תכונות אנטי-מלנוגניות להגנה על צילום של תמציות קדסורה קוצ'ינה שונות

איש קשר:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

קרינת שמש אולטרה סגולה (UV), המאופיינת ב-UVA (320-400 ננומטר), UVB (280-320 ננומטר) ו-UVC (100-280 ננומטר), היא הגורם הסביבתי הקריטי ביותר הגורם לסרטן העור ולהזדקנות הצילום הנובעת מציטוטוקסיות, גנוטוקסיות. , ופוטוטוקסיות. באופן ספציפי, קרינת UVA ו-UVB מהוות יותר מ-95% ו-3% מקרינת ה-UV היומית, בהתאמה [8]. קרינת UVA ו-UVB יכולה לגרום למיני חמצן תגובתיים (ROS) בעקיפין או ישירות על ידי חדירת שכבות האפידרמיס ו/או העוריות של העור, מה שמוביל לנזק חמצוני ומוות תאי. בעשורים האחרונים, קרינת UV הפכה לדאגה רצינית לבריאות העור ועדיין מתפשטת בצורה מסוכנת ברחבי העולם [9-11]. קרינת UV היא ממריץ ישיר ועקבי של קרטינוציטים, המהווים כ-95 אחוז ממסת תאי האפידרמיס בעור. קרטינוציטים פועלים כמחסום ראשון מפני סיכונים מיקרוביאליים, כימיים ופיזיים, ומסייעים בהגנה מפני קרינת UVA ו-UVB. כאשר קרטינוציטים נחשפים ל-UVA ו-UVB, נוצר ROS תוך תאי, ובכך מעורר אפופטוזיס [12-14].

המלנוציטים אחראים לייצור ולכמות של פיגמנטים מלנין, שהם שחקנים חשובים בהגנה הביולוגית של האפידרמיס העור; חוסר הוויסות שלהם יכול לגרום להפרעות היפרפיגמנטציה או היפופיגמנטציה [15,16]. המלנוציטים מופצים בשכבת הבסיס של אפידרמיס העור, המושפעת גם מחשיפה לאור השמש, מיני חמצן תגובתיים (ROS) והורמונים מעוררי מלנוציטים (-MSH) [17,18]. טירוזינאז, חבר במשפחת חלבוני הנחושת מסוג -3, הוא מטלופרוטאין שמור מבחינה אבולוציונית, הממלא תפקיד מכריע במלנוגנזה ובפעילות מונו-פנול מונואוקסיגנאז, קטקולאז ודיפנולים. לוויסות הירידה של tyrosinase, tyrosinase-related protein-1 (TRP-1), וחלבון tyrosinase-related-2 (TRP-2) יש השפעות קטליטיות מובהקות. TRP-1 הוא 5,6-dihydroxyindole-2-אוקסידאז של חומצה קרבוקסילית, ו-TRP-2 הוא DOPAchrome tautomerase [19,20]. בנוסף, גורם השעתוק הקשור ל-Myophthalmosis (MITF) וחלבון האלמנטים המקושר ל-cAMP (CREB) הם גורמי שעתוק המווסתים בעיקר את המלנוגנזה ומקודדים מידע על אופן ועוצמת הגירוי [17,21]. מחקרים רבים הצהירו שמסלולי MITF ו-CREB מווסתים את המלנוגנזה. MITF הוא גורם מפתח בתעתיק של אנזימים הקשורים למלנוגנזה והווסת המרכזי של מלנוגנזה. -MSH מוביל לביטוי של MITF באמצעות מנגנון איתות המערב חלבון מקשר הקשור ל-cAMP (CREB). לאחר מכן, MITF נכנס לגרעין עם רצף M-box (AGTCATGTGCT) כדי לקדם את השעתוק של גנים ואנזימים מלנוגניים ספציפיים. ידוע גם ש-CREB מזורחן מעורר על ידי -MSH, הנקשר לאלמנט הקונצנזוס של CRE במקדם ה-Mitf כדי להגביר את ה-Mitf שעתוק [21-24].

במחקר זה, הושוו באופן מקיף תמציות של שורש KC (KCR), גזע (KCS), עלה (KCL) ופירות (KCF) ובוצעו הערכות מרובות של תכונותיהם הפוטופרוקטטיביות והאנטי-מלנוגניות.

2. חומרים ושיטות

2.1. הכנת תמציות KC

צמח KC 15 בן שלוש שנים גודל בעציץ פלסטיק של 9 ליטר בקמפוס מיריאנג של האוניברסיטה הלאומית של פוסאן. KC זוהה על ידי פרופסור יאנג וואן צ'וי, מחבר המחקר הזה. דגימות אלו הופקדו כדגימות שובר (מספר גישה KC- PDRL-1) בצמחייה של המחלקה לביו-מדעי הגננות, המכללה למשאבי טבע ומדעי החיים, האוניברסיטה הלאומית של Pusan. צמחים הושקו במידה מספקת באמצעות תמיסה תזונתית מלאה עם רמת מוליכות של 1.0 mS·cm−1 ומכילה את האלמנטים הבאים (ב me·L−1): NO3-N, 16; NH4-N, 1.34; פ, 4; ק, 8; Ca, 8; ו-S, 4. שמלת KC בנמל נקצרה בדצמבר 2020 על ידי סיווג שורשים, גבעולים, עלים ופירות (איור 1א). דגימות שנקטפו עברו ליאופיל מיד במייבש הקפאה ואוחסנו בשקיות ויניל ב-20 מעלות צלזיוס עד לניתוח. השורשים היבשים, הגבעולים, העלים והפירות של KC (20 גרם) נטחנו לאבקה דקה וחולצו בטמפרטורת החדר עם אלכוהול אתילי. בקצרה, סינון ואידוי של תמציות EtOH של KC בוצעו בלחץ מופחת ב-45 ◦C ולאחר מכן ליטוף. לבסוף, התמצית המוצקה (50 מ"ג/מ"ל) הומסה בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) לניסויים נוספים.

cistancheherba epimedium sagittatumלחלץ

2.2. התוכן הכולל של פוליפנולים ופלבנואידים של תמציות KC

כפי שתואר קודם [25], התוכן הכולל של הפוליפנולים והפלבנואידים של תמציות שורש, גבעול, עלים ופירות KC נמדד בשיטות קולורימטריות Folin-Ciocalteu (סה"כ פוליפנול) ואלומיניום כלוריד (פלבנואיד). הספיגה נמדדה ב-700 ננומטר (סה"כ פוליפנול) באמצעות Ultrospec 6300 Pro (GE Healthcare Life Sciences, בקינגהמשייר, בריטניה) וב-510 ננומטר (פלבנואיד) באמצעות קורא הלוחות הרב-תווית של VICTOR (Perkin-Elmer, Waltham, MA, ארה"ב) .

עקומות סטנדרטיות נבנו באמצעות חומצה גאלית (סה"כ פוליפנול) וקוורצטין (פלבנואיד) כסטנדרטים, והתוצאות הובעו כשווי חומצה גאלית לגרם (GAE/g) של תמציות שורש, גבעול, עלים ופירות KC ומקבילות קוורצטין. לגרם (QE/g) של תמציות שורש, גבעול, עלים ופרי KC, בהתאמה.

2.3. בדיקת DPPH ו-ABTS

פעילויות ניקוי הרדיקליות של DPPH ו-ABTS של תמציות שורש, גבעול, עלים ופירות KC ({{0}}.5 מ"ג/מ"ל) נמדדו לפי שיטה שתוארה קודם לכן [25] עם שינויים קלים. תמציות שורש, גבעול, עלים ופרי KC (0.5 מ"ג/מ"ל) עורבבו עם תמיסת DPPH (60 מיקרומטר) במיקרו-צלחות. לאחר טלטול נמרץ הדגימות, הן נשמרו בחושך ב-25 ◦C למשך 0.5 שעות. פתרונות מלאי של 7 מ"מ ABTS ו-2.6 אשלגן פרסולפט הוכנו במים מזוקקים בטמפרטורת החדר בחושך למשך 18 שעות. תמציות שורש, גבעול, עלים ופרי KC (0.5 מ"ג/מ"ל) ערבבו עם תמיסת העבודה ולאחר מכן הורשו לעמוד במשך 0.5 שעות בטמפרטורת החדר בחושך. הספיגה של תערובות הדגימה נוטרה ב-510 ננומטר (DPPH) או 734 ננומטר (ABTS).

2.4. תרבית תאים

הקרטינוציטים המודבקים (HaCaT) והמלנוציטים המודבקים (B16F10) חוסנו בתמיסת תרבית DMEM (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, ארה"ב) המכילה 10% FBS (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, ארה"ב) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (Invitrogenycin) תאגיד, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב) ומתורבת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5 אחוז CO2. צמיחת תאי HaCaT ו-B16F10 הדבוקה נצפתה באופן קבוע, והמדיום הוחלף כל יומיים עד שלושה. תאים משלב הצמיחה הלוגריתמי שימשו לניסויים הבאים.

2.5. הקרנת UVA ו-UVB

קרטינוציטים נחשפו לקרינת UVA או UVB (Bio-Link BLX-365, Villber-Lourmat, Eberhardzell, גרמניה) עם 5 8 צינורות W שפולטים את רוב האנרגיה שלהם בשיא פליטה בכל 365 ננומטר ( UVA) או 312 ננומטר (UVB). מינוני קרינת UVA היו 20 J/cm2 ומינון קרינת UVB היו 50 mJ/cm2.

2.6. מדידת כדאיות תאים וציטוטוקסיות באמצעות ניתוח CCK-8 ו-LDH

לצורך ניתוח כדאיות תאים, נוספה תמיסת ערכת ספירת תאים-8 (CCK-8) מערכת ה-CCK-8 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב) לקרטינוציטים של HaCaT ו-B16F10 תאי מלנומה על פי הוראות היצרן והודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. בקצרה, 2 104 תאים נזרעו לכל באר של 24-צלחת באר והודגרו עם 5 אחוז CO ב-37 ◦C למשך 24 שעות. בקצרה, 2 104 תאים נזרעו לכל באר של 24-צלחת באר והודגרו עם 5 אחוז CO ב-37 ◦C למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות של דגירה, ריאגנט CCK-8 נוסף לכל באר, והתאים הודגרו במשך 4 שעות. ערכת זיהוי ציטוטוקסיות (Roche Applied Science, שוויץ) שימשה לקביעת שחרור לקטאט דהידרוגנאז (LDH) חוץ-תאי במדיום תרבית קרטינוציטים HaCaT. הספיגה נותחה ב-450 ננומטר (CCK-8) ו-490 ננומטר (LDH) באמצעות VICTOR Multi-label Reader.

2.7. הערכה של ייצור ROS תוך תאי בקרטינוציטים

רמות ROS תוך-תאיות נותחו באמצעות {{0}}(ו-6)-כלורומתיל-2′,7'-dichloride-hydrofluorescein דיאצטט אצטיל אסטר (CM-H2DCFDA; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב). כל ההליכים בוצעו על פי הוראות היצרן. בקצרה, לאחר טיפול בתמציות חלקיות אחרות של KC (0.5 מ"ג/מ"ל), קרטינוציטים (HaCaT) נשטפו עם מי מלח מבוצר פוספט (PBS) והודגרו עם CM-H2DCFDA (5 µM) למשך 0.5 שעות ב החושך. לאחר מכן, יצירת ROS תוך תאי הוצגה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של Carl Zeiss; עוצמת הקרינה נמדדה על בסיס צבע פלואורסצנטי (CM-H2DCFDA) באמצעות ציטומטר זרימה (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, פסדינה, קליפורניה, ארה"ב).

2.8. ניתוח אפופטוזיס

לאחר החשיפה והטיפול, עברו טריפסינציה של קרטינוציטים של HaCaT וצנטריפוגה. לאחר מכן, אפופטוזיס של התאים שהתקבלו הוערכה באמצעות fluorescein isothiocyanate (FITC) Annexin V/Dead CellApoptosis Kit (Invitrogen Life Technologies, Carls-bad, CA, ארה"ב) לפי הוראות היצרן. בקצרה, קרטינוציטים נשטפו פעמיים עם PBS, וקרטינוציטים במאגר המקשר של אנקסין התקבלו ועורבבו עם FITC/Annexin V (רכיב A) ותמיסת עבודה של propidium iodide (PI). לאחר דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות בחושך, נמדדה אפופטוזיס קרטינוציטים ואחוז התאים האפופטוטיים חושב באמצעות ציטומטר זרימה (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, פסדינה, קליפורניה, ארה"ב). התגלו אותות עבור ערוצי FL1 (FITC/Nexin V) ו-FL3 (PI), והוקמו צביעת סמן ברבע וחלקות נקודות של התאים המוכתמים.

2.9. ניתוח של תוכן מלנין תוך תאי ופעילות טירוזינאז

מבחני תכולת מלנין תוך תאי ופעילות טירוזינאז נמדדו על ידי הסבר היכן שונה הפרוצדורה שהשתנה מעט [24]. מלנוציטים טופלו בריכוז סופי של 0.5 µM -MSH ותמציות חלקיות אחרות של 0.5 mg/mL KC למשך 48 שעות. כדורי מלנוציטים חולקו עם 1 N NaOH ב-10 אחוז DMSO ב-80 ◦C למשך שעה אחת. תכולת המלנין היחסית נקבעה על ידי מדידת ספיגה ב-475 ננומטר באמצעות VICTORMultilabel Plate Reader. פעילות טירוזינאז התוך תאית נקבעה על ידי מדידת קצב ייצור הדופאכרום באמצעות L-DOPA. המלנוציטים נשטפו ב-PBS קר כקרח והוסרו ב-PBS המכיל 1 אחוז (w/v) Triton X-100. מצע טירוזינאז L-DOPA (2 מ"ג/מ"ל) הוכן באותו חיץ תמוגה של פוספט. כל תמצית הונחה בצלחת 96-באר, וניתוח אנזימים הוחל על ידי הוספת תמיסת L-DOPA. לאחר דגירה של שעה אחת, הספיגה נמדדה ב-475 ננומטר באמצעות VICTOR Multilabel Plate Reader לניתוח ייצור דופאכרום. הערך של כל מדידה הובע כאחוז מהביקורת. ארבוטין (A, 0.5 מ"ג/מ"ל) שימש כביקורת חיובית.

Cistancheechinacosideהוא מעכב טירוזינאז.

2.10. PCR כמותי בזמן אמת

RNA הכולל בודד מכל קבוצה של מלנוציטים באמצעות ערכת RNeasy Mini (QIAGEN, Hilden, גרמניה). שעתוק הפוך בוצע באמצעות ערכת שעתוק הפוך של cDNA בעלת קיבולת גבוהה (Thermo Fisher Scientific, מיאמי, OK, ארה"ב), לפי הוראות היצרן, כדי להשיג את הגדיל הראשון של cDNA. לאחר מכן, הגדילים שימשו כתבניות עבור PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR) באמצעות מכשיר Bio-Rad Chromo4TM ו-SYBR Green qPCR מיקס מאסטר (Thermo Fisher Scientific, מיאמי, אוקיי, ארה"ב). PCR בוצע תחת דנטורציה מוקדמת ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, וחישול ב-55-58 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. GAPDH mRNA שימש כהתייחסות פנימית ל-tyrosinase, TRP-1 ו-TRP-2 mRNA. הערך היחסי של ביטוי גן יעד=2-∆∆CT. רצפי הפריימר היו כדלקמן: Tyrosinase-sense (5'-ggccagctttcaggcagaggt-3'), Tyrosinase-anti-sense (5'-tggtgcttcatgggc aaaatc-3'), TRP-1-חוש (5 ′-agccccaactctgtcttttc-3′), TRP-1-anti-sense (5'-ggtctccctacatttccagc-3′), TRP-2-sense (5'- tccagaagtttgacag}}cc-3 ′), TRP-2-אנטי-חוש (5'-ggaaggagtgagccaagttatg-3'), GAPDH-sense (5'-aggtggtctcctctgacttc-3') ו-GAPDH-antisense (5gggaaatga-taccatt -3′).

2.11. סוטה מערבית

מלנוציטים נקצרו והוסרו באמצעות ריאגנט למיצוי חלבון יונקים (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב). כל ההליכים בוצעו על פי הוראות היצרן. כל ריכוזי החלבון נקבעו באמצעות ערכת בדיקת חלבון Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, ארה"ב). לאחר מכן, חיץ טעינה נוסף לסופרנטנט החלבון ועורבב. התערובת הורתחה במשך 10 דקות, והחלבונים הופרדו באמצעות Mini-PROTEAN Precast Gels (Bio-Rad, Hercules, CA, ארה"ב) והועברו על גבי ממברנת Hybond polyvinylidene difluoride (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, ארה"ב). איתור חיסוני בוצע באמצעות טירוזינאז (1:1000), TRP-1 (1:1000), TRP-2 (1:1000), MITF (1:1000), CREB פוספוריל (p-CREB 1: 1000), CREB(1:1000) ו-טובולין (1:1000) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, ארה"ב) באמצעות ערכת SignalBoost Immunoreaction Enhancer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב). הממברנה הודגרה למשך הלילה עם הנוגדנים הראשוניים ב-4 ◦C. הנוגדן המשני של עז נגד ארנבת (IgG) (1:5000, Cell Signaling Technology) הוסף לממברנה והודגר בטמפרטורת החדר למשך שעה. רצועות חלבון נצפו באמצעות מצע סופג מערבי משופר של Pierce ECL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב) וכומתו כיחס בין עוצמת רצועת חלבון המטרה לעוצמת רצועת -טובולין.

2.12. ניתוח סטטיסטי

כל המבחנים חזרו באופן עצמאי לפחות שלוש פעמים. כל הפרמטרים הסטטיסטיים מוצגים כשגיאת התקן הממוצעת של הממוצע (SEM). ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות אנליזה חד-כיוונית של שונות (ANOVA), ולאחר מכן הבדיקה הפוסט-הוקית של דאן. ערך של p < 0.01="" או="" p="">< 0.05="" נחשב="">

בדיקת פלבנואידים

3. תוצאות

3.1. השוואה בין תכונות נוגדי חמצון של מספר תמציות חלקיות של KC

The total polyphenol and flavonoid contents and ABTS and DPPH scavenging activities were compared to determine the potential effects of KCR, KCS, KCL, and KCF extracts on antioxidant capacity. As shown in Figure 1B, the KCR extract(197.6 27.2 mg GAE/g) exhibited the highest phenol content, followed by KCL (153.7 6.7 mg GAE/g) and KCS (88.1 7.8 mg GAE/g); the KCF (21.8 4.8 mg GAE/g) extract had the lowest phenol content. Moreover, the results of flavonoid content analyses showed that KCL (94.5 6.3 mg QE/g) had the highest flavonoid content followed by KCR (79.6 4.2 mg QE/g); the KCS (14.9 1.3 mg QE/g) and KCF (6.4 2.0 mg QE/g) extracts had the lowest flavonoid content (Figure 1C). To further investigate the antioxidant properties of KCR, KCS, KCL, and KCF, ABTS and DPPHradical scavenging assays were performed. As shown in Figure 1D, KCL (94.7 ± 2.9%) and KCR (82.8 ± 5.9%) exhibited the highest ABTS radical scavenging activity, followed by the KCS (29.7 ± 2.0%) and KCF extract (15.9 ± 2.0%). DPPH radical scavenging activity was also shown in the order of KCL (99.9 ± 0.1%) > KCR (95.5 ± 3.6%) >KCS (25.7 ± 2.1 אחוז) > KCF (8.7 ± 1.1 אחוז) (איור 1E).

3.2. השוואה של קרטינוציטים ברי קיימא ופגומים שטופלו במספר תמציות חלקיות של KC בנוכחות UVA, UVB או אי-הקרנה

ערכנו את הניסויים הבאים כדי לחקור את ההשפעות של אונקרטינוציטים KCR, KCS, KCL ו-KCF. ראשית, כל התמציות יושמו על קרטינוציטים של HaCaT בנוכחות UVA, UVB או אי-הקרנה. ניתוח CCK-8 הראה שהתמציות לא שינו באופן משמעותי את הכדאיות של קרטינוציטים בריכוזים של 0.5 mg/mL. מאוחר יותר, קרטינוציטים טופלו עם KCR, KCS, KCL ו-KCF בנוכחות הקרנת UVA או UVB. הקרנת UVA ו-UVB עיכבו באופן משמעותי את כדאיות הקרטינוציטים, כפי שמוצג על ידי ניתוח CCK-8 באיור 2A. עם זאת, מצאנו שכדאיותם של קרטינוציטים מוקרי UVA ו-UVB עלתה בסדר הבא: KCL, KCR, KCS ו-KCF (איור 2A). עקבנו גם אחר הקרטינוציטים הפגועים על ידי מדידת שחרור ה-LDH החוץ-תאי. התוצאות הראו שהקרנת UVA או UVB הקלה משמעותית על שחרור LDH; עם זאת, KCL, KCR, KCS ו-KCF החלישו באופן משמעותי את שחרור LDH עם חשיפה ל-UVA או UVB בסדר זה (איור 2B). תוצאות הניסוי שלעיל הראו שההשפעות האנטי-פרוליפרטיביות והציטוטוקסיות של הקרנת UVA או UVB על קרטינוציטים הוקלו בסדר גודל של KCL, KCR, KCS ו-KCF. יש לציין, KCL יכול להחזיר את כדאיות התא לרמות בקרה.

איור 2. השפעות הכדאיות והציטוטוקסיות של קרטינוציטים של תמצית KCR, KCS, KCL ו-KCF בנוכחות UVA, UVB או אי-הקרנה.

3.3. השוואה של ייצור ROS תוך תאי בקרטינוציטים שטופלו במספר תמציות חלקיות של KC בנוכחות או היעדר הקרנת UVA ו-UVB

מכיוון שהייצור התוך תאי של ROS גורם לנזק חמור לקרטינוציטים, הם נחשבים למתווכים פוטנציאליים של נזק הנגרם מקרינת UVA או UVB. מספר מחקרים העלו כי הקרנת UVA או UVB גורמת לייצור ROS אנדוגני [12,14]. מטרתנו הייתה לקבוע אם הייתה עלייה ברמות ה-ROS האנדוגניות בקרטינוציטים מוקרי UVA או UVB. בהתאם לכך, ניתחנו את עוצמת הקרינה התוך-תאית של הבדיקה CM-H2DCFDA באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וציטומטריית זרימה. כתוצאה ממיקרוסקופ פלואורסצנטי, תמונות צביעת CM-H2DCFDA הראו צביעה קלה בקרטינוציטים שטופלו בקרת, KCR,KCS, KCL ו-KCF וצביעה משמעותית בקרטינוציטים מוקרי UVA או UVB (איור 3A). על פי התוצאות המכומתות של ציטומטריית זרימה, הקרנת UVA ו-UVB העלתה את רמות ה-ROS התוך-תאי בקרטינוציטים ב-27.2 ± 4.5 אחוזים וב-34.1 ± 4.2 אחוזים, בהתאמה, בהשוואה לזו בביקורת (5.7). ±0.2 אחוזים). בנוסף, בדומה לתוצאות מיקרוסקופ הקרינה, אושר שרמת ה-ROS התוך תאית דוכאה על ידי תמציות KC בסדר גודל של KCL > KCR > KCS > KCF בנוכחות הקרנת UVA או UVB (איור 3B). תוצאות אלו מצביעות על כך שמספר תמציות חלקיות של KC עיכבו באופן משמעותי נזק לקרטינוציטים על ידי הפחתת רמות ROS אנדוגני.

איור 3. השפעת תמצית KCR, KCS, KCL ו-KCF על ייצור ROS תוך תאי ב-UVA, UVB או קרטינוציטים לא מוקרנים

3.4. השוואה בין אפופטוזיס של קרטינוציטים שטופלו במספר תמציות חלקיות של KC בנוכחות או בהיעדר הקרנת UVA ו-UVB

כדי לזהות אפופטוזיס, שהוא אינדיקטור אמין לנזק קרטינוציטים, קרטינוציטים נצבעו ב-Annexin V בשילוב עם propidium iodide. ערכת אפופטוזיס של תאים מתים (Flourescein isothiocyanate) (FITC) Annexin V/Dead Cell Apoptosis שימשה לבדיקת קצב האפופטוזיס בקרטינוציטים. הקרנת UVA ו-UVB הקלה על פעילות הצביעה של Annexin V, ואילו KCR, KCS, KCL ו-KCF הפחיתו את שיעור פעילות הצביעה של Annexin V בנוכחות הקרנת UVA ו-UVB. KCR, KCS, KCL ו-KCF בלבד (0.5 mg/mL) לא גרמו לפעילות צביעה של Annexin V. נתונים מכומתים מ-flow cytometry הראו שהקרנת UVA ו-UVB העלתה את רמות האפופטוזיס של קרטינוציטים ב-46.3± 1.5 אחוז ו-48.7 ± 1.0 אחוז, בהתאמה, בהשוואה לזה של השליטה (5.0 אחוזים ± 0.7 אחוזים). חשוב לציין, אושר שרמת האפופטוזיס דוכאה על ידי תמציות KC בסדר גודל של KCL > KCR > KCS > KCF בנוכחות הקרנת UVA או UVB (איור 4A,B). בסך הכל, הקרנת UVA ו-UVB גרמה לנזק לקרטינוציטים וכמה תמציות חלקיות של KC החלישו נזק לקרטינוציטים שנגרמו על ידי קרינת UV.

איור 4. השפעת תמציות KCR, KCS, KCL ו-KCF על האפופטוזיס ב-UVA, UVB או קרטינוציטים לא מוקרנים.

3.5. השוואה בין תוכן מלנין תוך תאי ופעילות טירוזינאז של מלנוציטים שטופלו במספר תמציות חלקיות של KC בנוכחות או היעדר טיפול -MSH

לפני חקירת הפוטנציאל הביולוגי של KCR, KCS, KCL ו-KCF על מלנוגנזה המושרה על ידי MSH, הוערכה כדאיות התא לאחר טיפול ב-KCR, KCS, KCL ו-KCF (0.5 mg/mL) באמצעות מבחן CCK-8 במלנוציטים B16F10 עם או בלי -MSH. KCR, KCS, KCL ו-KCF (0.5 מ"ג/מ"ל) לא שינו את הכדאיות של התא בנוכחות או היעדר -MSH (איור 5A). -MSH הוא חומר מלנוגני חשוב שיכול להגביר את תכולת המלנין התוך תאית על ידי קישור לקולטן מלנוקורטין 1 והפעלת אדנילט ציקלאז. כדי לחקור את ההשפעה של KCR, KCS, KCL ו-KCF על מלנוגנזה במלנוציטים, תכולת המלנין התוך תאית נקבעה על ידי תצפית חזותית ומדידות ביוכימיות. כפי שמוצג באיור 5B, תכולת המלנין התוך תאית גדלה באופן משמעותי על ידי -MSH. עם זאת, טיפול משותף עם KCR, KCS, KCL ו-KCF הראה הפחתה יוצאת דופן בתכולת המלנין התוך תאי בהשוואה לטיפול -MSH. רצף המדידות הביוכימיות המצביעות על עיכוב תכולת המלנין התוך תאית היה כדלקמן: KCL > KCR > KCS > KCF (איור 5B). בדיקת פעילות טירוזינאז התוך תאית בוצעה על פי בדיקת תכולת המלנין התוך תאית. פעילות ה-tyrosinase התוך-תאית של מלנוציטים מגורים -MSH עלתה, ואילו זו של מלנוציטים מגורים -MSH שטופלו ב-KCR, KCS, KCL ו-KCF ירדה. רצף המדידות הביוכימיות המצביעות על עיכוב הפעילות התוך-תאית של טירוזינאז היה כדלקמן: KCL > KCR > KCS > KCF (איור 5C). תוצאות אלו מצביעות על כך שמספר תמציות חלקיות של KC הפחיתו באופן משמעותי את תכולת המלנין התוך-תאי ועיכבו את פעילות טירוזינאז מבלי לשנות את הכדאיות של התא.

3.6. השוואה של רמות שעתוק ותרגום של טירוזינאז, TRP-1 ו-TRP-2 במלנוציטים שטופלו במספר תמציות חלקיות של KC בנוכחות או היעדר של-טיפול MSH

כדי לחקור את ההשפעה של KCR, KCS, KCL ו-KCF על ויסות מטה של ​​רמות ביטוי החלבון וה-mRNA של סמני מלנוגנזה (טירוזינאז, TRP-1 ו-TRP-2), המלנוציטים טופלו ב-KCR , KCS, KCL ו-KCF בנוכחות או היעדר -MSH. כפי שמוצג באיור 6A-C, רמות ה-mRNA של טירוזינאז, TRP-1 ו-TRP-2 עלו באופן משמעותי על ידי טיפול ב-MSH. לעומת זאת, בהשוואה לטיפול ב-MSH, KCR, KCS, KCL ו-KCF הורידו את ביטוי ה-mRNA של טירוזינאז, TRP-1 ו-TRP-2. בנוסף, ל-KCR, KCS, KCL ו-KCF לבדם לא הייתה השפעה משמעותית על רמות ה-Tyrosinase, TRP-1 ו-TRP-2 mRNA. ניתוח כתם Western בוצע בשיתוף פעולה עם PCR בזמן אמת. התוצאות הראו שטיפול ב-MSH העלה את רמות ביטוי החלבון של טירוזינאז, TRP-1 ו-TRP-2 ורמות אלו ירדו על ידי טיפול משותף עם KCR, KCS, KCL ו-KCF (איור 6D ). רצף ה-PCR הכמותי בזמן אמת ו-Western Blot המצביע על עיכוב של טירוזינאז, TRP-1 ו-TRP-2 ביטויי mRNA וחלבון היה כדלקמן: KCL > KCR=KCS > KCF (איור 6). תוצאות אלו מצביעות על כך שלכמה תמציות חלקיות של KC יש פוטנציאל לקדם אנטי-מלנוגנזה, אשר הוכח על ידי הורדת ויסות של סמני מלנוגנזה.

3.7. השוואה של ביטוי MITF וזרחון CREB של מלנוציטים שטופלו במספר תמציות חלקיות של KC בנוכחות או היעדר טיפול -MSH

טירוזינאז, TRP-1 ו-TRP-2 חיוניים במלנוגנזה. הביטוי שלהם מווסת על ידי MITFexpression וזרחון CREB [17,21]. ניתוח הכתם המערבי הצביע על כך ש-KCR, KCS, KCL ו-KCF מעכבים ביעילות את העלייה ברמת החלבון של MITF הנגרמת על ידי טיפול ב-MSH. בנוסף, KCR, KCS, KCL ו-KCF לבד כמעט ולא זיהו ביטוי חלבון MITF. הרצף של תוצאות הכתם המערבי המכומת המצביע על עיכוב רמות ביטוי חלבון MITF היה כדלקמן: KCL > KCR > KCS > KCF (איור 7A). יתרה מכך, KCR, KCS, KCL ו-KCF הפכו את ההשפעות של טיפול -MSH על זרחון CREB. ל-KCR, KCS, KCL ו-KCF בלבד הייתה השפעה מועטה על זרחון CREB. הרצף של תוצאות הכתם המערבי המכומת המצביע על עיכוב של רמות זרחון CREB היה כדלקמן: KCL > KCR > KCS > KCF (איור 7B). תוצאות אלו הצביעו על כך שמספר תמציות חלקיות של KC דיכאו מלנוגנזה במלנוציטים, לפחות חלקית, באמצעות ביטוי MITF וזרחון CREB.

4. דיון

הפופולריות של הלבנת עור הולכת וגוברת ברחבי העולם עקב העלייה בקרינת UV, והיא צפויה להגיע לממדים גבוהים בעשורים הקרובים למטרות אסתטיות [8]. סוגים רבים של אקונומיקה, כגון חומצה קוג'ית וארבוטין, שימשו בשוקי הקוסמטיקה והתרופות. יתר על כן, תמציות טבעיות זוכות לתשומת לב הולכת וגוברת בשל פעילותן הפוטנציאלית נוגדת חמצון, אנטי דלקתית, אנטי גידולית, אנטיבקטריאלית ואחרות [26,27]. בהתבסס על המאפיינים של נוגדי חמצון ופוטו-פרוטקטיבי ואנטי-מלנוגנזה, פותחו מספר מועמדים קוסמטיים ותרופות. ידוע היטב שתכונות אלו של מועמדים להלבנה הם תורמים הכרחיים למחקר ופיתוח קוסמטי ותרופות [28]. ל-TDM יש תכונות מרובות רכיבים ורב-מטרות ומשפרת מאוד את היעילות הביולוגית של האדם ואת איכות החיים [29]. מחקר פיטוכימי מודרני מראה כי KC מכיל מגוון של מרכיבים, כאשר ליגננים וטרפנואידים הם המרכיבים העיקריים [30]. יותר מ-202 תרכובות זוהו, כולל דיבנזוצי-קלוקטדיאן ליגנאנים, ליגנאנים של דיבנזוציקלוקטדיאן ספירו-בנזופורנואידים, ליגנאנים של Arylnaphthalene, טריטרפנואידים של Kadlongilactone ו-Sesquiterpenoids [31,32]. היבשים, הגבעולים והעלים של KC הם בעלי מסורת רחבה של שימוש ב-TDM לטיפול בדלקת מפרקים שגרונית, כיבים בתריסריון, הפרעות במערכת העיכול ובעיות גינקולוגיות. השורשים המיובשים של KC, עם פעולות של פינוי חום וסילוק רעלים, גרימת משתן להסרת בצקת. פירות של KC נצרכים בעיקר בצורה של פירות טריים, מיצים ויין פירות, מה שמצביע על כך שהם מועילים לבריאות האדם [7,33,34]. מחקרים קודמים גם הראו שהוא עשיר במרכיבים ביו-אקטיביים כמו ליגננים, טריטרפנואידים, פלבנואידים, חומצות פנוליות, סטרואידים וחומצות אמינו, בעלות ערך תזונתי ותרופתי גבוה [3,35]. במחקר זה חולצו חלקים שונים של KC. יש לציין כי תכולת הפוליפנולים והפלבנואידים הכוללת של עלי ושורשי KC הייתה גבוהה בהרבה מאלה של גבעולים ופירות. עלים ושורשים מכילים יותר מפי שניים יותר פוליפנולים ופלבונואידים מאשר גבעולים ופירות. כתוצאה מכך, אנו רואים כי סך הפוליפנולים והפלבנואידים תורמים תרומה משמעותית להשפעות הפוטופרוקטטיביות והאנטי-מלנוגניות של KC.

פוטוטוקסיות עורית הנגרמת על ידי קרינת UV נובעת בעיקר מציטוטוקסיות של התא, הצטברות ROS תוך תאית ואפופטוזיס בקרטינוציטים. לכן, סביר יותר להתמקד בעיכוב ציטוטוקסיות התא, הצטברות ROS תוך תאית ואפופטוזיס בקרטינוציטים מוקרנים ב-UVA ו-UVB [36,37]. כפי שתואר במחקר זה [10,38], תוצאות ההתערבות עם תמציות KC על ציטוטוקסיות פוטו (UVA: 20 J/cm2, UVB: 50 mJ/cm2) הראו שתמציות KC הפחיתו באופן משמעותי את הציטוטוקסיות של התא, הצטברות ROS תוך תאית אפופטוזיס. בהתאם לתוצאות קודמות, השפעות הצילום של עלי ושורשי KC היו גבוהות בהרבה מאלו של הגבעול והפרי. יתר על כן, התוצאות שלנו הצביעו על כך שתמציות KC מציגות את ההשפעות שהוזכרו לעיל על ידי קידום פעילות נוגדת חמצון. מלנוגנזה נצפית לעתים קרובות לאחר קרינת UV והיא קשורה בעיקר לפיגמנטציה או היפרפיגמנטציה [39]. על פי מחקרים קודמים, השיטה של ​​השראת מלנוגנזה באמצעות -MSH זכתה להכרה ומיושמת נרחבת. לכן, מחקר זה התבסס על בניית מודל מלנוציטים מגורה עם -MSH [24,39]. מצאנו שתמציות KC דיכאו את תכולת המלנין התוך תאית ופעילות טירוזינאז בגירוי -MSH. בנוסף, תמציות KC הרסו את השעתוק והתרגום של סמני מלנוגנזה כגון טירוזינאז, TRP-1 ו-TRP-2 במלנוציטים מגורים של-MSH. יתר על כן, חקרנו ביטוי חלבון MITF וזרחון CREB במלנוציטים מגורים של-MSH. באופן דומה, במחקר זה, מצאנו שתמציות KC דיכאו ביטוי חלבון MITF בתיווך MSH וזרחון CREB במלנוציטים. בהתאם לתוצאות הפוטו-פרוטקטיביות, ההשפעות האנטי-מלנוגניות של עלים ושורשים של KC היו גבוהות בהרבה מאלה של הגבעולים והפירות.

פרוסות cistanche

למידע נוסף, אנא לחץ כאן.

5. מסקנות

בסך הכל, ההשפעות הפוטנציאליות הפוטו-פרוקטיוניות והאנטי-מלנוגניות של תמצית KC נמצאו במחקר זה. תמצית KC עם תוכן גבוה של פוליפנול ופלבנואידים יכולה להפעיל השפעות פוטוגנטיות ואנטי-מלנוגניות על קרטינוציטים ומלנוציטים. מחקר זה מספק רציונל ואסטרטגיית מחקר להתערבויות קוסמטיות ותרופות להלבנה טבעית וסוכני הגנה מפני צילום.