. Zheng YL, Ye JX, Li ZY, Chen HJ, Gao Y. התקדמות אחרונה בטיפול דינמי בסרטן סונו פוטו: מחומרי רגישות חדשים שפותחו לאסטרטגיות משפרות יעילות מבוססות ננוטכנולוגיה. Acta Pharm Sin B 2021;11:2197e219.

15. Li SK, Zou QL, Li YX, Yuan CQ, Xing RR, Yan XH. תרופות מתכת-ננו פוטודינמיות סופרמולקולריות חכמות המבוססות על פפטידים שתוכננו על ידי הרכבה עצמית של קואורדינציה מרובת רכיבים. J Am Chem Soc 2018; 140:10794e802.

16. Zhi KK, Wang JC, Zhao HT, Yang X. ג'ל מוצר טבעי מולקולה קטנה בהרכבה עצמית לאספקת תרופות: פריצת דרך ביישום חדש של מוצרים טבעיים מולקולות קטנות. Acta Pharm Sin B 2020;10: 913e27.

17. Yang X, Ma C, Chen ZM, Liu J, Liu FY, Xie RB, et al. ננו-חלקיקים בודדים המורכבים מולקולה קטנה מתווכים מתן תרופות יעיל דרך הפה. Nano Res 2019;12:2468e76.

18. Zhi KK, Zhao HT, Yang X, Zhang H, Wang JC, Wang J, et al. ג'לטורים של מוצרים טבעיים ושיטה כללית להשגתם מאורגניזמים. ננומטרי 2018;10:3639e43.

19. Cheng JJ, Fu SY, Qin Z, Han Y, Yang X. חומצות דיטרפן טבעיות מולקולות קטנות בהרכבה עצמית עם פעילות אנטי-סרטנית חיובית ובטיחות ביולוגית לכימותרפיה אנטי-גידולית משופרת סינרגטית. J Mater Chem B 2021;9:2674e87.

20. Wang JC, Zhao HT, Zhi KK, Yang X. חקר תהליך טעינת תרופות פעיל טבעי של מולקולות קטנות ויעילות אנטי-גידול סינרגטית יעילה ביותר. ממשקי ACS Appl Mater 2020;12:6827e39.

21. Cheng JJ, Zhao HT, Yao L, Li Y, Qi BK, Wang J, et al. סטרולים טבעיים בהרכבה עצמית פשוטים ורב-תכליתיים עם גורמים פוטו-מולקולריים בתיווך פעילות אנטי-סרטנית לטיפול פוטודינמי אנטי-גידול משופר. ממשקי ACS Appl Mater 2019;11: 29498e511.

22. Cheng JJ, Zhao HT, Wang JC, Han Y, Yang X. שילוב מכוונן של מולקולות קטנות טבעיות ביו-אקטיביות של תרופות רגישות לאור לפוטוכימותרפיה סינרגטית יעילה ביותר ומשופרת מסוג I. ממשקי ACS Appl Mater 2020;12:43488e500.

23. Wang JC, Zhao HT, Qiao WS, Cheng JJ, Han Y, Yang X. Nanomedicine-cum-carrier על ידי הרכבה משותפת של מוצרים קטנים טבעיים לאנטי-גידולים משופרים סינרגטיים עם פעולות הגנה על רקמות. ממשקי ACS Appl Mater 2020;12:42537e50.

24. Xi JC, Liu HP. התקדמות אחרונה בתכנון של תרופות וחיסונים אמפיפיליים למסירה עצמית. עו"ד ת"ר 2019;3:1900107.

25. Zhang RS, Qin XF, Kong FD, Chen PW, Pan GJ. שיפור קליטה תאית של ישויות טיפוליות באמצעות אינטראקציה עם מרכיבים של קרום התא. Drug Deliv 2019;26:328e42.

26. Pujals S, Giralt E. פפטידים עשירים בפרולין, אמפיפטיים חודרים לתאים. עו"ד Drug Deliv Rev 2008;60:473e84.

27. Karimi M, Ghasemi A, Sahandi Zangabad P, Rahighi R, Moosavi Basri SM, Mirshekari H, et al. מיקרו/ננו-חלקיקים חכמים במערכות מסירת תרופות/גנים המגיבות לגירוי. Chem Soc Rev 2016;45: 1457e501.

28. Cheng JJ, Li XY, Wang S, Han Y, Zhao HT, Yang X. פרו-תרופות טריטרפן ללא נשא עם תגובה לגלוטתיון ובטיחות ביו לפוטוכימותרפיה משופרת סינרגטית. ממשקי ACS Appl Mater 2021;13:245e56.

29. Li XS, Lee SY, Yoon J. סופרמולקולרי פוטו-סנסיטיזורים מצעירים טיפול פוטודינמי. Chem Soc Rev 2018;47:1174e88.

30. Zou P, Yuan SJ, Yang X, Guo YZ, Li LN, Xu CW, et al. אפיון מבני והשפעות נוגדות גידולים של אוליגוסכרידים של צ'יטוסן נגד גידול אורתוטופי בכבד באמצעות מסלול איתות NF-kB. J Funct Foods 2019;57:157e65.

31. Zhai XC, Yuan SJ, Yang X, Zou P, Li NL, Li GY, et al. אוליגוסכרידים של צ'יטוסן מעוררים אפופטוזיס בקרצינומה של הכליה האנושית באמצעות מתח אנדופלזמי אנדופלזמי תלויי-חמצן. J Agric Food Chem 2019;67:1691e701.

32. Deng G, Ma C, Zhao HT, Zhang SQ, Liu J, Liu FY, et al. טיפול משולב אנטי-בצקת ונוגדי חמצון לשבץ איסכמי באמצעות ננו-חלקיקי חומצה בטולינית העמוסים בגליבוריד. Theranostics 2019;9: 6991e7002.

33. Liu K, Xing RR, Zou QL, Ma GH, Mo¨hwald H, Yan XH. הרכבה עצמית פשוטה מכווננת לפפטיד של חומרי פוטוסנסיטיזציה לקראת טיפול פוטודינמי אנטי-סרטני. Angew Chem Int Ed Engl 2016;55:3036e9.

34. Li Y, Lin JY, Wang PY, Luo Q, Lin HR, Zhang Y, et al. ננו-תרופה בהשראת ננו-תרופה מגיב למיקרו-סביבה בהיפוך צורה של וירוס לכימותרפיה פוטותרמית כמעט אינפרא אדום-II. ACS Nano 2019;13:12912e28.

35. Sawada SI, Sato YT, Kawasaki R, Yasuoka JI, Mizuta R, Sasaki Y, et al. הרכבה היברידית של ננוג'ל לאספקה ​​תוך-תאית של אקסוזום: השפעות על אנדוציטוזיס והיתוך על ידי הנדסת פולימר משטח אקסוזום. Biomater Sci 2020;8:619e30.

36. Chou TC. בסיס תיאורטי, עיצוב ניסוי וסימולציה ממוחשבת של סינרגיזם ואנטגוניזם במחקרי שילוב תרופות. Pharmacol Rev 2006;58:621e81.

37. Zhao YP, Zhao YN, Ma QS, Sun B, Wang QP, Ding Z, et al. ננורודים נטולי נשאים, דו-פונקציונליים באמצעות הרכבה עצמית של מולקולות תרופות טהורות לטיפול כימו-פוטודינמי סינרגטי. Int J Nanomed 2019;14:8665e83.

38. Ma X, Zhao YL. יישומים ביו-רפואיים של מערכות על-מולקולריות המבוססות על אינטראקציות מארח-אורח. Chem Rev 2015;115:7794e839.

39. Qin XH, Zhang MZ, Hu X, Du Q, Zhao ZP, Jiang Y, et al. הנדסת ננו של נגזרת כלורין e6 שעוצבה לאחרונה לטיפול פוטודינמי מוגבר באמצעות ויסות חילוף החומרים של לקטט. ננומטרי 2021;13:11953e62.

40. Du Q, Qin XH, Zhang MZ, Zhao ZP, Li Q, Ren XM, et al. ננו-תרופה נטולת נשא הניתנת לוויסות מיטוכונדריאלי-מטבוליזם להגברת הרגישות של טיפול פוטותרמי. Chem Commun (Camb) 2021;57:8993e6.

41. Li XS, Yu S, Lee D, Kim G, Lee B, Cho Y, et al. גישה על-מולקולרית קלה לננו-תרנוסטיות הניתנות להפעלה מונעות על ידי חומצות גרעין שמתגברות על החסרונות של טיפול פוטודינמי. ACS Nano 2018; 12:681ה8.

2. Gilson RC, Black KC, Lane DD, Achilefu S. Hybrid TiO2-ruthenium nano-photosensitizer מייצר באופן סינרגטי מיני חמצן תגובתיים בתנאים היפוקסיים ונורמוקסיים כאחד. Angew Chem Int Ed Engl 2017;56:10717e20.

43. Xu SD, Yuan YY, Cai XL, Zhang CJ, Hu F, Liang J, et al. כוונון פער האנרגיה של סינגל-טריפלט: גישה ייחודית לחומרי רגישות פוטו יעילים עם מאפייני פליטה הנגרמת על ידי צבירה (AIE). Chem Sci 2015;6:5824e30.

44. Wu WB, Mao D, Xu SD, Kenry, Hu F, Li XQ, et al. פולימריזציה מוגברת לפוטוסנסיטיזציה. Chem 2018;4:1937e51.

45. Kundu PK, Samanta D, Leizrowice R, Margulis B, Zhao H, Bo¨rner M, et al. הרכבה עצמית מבוקרת אור של ננו-חלקיקים שאינם מגיבים לצילום. Nat Chem 2015;7:646e52.

46. ​​Miyazaki M, Yuba E, Hayashi H, Harada A, Kono K. ליפוזומים רגישים ל-pH רגישים ל-PH רגישים לפולימר עבור מערכות אספקת תרופות תוך-תאיות ספציפיות לתא. Bioconjug Chem 2018;29:44e55.

47. Zhang JY, Liu ZN, Lian P, Qian J, Li XW, Wang L, et al. הדמיה סלקטיבית ומוות של תאי סרטן באמצעות קרינה קרובה לאינפרא אדום הניתנת להחלפה של pH והשפעות פוטותרמיות. Chem Sci 2016;7:5995e6005.

48. Cheng JJ, Tan GH, Li WT, Zhang HY, Wu XD, Wang ZQ, et al. סינתזה קלה של Fe3O4@ SiO2@CS@pyropheophorbide מגנטי רב תכליתי בעזרת ציטוזן - חלקיקי ננו פלואורסצנטיים לטיפול פוטודינמי. New J Chem 2016;40:8522e34.

49. Cheng JJ, Wang S, Zhao HT, Liu Y, Yang X. בחינת מנגנון ההרכבה העצמית וכימותרפיה סינרגטית אנטי-גידולית יעילה של ננו-תרופה מתכלה ומתגובתת לגלוטתיון בתיווך חומצה אורסולית. Biomater Sci 2021;9: 3762e75.

50. Yang Y, Xu J, Sun Y, Mo LT, Liu B, Pan XS, et al. תגובת מחשוב לוגית מבוססת Aptamer על תאים חיים כדי לאפשר טיפול חסימת נקודת ביקורת חיסונית ללא נוגדנים. J Am Chem Soc 2021;143: 8391e401.

51. Kuai R, Yuan WM, Son SJ, Nam J, Xu Y, Fan YC, et al. חיסול גידולים מבוססים עם כימותרפיה משולבת מבוססת ננו-דיסק. Sci Adv 2018;4:eaao1736.

52. Lesniak WG, Chatterjee S, Gabrielson M, Lisok A, Wharram B, Pomper MG, et al. זיהוי PD-L1 בגידולים באמצעות [(64)Cu]atezolizumab עם PET. Bioconjug Chem 2016;27:2103e10.

53. Sagiv-Barfi I, Kohrt HEK, Czerwinski DK, Ng PP, Chang BY, Levy R. חסינות טיפולית נגד גידולים על ידי חסימת מחסום מוגברת על ידי ibrutinib, מעכב הן של BTK והן של ITK. Proc Natl Acad Sci USA 2015;112:E966e72.

54. Liang C, Chao Y, Yi X, Xu J, Feng LZ, Zhao Q, et al. טיפול רדיואיזוטופ פנימי בתיווך ננו-חלקיקים כדי להגדיל באופן מקומי את חדירות כלי הדם של הגידול לטיפולי סרטן משופרים סינרגטית. Biomaterials 2019;197:368e79.